CN108424868B - 一种利用天然双碳源高产n-乙酰神经氨酸的重组菌 - Google Patents

一种利用天然双碳源高产n-乙酰神经氨酸的重组菌 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种利用天然双碳源高产N‑乙酰神经氨酸的重组菌，属于遗传工程领域。本发明通过强启动子P43过表达磷酸烯醇式丙酮酸羧激酶基因PckA，利用葡萄糖、L‑苹果酸钠天然双碳源发酵，实现N‑乙酰神经氨酸合成途径中磷酸烯醇式丙酮酸的高效供给，以加强合成途径，本发明的重组枯草芽孢杆菌与出发菌株相比，其N‑乙酰神经氨酸产量从1.15g/L提高到1.65g/L，为进一步代谢工程改造枯草芽孢杆菌生产N‑乙酰神经氨酸奠定了基础。

Description

一种利用天然双碳源高产N-乙酰神经氨酸的重组菌
技术领域
本发明涉及一种利用天然双碳源高产N-乙酰神经氨酸的重组菌，属于遗传工程领域。
背景技术
N-乙酰神经氨酸是生物体内重要的糖类物质，在生物体内负责信号传递等功能。在人体中，N-乙酰神经氨酸参与细胞间信号转导、识别等重要生理过程。因此，N-乙酰神经氨酸被广泛应用于流感抗炎，增强免疫力，促进适龄婴儿大脑发育，以及维持老年人大脑功能和健康。目前，N-乙酰神经氨酸主要采用从蛋类、燕窝等含量相对丰富的天然材料中提取，得到的产品易引起过敏反应，或是通过化学法合成，高温、高压工艺复杂，且对环境污染严重，或是大肠杆菌全细胞催化反应获得，存在底物转化率低，产物不易分离等问题。
枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)是一种被广泛用作食品酶制剂及重要营养化学品的生产宿主，其被FDA认证为“generally regarded as safe”(GRAS)安全级别。因此，通过基因工程改造枯草芽孢杆菌，可以高效生产食品安全级N-乙酰神经氨酸。然而，枯草芽孢杆菌自身合成途径代谢流通量不足，影响N-乙酰神经氨酸合成效率。如何强化枯草芽孢杆菌代谢流供给，实现N-乙酰神经氨酸合成前体的高效供给，对于N-乙酰神经氨酸的工业化生产具有重要意义。
发明内容
有报道表明，当底物存在葡萄糖的情况下，枯草芽孢杆菌可以同时、高效利用L-苹果酸钠，且L-苹果酸钠代谢主要流向Neu5Ac合成前体之一的磷酸烯醇式丙酮酸(Chubukov,V.et al.Transcriptional regulation is insufficient to explain substrate‐induced flux changes in Bacillus subtilis.Molecular systems biology 9,709(2013).)，据此，本发明利用枯草芽孢杆菌利用葡萄糖和L-苹果酸钠天然双碳源的特性，进一步以强启动子P43过表达磷酸烯醇式丙酮酸羧激酶基因pckA，强化L-苹果酸钠向磷酸烯醇式丙酮酸代谢流，以提高Neu5Ac合成效率。
本发明的第一个目的是提供一种高效利用天然双碳源生产N-乙酰神经氨酸的重组枯草芽孢杆菌，所述天然双碳源为葡萄糖和L-苹果酸。
在本发明的一种实施方式中，所述重组枯草芽孢杆菌在基因组中以组成型强启动子P43过表达磷酸烯醇式丙酮酸羧激酶基因pckA。
在本发明的一种实施方式中，所述磷酸烯醇式丙酮酸羧激酶的氨基酸序列如SEQID NO:1所示。
在本发明的一种实施方式中，所述重组枯草芽孢杆菌是以枯草芽孢杆菌Bacillussubtilis 168ΔnagPΔnagPΔgamPΔgamAΔnagAΔnagBΔ1dhΔptaΔptsG::lox72；Δctc::p43-Gna1；ΔspsC::p43-yqaB；Δglms::p43-glms,pP43NMK-AGE-NeuB为宿主构建得到的。
在本发明的一种实施方式中，所述枯草芽孢杆菌Bacillus subtilis 168ΔnagPΔnagPΔgamPΔgamAΔnagAΔnagBΔ1dhΔptaΔptsG::lox72；Δctc::p43-Gna1；ΔspsC::p43-yqaB；Δglms::p43-glms,p P43NMK-AGE-NeuB是通过将大肠杆菌来源的6-磷酸葡糖酸磷酸酶基因yqaB优化密码子序列基因合成后，重组于Bacillus subtilis 168ΔnagP ΔnagP ΔgamP ΔgamA ΔnagA ΔnagB Δ1dh Δpta ΔptsG::lox72；Δctc::p43-Gna1基因组上进行整合表达；并用组成型强启动子P43替换插入枯草芽孢杆菌谷氨酰胺-果糖-6-磷酸转氨酶基因glms原始启动子；所述Bacillus subtilis 168ΔnagP ΔnagP ΔgamP ΔgamA ΔnagA ΔnagB Δ1dh Δpta ΔptsG::lox72；Δctc::p43-Gna1公开于公开号为CN106929461A的专利申请中。
