CN112322565A

CN112322565A - 提高重组大肠杆菌中2’-岩藻糖基乳糖产量的方法

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Publication number: CN112322565A
Application number: CN202011240682.5A
Authority: CN
Inventors: 刘龙; 陈坚; 刘振民; 堵国成; 李江华; 吕雪芹; 苏米亚; 林璐; 房峻
Original assignee: Jiangnan University; Bright Dairy and Food Co Ltd
Current assignee: Jiangnan University; Bright Dairy and Food Co Ltd
Priority date: 2020-11-09
Filing date: 2020-11-09
Publication date: 2021-02-05
Anticipated expiration: 2040-11-09
Also published as: CN112322565B

Abstract

本发明公开了一种提高重组大肠杆菌中2’‑岩藻糖基乳糖产量的方法，属于基因工程技术领域。本发明采用柔性Linker将四种不同蛋白标签分别融合在α‑1,2‑岩藻糖基转移酶FutC的N端，构建的融合蛋白FP‑futC可以不同程度地提高α‑1,2‑岩藻糖基转移酶催化合成2'‑FL的产量。其中，采用TrxA‑futC融合蛋白合成2'‑FL的产量最高，达到2.94g/L，底物乳糖的消耗达到3.55g/L，乳糖转化率为0.58mol/mol。而在对照组中，不加蛋白标签构建的质粒pMA09‑futC获得的重组大肠杆菌合成2'‑FL的产量仅为1.71g/L，乳糖消耗量为2.88g/L，乳糖转化率仅为0.42mol/mol。进一步将TrxA‑futC融合蛋白基因整合至大肠杆菌MG1655基因组上的yjiP位点，获得一株无质粒的2'‑FL基因工程菌株MG‑26△yjiP::trxA‑futC，摇瓶发酵后2'‑FL的产量达到3.85g/L，乳糖转化率为0.68mol/mol。

Description

提高重组大肠杆菌中2’-岩藻糖基乳糖产量的方法

技术领域

本发明涉及一种提高重组大肠杆菌中2’-岩藻糖基乳糖产量的方法，属于基因工程技术领域。

背景技术

人乳低聚糖(Human milk oligosaccharides,HMOs)是一类母乳中含量仅次于脂肪和乳糖的新型功能性糖源，可以促进新生儿中有益肠道细菌的生长，增强肠道的屏障功能，对新生儿免疫系统的发育起着重要作用。HMOs具有多种核心单糖结构单元，根据构成HMOs单糖结构单元的不同空间构型、糖基序列、链长等，在糖链的不同位点上进一步岩藻糖化或唾液酸化，可以形成各种结构的HMOs，目前已鉴定出大约200种HMOs分子，其中，以中性岩藻糖基化HMOs为主。2'-岩藻糖基乳糖(2'-FL)是人乳中含量最丰富的一类岩藻糖基低聚糖，已被美国食品和药物管理局(FDA)批准为GRAS级别的HMOs，可作为高档婴配奶粉的营养补充剂，是目前最具商业价值的一种岩藻糖基乳糖。

岩藻糖基转移酶(Fucosyltranferase,FucTs,EC 2.4.1.69)广泛地分布于植物、脊椎动物和细菌中，通常是将岩藻糖从供体底物岩藻糖鸟苷二磷酸(GDP-L-fucose,GDP-L-Fuc)转移至寡糖、糖蛋白和糖脂等糖受体底物上，催化糖缀合物的岩藻糖基化。根据反应过程中形成的不同糖苷键，FucTs可以分成α-1,2-FucT、α-1,3/4-FucT、α-1,6-FucT和O-FucTs四个亚家族。α-1,2-岩藻糖基转移酶(α-1,2-FucT)属于CAZY家族11，催化岩藻糖从供体底物GDP-L-Fuc转移到受体底物，如Galβ1,4Glc NAc或Galβ1,3Glc NAc的半乳糖基上，形成α-1,2-糖苷键。其中，岩藻糖基化的2'-FL是通过α-1,2-岩藻糖基转移酶催化岩藻糖从GDP-L-Fuc转移到底物乳糖的半乳糖基上形成的(图1)。

迄今为止，多种方法已用于合成2'-FL，包括化学合成法、酶合成法和生物合成法。其中，化学合成法需要精确地选择性保护不同的羟基，合成过程中的副产物比例高，不利于产物2'-FL的分离纯化，很难实现2'-FL的高效合成。酶法合成中，需要添加昂贵的前体试剂GDP-L-Fuc催化合成2'-FL，使得大规模生产2'-FL的工业化成本较高。而生物合成法作为一种环境友好型的方法，可以利用微生物自身代谢途径合成供体GDP-L-Fuc，进一步在α-1,2-岩藻糖基转移酶的作用下催化合成2'-FL。目前，研究人员已在多种工业菌株中，包括大肠杆菌、谷氨酸棒状杆菌、枯草芽孢杆菌、酿酒酵母等，构建了2'-FL的合成途径。例如，Huang等人以Escherichia coli BL21(DE3)作为出发菌株，敲除wcaJ基因，阻断了GDP-L-Fuc生成克拉酸的反应；过表达调控蛋白RcsA以提高GDP-L-Fuc前体积累，在摇瓶发酵2’-FL的产量达到9.1g/L。Jung等人以Escherichia coli BL21作为出发菌株，异源表达α-1,2-岩藻糖基转移酶FutC和岩藻糖激酶Fkp；敲除araA和rhaA基因，阻断了岩藻糖生成墨角藻糖的反应，摇瓶发酵2’-FL产量达到4.1g/L，3-L发酵罐中2’-FL的产量达到47g/L。然而，异源蛋白在大肠杆菌中容易因错误折叠而聚集形成无活性的包涵体，鲜有研究关注α-1,2-岩藻糖基转移酶FutC在异源宿主中的高效表达，目前构建的2’-FL基因工程菌中采用多种质粒来发酵生产2’-FL，而质粒过多容易对宿主菌的代谢造成一定负担，此外在工业化生产中质粒容易丢失，不利于长时间发酵积累2’-FL。因此，将α-1,2-岩藻糖基转移酶FutC整合至基因组上，可以获得相对稳定的2’-FL基因工程菌株。

