CN113249285A

CN113249285A - 一种高产n-乙酰神经氨酸的重组枯草芽孢杆菌及其构建方法、应用

Info

Publication number: CN113249285A
Application number: CN202110521893.4A
Authority: CN
Inventors: 竹国津; 柳鹏福; 储消和; 陈艳; 郭倩; 韩笑笑
Original assignee: Zhejiang University of Technology ZJUT
Current assignee: Zhejiang University of Technology ZJUT
Priority date: 2021-05-13
Filing date: 2021-05-13
Publication date: 2021-08-13

Abstract

本发明涉及生物工程技术领域，尤其涉及一种高产N‑乙酰神经氨酸的重组枯草芽孢杆菌及其构建方法、应用。所述高产N‑乙酰神经氨酸的重组枯草芽孢杆菌以枯草芽孢杆菌为表达宿主，将N‑乙酰神经氨酸合成酶基因neuB和N‑乙酰葡萄糖胺2‑差向异构酶基因neuC整合到枯草芽孢杆菌基因组上稳定表达，然后通过在质粒上过表达磷酸葡萄糖胺变位酶基因glmM和果糖6‑磷酸转氨酶基因glmS。本发明通过基因工程技术对B.subtilis进行改造，使其可以以甘油为底物直接合成N‑乙酰神经氨酸，生产工艺简单、环境友好、无内毒素，可用于食品领域，具有工业化生产价值。

Description

一种高产N-乙酰神经氨酸的重组枯草芽孢杆菌及其构建方法、应用

技术领域

本发明涉及生物工程技术领域，尤其涉及一种高产N-乙酰神经氨酸的重组枯草芽孢杆菌及其构建方法、应用。

背景技术

唾液酸(sialic acid,SA)是一类含有9个碳原子并具有吡喃糖结构的酸性氨基糖，又称神经氨酸，广泛存在于植物、动物和微生物中，且种类繁多，目前已发现的有50多种，包括N-乙酰神经氨酸(Neu5Ac)、N-甘酰神经氨酸(Neu5Gc)和去氨基神经氨酸(KDN)等；而N-乙酰神经氨酸(Neu5Ac)是其中最重要的一种唾液酸，它的含量占唾液酸家族的99％以上，是其他唾液酸合成的前体物质，通常位于细胞膜表面糖链的末端，参与多种生理功能。

目前，唾液酸以及其各类衍生产品已经在食品、药品和疾病诊断等多个领域得到了广泛的应用，主要具有提高婴儿的智力和记忆力、抗老年痴呆、抗识别、抗病毒、抗炎和抗肿瘤以及提高肠道对矿物质和维生素的吸收等功能。

目前，N-乙酰神经氨酸的生产途径有从禽蛋、牛奶和燕窝等含量丰富的天然材料中提取，该方法获得的产物易引起过敏反应；或者是通过化学法合成，但该方法存在底物成本高、产物产率低、污染严重；或者是全细胞催化法生产，该法存在转化率低、底物成本高、分离步骤复杂、产物存在内毒素等问题。再或者通过构建高产N-乙酰神经氨酸的基因工程菌，通过发酵法直接生产。但目前主要采用的是大肠杆菌为宿主，大肠杆菌本身属于条件致病菌，其产品在用于食品领域，尤其是婴幼儿食品中，可能存在安全性问题。

发明内容

本发明为了克服上述现有技术中存在的问题，提供了一种高产N-乙酰神经氨酸的重组枯草芽孢杆菌。

本发明还提供了一种高产N-乙酰神经氨酸的重组枯草芽孢杆菌的构建方法。

本发明还提供了一种高产N-乙酰神经氨酸的重组枯草芽孢杆菌在发酵生产N-乙酰神经氨酸中的应用。

为了实现上述目的，本发明采用以下技术方案：

一种高产N-乙酰神经氨酸的重组枯草芽孢杆菌，以枯草芽孢杆菌为表达宿主，将N-乙酰神经氨酸合成酶基因neuB和N-乙酰葡萄糖胺2-差向异构酶基因neuC整合到枯草芽孢杆菌基因组上稳定表达，然后通过在质粒上过表达磷酸葡萄糖胺变位酶基因glmM和果糖6-磷酸转氨酶基因glmS。

本发明的重组枯草芽孢杆菌是通过外源表达N-乙酰神经氨酸合成酶neuB和N-乙酰葡萄糖胺2-差向异构酶neuC两个酶，结合枯草杆菌本身就有的从甘油或葡萄糖到UDP-N-乙酰氨基葡萄糖的合成途径，搭建出完整的N-乙酰神经氨酸合成途径，然后将neuBC的表达元件通过CRISPR系统整合到染色体上，再过表达的N-乙酰神经氨酸合成的两个限速酶(磷酸葡萄糖胺变位酶基因glmM和果糖6-磷酸转氨酶基因glmS)，最终实现高产N-乙酰神经氨酸的目的。

所述枯草芽孢杆菌优选为枯草芽孢杆菌168(Bacillus subtilis 168；简称B.subtilis 168)。所述重组枯草芽孢杆菌是以B.subtilis-Pgrac-neuBC为宿主菌株构建得到的。

作为优选，以质粒pHT01为表达载体，以诱导型启动子Pgrac过表达磷酸葡萄糖胺变位酶基因glmM和果糖6-磷酸转氨酶基因glmS。

作为优选，所述诱导型启动子Pgrac的核苷酸序列为SEQ ID NO.1。

作为优选，所述磷酸葡萄糖胺变位酶基因glmM的核苷酸序列为SEQ ID NO.2；所述果糖6-磷酸转氨酶基因glmS的核苷酸序列为SEQ ID NO.3。

作为优选，所述B.subtilis-Pgrac-neuBC是通过全基因合成C.jejuni来源的N-乙酰神经氨酸合成酶基因neuB和N-乙酰葡萄糖胺2-差向异构酶基因neuC，克隆到整合质粒pJOE8999上，重组于B.subtilis 168基因组上，neuBC的核苷酸序列为SEQ ID NO.4。

作为优选，所述磷酸葡萄糖胺变位酶基因glmM来源于枯草芽孢杆菌或能表达相同功能酶的微生物。

作为优选，所述果糖6-磷酸转氨酶基因glmS来源于大肠杆菌或能表达相同功能酶的微生物。

一种高产N-乙酰神经氨酸的重组枯草芽孢杆菌的构建方法，包括以下步骤：

(1)将N-乙酰神经氨酸合成酶基因neuB、N-乙酰葡萄糖胺2-差向异构酶基因neuC重组于枯草芽孢杆菌基因组；具体位置是淀粉酶amyE基因上；

(2)在质粒上过表达磷酸葡萄糖胺变位酶基因glmM和果糖6-磷酸转氨酶基因glmS，即得高产N-乙酰神经氨酸的重组枯草芽孢杆菌。

作为优选，步骤(1)的具体步骤为：

克隆N-乙酰神经氨酸合成酶基因neuB和N-乙酰葡萄糖胺2-差向异构酶基因neuBC，克隆Pgrac启动子基因序列和淀粉酶amyE两侧同源臂基因序列，4段基因通过Overlap PCR组装。

