CN115287273A

CN115287273A - 一种1，2-岩藻糖基转移酶及其融合蛋白和编码基因

Info

Publication number: CN115287273A
Application number: CN202210758112.8A
Authority: CN
Inventors: 王浩; 王芬; 左晴晴; 杨梦丹; 王瑞妍; 郭学平
Original assignee: Huaxi Biotechnology Tianjin Co ltd; Bloomage Biotech Co Ltd
Current assignee: Huaxi Biotechnology Tianjin Co ltd; Bloomage Biotech Co Ltd
Priority date: 2022-06-30
Filing date: 2022-06-30
Publication date: 2022-11-04

Abstract

本申请公开了编码1，2‑岩藻糖基转移酶的核酸分子及其编码的1，2‑岩藻糖基转移酶，本申请还公开了一种1，2‑岩藻糖基转移酶融合蛋白，其融合蛋白包括MBP蛋白标签、1，2‑岩藻糖基转移酶以及连接肽。1，2‑岩藻糖基转移酶以及1，2‑岩藻糖基转移酶融合蛋白得到的重组菌安全性高、催化效率高、特异性强，可以有效促进2’‑岩藻糖基乳糖的生产和纯化，为进一步提高1，2‑岩藻糖基转移酶的转化率，提升2’‑岩藻糖基乳糖产量，扩大产物的应用市场具有较大意义。

Description

一种1，2-岩藻糖基转移酶及其融合蛋白和编码基因

技术领域

本申请涉及酶工程和生物催化领域，特别涉及一种1，2-岩藻糖基转移酶融合蛋白及其编码基因和制备方法。

背景技术

人乳寡糖(Human milk oligosaccharides，HMOs)是母乳中仅次于乳糖和脂肪的第三大固体组分，HMOs具有益生元功效，可调节肠道菌群，调节局部和全身免疫，在婴儿成长和发育中具有重要的作用。在HMOs中，岩藻糖基化中性HMOs的比例约为50％，2’-岩藻糖基乳糖(2’-FL)是含量最高的一种岩藻糖基化的HMOs，在母乳中含量通常为2-3g/L，最高可达到8g/L，作为母乳中的一类特殊益生元，对婴儿的大脑发育、肠道发育、免疫调节，炎症抑制及抗病原微生物感染发挥着重要作用。目前2’-FL作为婴儿配方奶粉中添加的食品成分，膳食补充剂，已被美国食品药品管理局(FDA)批准为安全通用食品(GRAS)，并被欧洲食品安全局(EFSA)批准为新型食品(NF)。

鉴于2’-FL应用价值以及婴儿配方奶粉行业中广阔的市场前景，高效且经济的生产2’-FL成为研究热点。目前，2’-FL的合成方法包括化学法、酶法以及发酵法。化学法过程复杂，副反应和副产物比例高，需要精确地选择性保护不同羟基以及去保护等反应，并且涉及有毒试剂无法实现高效率合成。酶法合成供体核糖苷价格昂贵，酶催化活性低，无法实现规模化和工业化生产。近几年来，利用代谢工程和合成生物学策略通过微生物发酵法来合成2’-FL，在代谢通路中通过加强底物通道，减少中间产物代谢，提高关键酶的转化效率等策略逐步提高了2’-FL的产量。

微生物发酵生产2’-FL的关键酶是1，2-岩藻糖基转移酶，该酶属于GT11家族，催化GDP-岩藻糖的岩藻糖基转移到底物乳糖的半乳糖基上，形成2’-FL。目前专利报道的1，2-岩藻糖基转移酶主要为幽门螺杆菌来源FutC和大肠杆菌O126来源WbgL，除此之外还有蜡样芽孢杆菌FutBC、雪貂螺旋杆菌FutL、普通拟杆菌FutN、拟杆菌FutX、毛螺菌FutQ、产黑素普雷沃菌FutO、普雷沃菌FutW、多形杆状菌属FutZA、坦那菌属FutS、梭状芽孢杆菌FutP、粪拟杆菌FutU、肠道沙门氏菌FutZ、黑蒿产甲烷微菌FutR、丁酸弧菌FutV、肠道疣微菌FutY，由于这些菌属于致病菌或条件致病菌，存在一定的安全隐患。

发明内容

目前，尚未有益生菌来源的1，2-岩藻糖基转移酶用于2’-岩藻糖基乳糖合成的报道，且对于1，2-岩藻糖基转移酶存在蛋白表达量低的问题，尽管专利CN112322565A报道通过融合不同促溶标签提高幽门螺旋杆菌来源的1，2-岩藻糖基转移酶表达量，但是促溶标签并不存在普适性，不同的蛋白酶融合促溶标签会产生不可预料的效果。

故而本申请进一步探索不同来源的1，2-岩藻糖基转移酶，以及通过融合促溶标签提高1，2-岩藻糖基转移酶的表达量，并探索1，2-岩藻糖基转移酶用于2’-岩藻糖基乳糖合成，为2’-岩藻糖基乳糖的合成开发新的途径。

具体的，本申请采用如下技术方案，

1.一种1，2-岩藻糖基转移酶融合蛋白，其特征在于，所述融合蛋白包含氨基酸序列SEQ ID NO.2所示的1，2-岩藻糖基转移酶。

2.根据项1所述的融合蛋白，其特征在于，所述融合蛋白包括MBP蛋白标签、氨基酸序列SEQ ID NO.2所示的1，2-岩藻糖基转移酶以及连接肽。

3.根据项1所述的融合蛋白，其特征在于，所述编码氨基酸序列SEQ ID NO.2所示的1，2-岩藻糖基转移酶的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。

4.根据项2所述的融合蛋白，其特征在于，所述连接肽的核苷酸如SEQ ID NO.14所示，编码的氨基酸序列如SEQ ID NO.15所示。

5.根据项1-4中任一项所述的融合蛋白，其特征在于，所述融合蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO：4所示。

6.一种基因工程菌，其特征在于，所述基因工程菌表达包含项1-5任一项中所述的融合蛋白。

7.根据项6所述的基因工程菌，其特征在于，以大肠杆菌为宿主，所述大肠杆菌选自BL21、BL21(DE3)、JM109、JM109(DE3)或K12MG1655，优选为K12MG1655，进一步优选为敲除lacZ基因的K12 MG1655。