融合蛋白标签是指在蛋白质的N端或C端融合一段蛋白序列，其目的在于增强重组蛋白质的可溶性表达，以提高重组蛋白在大肠杆菌中的表达量。研究表明某些高度可溶的蛋白质，如谷胱甘肽S-转移酶(GST)、麦芽糖结合蛋白(MBP)、硫氧还蛋白A(TrxA)、转录终止抗终止因子(NusA)、蛋白二硫键折叠异构酶(DsbA)等，在与其它易形成包涵体的蛋白质融合后会促进融合蛋白质的可溶性表达。此外，近年来发现的泛素相关小修饰蛋白(SUMO)融合标签也被证明具有促进蛋白正确折叠的作用，可以调节融合蛋白与外源蛋白之间的作用，从而提高外源蛋白的溶解性。诸葛强等人发明了一种在大肠杆菌中高效表达的美国白蛾SUMO-ABP-dHC-CecropinA融合蛋白，具有明显的抗真菌活性。栾超利用SUMO融合技术在枯草芽孢杆菌中重组表达了一种Cathelicidin-BF(CBF)抗菌肽，并在体外验证了融合蛋白SUMO-CBF的抗菌活性。由此可见，融合蛋白标签已成为生产可溶性蛋白质的一种有效工具，被广泛应用于外源蛋白质的可溶性表达中。

近年来，利用微生物代谢途径合成2'-FL的研究集中于合成途径的构建、代谢竞争途径的基因敲除、辅因子的强化等方面，而关于α-1,2-岩藻糖基转移酶的高效表达方面鲜有报道。在2'-FL合成途径中，α-1,2-岩藻糖基转移酶催化供体GDP-L-Fuc转移至底物乳糖的半乳糖基上合成2'-FL，其稳定性和催化活性是高效合成2'-FL的关键限速步骤。尽管Huang等人考察了不同来源的α-1,2-岩藻糖基转移酶催化合成2'-FL的效率，发现来源于幽门螺旋杆菌的α-1,2-岩藻糖基转移酶合成2'-FL的效率最高，但并未对FutC的高效表达方面进一步改造。另一方面，在目前构建的2'-FL重组大肠杆菌中，需要添加诱导剂异丙基硫代半乳糖苷(IPTG)激活T₇启动子的活性，从而诱导α-1,2-岩藻糖基转移酶的表达，而IPTG试剂对细胞生长具有一定的毒害作用。

融合蛋白标签提供了一种外源蛋白在大肠杆菌中可溶性表达的有效策略，但由于外源蛋白在大肠杆菌中不表达或表达量很低的因素很多，例如翻译过程中因不正确折叠而形成无活性的包涵体，或是形成了非正确配对的二硫键造成蛋白质的不稳定表达，可能不同蛋白标签促进外源蛋白在大肠杆菌中表达的效果不同。目前还没有一种能够提高α-1,2-岩藻糖基转移酶在大肠杆菌中表达的融合蛋白标签。

发明内容

为解决上述技术问题，本发明构建基于N端融合蛋白标签的α-1,2-岩藻糖基转移酶合成2'-FL的重组大肠杆菌。考察不同蛋白标签与幽门螺旋杆菌来源的α-1,2-岩藻糖基转移酶FutC融合后，是否能促进FutC在大肠杆菌MG1655中催化合成2'-FL的效率。为避免融合蛋白和α-1,2-岩藻糖基转移酶在翻译过程中相互影响，在融合标签与FutC之间插入一段(GGGGS)₂柔性Linker(图2)；采用组成型启动子P_tac来表达N端融合了不同蛋白标签的α-1,2-岩藻糖基转移酶FutC，以避免IPTG诱导剂的添加对细胞生长的毒害作用；最后将带有融合标签蛋白的FutC整合至大肠杆菌基因组上，可以获得相对稳定的2’-FL基因工程菌株。

本发明的第一个目的是提供一种提高重组大肠杆菌中2'-岩藻糖基乳糖产量的方法，所述方法是在大肠杆菌宿主中异源表达N端融合蛋白标签的α-1,2-岩藻糖基转移酶。

进一步地，所述的大肠杆菌宿主为大肠杆菌MG1655△fliR::futC,△fuck::fkp,△lacI,△wcaJ,△lacZ,△flgA::futC,△flgG::futC。

进一步地，所述的蛋白标签为硫氧还蛋白A(TrxA)、类泛素蛋白修饰分子(SUMO)、麦芽糖结合蛋白(MBP)或转录终止抗终止因子(NusA)。

进一步地，所述的蛋白标签与α-1,2-岩藻糖基转移酶之间通过Linker进行连接，所述的Linker为(GGGGS)₂。

进一步地，所述的α-1,2-岩藻糖基转移酶来源于幽门螺旋杆菌，α-1,2-岩藻糖基转移酶的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示。

进一步地，所述的硫氧还蛋白A的氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示，类泛素蛋白修饰分子的氨基酸序列如SEQ ID NO.3所示，麦芽糖结合蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO.4所示，转录终止抗终止因子的氨基酸序列如SEQ ID NO.5所示。

进一步地，所述的N端融合蛋白标签的α-1,2-岩藻糖基转移酶通过组成型启动子P_tac进行表达。

本发明的第二个目的是提供一种大肠杆菌重组菌，所述的大肠杆菌重组菌是在大肠杆菌宿主中异源表达N端融合蛋白标签的α-1,2-岩藻糖基转移酶；所述的大肠杆菌宿主菌为大肠杆菌MG1655△fliR::futC,△fuck::fkp,△lacI,△wcaJ,△lacZ,△flgA::futC,△flgG::futC，所述的蛋白标签为硫氧还蛋白A，且所述的N端融合蛋白标签的α-1,2-岩藻糖基转移酶通过组成型启动子P_tac进行表达。

