CN109628512B - 一种生产n-乙酰神经氨酸的发酵方法 - Google Patents

一种生产n-乙酰神经氨酸的发酵方法 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种生产N‑乙酰神经氨酸的发酵方法，涉及N‑乙酰神经氨酸生产技术领域。本发明公开的生产N‑乙酰神经氨酸的发酵方法，其包括在发酵过程中，往接种有产N‑乙酰神经氨酸菌的发酵培养基中添加补料液，补料液含有甘油和添加剂；添加剂选自N‑乙酰葡萄糖胺和聚磷酸类物质中的一种或两种的组合。该发酵方法通过对补料液的组分或用量优化，提高了N‑乙酰神经氨酸的合成率，同时提高N‑乙酰神经氨酸的产量。

Description

一种生产N-乙酰神经氨酸的发酵方法
技术领域
本发明涉及N-乙酰神经氨酸生产技术领域，具体而言，涉及一种生产N-乙酰神经氨酸的发酵方法。
背景技术
N-乙酰神经氨酸(N-acetyl neuraminic acid，NeuAc)是含有9个碳原子，并具有吡喃糖结构的酸性氨基糖，是唾液酸家族的主要成员之一。NeuAc广泛分布于哺乳动物体内，是细胞膜蛋白的重要组成部分，参与机体多种生理功能：1)抗识别作用；2)提高婴幼儿智力和记忆力；3)抑制白细胞黏附和消炎；4)抗肿瘤、抗病毒；5)抗老年痴呆，等。NeuAc广泛应用于食品领域、保健品领域、化妆品领域、医药前体及疾病诊断等，具有重大的市场价值。
目前N-乙酰神经氨酸的主要生产方法包括：生物酶催转化、聚唾液酸发酵水解法及基因工程菌直接发酵。生物酶催转化因为转化前体N-乙酰葡萄糖胺和丙酮酸及能量供体ATP成本高，导致NeuAc合成成本高。聚唾液酸水解法由于其发酵产量低及后处理复杂，成本也居高不下。基因工程菌通过对大肠杆菌模式菌株基因改造，使之能够利用普通廉价的碳源进行高密度发酵，并达到较高的NeuAc产量，近年来受到广泛重视。虽然基因工程菌来源的NeuAc成本已经大幅度降低，但是产量还是相对较低，较高的成本限制了其应用范围。
鉴于此，特提出本发明。
发明内容
本发明的目的在于提供一种生产N-乙酰神经氨酸的发酵方法。该发酵方法通过对补料液的组分或用量优化，提高了N-乙酰神经氨酸的合成率，同时提高N-乙酰神经氨酸的产量。
本发明是这样实现的：
本发明提供了一种生产N-乙酰神经氨酸的发酵方法，在发酵过程中，往接种有产N-乙酰神经氨酸菌的发酵培养基中添加补料液；
其中，所述补料液含有甘油和添加剂；所述添加剂选自N-乙酰葡萄糖胺和聚磷酸类物质中的一种或两种的组合。
本发明中通过添加N-乙酰神经氨酸前体物质N-乙酰葡萄糖胺可以促进NeuAc的合成，提高单位时间NeuAc的合成量，并且最终产量也有提高。添加聚磷酸类物质，可以促进体内ATP的合成，给细胞提高更多能量，且促进N-乙酰葡萄糖胺异构化为N-乙酰甘露糖胺，从而更快速和高效合成NeuAc，同时产量能够提高。
进一步地，在本发明的一些实施方案中，所述补料液以7～16ml/(L*h)的速率(即每L发酵培养基，每小时添加的补料液7～16ml)添加至所述发酵培养基中。
发明人惊喜的发现补料液的添加速率能够影响N-乙酰神经氨酸的合成速率以及产量，在以合适的速率添加补料液可以提高N-乙酰神经氨酸的合成速率以及产量，这是本发明首次发现的。具体的，本发明发现以7～16ml/(L*h)的速率添加补料液，N-乙酰神经氨酸的合成速率以及产量得到提高，尤其是以11ml/(L*h)的速率添加，N-乙酰神经氨酸的合成速率以及产量具有明显的提高。
进一步地，在本发明的一些实施方案中，所述补料液以8-14ml/(L*h)的速率添加至所述发酵培养基中。
进一步地，在本发明的一些实施方案中，所述补料液以7-11ml/(L*h)的速率添加至所述发酵培养基中。
