CN106929462B

CN106929462B - 一种积累n-乙酰神经氨酸重组枯草芽孢杆菌及其应用

Info

Publication number: CN106929462B
Application number: CN201710278055.2A
Authority: CN
Inventors: 陈坚; 堵国成; 刘延峰; 张晓龙
Original assignee: Jiangnan University
Current assignee: Jiangnan University
Priority date: 2017-04-25
Filing date: 2017-04-25
Publication date: 2020-11-06
Anticipated expiration: 2037-04-25
Also published as: CN106929462A

Abstract

本发明公开了一种积累N‑乙酰神经氨酸重组枯草芽孢杆菌及其应用，属于遗传工程领域。本发明是以枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis 168ΔnagPΔnagPΔgamPΔgamAΔnagAΔnagBΔ1dhΔpta::lox72)作为表达宿主，通过过量共表达来源于酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae S288C)的氨基葡萄糖乙酰化酶编码基因GNA1，来源于念珠藻(Anabaena sp.CH1)的N‑乙酰氨基葡萄糖异构酶(AGE)和来源于大肠杆菌(Escherichia coli K1)的N‑乙酰神经氨酸合酶(NeuB)，得到了积累N‑乙酰神经氨酸枯草芽孢杆菌基因工程菌，N‑乙酰神经氨酸产量达到190mg/L，为进一步代谢工程改造枯草芽孢杆菌生产N‑乙酰神经氨酸奠定了基础。

Description

一种积累N-乙酰神经氨酸重组枯草芽孢杆菌及其应用

技术领域

本发明涉及一种积累N-乙酰神经氨酸重组枯草芽孢杆菌及其应用，属于遗传工程领域。

背景技术

N-乙酰神经氨酸是生物体内的一种单糖，广泛存在于微生物以及哺乳动物体内。在人体中，N-乙酰神经氨酸是细胞信息传递的第一接触位点，参与细胞识别、信号转导等多个生理过程。因此，N-乙酰神经氨酸被广泛应用于调节IgG抗炎活性，增强婴儿免疫力，促进婴儿大脑发育。目前，N-乙酰神经氨酸主要采用从酪蛋白、燕窝等含量相对丰富的天然材料中提取，得到的产品容易引起过敏反应，或是通过严苛条件的化学法合成，高温、高压工艺复杂，中间产物等难以分离，而且对环境污染严重。

枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)是一种被广泛用作食品酶制剂及重要营养化学品的生产宿主，其产品被FDA认证为“generally regarded as safe”(GRAS)安全级别。因此，运用代谢工程手段构建重组枯草芽孢杆菌是生产食品安全级N-乙酰神经氨酸的有效途径。然而，枯草芽孢杆菌中氨糖代谢途径调控严密，并不会形成氨糖的积累，而且没有N-乙酰神经氨酸关键基因。如何改造枯草芽孢杆菌中氨糖代谢途径，供需前体物质，以及建立N-乙酰神经氨酸代谢途径是一个值得深入探讨的问题。

目前在枯草中构建的N-乙酰神经氨酸代谢途径主要通过UDP-N-乙酰氨基葡萄糖为前体，该代谢流从底物葡萄糖到N-乙酰氨基葡萄糖前体物质UDP-N-乙酰氨基葡萄糖需要加强氨基葡萄糖-果糖-6-磷酸转氨酶(glmS)、磷酸氨基葡萄糖异构酶(glmM)、UDP-N-氨基葡萄糖焦磷酸化酶(gcaD)三个酶的作用，易导致代谢流强度不够，因此寻找新的、高效的合成代谢途径十分必要。

发明内容

为解决上述技术问题，本发明的第一个目的是构建一种积累N-乙酰神经氨酸的重组枯草芽孢杆菌。

本发明的重组枯草芽孢杆菌，表达外源的氨基葡萄糖乙酰化酶编码基因GNA1，N-乙酰氨基葡萄糖异构酶编码基因AGE，N-乙酰神经氨酸合酶编码基因NeuB。

在本发明的一种实施方式中，所述氨基葡萄糖乙酰化酶编码基因重组于基因组上整合表达，N-乙酰氨基葡萄糖异构酶编码基因、N-乙酰神经氨酸合酶编码基因重组于表达质粒上游离表达。