本发明的第三个目的是提供所述的大肠杆菌重组菌在合成2'-岩藻糖基乳糖中的应用。

进一步地，所述的应用是将所述大肠杆菌重组菌种子液以0.5-2％的接种量接种至发酵培养基中，于30-37℃、200-250r/min条件下培养5-10h后，添加L-岩藻糖1-5g/L、乳糖1-5g/L，继续发酵至60-80h，分离发酵液得到2'-岩藻糖基乳糖。

本发明的有益效果是：

本发明采用(GGGGS)₂柔性Linker将四种不同蛋白标签分别融合在α-1,2-岩藻糖基转移酶FutC的N端，构建的融合蛋白FP-futC可以不同程度地提高α-1,2-岩藻糖基转移酶催化合成2'-FL的产量。其中，采用TrxA-futC融合蛋白合成2'-FL的产量最高，达到2.94g/L，底物乳糖的消耗达到3.55g/L，乳糖转化率为0.58mol/mol。而在对照组中，不加蛋白标签构建的质粒pMA09-futC获得的重组大肠杆菌合成2'-FL的产量仅为1.71g/L，乳糖消耗量为2.88g/L，乳糖转化率仅为0.42mol/mol。进一步将TrxA-futC融合蛋白基因整合至大肠杆菌MG1655基因组上的yjiP位点，获得一株无质粒的2'-FL基因工程菌株MG-26△yjiP::trxA-futC，摇瓶发酵后2'-FL的产量达到3.85g/L，乳糖转化率为0.68mol/mol。

由此可见，结合N端融合蛋白标签和基因组整合策略，可以提高α-1,2-岩藻糖基转移酶FutC催化合成2'-FL的效率，并提高底物乳糖的转化效率，从而有效促进2'-FL的合成。本发明重组大肠杆菌的构建方法简单，具有很好的应用前景。

附图说明

图1为α-1,2-岩藻糖基转移酶催化合成2'-FL的化学反应式；

图2为重组质粒pMA09-FP-futC的构建示意图；

图3为实施例2摇瓶发酵重组大肠杆菌合成2'-FL的结果图；

图4为实施例3摇瓶发酵重组大肠杆菌合成2'-FL的结果图；

图5为通过HPLC检测2'-FL和乳糖的标准曲线图。

具体实施方式

下面结合附图和具体实施例对本发明作进一步说明，以使本领域的技术人员可以更好地理解本发明并能予以实施，但所举实施例不作为对本发明的限定。

为检测本发明所述的重组大肠杆菌合成2'-FL的产量以及底物乳糖的消耗量，采用高效液相色谱(HPLC)系统(Agilent Technologies 1260系列)检测重组大肠杆菌发酵液中2'-FL的合成量和乳糖的消耗量。具体是通过Rezex ROA有机酸柱(Phenomenex,Torrance,CA,USA)测定发酵上清液中2'-FL和乳糖的胞外浓度。其中，HPLC检测器为示差检测器，流动相采用0.01N稀H₂SO₄洗脱，色谱柱的检测温度设置为55℃，检测流速设置为0.6mL/min。

实施例中使用的大肠杆菌MG-26是在大肠杆菌MG1655△fliR::futC,△fuck::fkp,△lacI基础上敲除了△wcaJ,△lacZ,并在基因组上增加了2个拷贝数的futC，得到大肠杆菌MG1655△fliR::futC,△fuck::fkp,△lacI,△wcaJ,△lacZ,△flgA::futC,△flgG::futC，即为大肠杆菌MG-26，其中大肠杆菌MG1655△fliR::futC,△fuck::fkp,△lacI在公开号为CN111575220A的专利中公开。

实施例1：

(1)异源表达幽门螺杆菌来源的α-1,2-岩藻糖基转移酶

全基因合成NCBI上公布的幽门螺旋杆菌(Helicobacter pylori，ATCC No.26695)的α-1,2-岩藻糖基转移酶基因futC序列，通过PCR对futC基因和表达载体pMA09进行扩增，使用DpnI酶消化模板质粒，并对futC基因片段和线性化载体pMA09片段进行纯化回收。然后使用无缝克隆试剂盒(Seamless Cloning Kit)将futC基因和线性化载体pMA09进行重组连接。重组反应体系在50℃反应15-20min后冰浴30-40min，随后将重组体系化转到大肠杆菌JM109感受态细胞，37℃复苏1h涂布于终浓度为0.1mM的氨苄霉素抗性LB平板，37℃培养10-12h。最后挑选氨苄霉素抗性平板上的单菌落进行菌落PCR验证，并通过测序确认α-1,2-岩藻糖基转移酶FutC是否构建成功。

(2)构建融合蛋白质粒pMA09-TrxA-futC

以大肠杆菌MG1655为模板，PCR扩增后纯化回收获得硫氧还蛋白A(TrxA)的基因片段trxA；以上述步骤(1)中测序正确的重组质粒pMA09-futC为模板，通过反向PCR线性化扩增表达质粒pMA09-futC，随后使用DpnI酶消化模板质粒，纯化回收pMA09-futC线性化载体片段。然后使用无缝克隆试剂盒(Seamless Cloning Kit)将trxA基因片段和线性化载体pMA09-futC进行重组连接。其中，trxA的基因序列连接到futC基因的N端，(GGGGS)₂柔性Linker的基因序列设计在trxA的C端和futC的N端连接处，构建融合蛋白序列TrxA-futC。重组反应体系在50℃反应15-20min后冰浴30-40min，再将其化转到大肠杆菌JM109感受态细胞，37℃复苏1h涂布终浓度为0.1mM的氨苄霉素抗性LB平板，37℃培养10-12h。最后挑选氨苄霉素抗性平板上的单菌落进行菌落PCR验证，并通过测序确认融合蛋白TrxA-futC是否构建成功。