在本发明的一种实施方式中，所述N-乙酰氨基葡萄糖异构酶编码基因、N-乙酰神经氨酸合酶编码基因重组于质粒pP43NMK上；所述质粒pP43NMK的构建方法参见Zhang XZ,Cui ZL,Hong Q,Li SP.High-level expression and secretion of methyl parathionhydrolase in Bacillus subtilis WB800.Applied and environmentalmicrobiology.2005；71(7):4101-3。
在本发明的一种实施方式中，所述6-磷酸葡糖酸磷酸酶的氨基酸序列为SEQ IDNO.2，替换谷氨酰胺-果糖-6-磷酸转氨酶的原始核苷酸序列为SEQ ID NO.3，替换谷氨酰胺-果糖-6-磷酸转氨酶的P43启动子的核苷酸序列为SEQ ID NO.4，所述N-乙酰氨基葡萄糖异构酶的氨基酸序列为SEQ ID NO.5，所述N-乙酰神经氨酸合酶的氨基酸序列为SEQ IDNO.6。
本发明的第二个目的是提供所述重组枯草芽孢杆菌的构建方法，包括如下步骤：
1)构建重组整合片段：克隆磷酸烯醇式丙酮酸羧激酶编码基因pckA两侧同源臂基因，克隆Spectinomycin抗性基因和P43启动子基因序列，3段基因通过融合PCR组装。
2)构建高产N-乙酰神经氨酸重组枯草芽孢杆菌：将上述重组整合片段转化枯草芽孢杆菌，得到高效利用天然双碳源高产N-乙酰神经氨酸重组枯草芽孢杆菌。
本发明的第三个目的是提供了一种上述重组枯草芽孢杆菌在营养保健品方面的应用。
在本发明的一种实施方式中，所述枯草芽孢杆菌用于发酵生产N-乙酰神经氨酸。
在本发明的一种实施方式中，所述枯草芽孢杆菌用于发酵生产N-乙酰神经氨酸是将35-38℃、180-220rpm下培养10-20h的重组枯草芽孢杆菌以10％-20％的接种量转入发酵培养基，于35-38℃、180-220rpm条件下发酵30-50h。
本发明还要求保护所述重组枯草芽孢杆菌在生产或制备含N-乙酰神经氨酸的产品方面的应用。
有益效果：(1)本发明通过利用枯草芽孢杆菌宿主特性，可以同时利用葡萄糖和L-苹果酸钠天然双碳源生长，并利用L-苹果酸钠分支代谢途径，实现N-乙酰神经氨酸前体物质磷酸烯醇式丙酮酸的高效、充足供给，提高N-乙酰神经氨酸合成。
(2)本发明进一步通过以组成型强启动子P43过表达磷酸烯醇式丙酮酸羧激酶编码基因pckA，强化L-苹果酸钠向磷酸烯醇式丙酮酸代谢流强度，使得L-苹果酸钠更高效转化为磷酸烯醇式丙酮酸，提高N-乙酰神经氨酸合成效率。
(3)本发明提供的重组枯草芽孢杆菌可实现N-乙酰神经氨酸在胞外高效积累，其含量可达到1.65g/L，为进一步通过代谢工程，改造枯草芽孢杆菌高效生产N-乙酰神经氨酸奠定了基础。本发明提供的重组枯草芽孢杆菌构建方法简单，便于使用，具有很好地应用前景。
具体实施方式
磷酸烯醇式丙酮酸羧激酶的氨基酸序列如SEQ ID NO:1所示；
6-磷酸葡糖酸磷酸酶的氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示；
谷氨酰胺-果糖-6-磷酸转氨酶的原始核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示；
替换谷氨酰胺-果糖-6-磷酸转氨酶的P43启动子的核苷酸序列如SEQ ID NO.4所示；
N-乙酰氨基葡萄糖异构酶的氨基酸序列如SEQ ID NO.5所示；
N-乙酰神经氨酸合酶的氨基酸序列如SEQ ID NO.6所示。
重组枯草芽孢杆菌种子培养及发酵：
种子培养基(g/L)：胰蛋白胨10，酵母粉5，NaCl 10。
发酵培养基(g/L)：葡萄糖60，L-苹果酸钠10，胰蛋白胨10，酵母粉5，NaCl 10。
培养条件：将37℃、200rpm下培养16h的种子以15％的接种量转入发酵培养基，于37℃、200rpm条件下培养45h。
N-乙酰神经氨酸的测定方法：
高效液相色谱(HPLC)检测法：Agilent 1200，DAD检测器，195nm，HPX-87H柱(300×7.8mm，5μm)，流动相：10mM稀硫酸，流速0.50mL/min，柱温60℃，进样体积为10μL。
实施例1宿主细胞构建
1)构建重组整合片段
通过融合PCR，将氨基酸序列为SEQ ID NO:2的磷酸烯醇式丙酮酸羧激酶的编码基因yqaB克隆片段、重组同源臂，以及Spectinomycin抗性基因和P43启动子基因融合；