在本发明的一种实施方式中，所述氨基葡萄糖乙酰化酶编码基因表达的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示。

在本发明的一种实施方式中，所述N-乙酰氨基葡萄糖异构酶基因表达的氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示。

在本发明的一种实施方式中，所述N-乙酰神经氨酸合酶基因表达的氨基酸序列如SEQ ID NO.3所示。

本发明的第二个目的是提供一种上述重组枯草芽孢杆菌的构建方法，包括如下步骤：

1)构建重组片段

通过融合PCR，将酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae S288C)的氨基葡萄糖乙酰化酶编码基因GNA1克隆片段，与重组同源臂以及zeocin抗性基因融合；

2)构建重组质粒

克隆念珠藻(Anabaena sp.CH1)的N-乙酰氨基葡萄糖异构酶编码基因，以及来源于大肠杆菌(Escherichia coli K1)的N-乙酰神经氨酸合酶编码基因，连接到重组表达质粒pP43NMK(Zhang XZ,Cui ZL,Hong Q,Li SP.High-level expression and secretion ofmethyl parathion hydrolase in Bacillus subtilis WB800.Applied andenvironmental microbiology.2005；71(7):4101-3.)上；

3)构建产N-乙酰神经氨酸重组枯草芽孢杆菌

将上述步骤1)中重组片段转化枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis 168ΔnagPΔnagPΔgamPΔgamAΔnagAΔnagBΔ1dhΔpta::lox72，LiuY,ZhuY,Li J,Shin H-D,ChenRR,Du G,Liu L,Chen J.Modular pathway engineering ofBacillus subtilis forimproved N-acetylglucosamine production.Metabolic engineering,2014.23:42-52)，重组到基因组上，获得重组枯草芽孢杆菌工程菌，命名为B6C；而后将上述步骤2)中重组质粒转化到B6C菌株中，得到产N-乙酰神经氨酸重组枯草芽孢杆菌，命名为B6CAN。

本发明另一个目的是提供一种上述重组枯草芽孢杆菌在营养保健品方面的应用。

在本发明的一种实施方式中，所述枯草芽孢杆菌用于发酵生产N-乙酰神经氨酸。

在本发明的一种实施方式中，所述枯草芽孢杆菌用于发酵生产N-乙酰神经氨酸是将35-38℃、180-220rpm下培养10-20h的重组枯草芽孢杆菌以10％-20％的接种量转入发酵培养基，于35-38℃、180-220rpm条件下发酵30-50h。

本发明的有益效果

本发明构建了利用N-乙酰氨基葡萄糖异构酶编码基因AGE以及N-乙酰神经氨酸合酶编码基因NeuB合成N-乙酰神经氨酸的新途径，利用枯草芽孢杆菌自有的代谢途径，从底物葡萄糖到N-乙酰神经氨酸的前体物质N-乙酰氨基葡萄糖仅需要强化氨基葡萄糖-果糖-6-磷酸转氨酶(glmS)和氨基葡萄糖乙酰化酶(GNA1)两个酶的作用即可，有助于强化合成代谢流。

本发明提供的重组枯草芽孢杆菌可实现N-乙酰神经氨酸在胞外积累，其浓度可达到190mg/L，为进一步代谢工程改造枯草芽孢杆菌生产N-乙酰神经氨酸奠定了基础。本发明提供的重组枯草芽孢杆菌构建方法简单，便于使用，具有很好的应用前景。

附图说明

图1是重组枯草芽孢杆菌B6CAN中葡萄糖到N-乙酰神经氨酸的合成改造途径。

具体实施方式

重组枯草芽孢杆菌种子培养及发酵：

种子培养基(g/L)：胰蛋白胨10，酵母粉5，NaCl 10。

发酵培养基(g/L)：葡萄糖60，胰蛋白胨10，酵母粉5，尿素6，NaCl 10。

培养条件：将37℃、200rpm下培养10h的种子以10％的接种量转入发酵培养基，于37℃、200rpm条件下培养35h。

N-乙酰神经氨酸的测定方法：

高效液相色谱(HPLC)检测法：Agilent 1200，UV检测器，HPX-87H柱(300×7.8mm，5μm)，流动相：5mM稀硫酸，流速0.50mL/min，柱温60℃，进样体积为10μL。