对比例1：

构建融合蛋白载体pMA09-SUMO-futC

全基因合成获得类泛素蛋白修饰分子(SUMO)的基因片段sumo，随后制备pMA09-futC线性化载体片段，步骤同实施例1。然后使用无缝克隆试剂盒(Seamless Cloning Kit)将sumo基因片段和线性化载体pMA09-futC进行重组连接。其中，sumo的基因序列连接到futC基因的N端，(GGGGS)₂柔性Linker的基因序列设计在sumo的C端和futC的N端连接处，构建融合蛋白SUMO-futC。重组反应体系在50℃反应15-20min后冰浴30-40min，再将其化转到大肠杆菌JM109感受态细胞，37℃复苏1h涂布终浓度为0.1mM的氨苄霉素抗性LB平板，37℃培养10-12h。最后挑选氨苄霉素抗性平板上的单菌落进行菌落PCR验证，并通过测序确认融合蛋白SUMO-futC是否构建成功。

对比例2：

构建融合蛋白载体pMA09-MBP-futC

以大肠杆菌MG1655为模板，PCR扩增后纯化回收获得麦芽糖结合蛋白(MBP)的基因片段malE，随后制备pMA09-futC线性化载体片段，步骤同实施例1。然后使用无缝克隆试剂盒(Seamless Cloning Kit)将malE基因和线性化载体pMA09-futC进行重组连接。其中，malE的基因序列连接到futC基因的N端，(GGGGS)₂柔性Linker的基因序列设计在malE的C端和futC的N端连接处，构建融合蛋白MBP-futC。重组反应体系在50℃反应15-20min后冰浴30-40min，再将其化转到大肠杆菌JM109感受态细胞，37℃复苏1h涂布终浓度为0.1mM的氨苄霉素抗性LB平板，37℃培养10-12h。最后挑选氨苄霉素抗性平板上的单菌落进行菌落PCR验证，并通过测序确认融合蛋白MBP-futC是否构建成功。

对比例3：

构建融合蛋白载体pMA09-NusA-futC

以大肠杆菌MG1655为模板，PCR扩增后纯化回收获得转录终止抗终止因子(NusA)的基因片段nusA，随后制备pMA09-futC线性化载体片段，步骤同实施例1。然后使用无缝克隆试剂盒(Seamless Cloning Kit)将nusA基因和线性化载体pMA09-futC进行重组连接。其中，nusA的基因序列连接到futC基因的N端，(GGGGS)₂柔性Linker的基因序列设计在nusA的C端和futC的N端连接处，构建融合蛋白NusA-futC。重组反应体系在50℃反应15-20min后冰浴30-40min，再将其化转到大肠杆菌JM109感受态细胞，37℃复苏1h涂布终浓度为0.1mM的氨苄霉素抗性LB平板，37℃培养10-12h。最后挑选氨苄霉素抗性平板上的单菌落进行菌落PCR验证，并通过测序确认融合蛋白NusA-futC是否构建成功。

实施例2：

摇瓶发酵重组菌合成2'-FL

将上述实施例和对比例测序正确的重组质粒pMA09-TrxA-futC、pMA09-SUMO-futC、pMA09-MBP-futC和pMA09-NusA-futC分别转入MG-26感受态中，37℃复苏1h涂布终浓度为0.1mM的氨苄霉素抗性LB平板，37℃培养10-12h，以获得融合不同蛋白标签的pMA09-FP-futC发酵重组菌。挑取单菌落到终浓度为0.1mM氨苄霉素的LB培养基(胰蛋白胨10g/L、酵母粉5g/L、NaCl 10g/L)中培养8-10h，作为摇瓶发酵的种子液。然后将种子液按1％的接种量接入到装有20-25mL发酵培养基的250mL三角瓶中，同时添加终浓度为0.1mM的氨苄霉素，发酵培养基的配方是：甘油5-6g/L、胰蛋白胨12g/L、酵母粉24g/L、磷酸氢二钾12.54g/L、磷酸二氢钾2.31g/L。随后将三角瓶置于30℃、220r/min条件下培养7-9h后，添加终浓度为1-2g/L的L-岩藻糖、3-4g/L的乳糖至摇瓶中，继续摇瓶发酵至72h。

发酵结束时，采用高效液相色谱仪(HPLC)测定发酵上清液的2'-FL产量以及发酵液中乳糖的剩余量。首先取1-2mL发酵液在12000rpm下离心15-20min后，收集上清液，通过HPLC检测细胞外2'-FL和乳糖的浓度。发酵液中2'-FL和乳糖的HPLC检测结果如图3所示，最终测定重组大肠杆菌pMA09-TrxA-futC胞外的2'-FL产量达到2.94g/L，乳糖的消耗量达到3.55g/L，乳糖转化为2'-FL的得率为0.58mol/mol；pMA09-SUMO-futC胞外的2'-FL产量达到2.56g/L，乳糖的消耗量达到3.72g/L，乳糖转化为2'-FL的得率为0.48mol/mol；pMA09-MBP-futC胞外的2'-FL产量达到2.19g/L，乳糖的消耗量达到3.14g/L，乳糖转化为2'-FL的得率为0.49mol/mol；pMA09-NusA-futC胞外的2'-FL产量达到1.38g/L，乳糖的消耗量达到2.82g/L，乳糖转化为2'-FL的得率为0.34mol/mol。