进一步地，在本发明的一些实施方案中，所述补料液以7-16ml/(L*h)的速率添加至所述发酵培养基中。
进一步地，在本发明的一些实施方案中，所述补料液以11-16ml/(L*h)的速率添加至所述发酵培养基中。
进一步地，在本发明的一些实施方案中，所述补料液以7ml/(L*h)的速率添加至所述发酵培养基中。
进一步地，在本发明的一些实施方案中，所述补料液以11ml/(L*h)的速率添加至所述发酵培养基中。
进一步地，在本发明的一些实施方案中，所述补料液以16ml/(L*h)的速率添加至所述发酵培养基中。
进一步地，在本发明的一些实施方案中，所述补料液中的N-乙酰葡萄糖胺的含量为2％-3％。
进一步地，在本发明的一些实施方案中，所述补料液中的N-乙酰葡萄糖胺的含量为2.5％。
进一步地，在本发明的一些实施方案中，所述补料液中的聚磷酸类物质的含量为0.5％-1.5％。
进一步地，在本发明的一些实施方案中，所述补料液中的聚磷酸类物质的含量为0.5％。
进一步地，在本发明的一些实施方案中，所述补料液中的聚磷酸类物质的含量为1％。
进一步地，在本发明的一些实施方案中，聚磷酸类物质为多聚磷酸、多聚磷酸盐或三聚磷酸盐。
进一步地，在本发明的一些实施方案中，多聚磷酸盐为多聚磷酸钠、多聚磷酸钾、或多聚磷酸氨；三聚磷酸盐为三聚磷酸钠、三聚磷酸钾、三聚磷酸铝或三聚磷酸氨。
进一步地，在本发明的一些实施方案中，所述补料液中的甘油含量为40％-80％。
进一步地，在本发明的一些实施方案中，所述补料液中的甘油含量为50％。
进一步地，在本发明的一些实施方案中，所述产N-乙酰神经氨酸菌的保藏编号为CCTCC No：M2013494。
该菌株于2013年10月24日保藏于位于中国武汉大学的中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCC No：M2013494。分类学命名为：大肠杆菌(Escherichia)。
需要说明的，产N-乙酰神经氨酸菌并不限于保藏编号为CCTCC No：M2013494的大肠杆菌工程菌，其他的可以产N-乙酰神经氨酸的工程菌也可以适用本发明，均属于本发明的保护范围。
进一步地，在本发明的一些实施方案中，所述发酵培养基含有如下组分：甘油、酵母粉，蛋白胨、玉米浆干粉、磷酸氢二钾、磷酸二氢钾、硫酸镁、氯化钙、硫酸亚铁以及IPTG。
发酵培养基中同时采用复合氮源，让细胞营养更均衡，更有利于菌体的生产。
进一步地，在本发明的一些实施方案中，发酵过程中的条件如下：维持DO高于30％、发酵温度：36-38℃，维持所述发酵培养基的pH为6.5-6.9。
进一步地，在本发明的一些实施方案中，用氨水维持所述发酵培养基的pH。
本发明具有以下有益效果：
本发明提供的生产N-乙酰神经氨酸的发酵方法，通过在发酵过程中添加含甘油以及N-乙酰葡萄糖胺和/或聚磷酸类物质的补料液，有效地提高了N-乙酰神经氨酸的合成速率，提高了N-乙酰神经氨酸的产量。
附图说明
为了更清楚地说明本发明实施例的技术方案，下面将对实施例中所需要使用的附图作简单地介绍，应当理解，以下附图仅示出了本发明的某些实施例，因此不应被看作是对范围的限定，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他相关的附图。
图1为本发明实施例1的发酵液中的N-乙酰神经氨酸的HPLC图谱。
具体实施方式
为使本发明实施例的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述。实施例中未注明具体条件者，按照常规条件或制造商建议的条件进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市售购买获得的常规产品。