实施例1重组片段的构建

根据质粒p43NMK-Cegna1(本实验前期构建)序列信息，设计序列分别如SEQ IDNO.4和SEQ ID NO.5的引物GNA1-F：5’-AACGACAAGAGGATGGTGCTGAATTGATAGGTGGTATGTTTTCGCTTGAAC-3’，GNA1-R：5’-CCTGTGTGAAATTGTTATCCGCTCTTAAAAGCGCTGGGTCATAAAATTACAG-3’，使用上述引物以质粒pP43NMK-Cegna1为模板，扩增含有P43启动子的氨基葡萄糖乙酰化酶编码基因GNA1；根据枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis 168)基因组为模板，根据NCBI上公布的50S核糖体蛋白L25基因(CTC，GenBank：NC_000964.3)，设计两侧同源臂引物，序列分别如SEQ ID NO.6和SEQ ID NO.7左侧同源臂引物：ctc-1F:5’-ACGGGGAAGTCCAAATTAATATCG-3’，ctc-1R:5’-TTCAAGCGAAAACATACCACCTATCAATTCAGCACCATCCTCTTGTCGTT-3’，序列分别为SEQ ID NO.8和SEQ ID NO.9的右侧同源臂引物：ctc-2F:5’-GTCGTGACTGGGAAAACCCTGGCGATGCTCAGCCTGAAGGTGAAAAC-3’，ctc-2R:5’-ATGTGTGATATTCGTGGTAATGCGG-3’，使用上述引物从枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis168)基因组中扩增50S亚基核糖体蛋白L25基因ctc两侧同源臂基因序列；以P7Z6质粒(Yan,X.,Yu,H.J.,Hong,Q.&Li,S.P.Cre/lox system and PCR-based genome engineering inBacillus subtilis.Applied and Environmental Microbiology 74,5556-5562,doi:10.1128/aem.01156-08(2008).)为模板，设计序列分别为SEQ ID NO.10和SEQ IDNO.11Zeocin抗性基因扩增引物：zeocin-F:5’-CTGTAATTTTATGACCCAGCGCTTTTAAGAGCGGATAACAATTTCACACAGG-3’，zeocin-R:5’-GTTTTCACCTTCAGGCTGAGCATCGCCAGGGTTTTCCCAGTCACGAC-3’。4段扩增片段通过融合PCR技术融合，获得重组片段CPZC。

实施例2重组质粒的构建

根据NCBI上公布的念珠藻(Anabaena sp.CH1，GenBank：DQ661858.1)中的N-乙酰氨基葡萄糖异构酶基因AGE，通过枯草芽孢杆菌偏好密码子优化后，基因合成，设计序列分别为SEQ ID NO.12和SEQ ID NO.13的引物：AGE-F:5’-ATAAAGTGATAGCGGTACCATTATAGGTAAGAGAGGAATGTACACATGGGCAAAAACTACAAGCTCTG-3’,AGE-R:5’-ACGATGTAGATGTTAGACATGTGTACATTCCTCTCTTACCCCGGGTTATGAAAGTGCTTCAAACTGTTGCC-3’，使用上述引物，以合成N-乙酰氨基葡萄糖异构酶基因为模板扩增AGE基因片段；根据NCBI上公布的大肠杆菌(Escherichiacoli K1，GenBank：U05248.1)的N-乙酰神经氨酸合酶基因NeuB，通过枯草芽孢杆菌偏好密码子优化后，基因合成，设计序列分别为SEQ ID NO.14和SEQ ID NO.15的引物：NeuB-F:5’-ATGTCTAACATCTACATCGTGGCAGAAAT-3’，NeuB-R:5’-CCGCCCTTGGCGGCATCCGCGAAGGCCTTTATTCTCCCTGGTTTTTAAATTCGC-3’，以合成N-乙酰神经氨酸合酶基因为模板扩增NeuB基因片段；质粒pP43NMK经Kpn I和Stu I双酶切后与以上两段扩增基因片段通过GibsonAssemblyClonging Kit(New England Biolabs)，构建重组质粒，双酶切验证及测序，确认重组质粒pP43NMK-AN构建成功。

实施例3重组CPZC片段枯草芽孢杆菌的构建

将构建好的重组片段CPZC转化枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis 168ΔnagPΔnagPΔgamPΔgamAΔnagAΔnagBΔ1dhΔpta::lox72)。采用GNA1-F及GNA1-R引物挑选转化子进行菌落PCR，出现864bp条带，验证重组枯草芽孢杆菌B6C构建成功。