8.一种核酸分子，其特征在于，所述核苷酸是编码项1-5任一项中所示的1，2-岩藻糖基转移酶融合蛋白的多核苷酸。

9.根据项8所述的核酸分子，其特征在于，所述核苷酸序列如SEQ ID NO：3所示。

10.含有项8-9中任一项所述核酸分子的重组载体。

11.一种2’-岩藻糖基乳糖的生产方法，其特征在于，所述方法由项6或7所述的基因工程菌合成获得2’-岩藻糖基乳糖。

12.项1-5任一项所述的融合蛋白和项6-7所述的基因工程菌在表达2’-岩藻糖基乳糖中的应用。

发明效果

1.本申请将来源于益生菌Lactococcus lactis1，2-岩藻糖基转移酶的密码子进行优化，得到益生菌Lactococcus lactis来源的1，2-岩藻糖基转移酶，能够有效催化乳糖产生2’-岩藻糖基乳糖，为2’-岩藻糖基乳糖的生产开发了新的途径。

2.本申请进一步将1，2-岩藻糖基转移酶连接至含有MBP促溶标签表达载体中，在敲除了β-半乳糖苷酶的大肠杆菌工程菌上进行表达，所构建的重组菌能够成功表达1，2-岩藻糖基转移酶，且表达量有明显提高，所得1，2-岩藻糖基转移酶能够有效催化乳糖产生2’-岩藻糖基乳糖，安全性高，催化效率高，特异性强，没有副产物产生，应用于发酵生产2’-岩藻糖基乳糖时，有利于生产纯化和转化应用，对进一步提高1，2-岩藻糖基转移酶的转化率，提升2’-岩藻糖基乳糖产量，扩大产物的应用市场具有较大意义。

附图说明

附图用于更好地理解本申请，不构成对本申请的不当限定。其中：

图1益生菌Lactococcus lactis来源的本申请优化的1，2-岩藻糖基转移酶基因与野生型基因的核苷酸序列比对图。

图2构建重组质粒pMAL-c4X-H_FutC-XX的示意图(FutC-XX为不同来源1，2-岩藻糖基转移酶)。

图3不同来源的重组菌发酵破胞上清液Western Blot图。其中，

泳道M代表分子量为180kDa的标准蛋白；

泳道1代表W1(W0/pMAL-c4X-H_FutC-HP)破胞上清液；

泳道2代表W2(W0/pMAL-c4X-H_FutC-PC)破胞上清液；

泳道3代表W3(W0/pMAL-c4X-H_FutC-CB)破胞上清液；

泳道4代表W4(W0/pMAL-c4X-H_FutC-HS)破胞上清液；

泳道5代表W5(W0/pMAL-c4X-H_FutC-BP)破胞上清液；

泳道6代表W6(W0/pMAL-c4X-H_FutC-LL)破胞上清液；

泳道7代表W7(W0/pMAL-c4X-H_FutC-PM)破胞上清液；

泳道8代表W8(W0/pMAL-c4X-H_FutC-BD)破胞上清液；

泳道9代表W9(W0/pMAL-c4X-H_FutC-BT)破胞上清液；

泳道10代表W10(W0/pMAL-c4X-H_FutC-BX)破胞上清液。

图4不同来源的重组菌发酵产物2’-岩藻糖基乳糖的产量柱形图。

图5益生菌Lactococcus lactis来源的1，2-岩藻糖基转移酶基因去掉MBP促溶标签前后发酵破胞上清液的Western Blot对比图。其中，

泳道1-3代表W11(W0/pMAL-c4X-H_FutC-LL₁)破胞上清液；

泳道4-6代表W6(W0/pMAL-c4X-H_FutC-LL)破胞上清液。

图6重组菌发酵产物2’-岩藻糖基乳糖的质谱图。其中，

a为2’-岩藻糖基乳糖标准品LC-MS总离子流图；

b为重组菌W6(E.coli K12 MG1655Δ(lacZ)/pMAL-c4X-H_FutC-LL)LC-MS总离子流图；

c为2’-岩藻糖基乳糖标准品特征质荷比碎片离子峰；

d为重组菌W6(E.coli K12 MG1655Δ(lacZ)/pMAL-c4X-H_FutC-LL)发酵产物特征质荷比碎片离子峰。

图7不同来源1，2岩藻糖基转移酶的系统发育进化树。

具体实施方式

以下对本申请的示范性实施例做出说明，其中包括本申请实施例的各种细节以助于理解，应当将它们认为仅仅是示范性的。因此，本领域普通技术人员应当认识到，可以对这里描述的实施例做出各种改变和修改，而不会背离本申请的范围和精神。同样，为了清楚和简明，以下的描述中省略了对公知功能和结构的描述。

如本文所使用的，术语“基因”或“编码序列”是指编码基因产物的体外或体内的核苷酸序列。在一些情况下，基因由或基本上由编码序列组成，即，编码基因产物的序列。在其它情况中，基因包括附加的非编码序列。例如，基因可以或可以不包括编码区之前和之后的区域，例如5’非翻译(5’UTR)或“前导”序列和3’UTR或“非转录尾区(trailer)”序列，以及各个编码区段(外显子)之间的插入序列(内含子)。

如本文所使用的，术语“多肽”、“肽”和“蛋白”在本文中互换使用以意指氨基酸残基的聚合物。即，针对多肽的描述同样适用于描述肽和描述蛋白，且反之亦然。所述术语适用于天然产生氨基酸聚合物以及其中一个或一个以上氨基酸残基为非天然编码氨基酸的氨基酸聚合物。如本文中所使用，所述术语涵盖任何长度的氨基酸链。

如本文所使用的，术语“多核苷酸”或“核苷酸”或“核酸”意指单股或双股形式的脱氧核糖核苷酸、脱氧核糖核苷、核糖核苷或核糖核苷酸及其聚合物。除非特定限制，否则所述术语涵盖含有天然核苷酸的已知类似物的核酸，所述类似物具有类似于参考核酸的结合特性并以类似于天然产生的核苷酸的方式进行代谢。除非另外特定限制，否则所述术语也意指寡核苷酸类似物，其包括PNA(肽核酸)、在反义技术中所用的DNA类似物(硫代磷酸酯、磷酰胺酸酯等)。除非另外指定，否则特定核酸序列也隐含地涵盖其保守修饰的变异体(包括(但不限于)简并密码子取代)和互补序列以及明确指定的序列。此外，本申请中使用的“基因”也表示相同的含义。