以下结合实施例对本发明的特征和性能作进一步的详细描述。
实施例1
本实施例提供的生产N-乙酰神经氨酸的发酵方法，包括如下步骤：
1菌种活化：
取冻存的产N-乙酰神经氨酸的菌种(保藏号CCTCC No：M2013494)划线接种至固体LB培养基上，37℃培养。
2一级种子的培养：
待长出单菌落后，挑取单菌落，接种到含50mL液体LB种子培养基的三角瓶中，200rpm，37℃培养过夜，得到一级种子液。
3二级种子的培养：
将一级种子液按1％的接种量接到含50mL液体种子培养基的三角瓶中，200rpm，37℃培养6h，得到二级种子液。
液体LB培养基含有：蛋白胨10g/L，酵母浸膏粉5g/L，氯化钠10g/L，pH7.0。
固体LB培养基含有：蛋白胨10g/L，酵母浸膏粉5g/L，氯化钠10g/L，琼脂20g/L，pH7.0。
4发酵罐发酵：
发酵罐(5L的规格)装有液体发酵培养基3L，将二级种子液100mL接种至发酵罐中培养；
本实施例中，液体发酵培养基的成分包括如下：甘油20g/L、酵母粉2g/L，蛋白胨4g/L，玉米浆干粉11g/L、磷酸氢二钾5g/L、磷酸二氢钾3g/L，硫酸镁1.2g/L、氯化钙0.01g/L、硫酸亚铁1g/L，IPTG0.2mM。
发酵培养基中还加入有1mL泡敌以抑制泡沫产生。
发酵条件：
控制初始通气量1vvm，初始转速200rpm；接种后根据调整转速及通气维持DO高于30％、发酵温度：37℃。
发酵过程用17％的氨水维持pH6.8培养基中碳源耗完后，以11ml/(L*h)的速率流加补料液至发酵结束。
补料液：含50％甘油，且添加有2.5％的N-乙酰葡萄糖胺和1％的多聚磷酸(阿拉丁直接购买)。
该补料液的制备方法：称取1000g甘油、50g N-乙酰葡萄糖胺和20g多聚磷酸，加水定容2L，121℃灭菌20分钟备用。
发酵培养60h放罐，检测其NeuAc含量。
5N-乙酰神经氨酸含量的检测方法如下：
发酵液离心去除菌体，清液稀释一定倍数，HPLC检测。
高效液相色谱(HPLC)检测法：岛津Lc-15c；检测柱Bio-Rad AMINEX HPX 87HOrganic Analysis Column(300×7.8mm)；柱温60℃；流动相5mmol硫酸，流速是0.6ml/min；检测波长210nm。
结果如图1所示，结果显示，采用本实施例的发酵方法在发酵60h NeuAc产量达92.3g/L(即每L发酵液含92.3g NeuAc)，平均合成速率18.46g/L*12h(即每12h每升发酵液NeuAc产物增加量)。
实施例2
本实施例提供的生产N-乙酰神经氨酸的发酵方法与实施例1基本相同，不同的是本实施例中的补料液含50％甘油和2.5％的N-乙酰葡萄糖胺。
结果显示，采用本实施例的发酵方法在发酵60h NeuAc产量82.3g/L，平均合成速率16.46g/L*12h。
实施例3
本实施例提供的生产N-乙酰神经氨酸的发酵方法与实施例1基本相同，不同的是本实施例中的补料液含50％甘油和1％多聚磷酸。
结果显示，采用本实施例的发酵方法在发酵60h NeuAc产量76.8g/L，平均合成速率15.36g/L*12h。
实施例4
本实施例提供的生产N-乙酰神经氨酸的发酵方法与实施例1基本相同，不同的是本实施例中的补料液仅含50％甘油。
结果显示，采用本实施例的发酵方法在发酵60h NeuAc产量67.3g/L，平均合成速率13.46g/L*12h。
实施例5
本实施例提供的生产N-乙酰神经氨酸的发酵方法与实施例1基本相同，不同的是本实施例中的补料液以7ml/L*h的速率添加。
结果显示，采用本实施例的发酵方法在发酵60h，NeuAc产量60.7g/L，平均合成速率12.14g/L*12h。