实施例3：

基因敲入TrxA-futC融合蛋白基因

(1)制备带有pCas9质粒的大肠杆菌MG-26感受态

首先将pCas9质粒转化至大肠杆菌MG-26中，涂布在50μg/mL的卡那霉素平板上，30℃培养12h后挑取平板上的单菌落，接种于新鲜LB培养基，添加终浓度为50μg/mL的卡那霉素抗生素，30℃、220r/min过夜培养；将过夜培养的菌液按1％的接种量转接至含有50mL LB培养基的250mL锥形瓶中，待菌体OD₆₀₀达到0.2时，添加终浓度为30-40mmol/L的阿拉伯糖诱导pCas9质粒表达重组酶；继续培养至OD₆₀₀为0.6-0.7时，将菌液冰浴20min后，于5000r/min离心收集菌体细胞；用预冷的灭菌水洗涤细胞2次，倒掉上清液，用400-500μL预冷的10％甘油悬浮菌体，制备带有pCas9质粒的大肠杆菌MG1655感受态备用。

(2)整合片段与pTarget质粒的共转化

利用融合PCR技术获得由大肠杆菌MG1655基因组yjiP位点上下游同源臂、P_tac启动子和由实施例2构建的融合蛋白基因trxA-futC组成的整合片段HAyjiP-trxA-futC，其序列如SEQ ID NO.6所示，随后通过DNA凝胶电泳验证融合片段的长度；然后设计yjiP基因的N20序列，构建yjiP基因的pTarget-yjiP质粒。

将上述获得的整合片段HAyjiP-trxA-futC与pTarget-yjiP质粒按照2:1的质量比共同电转到带有pCas9质粒的大肠杆菌MG-26感受态中，加入800μL的LB培养基，在30℃、220r/min条件下培养2h，涂布含有卡那霉素(50μg/mL)和壮观霉素(50μg/mL)的平板中，30℃过夜培养。通过挑取单菌落进行PCR验证及DNA测序验证，确认融合蛋白基因trxA-futC成功整合至大肠杆菌基因组上的yjiP位点，得到无质粒的重组大肠杆菌MG-26△yjiP::trxA-futC。

(3)摇瓶发酵重组大肠杆菌MG-26△yjiP::trxA-futC

将上述大肠杆菌MG-26△yjiP::trxA-futC制成种子液，种子液培养基为LB培养基(胰蛋白胨10g/L、酵母粉5g/L、NaCl 10g/L)；种子液制作方法为：挑取新鲜平板上的单菌落在种子培养基中，培养10h。然后将种子液按1％的接种量接入到发酵培养基中，发酵培养基为TB培养基，其配方是：甘油5g/L、胰蛋白胨12g/L、酵母粉24g/L、磷酸氢二钾12.54g/L、磷酸二氢钾2.31g/L，于37℃、220r/min条件下培养7h后，添加L-岩藻糖2.5g/L、乳糖5g/L至摇瓶，继续摇瓶发酵至72h。

发酵结束时，采用高效液相色谱仪(HPLC)测定菌体胞外2'-FL的产量以及发酵液中乳糖的剩余量。首先将2mL发酵液在12000rpm下离心15-20min后，收集上清液，通过HPLC检测细胞外2'-FL和乳糖的浓度。2'-FL和乳糖的HPLC检测结果如图4所示，最终测定重组大肠杆菌MG-26△yjiP::trxA-futC胞外2'-FL的合成量达到3.85g/L，乳糖转化为2'-FL的得率为0.68mol/mol。

上述实施例中构建的重组大肠杆菌均采用高效液相色谱仪(HPLC)检测发酵上清液中2'-FL的产量和乳糖剩余量，通过Rezex ROA有机酸柱(Phenomenex,Torrance,CA,USA)检测2'-FL标准品和乳糖的出峰时间分别为7.2min和7.9min。因此，通过不同浓度标准品的出峰时间对应的峰面积可以确定2'-FL和乳糖的标准曲线(图5)，随后检测发酵上清液中2'-FL和乳糖的峰面积，最后通过标准曲线换算出2'-FL的胞外产量以及乳糖的剩余量。其中，HPLC检测器为示差检测器，流动相通过0.01N稀H₂SO₄洗脱，色谱柱的检测温度设置为55℃，检测流速为0.6mL/min。

以上所述实施例仅是为充分说明本发明而所举的较佳的实施例，本发明的保护范围不限于此。本技术领域的技术人员在本发明基础上所作的等同替代或变换，均在本发明的保护范围之内。本发明的保护范围以权利要求书为准。