作为优选，步骤(2)的具体步骤为：

(a)以枯草芽孢杆菌基因组DNA为模板PCR扩增获得glmM基因片段；

(b)以大肠杆菌菌株基因组DNA为模板PCR扩增获得glmS基因片段；

(c)以glmM片段和glmS片段为模板PCR扩增获得glmM-glmS基因片段；

(d)通过酶切连接克隆至表达载体pHT01上。

一种高产N-乙酰神经氨酸的重组枯草芽孢杆菌的应用，以甘油为底物，采用所述重组枯草芽孢杆菌发酵生产N-乙酰神经氨酸。

作为优选，发酵生产N-乙酰神经氨酸具体包括以下步骤：

1)活化培养菌种，发酵培养基(g/L)：甘油20，胰蛋白胨3，酵母粉1，MgSO4·7H20，补料培养基(g/L)：甘油800，酵母浸膏100，胰蛋白胨30；在发酵培养基中接种重组枯草芽孢杆菌；

2)将培养好的种子逐级放大，并在相应的发酵罐中进行好气培养，温度控制在37℃，pH通过氨水调控至6.8，溶氧保持在30％，同时补充合适的碳氮源；

3)加入异丙基-β-D-硫代吡喃半乳糖苷(IPTG)，诱导相关蛋白的表达。

因此，本发明具有如下有益效果：本发明通过基因工程技术对B.subtilis进行改造，使其可以以甘油为底物直接合成N-乙酰神经氨酸，生产工艺简单、环境友好、无内毒素，可用于食品领域，具有工业化生产价值。

附图说明

图1是B.subtilis中甘油到N-乙酰神经氨酸的合成途径。

图2是BsBC、BsBCpM、BsBCpS和BsBCpMS的发酵数据图。

具体实施方式

下面通过具体实施例，并结合附图，对本发明的技术方案作进一步具体的说明。

在本发明中，若非特指，所有设备和原料均可从市场购得或是本行业常用的，下述实施例中的方法，如无特别说明，均为本领域常规方法。

实施例1：基因组上表达neuBC基因的重组菌株Bs-neuBC构建

一、neuBC基因整合质粒pJOE8999-gRNA-L-P_grac-neuBC-R的构建

1)根据neuBC的基因序列(GenBank No.AF100048)全基因合成neuBC基因，两端添加BamHⅠ和XbaⅠ位点；

2)将合成的基因片段用BamHⅠ和XbaⅠ双酶切，回收备用；

3)抽提表达质粒pHT01，用BamHⅠ和XbaⅠ双酶切，回收备用；

4)连接上述酶切纯化好的载体和片段，用T4DNA连接酶连接，并转入大肠杆菌DH5α感受态细胞中，得到表达载体pHT01-neuBC；

5)将amyE淀粉酶基因序列输入网站http://chopchop.cbu.uib.no/中，计算最佳的gRNA序列，为TGAAGATCAGGCTATCACTG(SEQ ID NO.5)；

6)以B.subtilis总DNA为模板，根据最佳的gRNA序列设计引物，正向引物F-BsaⅠ-gRNA：GAGACCTGAAGATCAGGCTATCAC(SEQ ID NO.6)和反向引物R-BsaⅠ-gRNA：GAGACCCAGTGATAGCCTGATC(SEQ ID NO.7)，引物两端添加了BsaⅠ酶切位点，以便后续的基因操作；

7)以B.subtilis总DNA为模板，以上述引物(SEQ ID NO.6-7所示)PCR扩增得到gRNA片段；

8)将质粒pJOE8999和gRNA片段用BsaⅠ酶切，回收并用T4DNA连接酶连接，转入E.coli DH5α感受态细胞中，得到整合载体pJOE8999-gRNA；

9)根据amyE基因序列和gRNA基因序列设计上下游片段L、R的引物，L正向引物F-L-Sfi Ⅰ：GGCCAACGAGGCCGGAAGGGAATCAAGGAGA TAAAAGCAT(SEQ ID NO.8)和反向引物R-L-LacI：GTGAGTTAAGGCCTACTAGTTGTCGACTCTTCATCAT CAT TGG(SEQ ID NO.9)，正向引物前添加SfiⅠ酶切位点，反向引物添加P_grac-neuBC同源序列；R正向引物F-neuBC-R：GTTTTTAAGGATATAAAATGATGGAAACAACCAGATA TTTATG(SEQ ID NO.10)和反向引物R-SfiⅠ-R：GGCCTTATTGGCCGGCGCTGCCATTA TTAAA AATCACTTTTGC(SEQ ID NO.11)，正向引物添加P_grac-neuBC同源序列，反向引物添加SfiⅠ酶切位点；

10)以B.subtilis总DNA为模板，以上述引物(SEQ ID NO.8-11所示)PCR扩增得到L臂(SEQ ID NO.12)和R臂(SEQ ID NO.13)；

11)根据pHT01-neuBC质粒基因序列和amyE淀粉酶基因序列，设计P_grac-neuBC的引物，正向引物F-L-LacI：CCAATGATGATGAAGAGTCGACAACTAGTAGGCCTTAACTCACATTAATTGCGTTGCGC(SEQ ID NO.14)和反向引物R-R-neuBC：TGATTCA TAAATATCTGGTTGTTTCCATCATTTTATATCCTTAAAAACTTTTTG(SEQ ID NO.15)，正向引物添加L臂同源片段，反向引物添加R臂同源序列，以便Overlap PCR的操作；

12)以pHT01-neuBC质粒为模板，以上述引物(SEQ ID NO.14-15所示)PCR扩增得到P_grac-neuBC片段；

13)以L臂、R臂和P_grac-neuBC片段为模板，以上述引物(SEQ ID NO.8、15、11所示)通过Overlap PCR扩增得到L-P_grac-neuBC-R片段(SEQ ID NO.16)；

14)将质粒pJOE8999-gRNA和L-P_grac-neuBC-R片段用SfiⅠ酶切，回收并用T4DNA连接酶连接，转入E.coli DH5α感受态细胞中，得到整合载体pJOE8999-gRNA-L-P_grac-neuBC-R。

二、基因组上表达neuBC基因的重组菌株筛选

1)将整合载体pJOE8999-gRNA-L-P_grac-neuBC-R电转入B.subtilis感受态中，通过抗性筛选和和引物验证得到单交换菌株；

2)挑点至无抗LB试管中，加入木糖诱导Cas9蛋白表达，后转入50℃摇床使质粒脱落；

3)涂布无抗平板上，将平板上的菌落分别挑至无抗和Kan抗性平板上，对于无抗菌进行双交换验证，得到基因组上表达neuBC的重组菌株Bs-neuBC。

实施例2：glmS基因表达载体的构建

1)根据E.coli总DNA基因序列中的glmS基因及其上下游的序列设计引物，正向引物为F-BamHⅠ-glmS：GGATCCATGTGTGGAATTGTTGGCGCG(SEQ ID NO.17)和反向引物R-XbaⅠ-glmS：TCTAGATTACTCAACCGTAACCGATTTTGCCAGGT(SEQ ID NO.18)，正向引物前添加BamHⅠ酶切位点，反向引物前添加XbaⅠ酶切位点；