实施例4重组pP43NMK-AN质粒枯草芽孢杆菌的构建

将构建好的pP43NMK-AN质粒转化枯草芽孢杆菌B6C。采用NeuB-F及NeuB-R引物挑选转化子进行菌落PCR，出现1069bp条带，验证重组枯草芽孢杆菌B6CAN构建成功。重组枯草芽孢杆菌B6CAN中葡萄糖到N-乙酰神经氨酸的合成改造途径如图1所示。

实施例5发酵生产N-乙酰神经氨酸

将37℃、200rpm下培养10h的种子以15％的接种量转入发酵培养基，于37℃、200rpm条件下培养35h。最终发酵上清液中N-乙酰神经氨酸含量达到190mg/L。过量表达氨基葡萄糖乙酰化酶编码基因GNA1，N-乙酰氨基葡萄糖异构酶基因AGE，N-乙酰神经氨酸合酶基因NeuB，实现了N-乙酰神经氨酸在重组枯草芽孢杆菌胞外的积累。

对照实施例1整合表达AGE、NeuB积累N-乙酰神经氨酸

根据pP3NMK-AN质粒序列信息及pAX01质粒序列信息，设计序列分别为SEQ IDNO.16和SEQ ID NO.17的AGE和NeuB基因扩增引物：AN-F:5’-AAAATCAAAGGGGGAAATGGGATCCATGGGCAAAAACTTACAAGCTCTGG-3’，AN-R:5’-CGGCCGCCCGCGGGAGCTCGGATCCTTATTCTCCCTGGTTTTTAAATTCGCTATG-3’，使用上述引物，以pP43NMK-AN质粒为模板，扩增AGE和NeuB基因；将扩增所得基因片段与经过BamHI单酶切的pAX01质粒通过GibsonAssembly Clonging Kit(New England Biolabs)，构建整合型重组表达质粒pAX-AN，酶切、测序确定质粒构建成功。pAX-AN经pvu I线性化后，转化枯草芽孢杆菌B6C，将AGE和NeuB整合至枯草芽孢杆菌B6C基因组。菌落PCR验证AGE和NeuB基因整合成功。

将37℃、200rpm下培养10h的种子以15％的接种量转入发酵培养基，于37℃、200rpm条件下培养35h。最终发酵上清液中检测不到N-乙酰神经氨酸含量。

对照实施例2游离表达GNA1、AGE、NeuB积累N-乙酰神经氨酸

根据pP3NMK-AN质粒序列信息及氨基葡萄糖乙酰化酶编码基因GNA1基因序列，设计序列分别为SEQ ID NO.18和SEQ ID NO.19的GNA1基因重组构建引物：cz_GNA1-F:5’-TAAAAACCAGGGAGAATAAAGGCCTGTAAGAGAGGAATGTACACATGC-3’，cz_GNA1-R:5’-CTTGGCGGCATCCGCGAAGGCCTTTAAAAGCGCTGGGTCAT-3’，使用上述引物，扩增GNA1基因；将pP43NMK-AN质粒Eco147I单酶切后柱纯化回收；将线性化质粒与扩增GNA1基因由Vazyme的One StepCloning Kit重组构建，酶切、测序确定质粒构建成功。将构建成功质粒转化B6C菌，菌落PCR验证转化成功。

虽然本发明已以较佳实施例公开如上，但其并非用以限定本发明，任何熟悉此技术的人，在不脱离本发明的精神和范围内，都可做各种的改动和修饰，因此本发明的保护范围应该以权力要求书所界定的为准。