序列表

<110> 江南大学，光明乳业股份有限公司

<120> 提高重组大肠杆菌中2’-岩藻糖基乳糖产量的方法

<160> 6

<170> PatentIn version 3.3

<210> 1

<211> 300

<212> PRT

<213> （人工序列）

<400> 1

Met Ala Phe Lys Val Val Gln Ile Cys Gly Gly Leu Gly Asn Gln Met

1 5 10 15

Phe Gln Tyr Ala Phe Ala Lys Ser Leu Gln Lys His Ser Asn Thr Pro

20 25 30

Val Leu Leu Asp Ile Thr Ser Phe Asp Trp Ser Asp Arg Lys Met Gln

35 40 45

Leu Glu Leu Phe Pro Ile Asp Leu Pro Tyr Ala Ser Glu Lys Glu Ile

50 55 60

Ala Ile Ala Lys Met Gln His Leu Pro Lys Leu Val Arg Asp Ala Leu

65 70 75 80

Lys Cys Met Gly Phe Asp Arg Val Ser Lys Glu Ile Val Phe Glu Tyr

85 90 95

Glu Pro Glu Leu Leu Lys Pro Ser Arg Leu Thr Tyr Phe Tyr Gly Tyr

100 105 110

Phe Gln Asp Pro Arg Tyr Phe Asp Ala Ile Ser Pro Leu Ile Lys Gln

115 120 125

Thr Phe Thr Leu Pro Pro Pro Pro Pro Glu Asn Gly Asn Asn Lys Lys

130 135 140

Lys Glu Glu Glu Tyr His Arg Lys Leu Ala Leu Ile Leu Ala Ala Lys

145 150 155 160

Asn Ser Val Phe Val His Ile Arg Arg Gly Asp Tyr Val Gly Ile Gly

165 170 175

Cys Gln Leu Gly Ile Asp Tyr Gln Lys Lys Ala Leu Glu Tyr Met Ala

180 185 190

Lys Arg Val Pro Asn Met Glu Leu Phe Val Phe Cys Glu Asp Leu Thr

195 200 205

Phe Thr Gln Asn Leu Asp Leu Gly Tyr Pro Phe Met Asp Met Thr Thr

210 215 220

Arg Asp Lys Glu Glu Glu Ala Tyr Trp Asp Met Leu Leu Met Gln Ser

225 230 235 240

Cys Gln His Gly Ile Ile Ala Asn Ser Thr Tyr Ser Trp Trp Ala Ala

245 250 255

Tyr Leu Ile Asn Asn Pro Glu Lys Ile Ile Ile Gly Pro Lys His Trp

260 265 270

Leu Phe Gly His Glu Asn Ile Leu Cys Lys Glu Trp Val Lys Ile Glu

275 280 285

Ser His Phe Glu Val Lys Ser Gln Lys Tyr Asn Ala

290 295 300

<210> 2

<211> 109

<212> PRT

<213> （人工序列）

<400> 2

Met Ser Asp Lys Ile Ile His Leu Thr Asp Asp Ser Phe Asp Thr Asp

1 5 10 15

Val Leu Lys Ala Asp Gly Ala Ile Leu Val Asp Phe Trp Ala Glu Trp

20 25 30

Cys Gly Pro Cys Lys Met Ile Ala Pro Ile Leu Asp Glu Ile Ala Asp

35 40 45

Glu Tyr Gln Gly Lys Leu Thr Val Ala Lys Leu Asn Ile Asp Gln Asn

50 55 60

Pro Gly Thr Ala Pro Lys Tyr Gly Ile Arg Gly Ile Pro Thr Leu Leu

65 70 75 80

Leu Phe Lys Asn Gly Glu Val Ala Ala Thr Lys Val Gly Ala Leu Ser

85 90 95

Lys Gly Gln Leu Lys Glu Phe Leu Asp Ala Asn Leu Ala

100 105

<210> 3

<211> 101

<212> PRT

<213> （人工序列）

<400> 3

Met Ser Asp Ser Glu Val Asn Gln Glu Ala Lys Pro Glu Val Lys Pro

1 5 10 15

Glu Val Lys Pro Glu Thr His Ile Asn Leu Lys Val Ser Asp Gly Ser

20 25 30

Ser Glu Ile Phe Phe Lys Ile Lys Lys Thr Thr Pro Leu Arg Arg Leu

35 40 45

Met Glu Ala Phe Ala Lys Arg Gln Gly Lys Glu Met Asp Ser Leu Arg

50 55 60

Phe Leu Tyr Asp Gly Ile Arg Ile Gln Ala Asp Gln Thr Pro Glu Asp

65 70 75 80

Leu Asp Met Glu Asp Asn Asp Ile Ile Glu Ala His Arg Glu Gln Ile

85 90 95

Gly Gly Ala Thr Tyr

100

<210> 4

<211> 396

<212> PRT

<213> （人工序列）

<400> 4

Met Lys Ile Lys Thr Gly Ala Arg Ile Leu Ala Leu Ser Ala Leu Thr

1 5 10 15

Thr Met Met Phe Ser Ala Ser Ala Leu Ala Lys Ile Glu Glu Gly Lys

20 25 30

Leu Val Ile Trp Ile Asn Gly Asp Lys Gly Tyr Asn Gly Leu Ala Glu

35 40 45

Val Gly Lys Lys Phe Glu Lys Asp Thr Gly Ile Lys Val Thr Val Glu

50 55 60

His Pro Asp Lys Leu Glu Glu Lys Phe Pro Gln Val Ala Ala Thr Gly

65 70 75 80

Asp Gly Pro Asp Ile Ile Phe Trp Ala His Asp Arg Phe Gly Gly Tyr

85 90 95

Ala Gln Ser Gly Leu Leu Ala Glu Ile Thr Pro Asp Lys Ala Phe Gln

100 105 110

Asp Lys Leu Tyr Pro Phe Thr Trp Asp Ala Val Arg Tyr Asn Gly Lys

115 120 125

Leu Ile Ala Tyr Pro Ile Ala Val Glu Ala Leu Ser Leu Ile Tyr Asn

130 135 140

Lys Asp Leu Leu Pro Asn Pro Pro Lys Thr Trp Glu Glu Ile Pro Ala

145 150 155 160

Leu Asp Lys Glu Leu Lys Ala Lys Gly Lys Ser Ala Leu Met Phe Asn

165 170 175

Leu Gln Glu Pro Tyr Phe Thr Trp Pro Leu Ile Ala Ala Asp Gly Gly

180 185 190

Tyr Ala Phe Lys Tyr Glu Asn Gly Lys Tyr Asp Ile Lys Asp Val Gly