通过融合PCR，将chloromycetin抗性和碱基序列为SEQ ID NO:4的启动子P43片段、谷氨酰胺-果糖-6-磷酸转氨酶基因glms重组同源臂融合；
2)构建重组质粒
克隆氨基酸序列为SEQ ID NO:5的N-乙酰氨基葡萄糖异构酶的编码基因AGE，以及氨基酸序列为SEQ ID NO:6的N-乙酰神经氨酸合酶的编码基因NeuB，连接到重组表达质粒pP43NMK上；
3)构建产N-乙酰神经氨酸重组枯草芽孢杆菌
将上述步骤1)中磷酸烯醇式丙酮酸羧激酶的编码基因yqaB重组片段转化枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis 168 ΔnagP ΔnagP ΔgamP ΔgamA ΔnagA ΔnagB Δ1dhΔpta ΔptsG::lox72；Δctc::p43-Gna1)，重组到基因组上，获得重组枯草芽孢杆菌工程菌，命名为B6CG1；继续将上述步骤1)中谷氨酰胺-果糖-6-磷酸转氨酶基因glms启动子替换为P43，命名为B6CG2；而后将上述步骤2)中重组质粒转化到B6CG2菌株中，得到产N-乙酰神经氨酸重组枯草芽孢杆菌Bacillus subtilis 168ΔnagPΔnagPΔgamPΔgamAΔnagAΔnagBΔ1dhΔptaΔptsG::lox72；Δctc::p43-Gna1；ΔspsC::p43-yqaB；Δglms::p43-glms,pP43NMK-AGE-NeuB。
实施例2重组质粒的构建
根据NCBI上公布的磷酸烯醇式丙酮酸羧激酶基因pckA设计上游同源臂引物：pckA-1F：5’-GTCAATGCGGACTGGTTTGTTATTTTCATCG-3’，pckA-1R：5’-TCCTGTGTGAAATTGTTATCCGCTCATGAAACCTTCCTTTATCGTTTTTTGTGTTTTGC-3’；设计下游同源臂引物：pckA-2F：5’-TAGGTAAGAGAGGAATGTACACATGAACTCAGTTGATTTGACCGCTGATTTACAAGCC-3’，pckA-2R：5’-CCGCTCAAAAAATGGTACATCGCCTGC-3’；将P43启动子插入P7S6质粒(Yan,X.,Yu,H.J.,Hong,Q.&Li,S.P.Cre/lox system and PCR-based genome engineering in Bacillussubtilis.Applied and Environmental Microbiology 74,5556-5562,doi:10.1128/aem.01156-08(2008))构成P7SP43质粒，根据P7SP43质粒序列，设计spectinomycin抗性及P43启动子扩增引物：SpcP43-F:5’-ACACAAAAAACGATAAAGGAAGGTTTCATGAGCGGATAACAATTTCACACAGGAAACAG-3’，SpcP43-R:5’-AGCGGTCAAATCAACTGAGTTCATGTGTACATTCCTCTCTTACCTATAATGGTACCGC-3’。通过融合PCR，将以上3段基因(克隆磷酸烯醇式丙酮酸羧激酶编码基因pckA两侧同源臂基因，Spectinomycin抗性基因片段和P43启动子基因片段)融合成重组整合片段。
实施例3重组枯草芽孢杆菌的构建
将按照实施例2的方式构建好的重组整合片段转化至按照实施例1的步骤构建的枯草芽孢杆菌宿主细胞中(Bacillus subtilis 168ΔnagPΔnagPΔgamPΔgamAΔnagAΔnagBΔ1dhΔptaΔptsG::lox72；Δctc::p43-Gna1；ΔspsC::p43-yqaB；Δglms::p43-glms,pP43NMK-AGE-NeuB)。采用SpcP43-F及SpcP43-R引物挑选转化子进行菌落PCR，出现1499bp条带，验证重组枯草芽孢杆菌构建成功，命名为B6CG3。
实施例4宿主菌株发酵生产N-乙酰神经氨酸
将37℃、200rpm下培养10h的种子以15％的接种量转入发酵培养基，于37℃、200rpm条件下培养45h。最终发酵上清液中N-乙酰神经氨酸含量达到1.15g/L。过表达大肠杆菌来源的6-磷酸葡糖酸磷酸酶基因yqaB，枯草芽孢杆菌来源谷氨酰胺-果糖-6-磷酸转氨酶基因glms，N-乙酰氨基葡萄糖异构酶基因AGE，N-乙酰神经氨酸合酶基因NeuB，实现了N-乙酰神经氨酸在重组枯草芽孢杆菌胞外的积累。
实施例5重组菌株发酵生产N-乙酰神经氨酸