如本文所使用的，术语“载体”用于描述可以被工程化以含有可以在宿主细胞中扩增的克隆的一种多核苷酸或多种多核苷酸的核酸分子。载体包括但不限于：单链，双链或部分双链的核酸分子；包含一个或多个游离末端，没有游离末端(例如环状)的核酸分子；包含DNA，RNA或两者的核酸分子；以及本领域已知的其他多核苷酸种类。一种类型的载体是“质粒”，其是指可以插入额外DNA片段的环状双链DNA环，例如通过标准分子克隆技术。某些载体能够在引入它们的宿主细胞中自主复制(例如，具有细菌复制起点的细菌载体和游离型哺乳动物载体)。其他载体(例如，非游离型哺乳动物载体)在引入宿主细胞后整合到宿主细胞的基因组中，从而与宿主基因组一起复制。此外，某些载体能够指导它们可操作地连接的那些基因的表达。此类载体在本文中称为“表达载体”。重组表达载体可以包含适于在宿主细胞中表达核酸的形式的本发明的核酸，这意味着重组表达载体包括一种或多种调节元件，其可以基于用于表达的、可以与待表达的核酸序列可操作地连接的宿主细胞来选择。

如本文所使用的，密码子优化是指在维持天然氨基酸序列的同时，通过用目的宿主细胞的基因中更频繁或最频繁使用的密码子替换天然序列的至少一个密码子来修饰核酸序列以在该宿主细胞中增强表达的过程。多种物种对特定氨基酸的某些密码子表现出特定的偏倚。密码子偏倚(生物体之间密码子选用的差异)通常与信使RNA(mRNA)的翻译效率相关，而信使RNA(mRNA)的翻译效率继而被认为尤其取决于所翻译密码子的特性和特定转移RNA(tRNA)分子的可用性。所选择tRNA在细胞中的优势通常反映了肽合成中最频繁使用的密码子。因此，可基于密码子优化来定制基因以在给定生物体中进行最佳基因表达。

密码子优化可以例如通过将一种物种的核苷酸序列转化为不同物种的遗传序列来实现。优化的密码子有助于实现更快的翻译速度和更高的准确性。由于这些因素，预计在高表达基因中翻译选择会更强。然而，尽管本文考虑了使用优化的密码子来表达公开的蛋白质，但是本文考虑了用于编码任何公开的蛋白质的核酸的所有可能的密码子。

术语“基因工程菌”，是指将目的基因导入细菌体内使其表达，产生所需要的蛋白的细菌。

本申请提供的一种编码1，2-岩藻糖基转移酶的核酸分子，其核苷酸序列如SEQ IDNO.1所示，其编码的氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示。

本申请提供的一种1，2-岩藻糖基转移酶融合蛋白，包括MBP蛋白标签、1，2-岩藻糖基转移酶以及连接肽。

术语“融合蛋白”是将两个蛋白或者多肽以肽键进行连接，表达出的蛋白即融合蛋白。本申请中是指将MBP(麦芽糖结合蛋白)蛋白标签和1，2-岩藻糖基转移酶通过连接肽进行连接，表达出1，2-岩藻糖基转移酶融合蛋白。

在本申请的一种优选的实施方式中，所述连接肽的核苷酸如SEQ ID NO.14所示，编码的氨基酸序列如SEQ ID NO.15所示。

在本申请的另一个优选的的实施方式，所述1，2-岩藻糖基转移酶的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示，编码的氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示。

在本申请进一步的优选的实施方式，本申请提供的1，2-岩藻糖基转移酶融合蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO：4所示。

本申请提供的1，2-岩藻糖基转移酶融合蛋白的核酸分子，其核苷酸序列如SEQ IDNO：3所示。

本申请还提供一种基因工程菌，所述基因工程菌用于表达包含如上所述的任何一种融合蛋白。

本申请还提供一种重组载体，所述重组载体包含如前所述的1，2-岩藻糖基转移酶融合蛋白的多核苷酸序列，或者，包含SEQ ID NO：3的核苷酸序列。

在一个优选的实施方式中，所述重组载体为原核细胞重组载体，包括但不限于pMAL系列中pMAL-c2E，pMAL-c4E，pMAL-c2G，pMAL-c4G，pMAL-c2X，pMAL-c4X，pMAL-c6T，pMAL-p2E，pMAL-p4E，pMAL-p5E，pMAL-p2G，pMAL-p4G，pMAL-p5G，pMAL-p2X，pMAL-p4X，pMAL-p5X，在本申请进一步优选的实施方式中，所述载体为pMAL-c4X系列载体中的任意一种，更进一步的，本申请的所述载体为金斯瑞公司合成提供的载体pMAL-c4X-H。

在本申请中，所述基因工程菌的宿主细胞包括但不限于大肠杆菌、枯草杆菌、农杆菌，在一个优选的实施方式中，所述宿主细胞为大肠杆菌。在进一步优选的实施方式中，所述大肠杆菌选自BL21、BL21(DE3)、JM109、JM109(DE3)或K12MG1655，更进一步优选为K12MG1655，进一步优选为敲除lacZ基因的K12 MG1655。

本申请进一步提供了一种2’-岩藻糖基乳糖的生产方法，其是在本申请提供的基因工程菌中进行2’-岩藻糖基乳糖的合成。

本申请进一步提供了本申请提供的融合蛋白和基因工程菌在表达2’-岩藻糖基乳糖中的应用。

本申请提供的编码1，2-岩藻糖基转移酶的核酸分子及其所编码的1，2-岩藻糖基转移酶来源于益生菌Lactococcus lactis，其核酸分子是对野生型益生菌Lactococcuslactis来源的1，2-岩藻糖基转移酶的核酸分子进行优化得到的，可以有效催化乳糖转化为2’-岩藻糖基乳糖。目前专利文献报道中并没有其他益生菌来源的1，2-岩藻糖基转移酶可以起到催化乳糖转化为2’-岩藻糖基乳糖的效果，本申请中筛选的其他益生菌如Prevotella copri、Clostridium Butyricum等等也是不产生或只能产生极少生产2’-岩藻糖基乳糖，催化效果差。