实施例6
本实施例提供的生产N-乙酰神经氨酸的发酵方法与实施例1基本相同，不同的是本实施例中的补料液以16ml/L*h的速率添加。
结果显示，采用本实施例的发酵方法发酵60h，NeuAc产量85.2g/L，平均合成速率17.04g/L*12h。
实施例7
本实施例提供的生产N-乙酰神经氨酸的发酵方法与实施例1基本相同，不同的是本实施例中的补料液含50％甘油和2.5％的N-乙酰葡萄糖胺和0.5％的多聚磷酸。
结果显示，采用本实施例的发酵方法在发酵60h NeuAc产量88.7g/L，平均合成速率17.74g/L*12h。
实施例8
本实施例提供的生产N-乙酰神经氨酸的发酵方法与实施例1基本相同，不同的是本实施例中的补料液含50％甘油和2.5％的N-乙酰葡萄糖胺和1％的三聚磷酸钠。
结果显示，采用本实施例的发酵方法在发酵60h NeuAc产量91.6g/L，平均合成速率18.32g/L*12h。
对比例1
本对比例提供的生产N-乙酰神经氨酸的发酵方法与实施例1基本相同，不同的是底料甘油耗完后，不进行补料液流加。
结果显示，采用本对比例的发酵方法发酵60h，NeuAc产量3.4g/L，与底料甘油耗完时产量一致。
对比例2
本对比例提供的生产N-乙酰神经氨酸的发酵方法与实施例1基本相同，不同的是本对比例中的补料液仅含50％葡萄糖。
结果显示，采用本实施例的发酵方法发酵60h，NeuAc产量34.5g/L，平均合成速率6.90g/L*12h。
以上所述仅为本发明的优选实施例而已，并不用于限制本发明，对于本领域的技术人员来说，本发明可以有各种更改和变化。凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

Claims (9)

1.一种生产N-乙酰神经氨酸的发酵方法，其特征在于，其包括：在发酵过程中，往接种有产N-乙酰神经氨酸菌的发酵培养基中添加补料液；
其中，所述补料液含有甘油和添加剂；所述添加剂选自N-乙酰葡萄糖胺和聚磷酸类物质中的一种或两种的组合；
所述产N-乙酰神经氨酸菌的保藏编号为CCTCC No：M2013494；
所述聚磷酸类物质为多聚磷酸或多聚磷酸盐。
2.根据权利要求1所述的生产N-乙酰神经氨酸的发酵方法，其特征在于，所述补料液以7～16ml/L*h的速率添加至所述发酵培养基中。
3.根据权利要求2所述的生产N-乙酰神经氨酸的发酵方法，其特征在于，所述补料液中的N-乙酰葡萄糖胺的含量为2％-3％。
4.根据权利要求2所述的生产N-乙酰神经氨酸的发酵方法，其特征在于，所述补料液中的聚磷酸类物质的含量为0.5％-1.5％。
5.根据权利要求4所述的生产N-乙酰神经氨酸的发酵方法，其特征在于，所述多聚磷酸盐为多聚磷酸钠、多聚磷酸钾或多聚磷酸氨。
6.根据权利要求4所述的生产N-乙酰神经氨酸的发酵方法，其特征在于，所述多聚磷酸盐为三聚磷酸盐，所述三聚磷酸盐为三聚磷酸钠、三聚磷酸钾、三聚磷酸铝或三聚磷酸氨。
7.根据权利要求2-6任一项所述的生产N-乙酰神经氨酸的发酵方法，其特征在于，所述补料液中的甘油含量为40％-80％。
8.根据权利要求2-6任一项所述的生产N-乙酰神经氨酸的发酵方法，其特征在于，所述发酵培养基含有如下组分：甘油、酵母粉，蛋白胨、玉米浆干粉、磷酸氢二钾、磷酸二氢钾、硫酸镁、氯化钙、硫酸亚铁以及IPTG。
9.根据权利要求2-6任一项所述的生产N-乙酰神经氨酸的发酵方法，其特征在于，发酵过程中的条件如下：维持DO高于30％、发酵温度：36-38℃，维持所述发酵培养基的pH为6.5-6.9。
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