2)以E.coli总DNA为模板，以上述引物(SEQ ID NO.17-18所示)通过PCR扩增获得glmS片段(SEQ ID NO.19)；

3)将质粒pHT01和glmS片段用BamHⅠ和XbaⅠ双酶切，回收并用T4DNA连接酶连接，转入E.coli DH5α感受态细胞中，得到表达载体pHT01-glmS。

实施例3：glmM基因表达载体的构建

1)根据B.subtilis总DNA基因序列中的glmS基因及其上下游的序列设计引物，正向引物为F-BamHⅠ-glmM：GGATCCATGGGCAAGTATTTTGGAACAGACGGTGTA A(SEQ ID NO.20)和反向引物R-XbaⅠ-glmM：TCTAGATTACTCTAATCCCATTTCTGAC CGGA(SEQ ID NO.21)，正向引物前添加BamHⅠ酶切位点，反向引物前添加XbaⅠ酶切位点；

2)以B.subtilis总DNA为模板，以上述引物(SEQ ID NO.20-21所示)通过PCR扩增获得glmM(SEQ ID NO.22)片段；

3)将质粒pHT01和glmM片段用BamHⅠ和XbaⅠ双酶切，回收并用T4DNA连接酶连接，转入E.coli DH5α感受态细胞中，得到表达载体pHT01-glmM。

实施例4：glmM-glmS基因表达载体的构建

1)根据glmM和glmS基因序列设计引物，反向引物R-glmS-glmM：ATCGCGC CAACAATTCCACACATTTACTCTAATCCCATTTCT(SEQ ID NO.23)，在反向引物上添加glmS同源序列；

2)以glmM和glmS片段为模板，以上述引物(SEQ ID NO.20、23、21所示)通过Overlap PCR扩增获得glmM-glmS片段(SEQ ID NO.24)；

3)将质粒pHT01和glmM-glmS片段用BamHⅠ和XbaⅠ双酶切，回收并用T4DNA连接酶连接，转入E.coli DH5α感受态细胞中，得到表达载体pHT01-glmM-glmS。

实施例5：过表达基因产N-乙酰神经氨酸的重组B.subtilis菌株构建

1)将用液体LB培养基培养含有载体pHT01-glmM、pHT01-glmS和pHT01-glmM-glmS的E.coli DH5α菌株，抽提质粒pHT01-glmM、pHT01-glmS和pHT01-glmM-glmS；

2)培养重组B.subtilis菌株Bs-neuBC，制备感受态细胞，并分别电击转化质粒pHT01-glmM、pHT01-glmS和pHT01-glmM-glmS进入，获得基因工程菌株Bs-neuBC-pHT01-glmM、Bs-neuBC-pHT01-glmS和Bs-neuBC-pHT01-glmM-glmS，分别命名为BsBCpM、BsBCpS和BsBCpMS，重组枯草芽孢杆菌菌株Bs-neuBC命名为BsBC。

实施例6：甘油为碳源发酵生产N-乙酰神经氨酸

1、种子和发酵培养基

发酵培养基(g/L)：甘油20，胰蛋白胨3，酵母粉1，MgSO₄·7H₂0；

补料培养基(g/L)：甘油800，酵母浸膏100，胰蛋白胨30。

2、发酵过程：

1)挑取BsBC、BsBCpM、BsBCpS和BsBCpMS单菌落于装液量5mL LB试管中，37℃培养12小时；

2)2mL一级种子液接种于200mL种子培养基中，37℃，220rpm培养12h；

3)二级种子液接种于装液量3.8L的发酵罐中，37℃，搅拌速度300-700转/分钟，溶氧保持在30％以上，用氨水控制pH在6.8；

4)甘油耗完后，开始以1g/(L·h)的速度补加甘油，后根据溶氧变化调整补料速度；

5)发酵液菌体OD₆₀₀＝20左右时加入IPTG(IPTG终浓度为0.2mM)，37℃培养96h；

6)经检测，96h发酵结束时，BsBC产物N-乙酰神经氨酸的浓度可达8.99g/L，BsBCpM产物N-乙酰神经氨酸的浓度可达10.35g/L，BsBCpS产物N-乙酰神经氨酸的浓度可达12.84g/L，BsBCpMS产物N-乙酰神经氨酸的浓度可达14.64g/L。

发酵结果如表1所示，分别过表达过表达磷酸葡萄糖胺变位酶基因glmM和果糖6-磷酸转氨酶基因glmS能有效提高N-乙酰神经氨酸的产量，而同时过表达双基因大大提高了N-乙酰神经氨酸的产量，较原菌株相比，提高了62.8％。