本申请进一步提供的一种1，2-岩藻糖基转移酶融合蛋白，其包含MBP促溶标签，相对于不含有促溶标签的1，2-岩藻糖基转移酶重组菌，促溶标签可以更好的促进1，2-岩藻糖基转移酶的表达，提高1，2-岩藻糖基转移酶的产量，且催化乳糖转化为2’-岩藻糖基乳糖的特异性强未发现其它副产物产生。而现有技术中通常所用到的TrxA促溶标签、GST促溶标签并不能很好的起到促进本申请中1，2-岩藻糖基转移酶表达的效果。

实施例

材料与方法

LC-MS检测条件：

使用LC(Waters，Milford，MA，USA)配置A MALDI SYNAPT Q-TOF MS(Waters，Milford，MA，USA)作为质谱仪，在ESI模式下运行分析样品。LC(Waters Acquity UPLC)配有Acquity UPLC BEH AMIDE(2.1mm×100mm)色谱柱。流动相A：0.1％(v/v)NH₃·H₂O，流动相B：乙腈梯度80％(v/v)-60％(v/v)，保持10min，流速为0.3mL/min。色谱柱和自动进样器的温度分别设置为55℃和30℃。

LC检测条件：

使用Rezex ROA-Organic Acid H+(8％)色谱柱配置安捷伦1260液相色谱仪RID检测器。流动相为5mM H₂SO₄，液相检测条件为柱温55℃，进样量20uL，流速0.6mL/min。

实施例1：菌株E.coli K12 MG1655Δ(lacZ)的构建

以大肠杆菌MG1655为原始菌株敲除lacZ基因，阻遏底物乳糖进入细胞后被lacZ降解为葡萄糖和半乳糖。利用CRISPR-Cas9基因敲除系统敲除大肠杆菌K12 MG1655中lacZ。

其中，构建引物如下表1所示。PCR扩增体系如下，总体系50μL：100μM上游引物1.0μL，100μM下游引物1.0μL，模板1.0μL，prime star酶25μL，ddH₂O 22μL。

PCR扩增条件如下：95℃预变性3min；95℃变性30s，60℃退火30s，72℃延伸2min30s，循环30次；72℃延伸5min。

具体步骤如下：

(1)以大肠杆菌K12 MG1655基因组为模板，使用lacZ-up-F/R和lacZ-down-F/R，通过PCR分别扩增出lacZ的上下游片段，胶回收。再分别以lacZ上下游片段为模板，采用lacZ-up-F/lacZ-down-R引物通过重叠PCR得到完整的lacZ模板，胶回收DNA片段。

(2)以原始pTargetF质粒为模板，lacZ-sg-F/R为引物，采用PCR扩增将原始质粒上的N20序列分别替换为与lacZ序列互补的N20序列，得到带有靶向lacZ的pTargetF质粒。PCR产物采用Dpn I去除模板，转化大肠杆菌TOP10感受态，涂布LB平板(含壮观霉素)，37℃扩大培养提取质粒并测序。

(3)取pCas质粒及大肠杆菌K12 MG1655感受态，冰上放置5min至感受态融化，取5uL质粒加入100uL感受态细胞中，轻轻混匀。冰浴30min，42℃热激90s，立即置于冰上5min。加入900uL LB培养基，30℃，220rpm培养1h。取200uL浓缩菌液，均匀涂布于LB平板(含卡那霉素)上，30℃倒置培养过夜成为大肠杆菌K12 MG1655/pCas。

(4)接种2％过夜培养大肠杆菌K12 MG1655/pCas种子液于LB培养基中，加入终浓度为10mM的L-阿拉伯糖以诱导pCas-λ-red系统表达，30℃培养至OD600达到0.6-0.8时，制备大肠杆菌K12 MG1655/pCas感受态。

(5)将100ng pTargetF质粒和400ng的供体DNA片段，电转至上述大肠杆菌K12MG1655/pCas感受态，涂布于LB平板(卡那霉素和壮观霉素)，30℃培养24h，PCR验证lacZ敲除效果。

(6)将上述阳性克隆菌落挑至2mL LB液体试管，加入终浓度为1mM的IPTG和50mg/L卡那霉素，30℃培养8-16h去除pTargetF质粒，划线点板验证。确定去除pTargetF后，42℃培养12h去除pCas质粒，划线点板验证，最终获得W0(E.coli K12 MG1655Δ(lacZ))大肠杆菌K12 MG1655敲除菌株。

表1敲除引物

实施例2：含1，2-岩藻糖基转移酶表达系统的构建

本申请基于NCBI数据库公开的Lactococcus lactis 1，2-岩藻糖基转移酶全长基因序列(Genbank:TRW56882.1)，根据大肠杆菌密码子偏好性对其进行了密码子优化，优化后的基因与野生型基因序列同源性为74.34％(参见图1)，其编码的氨基酸序列与野生型一致(SEQ ID NO.2)。密码子优化的1，2-岩藻糖基转移酶基因序列委托南京金斯瑞生物科技有限公司全基因合成，并克隆到大肠杆菌表达载体pMAL-c4X-H的EcoR I和Hind III酶切位点之间，得到重组表达载体pMAL-c4X-H_FutC-LL，其中FutC-LL为益生菌Lactococcuslactis来源的优化的1，2-岩藻糖基转移酶(参见图2)。经DNA测序比对，重组序列正确。重组表达质粒pMAL-c4X-H_FutC-LL转入大肠杆菌K12 MG1655敲除菌株W0表达宿主细胞中，获得重组大肠杆菌W6(W0/pMAL-c4X-H_FutC-LL)。