将37℃、200rpm下培养10h的重组菌株种子液以15％的接种量转入发酵培养基，于37℃、200rpm条件下培养45h，最终发酵上清液中N-乙酰神经氨酸含量达到1.65g/L。以强启动子P43过表达磷酸烯醇式丙酮酸羧激酶基因pckA，通过葡萄糖、L-苹果酸钠天然双碳源发酵，实现了N-乙酰神经氨酸高产重组工程菌的构建，较原始菌株产量1.15g/L，提高了43.5％。
虽然本发明已以较佳实施例公开如上，但其并非用以限定本发明，任何熟悉此技术的人，在不脱离本发明的精神和范围内，都可做各种的改动与修饰，因此本发明的保护范围应该以权利要求书所界定的为准。
SEQUENCE LISTING
<110> 江南大学
<120> 一种利用天然双碳源高产N-乙酰神经氨酸的重组菌
<160> 12
<170> PatentIn version 3.3
<210> 1
<211> 527
<212> PRT
<213> 人工序列
<400> 1
Met Asn Ser Val Asp Leu Thr Ala Asp Leu Gln Ala Leu Leu Thr Cys
1 5 10 15
Pro Asn Val Arg His Asn Leu Ser Ala Ala Gln Leu Thr Glu Lys Val
20 25 30
Leu Ser Arg Asn Glu Gly Ile Leu Thr Ser Thr Gly Ala Val Arg Ala
35 40 45
Thr Thr Gly Ala Tyr Thr Gly Arg Ser Pro Lys Asp Lys Phe Ile Val
50 55 60
Glu Glu Glu Ser Thr Lys Asn Lys Ile Asp Trp Gly Pro Val Asn Gln
65 70 75 80
Pro Ile Ser Glu Glu Ala Phe Glu Arg Leu Tyr Thr Lys Val Val Ser
85 90 95
Tyr Leu Lys Glu Arg Asp Glu Leu Phe Val Phe Glu Gly Phe Ala Gly
100 105 110
Ala Asp Glu Lys Tyr Arg Leu Pro Ile Thr Val Val Asn Glu Phe Ala
115 120 125
Trp His Asn Leu Phe Ala Arg Gln Leu Phe Ile Arg Pro Glu Gly Asn
130 135 140
Asp Lys Lys Thr Val Glu Gln Pro Phe Thr Ile Leu Ser Ala Pro His
145 150 155 160
Phe Lys Ala Asp Pro Lys Thr Asp Gly Thr His Ser Glu Thr Phe Ile
165 170 175
Ile Val Ser Phe Glu Lys Arg Thr Ile Leu Ile Gly Gly Thr Glu Tyr
180 185 190
Ala Gly Glu Met Lys Lys Ser Ile Phe Ser Ile Met Asn Phe Leu Leu
195 200 205
Pro Glu Arg Asp Ile Leu Ser Met His Cys Ser Ala Asn Val Gly Glu
210 215 220
Lys Gly Asp Val Ala Leu Phe Phe Gly Leu Ser Gly Thr Gly Lys Thr
225 230 235 240
Thr Leu Ser Ala Asp Ala Asp Arg Lys Leu Ile Gly Asp Asp Glu His
245 250 255
Gly Trp Ser Asp Thr Gly Val Phe Asn Ile Glu Gly Gly Cys Tyr Ala
260 265 270
Lys Cys Ile His Leu Ser Glu Glu Lys Glu Pro Gln Ile Phe Asn Ala
275 280 285
Ile Arg Phe Gly Ser Val Leu Glu Asn Val Val Val Asp Glu Asp Thr
290 295 300
Arg Glu Ala Asn Tyr Asp Asp Ser Phe Tyr Thr Glu Asn Thr Arg Ala
305 310 315 320
Ala Tyr Pro Ile His Met Ile Asn Asn Ile Val Thr Pro Ser Met Ala