表1.各个菌株发酵产N-乙酰神经氨酸的结果

以上所述仅为本发明的较佳实施例，并非对本发明作任何形式上的限制，在不超出权利要求所记载的技术方案的前提下还有其它的变体及改型。

序列表

<110> 浙江工业大学

<120> 一种高产N-乙酰神经氨酸的重组枯草芽孢杆菌及其构建方法、应用

<160> 24

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 2

<211> 1506

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 2

tcactgcccg ctttccagtc gggaaacctg tcgtgccagc tgcattaatg aatcggccaa 60

cgcgcgggga gaggcggttt gcgtattggg cgccagggtg gtttttcttt tcaccagtga 120

gacgggcaac agctgattgc ccttcaccgc ctggccctga gagagttgca gcaagcggtc 180

cacgctggtt tgccccagca ggcgaaaatc ctgtttgatg gtggttaacg gcgggatata 240

acatgagctg tcttcggtat cgtcgtatcc cactaccgag atatccgcac caacgcgcag 300

cccggactcg gtaatggcgc gcattgcgcc cagcgccatc tgatcgttgg caaccagcat 360

cgcagtggga acgatgccct cattcagcat ttgcatggtt tgttgaaaac cggacatggc 420

actccagtcg ccttcccgtt ccgctatcgg ctgaatttga ttgcgagtga gatatttatg 480

ccagccagcc agacgcagac gcgccgagac agaacttaat gggcccgcta acagcgcgat 540

ttgctggtga cccaatgcga ccagatgctc cacgcccagt cgcgtaccgt cttcatggga 600

gaaaataata ctgttgatgg gtgtctggtc agagacatca agaaataacg ccggaacatt 660

agtgcaggca gcttccacag caatggcatc ctggtcatcc agcggatagt taatgatcag 720

cccactgacg cgttgcgcga gaagattgtg caccgccgtt ttacaggctt cgacgccgct 780

tcgttctacc atcgacacca ccacgctggc acccagttga tcggcgcgag atttaatcgc 840

cgcgacaatt tgcgacggcg cgtgcagggc cagactggag gtggcaacgc caatcagcaa 900

cgactgtttg cccgccagtt gttgtgccac gcggttggga atgtaattca gctccgccat 960

cgccgcttcc actttttccc gcgttttcgc agaaacgtgg ctggcctggt tcaccacgcg 1020

ggaaacggtc tgataagaga caccggcata ctctgcgaca tcgtataacg ttactggttt 1080

catcaaaatc gtctccctcc gtttgaatat ttgattgatc gtaaccagat gaagcactct 1140

ttccactatc cctacagtgt tatggcttga acaatcacga aacaataatt ggtacgtacg 1200

atctttcagc cgactcaaac atcaaatctt acaaatgtag tctttgaaag tattacatat 1260

gtaagattta aatgcaaccg ttttttcgga aggaaatgat gacctcgttt ccaccggaat 1320

tagcttggta ccagctattg taacataatc ggtacggggg tgaaaaagct aacggaaaag 1380

ggagcggaaa agaatgatgt aagcgtgaaa aattttttat cttatcactt gaaattggaa 1440

gggagattct ttattataag aattgtggaa ttgtgagcgg ataacaattc ccaattaaag 1500

gaggaa 1506

<210> 2

<211> 1347

<212> DNA

<213> 磷酸葡萄糖胺变位酶(Artificial Sequence)

<400> 2

atgggcaagt attttggaac agacggtgta agaggtgtcg ccaatagtga gcttacacct 60

gagctggcct ttaaagtcgg acgtttcggc ggttatgtgc tgacaaaaga caaacaacgt 120

ccaaaagtgc tgataggccg cgatacacgc atctccggcc atatgctgga gggagccctt 180

gtcgccggac ttttatccat tggcgcagaa gtcatgcgcc tgggtgtcat ttctacacca 240

ggtgtatctt atttgacaaa agcgatggat gcagaggcgg gcgtcatgat ttccgcttct 300

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cctgtcggag cagaccttgg acttgtaaac gattattttg aaggcggaca aaaatatctg 480

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gccaatggcg caacgtcatc cttggcgaca cacctgtttg ctgatttaga tgcagatgtt 600

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aacgtcggcg gagagcagtc aggacatctt attttccttg attacaacac gacaggggac 1020

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gagcttgcag ctgaaatgca gaagttcccg cagctgttag tcaatgtgag agtgactgat 1140

aaatataaag ttgaagaaaa tgaaaaagta aaagcagtta tttctgaagt tgaaaaagaa 1200

atgaacggcg acggccggat tttggtgcgc ccttcaggaa ctgaaccgct cgtccgtgtc 1260

atggctgaag cgaagacgaa agagctgtgc gatgagtatg tcaatcgcat tgttgaagtc 1320

gtccggtcag aaatgggatt agagtaa 1347

<210> 3

<211> 1830

<212> DNA

<213> 果糖6-磷酸转氨酶(Artificial Sequence)

<400> 3

atgtgtggaa ttgttggcgc gatcgcgcaa cgtgatgtag cagaaatcct tcttgaaggt 60

ttacgtcgtc tggaataccg cggatatgac tctgccggtc tggccgttgt tgatacagaa 120

ggtcatatga cccgcctgcg tcgcctcggt aaagtccaga tgctggcaca ggcagcggaa 180

gaacatcctc tgcatggcgg cactggtatt gctcacactc gctgggcgac ccacggtgaa 240

ccttcagaag tgaatgcgca tccgcatgtt tctgaacaca ttgtggtggt gcataacggc 300

atcatcgaaa accatgaacc gctgcgtgaa gagctaaaag cgcgtggcta taccttcgtt 360

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cgtctgtcga aagagctggg ttaccttggt tcactggcaa tctgtaacgt tccgggttct 1140

tctctggtgc gcgaatccga tctggcgcta atgaccaacg cgggtacaga aatcggcgtg 1200

gcatccacta aagcattcac cactcagtta actgtgctgt tgatgctggt ggcgaagctg 1260

tctcgcctga aaggtctgga tgcctccatt gaacatgaca tcgtgcatgg tctgcaggcg 1320

ctgccgagcc gtattgagca gatgctgtct caggacaaac gcattgaagc gctggcagaa 1380

gatttctctg acaaacatca cgcgctgttc ctgagccgtg gcgatcagta cccaatcgcg 1440

ctggaaggcg cattgaagtt gaaagagatc tcttacattc acgctgaagc ctacgctgct 1500

ggcgaactga aacacggtcc gctggcgcta attgatgccg atatgccggt tattgttgtt 1560

gcaccgaaca acgaattgct ggaaaaactg aaatccaaca ttgaagaagt tcgcgcgcgt 1620

ggcggtcagt tgtatgtctt cgccgatcag gatgcgggtt ttgtaagtag cgataacatg 1680

cacatcatcg agatgccgca tgtggaagag gtgattgcac cgatcttcta caccgttccg 1740

ctgcagctgc tggcttacca tgtcgcgctg atcaaaggca ccgacgttga ccagccgcgt 1800

aacctggcaa aatcggttac ggttgagtaa 1830

<210> 4

<211> 1554

<212> DNA

<213> 枯草芽孢杆菌(Artificial Sequence)

<400> 4

attttcttgt atggtaggct taagcgacca cacaacagat aatcttgcgt gtttaggtgc 60

agttgtactt ggagcttgtg tgcttgaaag acattttact gatagtatgc atagaagtgg 120

ccctgatata gtttgttcta tggatacaaa ggctttaaaa gagctaatta tacaaagtga 180

gcaaatggct ataataagag gaaataatga aagtaaaaaa gcggctaaac aagaacaagt 240

tacaattgat tttgcctttg caagtgtagt tagcattaaa gatattaaaa aaggcgaagt 300

tttatctatg gataatattt gggttaaaag acctggactt ggtggaatta gtgcggctga 360

atttgaaaat attttaggca aaaaagcatt aagagatata gaaaatgatg ctcagttaag 420

ctatgaggat tttgcgtgaa aaaaatcctt tttataacag gctctagggc tgattattct 480

aagattaaat ctttaatgta cagggtgcaa aactcaagcg aatttgaact ttacatcttt 540

gcaacaggaa tgcacttaag taaaaatttt ggctatacag ttaaagaact ttataaaaat 600

ggctttaaaa atatttatga atttataaat tatgataaat attatcaaac tgataaggct 660

ttagctacta caattgatgg attttcaagg tatgcaaatg agctaaaacc tgatttaatc 720

gtagtacatg gagatagaat tgagccttta gcagcagcta ttgttggagc attaaataat 780

atcttagtag cgcatattga aggcggagag atttcaggaa ctattgacga tagcttacgc 840

cacgctatat caaaactagc tcatattcat ttagtaaatg atgagtttgc aaaaaggcgt 900

ttaatgcagc ttggagaaga tgaaaaatct atttttatca taggttcgcc tgatttagaa 960

cttttaaacg ataataaaat ttcacttagc gaagcaaaaa aatattatga tataaattat 1020

gaaaactacg ctttgcttat gtttcatcct gttacaactg aaattactag cattaaaaat 1080

caagcagaca atttagtaaa agcactgata caaagtaata aaaattatat tgttatttat 1140

ccaaataatg atttaggttt tgaattaatc ttgcaaagct atgaagagtt taaaaataac 1200

cctagattta agctttttcc atcgcttaga tttgagtatt ttataacttt gttaaaaaat 1260

gctgatttta taataggtaa ttcaagttgt attttaaaag aggccttata cttaaaaaca 1320

gcagggattt tagttggctc aagacaaaat ggaagacttg gcaatgaaaa tacactaaaa 1380

gttaatgcaa atagtgatga aatactaaaa gctattaaca ctattcataa aaaacaagat 1440

ttatttagcg ctaagttaga gattttagat agctcaaaat tattttttga atatttacaa 1500

agcggagatt tttttaaact cagcacacaa aaagttttta aggatataaa atga 1554

<210> 6

<211> 20

<212> DNA

<213> amyE淀粉酶(Artificial Sequence)