实施例3：Lactococcus lactis来源1，2-岩藻糖基转移酶的重组表达

将重组大肠杆菌W6进行摇瓶发酵培养。挑取单克隆接种于5mL的LB培养基(酵母提取物5g/L，蛋白胨10g/L，氯化钠10g/L)，37℃、220rpm过夜培养。按2％的接种量转接于25mL的发酵培养基(甘油20g/L，13.5g/L磷酸二氢钾，4.0g/L磷酸铵，1.7g/L柠檬酸，1.4g/L七水合硫酸镁，4.5mg/L硫胺素，10mL/L微量金属元素溶液：10g/L七水合硫酸亚铁，2.2g/L七水合硫酸锌，1.0g/L五水合硫酸铜，0.38g/L一水合硫酸锰，0.02g/L十水合硼酸钠，0.1g/L钼酸铵，2.0g/L氯化钙；pH 6.8)中，37℃220rpm培养至OD₆₀₀ 0.6-0.8，加入0.2mM IPTG，变温至25℃培养16h。发酵结束后取1mL菌液5000rpm 10min离心收集菌体，菌体用Tris-HCl(pH8.0)洗涤后重悬，超声破碎8min(破碎2s,停止4s)，12000rpm离心10min收集上清进行Western Blot蛋白电泳分析，如图3所示。重组菌W6(W0/pMAL-c4X-H_LL)(泳道6)在1，2-岩藻糖基转移酶理论蛋白分子量76.5kDa附近有对应的蛋白条带。

实施例4：发酵法生产2’-岩藻糖基乳糖

将重组大肠杆菌W6进行摇瓶发酵培养。挑取单克隆接种于5mL的LB培养基(酵母提取物5g/L，蛋白胨10g/L，氯化钠10g/L)，37℃、220rpm过夜培养。按2％的接种量转接于25mL的发酵培养基(甘油20g/L，13.5g/L磷酸二氢钾，4.0g/L磷酸铵，1.7g/L柠檬酸，1.4g/L七水合硫酸镁，4.5mg/L硫胺素，10mL/L微量金属元素溶液：10g/L七水合硫酸亚铁，2.2g/L七水合硫酸锌，1.0g/L五水合硫酸铜，0.38g/L一水合硫酸锰，0.02g/L十水合硼酸钠，0.1g/L钼酸铵，2.0g/L氯化钙；pH 6.8)中，37℃220rpm培养至OD₆₀₀ 0.6-0.8，加入0.2mM IPTG和10g/L乳糖，变温至25℃培养72h。发酵结束后，取1mL发酵菌液5000rpm 10min离心，上清收集进行胞外产物检测。菌体用纯水洗涤后重悬，100℃煮沸10min离心收集上清进行胞内产物检测。通过液相检测重组菌W6发酵产物2’-岩藻糖基乳糖总产量为51.40mg/L(参照图4)。

液相质谱联用检测产物如图6所示，a为2’-岩藻糖基乳糖标准品LC-MS总离子流图；b为重组菌W6(E.coli K12 MG1655Δ(lacZ)/pMAL-c4X-H_FutC-LL)LC-MS总离子流图；c为2’-岩藻糖基乳糖标准品特征质荷比碎片离子峰；d为重组菌W6(E.coli K12 MG1655Δ(lacZ)/pMAL-c4X-H_FutC-LL)发酵产物特征质荷比碎片离子峰。对比质谱结果可以看到重组菌W6发酵产物2’-岩藻糖基乳糖的特征离子碎片，证明Lactococcus lactis来源的1，2-岩藻糖基转移酶能够催化乳糖转化为2’-岩藻糖基乳糖，且其特异性强未发现其它副产物产生。

对比例1：其它来源的1，2-岩藻糖基转移酶的重组表达及应用

在进行上述Lactococcus lactis 1，2-岩藻糖基转移酶全长基因序列(Genbank:TRW56882.1)表达的同时，本申请还通过NCBI数据库筛选还确定了其他8种不同益生菌来源及幽门螺旋杆菌来源的1，2-岩藻糖基转移酶基因，它们分别如下表2所示：

表2其他来源的1，2-岩藻糖基转移酶基因

为了进一步分析本申请所筛选的益生菌来源的1，2-岩藻糖基转移酶与目前已报道的其他来源的1，2-岩藻糖基转移酶遗传进化的差别。通过MEGA软件，将本申请筛选和目前已报道的1，2-岩藻糖基转移酶的氨基酸进行多序列比对，将距离最近的序列通过动态规划法和渐进方式比对从而构建距离矩阵，经过邻接法计算遗传距离从而获得系统发育进化树。参照图7所示，可以直观的看到上述不同来源1，2-岩藻糖基转移酶的遗传进化分支，其中本申请筛选的益生菌来源的1，2-岩藻糖基转移酶彼此之间遗传进化距离较远。

进一步，将上述8种益生菌及幽门螺旋杆菌来源基因根据大肠杆菌密码子偏好性对其进行了密码子优化。密码子优化的1，2-岩藻糖基转移酶序列委托南京金斯瑞生物科技有限公司全基因合成，并克隆到pMAL-c4X-H的EcoR I和Hind III酶切位点之间，得到重组表达载体pMAL-c4X-H_FutC-HP，pMAL-c4X-H_FutC-PC，pMAL-c4X-H_FutC-CB，pMAL-c4X-H_FutC-HS，pMAL-c4X-H_FutC-BP，pMAL-c4X-H_FutC-PM，pMAL-c4X-H_FutC-BD，pMAL-c4X-H_FutC-BT，pMAL-c4X-H_FutC-BX(重组质粒构建示意图参照图2)。经DNA测序比对，重组序列正确。将上述重组表达质粒化转入大肠杆菌MG1655敲除菌株W0表达宿主细胞中，获得各自重组大肠杆菌W1(W0/pMAL-c4X-H_FutC-HP)，W2(W0/pMAL-c4X-H_FutC-PC)，W3(W0/pMAL-c4X-H_FutC-CB)，W4(W0/pMAL-c4X-H_FutC-HS)，W5(W0/pMAL-c4X-H_FutC-BP)，W7(W0/pMAL-c4X-H_FutC-PM)，W8(W0/pMAL-c4X-H_FutC-BD)，W9(W0/pMAL-c4X-H_FutC-BT)，W10(W0/pMAL-c4X-H_FutC-BX)。