325 330 335
Gly His Pro Ser Ala Ile Val Phe Leu Thr Ala Asp Ala Phe Gly Val
340 345 350
Leu Pro Pro Ile Ser Lys Leu Thr Lys Glu Gln Ala Met Tyr His Phe
355 360 365
Leu Ser Gly Tyr Thr Ser Lys Leu Ala Gly Thr Glu Arg Gly Val Thr
370 375 380
Ser Pro Glu Thr Thr Phe Ser Thr Cys Phe Gly Ser Pro Phe Leu Pro
385 390 395 400
Leu Pro Ala His Val Tyr Ala Glu Met Leu Gly Lys Lys Ile Asp Glu
405 410 415
His Gly Ala Asp Val Phe Leu Val Asn Thr Gly Trp Thr Gly Gly Gly
420 425 430
Tyr Gly Thr Gly Glu Arg Met Lys Leu Ser Tyr Thr Arg Ala Met Val
435 440 445
Lys Ala Ala Ile Glu Gly Lys Leu Glu Asp Ala Glu Met Ile Thr Asp
450 455 460
Asp Ile Phe Gly Leu His Ile Pro Ala His Val Pro Gly Val Pro Asp
465 470 475 480
His Ile Leu Gln Pro Glu Asn Thr Trp Thr Asn Lys Glu Glu Tyr Lys
485 490 495
Glu Lys Ala Val Tyr Leu Ala Asn Glu Phe Lys Glu Asn Phe Lys Lys
500 505 510
Phe Ala His Thr Asp Ala Ile Ala Gln Ala Gly Gly Pro Leu Val
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<211> 188
<212> PRT
<213> 人工序列
<400> 2
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1 5 10 15
Leu Asp Thr Glu Pro Thr His Arg Lys Ala Trp Arg Glu Val Leu Gly
20 25 30
His Tyr Gly Leu Gln Tyr Asp Ile Gln Ala Met Ile Ala Leu Asn Gly
35 40 45
Ser Pro Thr Trp Arg Ile Ala Gln Ala Ile Ile Glu Leu Asn Gln Ala
50 55 60
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65 70 75 80
Ser Met Leu Leu Asp Ser Val Glu Pro Leu Pro Leu Val Asp Val Val
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100 105 110
Ser Ala Ile Ala Glu Ala Leu Leu Ala His Leu Gly Leu Arg His Tyr
115 120 125
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130 135 140
Pro Asp Thr Phe Leu Leu Cys Ala Gln Arg Met Gly Val Gln Pro Thr
145 150 155 160
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165 170 175
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<213> 人工序列
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cgaagtctat tatcagagag tgaacaagac aagcgaggtt tacataagat aattgtgaga 60