195 200 205

Val Asp Asn Ala Gly Ala Lys Ala Gly Leu Thr Phe Leu Val Asp Leu

210 215 220

Ile Lys Asn Lys His Met Asn Ala Asp Thr Asp Tyr Ser Ile Ala Glu

225 230 235 240

Ala Ala Phe Asn Lys Gly Glu Thr Ala Met Thr Ile Asn Gly Pro Trp

245 250 255

Ala Trp Ser Asn Ile Asp Thr Ser Lys Val Asn Tyr Gly Val Thr Val

260 265 270

Leu Pro Thr Phe Lys Gly Gln Pro Ser Lys Pro Phe Val Gly Val Leu

275 280 285

Ser Ala Gly Ile Asn Ala Ala Ser Pro Asn Lys Glu Leu Ala Lys Glu

290 295 300

Phe Leu Glu Asn Tyr Leu Leu Thr Asp Glu Gly Leu Glu Ala Val Asn

305 310 315 320

Lys Asp Lys Pro Leu Gly Ala Val Ala Leu Lys Ser Tyr Glu Glu Glu

325 330 335

Leu Ala Lys Asp Pro Arg Ile Ala Ala Thr Met Glu Asn Ala Gln Lys

340 345 350

Gly Glu Ile Met Pro Asn Ile Pro Gln Met Ser Ala Phe Trp Tyr Ala

355 360 365

Val Arg Thr Ala Val Ile Asn Ala Ala Ser Gly Arg Gln Thr Val Asp

370 375 380

Glu Ala Leu Lys Asp Ala Gln Thr Arg Ile Thr Lys

385 390 395

<210> 5

<211> 495

<212> PRT

<213> （人工序列）

<400> 5

Met Asn Lys Glu Ile Leu Ala Val Val Glu Ala Val Ser Asn Glu Lys

1 5 10 15

Ala Leu Pro Arg Glu Lys Ile Phe Glu Ala Leu Glu Ser Ala Leu Ala

20 25 30

Thr Ala Thr Lys Lys Lys Tyr Glu Gln Glu Ile Asp Val Arg Val Gln

35 40 45

Ile Asp Arg Lys Ser Gly Asp Phe Asp Thr Phe Arg Arg Trp Leu Val

50 55 60

Val Asp Glu Val Thr Gln Pro Thr Lys Glu Ile Thr Leu Glu Ala Ala

65 70 75 80

Arg Tyr Glu Asp Glu Ser Leu Asn Leu Gly Asp Tyr Val Glu Asp Gln

85 90 95

Ile Glu Ser Val Thr Phe Asp Arg Ile Thr Thr Gln Thr Ala Lys Gln

100 105 110

Val Ile Val Gln Lys Val Arg Glu Ala Glu Arg Ala Met Val Val Asp

115 120 125

Gln Phe Arg Glu His Glu Gly Glu Ile Ile Thr Gly Val Val Lys Lys

130 135 140

Val Asn Arg Asp Asn Ile Ser Leu Asp Leu Gly Asn Asn Ala Glu Ala

145 150 155 160

Val Ile Leu Arg Glu Asp Met Leu Pro Arg Glu Asn Phe Arg Pro Gly

165 170 175

Asp Arg Val Arg Gly Val Leu Tyr Ser Val Arg Pro Glu Ala Arg Gly

180 185 190

Ala Gln Leu Phe Val Thr Arg Ser Lys Pro Glu Met Leu Ile Glu Leu

195 200 205

Phe Arg Ile Glu Val Pro Glu Ile Gly Glu Glu Val Ile Glu Ile Lys

210 215 220

Ala Ala Ala Arg Asp Pro Gly Ser Arg Ala Lys Ile Ala Val Lys Thr

225 230 235 240

Asn Asp Lys Arg Ile Asp Pro Val Gly Ala Cys Val Gly Met Arg Gly

245 250 255

Ala Arg Val Gln Ala Val Ser Thr Glu Leu Gly Gly Glu Arg Ile Asp

260 265 270

Ile Val Leu Trp Asp Asp Asn Pro Ala Gln Phe Val Ile Asn Ala Met

275 280 285

Ala Pro Ala Asp Val Ala Ser Ile Val Val Asp Glu Asp Lys His Thr

290 295 300

Met Asp Ile Ala Val Glu Ala Gly Asn Leu Ala Gln Ala Ile Gly Arg

305 310 315 320

Asn Gly Gln Asn Val Arg Leu Ala Ser Gln Leu Ser Gly Trp Glu Leu

325 330 335

Asn Val Met Thr Val Asp Asp Leu Gln Ala Lys His Gln Ala Glu Ala

340 345 350

His Ala Ala Ile Asp Thr Phe Thr Lys Tyr Leu Asp Ile Asp Glu Asp

355 360 365

Phe Ala Thr Val Leu Val Glu Glu Gly Phe Ser Thr Leu Glu Glu Leu

370 375 380

Ala Tyr Val Pro Met Lys Glu Leu Leu Glu Ile Glu Gly Leu Asp Glu

385 390 395 400

Pro Thr Val Glu Ala Leu Arg Glu Arg Ala Lys Asn Ala Leu Ala Thr

405 410 415

Ile Ala Gln Ala Gln Glu Glu Ser Leu Gly Asp Asn Lys Pro Ala Asp

420 425 430

Asp Leu Leu Asn Leu Glu Gly Val Asp Arg Asp Leu Ala Phe Lys Leu

435 440 445

Ala Ala Arg Gly Val Cys Thr Leu Glu Asp Leu Ala Glu Gln Gly Ile

450 455 460

Asp Asp Leu Ala Asp Ile Glu Gly Leu Thr Asp Glu Lys Ala Gly Ala

465 470 475 480

Leu Ile Met Ala Ala Arg Asn Ile Cys Trp Phe Gly Asp Glu Ala

485 490 495

<210> 6

<211> 2325

<212> DNA

<213> （人工序列）

<400> 6

ggcgggtaaa aaaacgtggc ataacaaaca actccttgtc cggagaaccc caacggggaa 60

aacgaaattc aataccgtcg gtaatgacga aaggcaggtg agaagggcaa cgagactgca 120

aatgtactga atttcatgta atcaaccaca ctgcctgtga acacacagac agagaaatac 180

tttctgactt cgggtcagaa tgtataacga ttacaaatag tcatcagcac attacacctc 240