<400> 6

tgaagatcag gctatcactg 20

<210> 6

<211> 24

<212> DNA

<213> 正向引物(Artificial Sequence)

<400> 6

gagacctgaa gatcaggcta tcac 24

<210> 7

<211> 24

<212> DNA

<213> 反向引物(Artificial Sequence)

<400> 7

gagacctgaa gatcaggcta tcac 24

<210> 8

<211> 40

<212> DNA

<213> L正向引物(Artificial Sequence)

<400> 8

ggccaacgag gccggaaggg aatcaaggag ataaaagcat 40

<210> 9

<211> 43

<212> DNA

<213> 反向引物(Artificial Sequence)

<400> 9

gtgagttaag gcctactagt tgtcgactct tcatcatcat tgg 43

<210> 10

<211> 43

<212> DNA

<213> R正向引物(Artificial Sequence)

<400> 10

gtttttaagg atataaaatg atggaaacaa ccagatattt atg 43

<210> 11

<211> 43

<212> DNA

<213> 反向引物(Artificial Sequence)

<400> 11

ggccttattg gccggcgctg ccattattaa aaatcacttt tgc 43

<210> 12

<211> 700

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 12

ggaagggaat caaggagata aaagcatgtc gaactggtac tggctgtatc agccgacatc 60

gtatcaaatt ggcaaccgtt acttaggtac tgaacaagaa tttaaagaaa tgtgtgcagc 120

cgctgaagaa tatggcataa aggtcattgt tgacgcggtc atcaatcata ccaccagtga 180

ttatgccgcg atttccaatg aggttaagag tattccaaac tggacacatg gaaacacaca 240

aattaaaaac tggtctgatc gatgggatgt cacgcagaat tcattgctcg ggctgtatga 300

ctggaataca caaaatacac aagtacagtc ctatctgaaa cggttcttag acagggcatt 360

gaatgacggg gcagacggtt ttcgatttga tgccgccaaa catatagagc ttccagatga 420

tggcagttac ggcagtcaat tttggccgaa tatcacaaat acatctgcag agttccaata 480

cggagaaatc ctgcaggata gtgcctccag agatgctgca tatgcgaatt atatggatgt 540

gacagcgtct aactatgggc attccataag gtccgcttta aagaatcgta atctgggcgt 600

gtcgaatatc tcccactatg catctgatgt gtctgcggac aagctagtga catgggtaga 660

gtcgcatgat acgtatgcca atgatgatga agagtcgaca 700

<210> 13

<211> 700

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 13

tggaaacaac cagatattta tgaatcagcg cggctcacat ggcgttgtgc tggcaaatgc 60

aggttcatcc tctgtctcta tcaatacggc aacaaaattg cctgatggca ggtatgacaa 120

taaagctgga gcgggttcat ttcaagtgaa cgatggtaaa ctgacaggca cgatcaatgc 180

caggtctgta gctgtgcttt atcctgatga tattgcaaaa gcgcctcatg ttttccttga 240

gaattacaaa acaggtgtaa cacattcttt caatgatcaa ctgacgatta ccttgcgtgc 300

agatgcgaat acaacaaaag ccgtttatca aatcaataat ggaccagaga cggcgtttaa 360

ggatggagat caattcacaa tcggaaaagg agatccattt ggcaaaacat acaccatcat 420

gttaaaagga acgaacagtg atggtgtaac gaggaccgag aaatacagtt ttgttaaaag 480

agatccagcg tcggccaaaa ccatcggcta tcaaaatccg aatcattgga gccaggtaaa 540

tgcttatatc tataaacatg atgggagccg agtaattgaa ttgaccggat cttggcctgg 600

aaaaccaatg actaaaaatg cagacggaat ttacacgctg acgctgcctg cggacacgga 660

tacaaccaac gcaaaagtga tttttaataa tggcagcgcc 700

<210> 14

<211> 59

<212> DNA

<213> 正向引物(Artificial Sequence)

<400> 14

ccaatgatga tgaagagtcg acaactagta ggccttaact cacattaatt gcgttgcgc 59

<210> 15

<211> 54

<212> DNA

<213> 反向引物(Artificial Sequence)

<400> 15

tgattcataa atatctggtt gtttccatca ttttatatcc ttaaaaactt tttg 54

<210> 16

<211> 5117

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 16

ggaagggaat caaggagata aaagcatgtc gaactggtac tggctgtatc agccgacatc 60

gtatcaaatt ggcaaccgtt acttaggtac tgaacaagaa tttaaagaaa tgtgtgcagc 120

cgctgaagaa tatggcataa aggtcattgt tgacgcggtc atcaatcata ccaccagtga 180

ttatgccgcg atttccaatg aggttaagag tattccaaac tggacacatg gaaacacaca 240

aattaaaaac tggtctgatc gatgggatgt cacgcagaat tcattgctcg ggctgtatga 300

ctggaataca caaaatacac aagtacagtc ctatctgaaa cggttcttag acagggcatt 360

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gagtgagata tttatgccag ccagccagac gcagacgcgc cgagacagaa cttaatgggc 1260