上述9株重组菌参照实施例3进行摇瓶发酵，破胞上清进行分析，取1ml菌液离心收集菌体，菌体用Tris-HCl(pH 8.0)洗涤后重悬，超声破碎8min(破碎2s,停止4s)，12000rpm离心10min收集上清进行Western Blot蛋白电泳分析，如图3所示。重组工程菌W1、W2、W3、W4、W5、W7、W9(泳道1、2、3、4、5、7、9)在1，2岩藻糖基转移酶理论蛋白分子量附近均有对应的蛋白条带，重组工程菌W8、W10(泳道8、10)在1，2岩藻糖基转移酶理论蛋白分子量附近未发现对应的蛋白条带。由于上述9种不同来源的1，2岩藻糖基转移酶可溶蛋白表达情况不一致，通过进一步液相检测发酵产物2’-岩藻糖基乳糖。最终对比分析，Lactococcus lactis来源重组菌发酵产物2’-岩藻糖基乳糖产量最高，其它包括幽门螺旋杆菌在内的9种不同来源的重组菌发酵生产2’-岩藻糖基乳糖能力极弱，不产生或只有极少产物产生。(液相检测上述重组菌发酵产物产量图如图4所示。)

对比例2：去除MBP促溶标签Lactococcus lactis来源1，2-岩藻糖基转移酶的重组表达

本申请选用含有MBP促溶标签的pMAL-c4X-H的表达载体，对上述Lactococcuslactis来源1，2-岩藻糖基转移酶全长基因序列进行表达。本申请的发明人为进一步证实MBP标签对1，2-岩藻糖基转移酶表达的作用，在实施例2表达载体基础上截掉MBP标签获得重组载体pMAL-c4X-H-FutC-LL₁，经DNA测序比对，重组序列正确。重组表达质粒pMAL-c4X-H_FutC-LL₁化转入大肠杆菌K12 MG1655敲除菌株W0表达宿主细胞中，获得重组大肠杆菌W11(W0/pMAL-c4X-H_FutC-LL₁)。参照实施例3对截掉MBP标签Lactococcus lactis来源的1，2-岩藻糖基转移酶进行重组表达。

发酵结束后取1mL菌液5000rpm 10min离心收集菌体，菌体用Tris-HCl(pH 8.0)洗涤后重悬，超声破碎8min(破碎2s,停止4s)，12000rpm离心10min收集上清进行WesternBlot蛋白电泳分析，如图5所示，重组菌W6(W0/pMAL-c4X-H_LL)(泳道4-6)在1，2-岩藻糖基转移酶理论蛋白分子量76.5kDa附近有对应的蛋白条带，然而截掉MBP促溶标签的重组菌W11(W0/pMAL-c4X-H_LL₁)(泳道1-3)未发现对应蛋白条带，可见MBP促溶标签有利于1，2-岩藻糖基转移酶的表达。

对比例3：融合TrxA促溶标签的Lactococcus lactis来源1，2-岩藻糖基转移酶的重组表达及应用

本申请选用的MBP促溶标签有利于1，2-岩藻糖基转移酶的表达，故而进一步验证了其他促溶标签的作用。

以大肠杆菌MG1655基因组为模板，PCR扩增后纯化回收获得硫氧还蛋白A(TrxA)的基因片段；以实施例2表达载体pMAL-c4X-H-FutC-LL为模板，反向PCR线性化扩增消化回收后获得截掉MBP标签的线性载体；通过Gibson组装将TrxA基因片段和上述线性化载体进行重组连接。其中，TrxA基因序列连接到FutC-LL基因的N端，TrxA和FutC-LL之间通过Linker连接，获得重组载体pMAL-c4X-H-FutC-LL₂，经DNA测序比对，重组序列正确。重组表达质粒pMAL-c4X-H_FutC-LL₂化转入大肠杆菌K12 MG1655敲除菌株W0表达宿主细胞中，获得重组大肠杆菌W12(W0/pMAL-c4X-H_FutC-LL₂)。参照实施例3对融合TrxA标签Lactococcuslactis来源的1，2-岩藻糖基转移酶进行重组表达。

发酵结束后取1mL菌液5000rpm 10min离心收集菌体，菌体用Tris-HCl(pH 8.0)洗涤后重悬，超声破碎8min(破碎2s,停止4s)，12000rpm离心10min收集上清进行WesternBlot蛋白电泳分析，重组菌W12(W0/pMAL-c4X-H_LL₂)在1，2-岩藻糖基转移酶理论蛋白分子量处有相应表达。参照实施例4进行摇瓶发酵，液相检测2’-岩藻糖基乳糖产量，结果显示融合TrxA促溶标签的重组菌W12产量远低于重组菌W6仅有5.87mg/L产物产生。

对比例4：融合GST促溶标签的Lactococcus lactis来源1，2-岩藻糖基转移酶的重组表达及应用

以质粒pET-41a为模板，PCR扩增后纯化回收获得谷胱甘肽巯基转移酶(GST)的基因片段；以实施例2表达载体pMAL-c4X-H-FutC-LL为模板，反向PCR线性化扩增消化回收后获得截掉MBP标签的线性载体；通过Gibson组装将GST基因片段和上述线性化载体进行重组连接。其中，GST基因序列连接到FutC-LL基因的N端，GST和FutC-LL之间通过Linker连接，获得重组载体pMAL-c4X-H-FutC-LL₃，经DNA测序比对，重组序列正确。重组表达质粒pMAL-c4X-H_FutC-LL₃化转入大肠杆菌K12 MG1655敲除菌株W0表达宿主细胞中，获得重组大肠杆菌W13(W0/pMAL-c4X-H_FutC-LL₃)。参照实施例3对融合GST标签Lactococcus lactis来源的1，2-岩藻糖基转移酶进行重组表达。

发酵结束后取1mL菌液5000rpm 10min离心收集菌体，菌体用Tris-HCl(pH 8.0)洗涤后重悬，超声破碎8min(破碎2s,停止4s)，12000rpm离心10min收集上清进行WesternBlot蛋白电泳分析，重组菌W13(W0/pMAL-c4X-H_LL₃)在1，2-岩藻糖基转移酶理论蛋白分子量处有相应表达。参照实施例4进行摇瓶发酵，液相检测2’-岩藻糖基乳糖产量，结果显示融合GST促溶标签的重组菌W13产量低于重组菌W6仅有10.12mg/L产物产生。