ttgaattgat gggttgcata gaaaatatac accttaagtg taattaaaat ttgcggttaa 300

tcaaaagagc gcggtggaaa ggggaatatc tgccgggtac aggacatgta aaacgcgagc 360

ttgtttccgg aaaaatgtat cgtttgcaga agaataaaaa tagcctggaa agcgcctcgg 420

ggaatgggaa attgccgggt gagaatggtt ttgttagtcg ctaaagtcag gccatctttt 480

tcaacaggtg atggatcgcc ttgacaatta atcatcggct cgtataatgt gatcagacct 540

ttgtttaact ttaagaagga gatataccat gagcgataaa attattcacc tgactgacga 600

cagttttgac acggatgtac tcaaagcgga cggggcgatc ctcgtcgatt tctgggcaga 660

gtggtgcggt ccgtgcaaaa tgatcgcccc gattctggat gaaatcgctg acgaatatca 720

gggcaaactg accgttgcaa aactgaacat cgatcaaaac cctggcactg cgccgaaata 780

tggcatccgt ggtatcccga ctctgctgct gttcaaaaac ggtgaagtgg cggcaaccaa 840

agtgggtgca ctgtctaaag gtcagttgaa agagttcctc gacgctaacc tggcgggtgg 900

tggtggttct ggtggtggtg gttctgcatt taaggttgtt cagatttgcg gggggttagg 960

gaatcagatg tttcaatatg cgtttgcgaa aagcctgcaa aaacactcaa atacgccggt 1020

tctgctggat attacgtcgt ttgattggtc agatagaaaa atgcaactgg aactgtttcc 1080

gatcgatctg ccatatgcaa gcgaaaaaga aattgcaatc gcaaaaatgc aacatctgcc 1140

taaactggtg agagatgcgc tgaaatgcat gggattcgac cgcgtttcaa aagaaattgt 1200

ttttgaatac gagccggaac tgctgaaacc gtcaagactg acatacttct atggttactt 1260

ccaagatccg agatattttg atgcgatcag tcctctgatt aaacaaacat ttacactgcc 1320

gccgccgccg cctgaaaatg gcaacaataa aaagaaagaa gaggaatatc accgcaaatt 1380

agcactgatt ctggcagcaa aaaattcagt ttttgttcat attagaagag gcgattatgt 1440

tggcattggc tgccaactgg gcattgatta tcaaaaaaaa gcactggaat atatggcaaa 1500

aagagttccg aatatggaac tgtttgtttt ttgcgaagat ctgacattta cacaaaatct 1560

ggatctgggc tatccgttta tggatatgac aacaagagat aaagaagaag aagcatattg 1620

ggatatgctg ctgatgcaat catgccaaca tggcattatt gcaaattcaa catattcatg 1680

gtgggcagca tatctgatta ataatccgga aaaaattatt attggcccga aacattggct 1740

gtttggccat gaaaatattc tgtgcaaaga atgggttaaa attgaatcac attttgaagt 1800

taaatcacaa aaatataatg cataatcaga gacggatgac aaacgcaaag cagcctgatg 1860

cgctatgctt atcaggtcta cataacccat taaatatatt gaactttaaa gatttttgta 1920

gacctggtca ggcgttcaca tggcatccgg catgaacaaa gcgtactttg cttaattcag 1980

gctggaacgt ggcgatgacc cagcaaagat aaaacgagtc acaggttatg catgagagga 2040

aatcaggcgc ttcgccgcta tttcgaattt attccattgc ccgatacacg gcctcgccaa 2100

tttgcttcag tgcttcgcga taggtttcgc tgagcggcaa agcgcagttg atgcgcagac 2160

aattacggta tttgccggaa gctgagaaaa tcgagcctgc cgccacctgg attttcatgc 2220

ggcacagctg ccgcgcgacg cagaccatat cgacctgttc aggcaattct atccacagta 2280

aaaatccgcc tttcgggcgc gtaatacaga tttcgcaggg aaaat 2325

Claims

1.一种提高重组大肠杆菌中2'-岩藻糖基乳糖产量的方法，其特征在于，所述方法是在大肠杆菌宿主中异源表达N端融合蛋白标签的α-1,2-岩藻糖基转移酶。

2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述的大肠杆菌宿主为大肠杆菌MG1655△fliR::futC,△fuck::fkp,△lacI,△wcaJ,△lacZ,△flgA::futC,△flgG::futC。

3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述的蛋白标签为麦芽糖结合蛋白、硫氧还蛋白A、转录终止抗终止因子或类泛素蛋白修饰分子。

4.根据权利要求3所述的方法，其特征在于，所述的硫氧还蛋白A的氨基酸序列如SEQID NO.2所示，类泛素蛋白修饰分子的氨基酸序列如SEQ ID NO.3所示，麦芽糖结合蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO.4所示，转录终止抗终止因子的氨基酸序列如SEQ ID NO.5所示。

5.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述的蛋白标签与α-1,2-岩藻糖基转移酶之间通过Linker进行连接，所述的Linker为(GGGGS)₂。

6.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述的α-1,2-岩藻糖基转移酶来源于幽门螺旋杆菌，α-1,2-岩藻糖基转移酶的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示。

7.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述的N端融合蛋白标签的α-1,2-岩藻糖基转移酶通过组成型启动子P_tac进行表达。

8.一种大肠杆菌重组菌，其特征在于，所述的大肠杆菌重组菌是在大肠杆菌宿主中异源表达N端融合蛋白标签的α-1,2-岩藻糖基转移酶；所述的大肠杆菌宿主菌为大肠杆菌MG1655△fliR::futC,△fuck::fkp,△lacI,△wcaJ,△lacZ,△flgA::futC,△flgG::futC，所述的蛋白标签为硫氧还蛋白A，且所述的N端融合蛋白标签的α-1,2-岩藻糖基转移酶通过组成型启动子P_tac进行表达。

9.权利要求8所述的大肠杆菌重组菌在合成2'-岩藻糖基乳糖中的应用。

10.根据权利要求9所述的应用，其特征在于，所述的应用是将所述大肠杆菌重组菌种子液以0.5-2％的接种量接种至发酵培养基中，于30-37℃、200-2 50r/min条件下培养5-10h后，添加L-岩藻糖1-5g/L、乳糖1-5g/L，继续发酵至60-80h，分离发酵液得到2'-岩藻糖基乳糖。