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caacgccaat cagcaacgac tgtttgcccg ccagttgttg tgccacgcgg ttgggaatgt 1680

aattcagctc cgccatcgcc gcttccactt tttcccgcgt tttcgcagaa acgtggctgg 1740

cctggttcac cacgcgggaa acggtctgat aagagacacc ggcatactct gcgacatcgt 1800

ataacgttac tggtttcatc aaaatcgtct ccctccgttt gaatatttga ttgatcgtaa 1860

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ataattggta cgtacgatct ttcagccgac tcaaacatca aatcttacaa atgtagtctt 1980

tgaaagtatt acatatgtaa gatttaaatg caaccgtttt ttcggaagga aatgatgacc 2040

tcgtttccac cggaattagc ttggtaccag ctattgtaac ataatcggta cgggggtgaa 2100

aaagctaacg gaaaagggag cggaaaagaa tgatgtaagc gtgaaaaatt ttttatctta 2160

tcacttgaaa ttggaaggga gattctttat tataagaatt gtggaattgt gagcggataa 2220

caattcccaa ttaaaggagg aaggatccat gaaagaaata aaaatacaaa atataatcat 2280

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tgcaaaaata agcatttatg agattatgca aaaatgtgct ttggattata aagatgagct 2520

agcacttaaa gaatacacag aaaaattagg tcttgtttat cttagcacac ctttttctcg 2580

tgcaggtgcg aaccgcttag aagatatggg agttagtgct tttaagattg gttcaggtga 2640

gtgtaataat tatccgctta ttaaacacat agcagccttt aaaaagccta tgatagttag 2700

cacaggaatg aatagtattg aaagtataaa accaactgta aaaatcttat tagacaatga 2760

aattcctttt gttttaatgc acacgaccaa tctttaccca accccgcata atcttgtaag 2820

attaaacgct atgcttgagt taaaaaaaga attttcttgt atggtaggct taagcgacca 2880

cacaacagat aatcttgcgt gtttaggtgc agttgtactt ggagcttgtg tgcttgaaag 2940

acattttact gatagtatgc atagaagtgg ccctgatata gtttgttcta tggatacaaa 3000

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tagcattaaa gatattaaaa aaggcgaagt tttatctatg gataatattt gggttaaaag 3180

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aagagatata gaaaatgatg ctcagttaag ctatgaggat tttgcgtgaa aaaaatcctt 3300

tttataacag gctctagggc tgattattct aagattaaat ctttaatgta cagggtgcaa 3360

aactcaagcg aatttgaact ttacatcttt gcaacaggaa tgcacttaag taaaaatttt 3420

ggctatacag ttaaagaact ttataaaaat ggctttaaaa atatttatga atttataaat 3480

tatgataaat attatcaaac tgataaggct ttagctacta caattgatgg attttcaagg 3540

tatgcaaatg agctaaaacc tgatttaatc gtagtacatg gagatagaat tgagccttta 3600

gcagcagcta ttgttggagc attaaataat atcttagtag cgcatattga aggcggagag 3660

atttcaggaa ctattgacga tagcttacgc cacgctatat caaaactagc tcatattcat 3720

ttagtaaatg atgagtttgc aaaaaggcgt ttaatgcagc ttggagaaga tgaaaaatct 3780

atttttatca taggttcgcc tgatttagaa cttttaaacg ataataaaat ttcacttagc 3840

gaagcaaaaa aatattatga tataaattat gaaaactacg ctttgcttat gtttcatcct 3900

gttacaactg aaattactag cattaaaaat caagcagaca atttagtaaa agcactgata 3960

caaagtaata aaaattatat tgttatttat ccaaataatg atttaggttt tgaattaatc 4020

ttgcaaagct atgaagagtt taaaaataac cctagattta agctttttcc atcgcttaga 4080

tttgagtatt ttataacttt gttaaaaaat gctgatttta taataggtaa ttcaagttgt 4140

attttaaaag aggccttata cttaaaaaca gcagggattt tagttggctc aagacaaaat 4200

ggaagacttg gcaatgaaaa tacactaaaa gttaatgcaa atagtgatga aatactaaaa 4260

gctattaaca ctattcataa aaaacaagat ttatttagcg ctaagttaga gattttagat 4320

agctcaaaat tattttttga atatttacaa agcggagatt tttttaaact cagcacacaa 4380

aaagttttta aggatataaa atgatggaaa caaccagata tttatgaatc agcgcggctc 4440

acatggcgtt gtgctggcaa atgcaggttc atcctctgtc tctatcaata cggcaacaaa 4500

attgcctgat ggcaggtatg acaataaagc tggagcgggt tcatttcaag tgaacgatgg 4560

taaactgaca ggcacgatca atgccaggtc tgtagctgtg ctttatcctg atgatattgc 4620

aaaagcgcct catgttttcc ttgagaatta caaaacaggt gtaacacatt ctttcaatga 4680

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taatggacca gagacggcgt ttaaggatgg agatcaattc acaatcggaa aaggagatcc 4800

atttggcaaa acatacacca tcatgttaaa aggaacgaac agtgatggtg taacgaggac 4860

cgagaaatac agttttgtta aaagagatcc agcgtcggcc aaaaccatcg gctatcaaaa 4920

tccgaatcat tggagccagg taaatgctta tatctataaa catgatggga gccgagtaat 4980

tgaattgacc ggatcttggc ctggaaaacc aatgactaaa aatgcagacg gaatttacac 5040

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cgccggccaa taaggcc 5117

<210> 17

<211> 27

<212> DNA

<213> 正向引物(Artificial Sequence)

<400> 17

ggatccatgt gtggaattgt tggcgcg 27

<210> 18

<211> 35

<212> DNA

<213> 反向引物(Artificial Sequence)

<400> 18

tctagattac tcaaccgtaa ccgattttgc caggt 35

<210> 19

<211> 1842

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 19

ggatccatgt gtggaattgt tggcgcgatc gcgcaacgtg atgtagcaga aatccttctt 60

gaaggtttac gtcgtctgga ataccgcgga tatgactctg ccggtctggc cgttgttgat 120

acagaaggtc atatgacccg cctgcgtcgc ctcggtaaag tccagatgct ggcacaggca 180

gcggaagaac atcctctgca tggcggcact ggtattgctc acactcgctg ggcgacccac 240

ggtgaacctt cagaagtgaa tgcgcatccg catgtttctg aacacattgt ggtggtgcat 300

aacggcatca tcgaaaacca tgaaccgctg cgtgaagagc taaaagcgcg tggctatacc 360

ttcgtttctg aaaccgacac cgaagtgatt gcccatctgg tgaactggga gctgaaacaa 420

ggcgggactc tgcgtgaggc cgttctgcgt gctatcccgc agctgcgtgg tgcgtacggt 480

acagtgatca tggactcccg tcacccggat accctgctgg cggcacgttc tggtagtccg 540

ctggtgattg gcctggggat gggcgaaaac tttatcgctt ctgaccagct ggcgctgttg 600

ccggtgaccc gtcgctttat cttccttgaa gagggcgata ttgcggaaat cactcgccgt 660

tcggtaaaca tcttcgataa aactggcgcg gaagtaaaac gtcaggatat cgaatccaat 720

ctgcaatatg acgcgggcga taaaggcatt tactgtcact acatgcagaa agagatctac 780

gaacagccga acgcgatcaa aaacaccctt accggacgca tcagccacgg tcaggttgat 840

ttaagcgagc tgggaccgaa cgccgacgaa ctgctgtcga aggttgagca tattcagatc 900

ctcgcctgtg gtacttctta taactccggt atggtttccc gctactggtt tgaatcgcta 960

gcaggtattc cgtgcgacgt cgaaatcgcc tctgaattcc gctatcgcaa atctgccgtg 1020

cgtcgtaaca gcctgatgat caccttgtca cagtctggcg aaaccgcgga taccctggct 1080

ggcctgcgtc tgtcgaaaga gctgggttac cttggttcac tggcaatctg taacgttccg 1140

ggttcttctc tggtgcgcga atccgatctg gcgctaatga ccaacgcggg tacagaaatc 1200

ggcgtggcat ccactaaagc attcaccact cagttaactg tgctgttgat gctggtggcg 1260

aagctgtctc gcctgaaagg tctggatgcc tccattgaac atgacatcgt gcatggtctg 1320

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gcagaagatt tctctgacaa acatcacgcg ctgttcctga gccgtggcga tcagtaccca 1440