综上所述，本申请将来源于益生菌Lactococcus lactis的1，2-岩藻糖基转移酶连接至含有MBP促溶标签表达载体，接着导入敲除β-半乳糖苷酶的大肠杆菌工程菌，其重组菌能够成功表达1，2-岩藻糖基转移酶并应用于发酵生产岩藻糖基乳糖。对比幽门螺旋杆菌来源的FutC，在本申请所述的宿主细胞中益生菌Lactococcus lactis来源的1，2-岩藻糖基转移酶安全性高、催化效率高、特异性强，有利于后期产物2’-岩藻糖基乳糖的生产纯化和转化应用，为进一步提高关键酶的转化率，提升2’-岩藻糖基乳糖产量，扩大产物的应用市场具有较大意义。

尽管以上结合对本申请的实施方案进行了描述，但本申请并不局限于上述的具体实施方案和应用领域，上述的具体实施方案仅仅是示意性的、指导性的，而不是限制性的。本领域的普通技术人员在本说明书的启示下和在不脱离本申请权利要求所保护的范围的情况下，还可以做出很多种的形式，这些均属于本申请保护之列。

序列表

<110> 华熙生物科技股份有限公司

华熙生物科技（天津）有限公司

<120> 一种1，2-岩藻糖基转移酶及其融合蛋白和编码基因

<130> TPF02266

<160> 15

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 990

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 人工序列描述：人工合成序列

<400> 1

atgaaaaaga ttatagtaga tatggacgga agattaggta accagatgtt tcagtacgcg 60

tacgctctga agctcaaaaa agagatcccg gaatcggaaa tcattatcaa cttctatcgt 120

atttccctgt acggcgactt ggctccgaac gaacaaggtt ggatgaataa cctgcagtac 180

ttccacgcgg attaccagct ggatcagcag aagctgagta attttctgat ccaatacttg 240

tctaagcgcc aatacttctg gctgcgtgtt acgaaccgtc tgttacatca cttatccagc 300

ttcaaacgtc attcttactt tccgtttgat aaacttccaa acttcctgaa gtattatagc 360

cgttttttgt atcgcaaagg cctgctgatt tacccgagca aaatcaagga cctgaattat 420

gaaccgcaaa acgagactat tctgctgcat agctacttcg aggatgcgag cttcttcgag 480

ggcatgcagg cagagctgca agcgaccttt tccccgcgtg aaggtttgtt ggagcagaat 540

aaggagtttt accgcaagat ccaagagtcg caaagcattt gcattaccat tcgtcgtggt 600

gactacctgt ctaccgaaaa tcgtcagagc ttcttccagt gtgatgaatc ctatttcatc 660

aagggtattg agatcctgaa gagcaagatc gtgaatccgg tttttttctt cttctgcgac 720

gatcttgagt atgccaaaca gtttgcagag gacatgatga ccgaagaaga caacttcatg 780

gttgaaaaag agggcaatcc agtgtgggaa aaactgcgcc tgatgagcgc gtgcaaacat 840

tatatcatcg ccaacagcac ctttagctgg tggtgtcagt ttctctctgc gaacccgcaa 900

aaaatcgtcg tgggtccgaa aaactggtat ccgaaggaca gcatcaacaa gaataacgcg 960

ttggttcagt ctgattggat tcagctgtaa 990

<210> 2

<211> 329

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 人工序列描述：人工合成序列

<400> 2

Met Lys Lys Ile Ile Val Asp Met Asp Gly Arg Leu Gly Asn Gln Met

1 5 10 15

Phe Gln Tyr Ala Tyr Ala Leu Lys Leu Lys Lys Glu Ile Pro Glu Ser

20 25 30

Glu Ile Ile Ile Asn Phe Tyr Arg Ile Ser Leu Tyr Gly Asp Leu Ala

35 40 45

Pro Asn Glu Gln Gly Trp Met Asn Asn Leu Gln Tyr Phe His Ala Asp

50 55 60

Tyr Gln Leu Asp Gln Gln Lys Leu Ser Asn Phe Leu Ile Gln Tyr Leu

65 70 75 80

Ser Lys Arg Gln Tyr Phe Trp Leu Arg Val Thr Asn Arg Leu Leu His

85 90 95

His Leu Ser Ser Phe Lys Arg His Ser Tyr Phe Pro Phe Asp Lys Leu

100 105 110

Pro Asn Phe Leu Lys Tyr Tyr Ser Arg Phe Leu Tyr Arg Lys Gly Leu

115 120 125

Leu Ile Tyr Pro Ser Lys Ile Lys Asp Leu Asn Tyr Glu Pro Gln Asn

130 135 140

Glu Thr Ile Leu Leu His Ser Tyr Phe Glu Asp Ala Ser Phe Phe Glu

145 150 155 160

Gly Met Gln Ala Glu Leu Gln Ala Thr Phe Ser Pro Arg Glu Gly Leu

165 170 175

Leu Glu Gln Asn Lys Glu Phe Tyr Arg Lys Ile Gln Glu Ser Gln Ser

180 185 190

Ile Cys Ile Thr Ile Arg Arg Gly Asp Tyr Leu Ser Thr Glu Asn Arg

195 200 205

Gln Ser Phe Phe Gln Cys Asp Glu Ser Tyr Phe Ile Lys Gly Ile Glu

210 215 220

Ile Leu Lys Ser Lys Ile Val Asn Pro Val Phe Phe Phe Phe Cys Asp

225 230 235 240

Asp Leu Glu Tyr Ala Lys Gln Phe Ala Glu Asp Met Met Thr Glu Glu

245 250 255

Asp Asn Phe Met Val Glu Lys Glu Gly Asn Pro Val Trp Glu Lys Leu

260 265 270

Arg Leu Met Ser Ala Cys Lys His Tyr Ile Ile Ala Asn Ser Thr Phe

275 280 285

Ser Trp Trp Cys Gln Phe Leu Ser Ala Asn Pro Gln Lys Ile Val Val

290 295 300

Gly Pro Lys Asn Trp Tyr Pro Lys Asp Ser Ile Asn Lys Asn Asn Ala

305 310 315 320

Leu Val Gln Ser Asp Trp Ile Gln Leu

325

<210> 3

<211> 2163

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 人工序列描述：人工合成序列

<400> 3

atgaaaatcg aagaaggtaa actggtaatc tggattaacg gcgataaagg ctataacggt 60

ctcgctgaag tcggtaagaa attcgagaaa gataccggaa ttaaagtcac cgttgagcat 120