序列表

<110> 江南大学

<120> 一种积累N-乙酰神经氨酸重组枯草芽孢杆菌及其应用

<160> 19

<170> PatentIn version 3.3

<210> 1

<211> 159

<212> PRT

<213> 酿酒酵母（Saccharomyces cerevisiae S288C）

<400> 1

Met Ser Leu Pro Asp Gly Phe Tyr Ile Arg Arg Met Glu Glu Gly Asp

1 5 10 15

Leu Glu Gln Val Thr Glu Thr Leu Lys Val Leu Thr Thr Val Gly Thr

20 25 30

Ile Thr Pro Glu Ser Phe Ser Lys Leu Ile Lys Tyr Trp Asn Glu Ala

35 40 45

Thr Val Trp Asn Asp Asn Glu Asp Lys Lys Ile Met Gln Tyr Asn Pro

50 55 60

Met Val Ile Val Asp Lys Arg Thr Glu Thr Val Ala Ala Thr Gly Asn

65 70 75 80

Ile Ile Ile Glu Arg Lys Ile Ile His Glu Leu Gly Leu Cys Gly His

85 90 95

Ile Glu Asp Ile Ala Val Asn Ser Lys Tyr Gln Gly Gln Gly Leu Gly

100 105 110

Lys Leu Leu Ile Asp Gln Leu Val Thr Ile Gly Phe Asp Tyr Gly Cys

115 120 125

Tyr Lys Ile Ile Leu Asp Cys Asp Glu Lys Asn Val Lys Phe Tyr Glu

130 135 140

Lys Cys Gly Phe Ser Asn Ala Gly Val Glu Met Gln Ile Arg Lys

145 150 155

<210> 2

<211> 388

<212> PRT

<213> 念珠藻（Anabaena sp.CH1）

<400> 2

Met Gly Lys Asn Leu Gln Ala Leu Ala Gln Leu Tyr Lys Asn Ala Leu

1 5 10 15

Leu Asn Asp Val Leu Pro Phe Trp Glu Asn His Ser Leu Asp Ser Glu

20 25 30

Gly Gly Tyr Phe Thr Cys Leu Asp Arg Gln Gly Lys Val Tyr Asp Thr

35 40 45

Asp Lys Phe Ile Trp Leu Gln Asn Arg Gln Val Trp Thr Phe Ser Met

50 55 60

Leu Cys Asn Gln Leu Glu Lys Arg Glu Asn Trp Leu Lys Ile Ala Arg

65 70 75 80

Asn Gly Ala Lys Phe Leu Ala Gln His Gly Arg Asp Asp Glu Gly Asn

85 90 95

Trp Tyr Phe Ala Leu Thr Arg Gly Gly Glu Pro Leu Val Gln Pro Tyr

100 105 110

Asn Ile Phe Ser Asp Cys Phe Ala Ala Met Ala Phe Ser Gln Tyr Ala

115 120 125

Leu Ala Ser Gly Glu Glu Trp Ala Lys Asp Val Ala Met Gln Ala Tyr

130 135 140

Asn Asn Val Leu Arg Arg Lys Asp Asn Pro Lys Gly Lys Tyr Thr Lys

145 150 155 160

Thr Tyr Pro Gly Thr Arg Pro Met Lys Ala Leu Ala Val Pro Met Ile

165 170 175

Leu Ala Asn Leu Thr Leu Glu Met Glu Trp Leu Leu Pro Gln Glu Thr

180 185 190

Leu Glu Asn Val Leu Ala Ala Thr Val Gln Glu Val Met Gly Asp Phe

195 200 205

Leu Asp Gln Glu Gln Gly Leu Met Tyr Glu Asn Val Ala Pro Asp Gly

210 215 220

Ser His Ile Asp Cys Phe Glu Gly Arg Leu Ile Asn Pro Gly His Gly

225 230 235 240

Ile Glu Ala Met Trp Phe Ile Met Asp Ile Ala Arg Arg Lys Asn Asp

245 250 255

Ser Lys Thr Ile Asn Gln Ala Val Asp Val Val Leu Asn Ile Leu Asn

260 265 270

Phe Ala Trp Asp Asn Glu Tyr Gly Gly Leu Tyr Tyr Phe Met Asp Ala

275 280 285

Ala Gly His Pro Pro Gln Gln Leu Glu Trp Asp Gln Lys Leu Trp Trp