atcgcgctgg aaggcgcatt gaagttgaaa gagatctctt acattcacgc tgaagcctac 1500

gctgctggcg aactgaaaca cggtccgctg gcgctaattg atgccgatat gccggttatt 1560

gttgttgcac cgaacaacga attgctggaa aaactgaaat ccaacattga agaagttcgc 1620

gcgcgtggcg gtcagttgta tgtcttcgcc gatcaggatg cgggttttgt aagtagcgat 1680

aacatgcaca tcatcgagat gccgcatgtg gaagaggtga ttgcaccgat cttctacacc 1740

gttccgctgc agctgctggc ttaccatgtc gcgctgatca aaggcaccga cgttgaccag 1800

ccgcgtaacc tggcaaaatc ggttacggtt gagtaatcta ga 1842

<210> 20

<211> 37

<212> DNA

<213> 正向引物(Artificial Sequence)

<400> 20

ggatccatgg gcaagtattt tggaacagac ggtgtaa 37

<210> 21

<211> 32

<212> DNA

<213> 反向引物(Artificial Sequence)

<400> 21

tctagattac tctaatccca tttctgaccg ga 32

<210> 22

<211> 1358

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 22

ggatccatgg gcaagtattt tggaacagac ggtgtaagag gtgtcgccaa tagtgagctt 60

acacctgagc tggcctttaa agtcggacgt ttcggcggtt atgtgctgac aaaagacaaa 120

caacgtccaa aagtgctgat aggccgcgat acacgcatct ccggccatat gctggaggga 180

gcccttgtcg ccggactttt atccattggc gcagaagtca tgcgcctggg tgtcatttct 240

acaccaggtg tatcttattt gacaaaagcg atggatgcag aggcgggcgt catgatttcc 300

gcttctcata acccagtgca ggataacggc atcaaattct ttgggggaga tggatttaag 360

ctttctgatg aacaggaggc tgaaattgag cgcctgatgg acgaacctga ggataagctg 420

ccaagacctg tcggagcaga ccttggactt gtaaacgatt attttgaagg cggacaaaaa 480

tatctgcaat tcttaaaaca gacagctgat gaagatttca caggcattca tgtggcattg 540

gactgtgcca atggcgcaac gtcatccttg gcgacacacc tgtttgctga tttagatgca 600

gatgtttcta caatggggac ttccccgaac ggattaaaca ttaatgacgg cgtcggttcg 660

actcatcccg aagcgctcag cgcgtttgtc aaagagaaaa acgcggatct cggtcttgcg 720

ttcgacggtg acggcgaccg cctgattgct gtcgatgaaa aaggaaatat tgtagacggc 780

gaccaaatca tgtacatatg ctcaaaacat ctgaaatcag agggccgttt aaaggatgat 840

acagtggttt caaccgtgat gagcaacctc ggcttctata aggcgctcga aaaagaaggc 900

atcaaaagcg tgcagacagc tgtcggcgac cgctacgtag tagaagcaat gaaaaaagac 960

ggctacaacg tcggcggaga gcagtcagga catcttattt tccttgatta caacacgaca 1020

ggggacggat tattgtctgc tattatgctg atgaacactt taaaagcaac aggcaagccg 1080

ctgtcagagc ttgcagctga aatgcagaag ttcccgcagc tgttagtcaa tgtgagagtg 1140

actgataaat ataaagttga agaaaatgaa aaagtaaaag cagttatttc tgaagttgaa 1200

aaagaaatga acggcgacgg ccggattttg gtgcgccctt caggaactga accgctcgtc 1260

cgtgtcatgg ctgaagcgaa gacgaaagag ctgtgcgatg agtatgtcaa tcgcattgtt 1320

gaagtcgtcc ggtcagaaat gggattagag tatctaga 1358

<210> 23

<211> 42

<212> DNA

<213> 反向引物(Artificial Sequence)