catacggcaa agttgcttaa aaaacaattg accgtttatg ccacatgttg taaaatcaag 120
cttgtcttgt tcttattttc tcaataggaa aagaagacgg gattattgct ttacctataa 180
ttatagcgcc cgaactaagc gcccggaaaa aggcttagtt gacgaggatg gaggttatcg 240
aattttcggc ggatgcctcc cggctgagtg tgcagatcac agccgtaagg atttcttcaa 300
accaaggggg tgactccttg aacaaagaga aatcacatga tcttccaaaa aacatgtagg 360
aggggacgat tgaaagtccc cttgaaattt gactttcttc gtctcctttt acaatcttag 420
gaggaagaaa aat 433
<210> 4
<211> 300
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 4
tgataggtgg tatgttttcg cttgaacttt taaatacagc cattgaacat acggttgatt 60
taataactga caaacatcac cctcttgcta aagcggccaa ggacgccgcc gccggggctg 120
tttgcgttct tgccgtgatt tcgtgtacca ttggtttact tatttttttg ccaaggctgt 180
aatggctgaa aattcttaca tttattttac atttttagaa atgggcgtga aaaaaagcgc 240
gcgattatgt aaaatataaa gtgatagcgg taccattata ggtaagagag gaatgtacac 300
<210> 5
<211> 388
<212> PRT
<213> 人工序列
<400> 5
Met Gly Lys Asn Leu Gln Ala Leu Ala Gln Leu Tyr Lys Asn Ala Leu
1 5 10 15
Leu Asn Asp Val Leu Pro Phe Trp Glu Asn His Ser Leu Asp Ser Glu
20 25 30
Gly Gly Tyr Phe Thr Cys Leu Asp Arg Gln Gly Lys Val Tyr Asp Thr
35 40 45
Asp Lys Phe Ile Trp Leu Gln Asn Arg Gln Val Trp Thr Phe Ser Met
50 55 60
Leu Cys Asn Gln Leu Glu Lys Arg Glu Asn Trp Leu Lys Ile Ala Arg
65 70 75 80
Asn Gly Ala Lys Phe Leu Ala Gln His Gly Arg Asp Asp Glu Gly Asn
85 90 95
Trp Tyr Phe Ala Leu Thr Arg Gly Gly Glu Pro Leu Val Gln Pro Tyr
100 105 110
Asn Ile Phe Ser Asp Cys Phe Ala Ala Met Ala Phe Ser Gln Tyr Ala
115 120 125
Leu Ala Ser Gly Glu Glu Trp Ala Lys Asp Val Ala Met Gln Ala Tyr
130 135 140
Asn Asn Val Leu Arg Arg Lys Asp Asn Pro Lys Gly Lys Tyr Thr Lys
145 150 155 160
Thr Tyr Pro Gly Thr Arg Pro Met Lys Ala Leu Ala Val Pro Met Ile
165 170 175
Leu Ala Asn Leu Thr Leu Glu Met Glu Trp Leu Leu Pro Gln Glu Thr
180 185 190
Leu Glu Asn Val Leu Ala Ala Thr Val Gln Glu Val Met Gly Asp Phe
195 200 205
Leu Asp Gln Glu Gln Gly Leu Met Tyr Glu Asn Val Ala Pro Asp Gly
210 215 220