290 295 300

Val His Leu Glu Ser Leu Val Ala Leu Ala Met Gly Tyr Arg Leu Thr

305 310 315 320

Gly Arg Asp Ala Cys Trp Ala Trp Tyr Gln Lys Met His Asp Tyr Ser

325 330 335

Trp Gln His Phe Ala Asp Pro Glu Tyr Gly Glu Trp Phe Gly Tyr Leu

340 345 350

Asn Arg Arg Gly Glu Val Leu Leu Asn Leu Lys Gly Gly Lys Trp Lys

355 360 365

Gly Cys Phe His Val Pro Arg Ala Met Tyr Leu Cys Trp Gln Gln Phe

370 375 380

Glu Ala Leu Ser

385

<210> 3

<211> 346

<212> PRT

<213> 大肠杆菌（Escherichia coli K1）

<400> 3

Met Ser Asn Ile Tyr Ile Val Ala Glu Ile Gly Cys Asn His Asn Gly

1 5 10 15

Ser Val Asp Ile Ala Arg Glu Met Ile Leu Lys Ala Lys Glu Ala Gly

20 25 30

Val Asn Ala Val Lys Phe Gln Thr Phe Lys Ala Asp Lys Leu Ile Ser

35 40 45

Ala Ile Ala Pro Lys Ala Glu Tyr Gln Ile Lys Asn Thr Gly Glu Leu

50 55 60

Glu Ser Gln Leu Glu Met Thr Lys Lys Leu Glu Met Lys Tyr Asp Asp

65 70 75 80

Tyr Leu His Leu Met Glu Tyr Ala Val Ser Leu Asn Leu Asp Val Phe

85 90 95

Ser Thr Pro Phe Asp Glu Asp Ser Ile Asp Phe Leu Ala Ser Leu Lys

100 105 110

Gln Lys Ile Trp Lys Ile Pro Ser Gly Glu Leu Leu Asn Leu Pro Tyr

115 120 125

Leu Glu Lys Ile Ala Lys Leu Pro Ile Pro Asp Lys Lys Ile Ile Ile

130 135 140

Ser Thr Gly Met Ala Thr Ile Asp Glu Ile Lys Gln Ser Val Ser Ile

145 150 155 160

Phe Ile Asn Asn Lys Val Pro Val Gly Asn Ile Thr Ile Leu His Cys

165 170 175

Asn Thr Glu Tyr Pro Thr Pro Phe Glu Asp Val Asn Leu Asn Ala Ile

180 185 190

Asn Asp Leu Lys Lys His Phe Pro Lys Asn Asn Ile Gly Phe Ser Asp

195 200 205

His Ser Ser Gly Phe Tyr Ala Ala Ile Ala Ala Val Pro Tyr Gly Ile

210 215 220

Thr Phe Ile Glu Lys His Phe Thr Leu Asp Lys Ser Met Ser Gly Pro

225 230 235 240

Asp His Leu Ala Ser Ile Glu Pro Asp Glu Leu Lys His Leu Cys Ile

245 250 255

Gly Val Arg Cys Val Glu Lys Ser Leu Gly Ser Asn Ser Lys Val Val

260 265 270

Thr Ala Ser Glu Arg Lys Asn Lys Ile Val Ala Arg Lys Ser Ile Ile

275 280 285

Ala Lys Thr Glu Ile Lys Lys Gly Glu Val Phe Ser Glu Lys Asn Ile

290 295 300

Thr Thr Lys Arg Pro Gly Asn Gly Ile Ser Pro Met Glu Trp Tyr Asn

305 310 315 320

Leu Leu Gly Lys Ile Ala Glu Gln Asp Phe Ile Pro Asp Glu Leu Ile

325 330 335

Ile His Ser Glu Phe Lys Asn Gln Gly Glu

340 345

<210> 4

<211> 51

<212> DNA

<213> 人工合成

<400> 4

aacgacaaga ggatggtgct gaattgatag gtggtatgtt ttcgcttgaa c 51

<210> 5

<211> 52

<212> DNA

<213> 人工合成

<400> 5

cctgtgtgaa attgttatcc gctcttaaaa gcgctgggtc ataaaattac ag 52

<210> 6

<211> 24