<400> 23

atcgcgccaa caattccaca catttactct aatcccattt ct 42

<210> 24

<211> 3188

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 24

ggatccatgg gcaagtattt tggaacagac ggtgtaagag gtgtcgccaa tagtgagctt 60

acacctgagc tggcctttaa agtcggacgt ttcggcggtt atgtgctgac aaaagacaaa 120

caacgtccaa aagtgctgat aggccgcgat acacgcatct ccggccatat gctggaggga 180

gcccttgtcg ccggactttt atccattggc gcagaagtca tgcgcctggg tgtcatttct 240

acaccaggtg tatcttattt gacaaaagcg atggatgcag aggcgggcgt catgatttcc 300

gcttctcata acccagtgca ggataacggc atcaaattct ttgggggaga tggatttaag 360

ctttctgatg aacaggaggc tgaaattgag cgcctgatgg acgaacctga ggataagctg 420

ccaagacctg tcggagcaga ccttggactt gtaaacgatt attttgaagg cggacaaaaa 480

tatctgcaat tcttaaaaca gacagctgat gaagatttca caggcattca tgtggcattg 540

gactgtgcca atggcgcaac gtcatccttg gcgacacacc tgtttgctga tttagatgca 600

gatgtttcta caatggggac ttccccgaac ggattaaaca ttaatgacgg cgtcggttcg 660

actcatcccg aagcgctcag cgcgtttgtc aaagagaaaa acgcggatct cggtcttgcg 720

ttcgacggtg acggcgaccg cctgattgct gtcgatgaaa aaggaaatat tgtagacggc 780

gaccaaatca tgtacatatg ctcaaaacat ctgaaatcag agggccgttt aaaggatgat 840

acagtggttt caaccgtgat gagcaacctc ggcttctata aggcgctcga aaaagaaggc 900

atcaaaagcg tgcagacagc tgtcggcgac cgctacgtag tagaagcaat gaaaaaagac 960

ggctacaacg tcggcggaga gcagtcagga catcttattt tccttgatta caacacgaca 1020

ggggacggat tattgtctgc tattatgctg atgaacactt taaaagcaac aggcaagccg 1080

ctgtcagagc ttgcagctga aatgcagaag ttcccgcagc tgttagtcaa tgtgagagtg 1140

actgataaat ataaagttga agaaaatgaa aaagtaaaag cagttatttc tgaagttgaa 1200

aaagaaatga acggcgacgg ccggattttg gtgcgccctt caggaactga accgctcgtc 1260

cgtgtcatgg ctgaagcgaa gacgaaagag ctgtgcgatg agtatgtcaa tcgcattgtt 1320

gaagtcgtcc ggtcagaaat gggattagag taatgtgtgg aattgttggc gcgatcgcgc 1380

aacgtgatgt agcagaaatc cttcttgaag gtttacgtcg tctggaatac cgcggatatg 1440

actctgccgg tctggccgtt gttgatacag aaggtcatat gacccgcctg cgtcgcctcg 1500

gtaaagtcca gatgctggca caggcagcgg aagaacatcc tctgcatggc ggcactggta 1560

ttgctcacac tcgctgggcg acccacggtg aaccttcaga agtgaatgcg catccgcatg 1620

tttctgaaca cattgtggtg gtgcataacg gcatcatcga aaaccatgaa ccgctgcgtg 1680

aagagctaaa agcgcgtggc tataccttcg tttctgaaac cgacaccgaa gtgattgccc 1740

atctggtgaa ctgggagctg aaacaaggcg ggactctgcg tgaggccgtt ctgcgtgcta 1800

tcccgcagct gcgtggtgcg tacggtacag tgatcatgga ctcccgtcac ccggataccc 1860

tgctggcggc acgttctggt agtccgctgg tgattggcct ggggatgggc gaaaacttta 1920

tcgcttctga ccagctggcg ctgttgccgg tgacccgtcg ctttatcttc cttgaagagg 1980

gcgatattgc ggaaatcact cgccgttcgg taaacatctt cgataaaact ggcgcggaag 2040

taaaacgtca ggatatcgaa tccaatctgc aatatgacgc gggcgataaa ggcatttact 2100

gtcactacat gcagaaagag atctacgaac agccgaacgc gatcaaaaac acccttaccg 2160

gacgcatcag ccacggtcag gttgatttaa gcgagctggg accgaacgcc gacgaactgc 2220

tgtcgaaggt tgagcatatt cagatcctcg cctgtggtac ttcttataac tccggtatgg 2280

tttcccgcta ctggtttgaa tcgctagcag gtattccgtg cgacgtcgaa atcgcctctg 2340

aattccgcta tcgcaaatct gccgtgcgtc gtaacagcct gatgatcacc ttgtcacagt 2400

ctggcgaaac cgcggatacc ctggctggcc tgcgtctgtc gaaagagctg ggttaccttg 2460

gttcactggc aatctgtaac gttccgggtt cttctctggt gcgcgaatcc gatctggcgc 2520

taatgaccaa cgcgggtaca gaaatcggcg tggcatccac taaagcattc accactcagt 2580

taactgtgct gttgatgctg gtggcgaagc tgtctcgcct gaaaggtctg gatgcctcca 2640

ttgaacatga catcgtgcat ggtctgcagg cgctgccgag ccgtattgag cagatgctgt 2700

ctcaggacaa acgcattgaa gcgctggcag aagatttctc tgacaaacat cacgcgctgt 2760

tcctgagccg tggcgatcag tacccaatcg cgctggaagg cgcattgaag ttgaaagaga 2820

tctcttacat tcacgctgaa gcctacgctg ctggcgaact gaaacacggt ccgctggcgc 2880

taattgatgc cgatatgccg gttattgttg ttgcaccgaa caacgaattg ctggaaaaac 2940

tgaaatccaa cattgaagaa gttcgcgcgc gtggcggtca gttgtatgtc ttcgccgatc 3000

aggatgcggg ttttgtaagt agcgataaca tgcacatcat cgagatgccg catgtggaag 3060

aggtgattgc accgatcttc tacaccgttc cgctgcagct gctggcttac catgtcgcgc 3120

tgatcaaagg caccgacgtt gaccagccgc gtaacctggc aaaatcggtt acggttgagt 3180

aatctaga 3188

Claims

1.一种高产N-乙酰神经氨酸的重组枯草芽孢杆菌，其特征在于，以枯草芽孢杆菌为表达宿主，将N-乙酰神经氨酸合成酶基因neuB和N-乙酰葡萄糖胺2-差向异构酶基因neuC整合到枯草芽孢杆菌基因组上稳定表达，然后通过在质粒上过表达磷酸葡萄糖胺变位酶基因glmM和果糖6-磷酸转氨酶基因glmS。

2.根据权利要求1所述的一种高产N-乙酰神经氨酸的重组枯草芽孢杆菌，其特征在于，以质粒pHT01为表达载体，以诱导型启动子Pgrac过表达磷酸葡萄糖胺变位酶基因glmM和果糖6-磷酸转氨酶基因glmS。

3.根据权利要求2所述的一种高产N-乙酰神经氨酸的重组枯草芽孢杆菌，其特征在于，所述诱导型启动子Pgrac的核苷酸序列为SEQ ID NO.1。

4.根据权利要求1所述的一种高产N-乙酰神经氨酸的重组枯草芽孢杆菌，其特征在于，所述磷酸葡萄糖胺变位酶基因glmM的核苷酸序列为SEQ ID NO.2；所述果糖6-磷酸转氨酶基因glmS的核苷酸序列为SEQ ID NO.3。

5.根据权利要求1所述的一种高产N-乙酰神经氨酸的重组枯草芽孢杆菌，其特征在于，所述磷酸葡萄糖胺变位酶基因glmM来源于枯草芽孢杆菌或能表达相同功能酶的微生物。

6.根据权利要求1所述的一种高产N-乙酰神经氨酸的重组枯草芽孢杆菌，其特征在于，所述果糖6-磷酸转氨酶基因glmS来源于大肠杆菌或能表达相同功能酶的微生物。

7.一种如权利要求1-6任一所述的高产N-乙酰神经氨酸的重组枯草芽孢杆菌的构建方法，其特征在于，包括以下步骤：

（1）将N-乙酰神经氨酸合成酶基因neuB、N-乙酰葡萄糖胺2-差向异构酶基因neuC重组于枯草芽孢杆菌基因组；具体位置是淀粉酶amyE基因上；

（2）在质粒上过表达磷酸葡萄糖胺变位酶基因glmM和果糖6-磷酸转氨酶基因glmS，即得高产N-乙酰神经氨酸的重组枯草芽孢杆菌。

8.根据权利要求7所述的构建方法，其特征在于，步骤（1）的具体步骤为：

克隆N-乙酰神经氨酸合成酶基因neuB和N-乙酰葡萄糖胺2-差向异构酶基因neuC，克隆Pgrac启动子基因序列和淀粉酶amyE两侧同源臂基因序列，4段基因通过Overlap PCR组装。

9.根据权利要求7所述的构建方法，其特征在于，步骤（2）的具体步骤为：

（a）以枯草芽孢杆菌基因组DNA为模板PCR扩增获得glmM基因片段；

（b）以大肠杆菌菌株基因组DNA为模板PCR扩增获得glmS基因片段；

（c）以glmM片段和glmS片段为模板PCR扩增获得glmM-glmS基因片段；

（d）通过酶切连接克隆至表达载体pHT01上。

10.一种如权利要求1-6任一所述的高产N-乙酰神经氨酸的重组枯草芽孢杆菌的应用，其特征在于，以甘油为底物，采用所述重组枯草芽孢杆菌发酵生产N-乙酰神经氨酸。