Ser His Ile Asp Cys Phe Glu Gly Arg Leu Ile Asn Pro Gly His Gly
225 230 235 240
Ile Glu Ala Met Trp Phe Ile Met Asp Ile Ala Arg Arg Lys Asn Asp
245 250 255
Ser Lys Thr Ile Asn Gln Ala Val Asp Val Val Leu Asn Ile Leu Asn
260 265 270
Phe Ala Trp Asp Asn Glu Tyr Gly Gly Leu Tyr Tyr Phe Met Asp Ala
275 280 285
Ala Gly His Pro Pro Gln Gln Leu Glu Trp Asp Gln Lys Leu Trp Trp
290 295 300
Val His Leu Glu Ser Leu Val Ala Leu Ala Met Gly Tyr Arg Leu Thr
305 310 315 320
Gly Arg Asp Ala Cys Trp Ala Trp Tyr Gln Lys Met His Asp Tyr Ser
325 330 335
Trp Gln His Phe Ala Asp Pro Glu Tyr Gly Glu Trp Phe Gly Tyr Leu
340 345 350
Asn Arg Arg Gly Glu Val Leu Leu Asn Leu Lys Gly Gly Lys Trp Lys
355 360 365
Gly Cys Phe His Val Pro Arg Ala Met Tyr Leu Cys Trp Gln Gln Phe
370 375 380
Glu Ala Leu Ser
385
<210> 6
<211> 346
<212> PRT
<213> 人工序列
<400> 6
Met Ser Asn Ile Tyr Ile Val Ala Glu Ile Gly Cys Asn His Asn Gly
1 5 10 15
Ser Val Asp Ile Ala Arg Glu Met Ile Leu Lys Ala Lys Glu Ala Gly
20 25 30
Val Asn Ala Val Lys Phe Gln Thr Phe Lys Ala Asp Lys Leu Ile Ser
35 40 45
Ala Ile Ala Pro Lys Ala Glu Tyr Gln Ile Lys Asn Thr Gly Glu Leu
50 55 60
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65 70 75 80
Tyr Leu His Leu Met Glu Tyr Ala Val Ser Leu Asn Leu Asp Val Phe
85 90 95
Ser Thr Pro Phe Asp Glu Asp Ser Ile Asp Phe Leu Ala Ser Leu Lys
100 105 110
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115 120 125
Leu Glu Lys Ile Ala Lys Leu Pro Ile Pro Asp Lys Lys Ile Ile Ile
130 135 140
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145 150 155 160
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165 170 175
Asn Thr Glu Tyr Pro Thr Pro Phe Glu Asp Val Asn Leu Asn Ala Ile
180 185 190
Asn Asp Leu Lys Lys His Phe Pro Lys Asn Asn Ile Gly Phe Ser Asp
195 200 205
His Ser Ser Gly Phe Tyr Ala Ala Ile Ala Ala Val Pro Tyr Gly Ile
210 215 220
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225 230 235 240
Asp His Leu Ala Ser Ile Glu Pro Asp Glu Leu Lys His Leu Cys Ile