<212> DNA

<213> 人工合成

<400> 6

acggggaagt ccaaattaat atcg 24

<210> 7

<211> 50

<212> DNA

<213> 人工合成

<400> 7

ttcaagcgaa aacataccac ctatcaattc agcaccatcc tcttgtcgtt 50

<210> 8

<211> 47

<212> DNA

<213> 人工合成

<400> 8

gtcgtgactg ggaaaaccct ggcgatgctc agcctgaagg tgaaaac 47

<210> 9

<211> 25

<212> DNA

<213> 人工合成

<400> 9

atgtgtgata ttcgtggtaa tgcgg 25

<210> 10

<211> 52

<212> DNA

<213> 人工合成

<400> 10

ctgtaatttt atgacccagc gcttttaaga gcggataaca atttcacaca gg 52

<210> 11

<211> 47

<212> DNA

<213> 人工合成

<400> 11

gttttcacct tcaggctgag catcgccagg gttttcccag tcacgac 47

<210> 12

<211> 68

<212> DNA

<213> 人工合成

<400> 12

ataaagtgat agcggtacca ttataggtaa gagaggaatg tacacatggg caaaaactac 60

aagctctg 68

<210> 13

<211> 71

<212> DNA

<213> 人工合成

<400> 13

acgatgtaga tgttagacat gtgtacattc ctctcttacc ccgggttatg aaagtgcttc 60

aaactgttgc c 71

<210> 14

<211> 29

<212> DNA

<213> 人工合成

<400> 14

atgtctaaca tctacatcgt ggcagaaat 29

<210> 15

<211> 54

<212> DNA

<213> 人工合成

<400> 15

ccgcccttgg cggcatccgc gaaggccttt attctccctg gtttttaaat tcgc 54

<210> 16

<211> 50

<212> DNA

<213> 人工合成

<400> 16

aaaatcaaag ggggaaatgg gatccatggg caaaaactta caagctctgg 50

<210> 17

<211> 55

<212> DNA

<213> 人工合成

<400> 17

cggccgcccg cgggagctcg gatccttatt ctccctggtt tttaaattcg ctatg 55

<210> 18

<211> 48

<212> DNA

<213> 人工合成

<400> 18

taaaaaccag ggagaataaa ggcctgtaag agaggaatgt acacatgc 48

<210> 19

<211> 41

<212> DNA

<213> 人工合成

<400> 19

cttggcggca tccgcgaagg cctttaaaag cgctgggtca t 41

Claims

1.一种积累N-乙酰神经氨酸的重组枯草芽孢杆菌，其特征在于，所述重组芽孢杆菌表达外源的氨基葡萄糖乙酰化酶编码基因GNA1，N-乙酰氨基葡萄糖异构酶编码基因AGE，N-乙酰神经氨酸合酶编码基因NeuB，所述氨基葡萄糖乙酰化酶的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示，所述N-乙酰氨基葡萄糖异构酶的氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示，所述N-乙酰神经氨酸合酶的氨基酸序列如SEQ ID NO.3所示，所述重组芽孢杆菌的宿主细胞为枯草芽孢杆菌Bacillus subtilis 168ΔnagP ΔnagP ΔgamP ΔgamA ΔnagAΔnagBΔ1dh Δpta::lox72，所述氨基葡萄糖乙酰化酶编码基因重组于基因组上整合表达，N-乙酰氨基葡萄糖异构酶编码基因、N-乙酰神经氨酸合酶编码基因重组于质粒上游离表达。

2.权利要求1所述重组枯草芽孢杆菌的构建方法，其特征在于包括如下步骤：

1)构建氨基葡萄糖乙酰化酶重组片段：

克隆氨基葡萄糖乙酰化酶编码基因GNA1，重组于枯草芽孢杆菌Bacillus subtilis168ΔnagP ΔnagP ΔgamP ΔgamA ΔnagAΔnagBΔ1dh Δpta::lox72基因组上，得到工程菌B6C；

2)构建重组质粒：

克隆N-乙酰氨基葡萄糖异构酶编码基因AGE、N-乙酰神经氨酸合酶编码基因NeuB，连接到重组表达质粒pP43NMK上；

3)构建产N-乙酰神经氨酸重组枯草芽孢杆菌：

将上述重组表达载体转化枯草芽孢杆菌B6C，得到产N-乙酰神经氨酸重组枯草芽孢杆菌B6CAN。

3.权利要求1所述重组枯草芽孢杆菌在制备营养保健品方面的应用。

4.权利要求3所述应用，其特征在于，所述重组枯草芽孢杆菌用于生产N-乙酰神经氨酸。

5.权利要求4所述应用，其特征在于，所述生产，是将35-38℃、180-220rpm下培养10-20h的重组枯草芽孢杆菌以10％-20％的接种量转入发酵培养基，于35-38℃、180-220rpm条件下发酵30-50h。