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260 265 270
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275 280 285
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290 295 300
Thr Thr Lys Arg Pro Gly Asn Gly Ile Ser Pro Met Glu Trp Tyr Asn
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Leu Leu Gly Lys Ile Ala Glu Gln Asp Phe Ile Pro Asp Glu Leu Ile
325 330 335
Ile His Ser Glu Phe Lys Asn Gln Gly Glu
340 345
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<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 7
gtcaatgcgg actggtttgt tattttcatc g 31
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<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 8
tcctgtgtga aattgttatc cgctcatgaa accttccttt atcgtttttt gtgttttgc 59
<210> 9
<211> 58
<212> DNA
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<400> 9
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<212> DNA
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<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 12
agcggtcaaa tcaactgagt tcatgtgtac attcctctct tacctataat ggtaccgc 58

Claims (5)

1.一种重组枯草芽孢杆菌，其特征在于，利用天然双碳源生产N-乙酰神经氨酸；所述天然双碳源为葡萄糖和L-苹果酸，在其基因组中以组成型强启动子P43过表达磷酸烯醇式丙酮酸羧激酶基因pckA，所述重组枯草芽孢杆菌以枯草芽孢杆菌Bacillus subtilis168ΔnagPΔnagPΔgamPΔgamAΔnagAΔnagBΔ1dhΔptaΔptsG::lox72；Δctc::p43-Gna1为出发菌株，在基因组上将大肠杆菌来源的6-磷酸葡糖酸磷酸酶基因yqaB基因进行整合表达，并用组成型强启动子P43替换插入枯草芽孢杆菌谷氨酰胺-果糖-6-磷酸转氨酶基因glms原始启动子，所述磷酸烯醇式丙酮酸羧激酶氨基酸序列如SEQ ID NO:1所示；所述6-磷酸葡糖酸磷酸酶的氨基酸序列为SEQ ID NO.2，替换谷氨酰胺-果糖-6-磷酸转氨酶的P43启动子的核苷酸序列为SEQ ID NO.4；还以pP43NMK表达N-乙酰氨基葡萄糖异构酶的编码基因AGE和N-乙酰神经氨酸合酶的编码基因NeuB。
2.构建权利要求1所述重组枯草芽孢杆菌的方法，其特征在于，包括如下步骤：
1)将磷酸烯醇式丙酮酸羧激酶编码基因pckA两侧同源臂基因、标记基因和P43启动子基因序列融合；
2)将上述重组整合片段转化至枯草芽孢杆菌Bacillus subtilis168ΔnagPΔnagPΔgamPΔgamAΔnagAΔnagBΔ1dhΔptaΔptsG::lox72；Δctc::p43-Gna1；ΔspsC::p43-yqaB；Δglms::p43-glms,pP43NMK-AGE-NeuB中。
3.一种生产N-乙酰神经氨酸的方法，其特征在于，应用权利要求1所述的重组枯草芽孢杆菌进行发酵。
4.根据权利要求3所述的方法，其特征在于，向含有葡萄糖和L-苹果酸的培养基中接种所述重组枯草芽孢杆菌，于35～38℃下发酵30～50h。
5.权利要求1所述的重组枯草芽孢杆菌在生产或制备含N-乙酰神经氨酸的产品方面的应用。
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