ccggataaac tggaagagaa attcccacag gttgcggcaa ctggcgatgg ccctgacatt 180

atcttctggg cacacgaccg ctttggtggc tacgctcaat ctggcctgtt ggctgaaatc 240

accccggaca aagcgttcca ggacaagctg tatccgttta cctgggatgc cgtacgttac 300

aacggcaagc tgattgctta cccgatcgct gttgaagcgt tatcgctgat ttataacaaa 360

gatctgctgc cgaacccgcc aaaaacctgg gaagagatcc cggcgctgga taaagaactg 420

aaagcgaaag gtaagagcgc gctgatgttc aacctgcaag aaccgtactt cacctggccg 480

ctgattgctg ctgacggggg ttatgcgttc aagtatgaaa acggcaagta cgacattaaa 540

gacgtgggcg tggataacgc tggcgcgaaa gcgggtctga ccttcctggt tgacctgatt 600

aaaaacaaac acatgaatgc agacaccgat tactccatcg cagaagctgc ctttaataaa 660

ggcgaaacag cgatgaccat caacggcccg tgggcatggt ccaacatcga caccagcaaa 720

gtgaattatg gtgtaacggt actgccgacc ttcaagggtc aaccatccaa accgttcgtt 780

ggcgtgctga gcgcaggtat taacgccgcc agtccgaaca aagagctggc aaaagagttc 840

ctcgaaaact atctgctgac tgatgaaggt ctggaagcgg ttaataaaga caaaccgctg 900

ggtgccgtag cgctgaagtc ttacgaggaa gagttggtga aagatccgcg gattgccgcc 960

actatggaaa acgcccagaa aggtgaaatc atgccgaaca tcccgcagat gtccgctttc 1020

tggtatgccg tgcgtactgc ggtgatcaac gccgccagcg gtcgtcagac tgtcgatgaa 1080

gccctgaaag acgcgcagac taattcgagc tcgaacaaca acaacaataa caataacaac 1140

aacctcggga tcgagggaag gatttcagaa ttcatgaaaa agattatagt agatatggac 1200

ggaagattag gtaaccagat gtttcagtac gcgtacgctc tgaagctcaa aaaagagatc 1260

ccggaatcgg aaatcattat caacttctat cgtatttccc tgtacggcga cttggctccg 1320

aacgaacaag gttggatgaa taacctgcag tacttccacg cggattacca gctggatcag 1380

cagaagctga gtaattttct gatccaatac ttgtctaagc gccaatactt ctggctgcgt 1440

gttacgaacc gtctgttaca tcacttatcc agcttcaaac gtcattctta ctttccgttt 1500

gataaacttc caaacttcct gaagtattat agccgttttt tgtatcgcaa aggcctgctg 1560

atttacccga gcaaaatcaa ggacctgaat tatgaaccgc aaaacgagac tattctgctg 1620

catagctact tcgaggatgc gagcttcttc gagggcatgc aggcagagct gcaagcgacc 1680

ttttccccgc gtgaaggttt gttggagcag aataaggagt tttaccgcaa gatccaagag 1740

tcgcaaagca tttgcattac cattcgtcgt ggtgactacc tgtctaccga aaatcgtcag 1800

agcttcttcc agtgtgatga atcctatttc atcaagggta ttgagatcct gaagagcaag 1860

atcgtgaatc cggttttttt cttcttctgc gacgatcttg agtatgccaa acagtttgca 1920

gaggacatga tgaccgaaga agacaacttc atggttgaaa aagagggcaa tccagtgtgg 1980

gaaaaactgc gcctgatgag cgcgtgcaaa cattatatca tcgccaacag cacctttagc 2040

tggtggtgtc agtttctctc tgcgaacccg caaaaaatcg tcgtgggtcc gaaaaactgg 2100

tatccgaagg acagcatcaa caagaataac gcgttggttc agtctgattg gattcagctg 2160

taa 2163

<210> 4

<211> 720

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 人工序列描述：人工合成序列

<400> 4

Met Lys Ile Glu Glu Gly Lys Leu Val Ile Trp Ile Asn Gly Asp Lys

1 5 10 15

Gly Tyr Asn Gly Leu Ala Glu Val Gly Lys Lys Phe Glu Lys Asp Thr

20 25 30

Gly Ile Lys Val Thr Val Glu His Pro Asp Lys Leu Glu Glu Lys Phe

35 40 45

Pro Gln Val Ala Ala Thr Gly Asp Gly Pro Asp Ile Ile Phe Trp Ala

50 55 60

His Asp Arg Phe Gly Gly Tyr Ala Gln Ser Gly Leu Leu Ala Glu Ile

65 70 75 80

Thr Pro Asp Lys Ala Phe Gln Asp Lys Leu Tyr Pro Phe Thr Trp Asp

85 90 95

Ala Val Arg Tyr Asn Gly Lys Leu Ile Ala Tyr Pro Ile Ala Val Glu

100 105 110

Ala Leu Ser Leu Ile Tyr Asn Lys Asp Leu Leu Pro Asn Pro Pro Lys

115 120 125

Thr Trp Glu Glu Ile Pro Ala Leu Asp Lys Glu Leu Lys Ala Lys Gly

130 135 140

Lys Ser Ala Leu Met Phe Asn Leu Gln Glu Pro Tyr Phe Thr Trp Pro

145 150 155 160

Leu Ile Ala Ala Asp Gly Gly Tyr Ala Phe Lys Tyr Glu Asn Gly Lys

165 170 175

Tyr Asp Ile Lys Asp Val Gly Val Asp Asn Ala Gly Ala Lys Ala Gly

180 185 190

Leu Thr Phe Leu Val Asp Leu Ile Lys Asn Lys His Met Asn Ala Asp

195 200 205

Thr Asp Tyr Ser Ile Ala Glu Ala Ala Phe Asn Lys Gly Glu Thr Ala

210 215 220

Met Thr Ile Asn Gly Pro Trp Ala Trp Ser Asn Ile Asp Thr Ser Lys

225 230 235 240

Val Asn Tyr Gly Val Thr Val Leu Pro Thr Phe Lys Gly Gln Pro Ser

245 250 255

Lys Pro Phe Val Gly Val Leu Ser Ala Gly Ile Asn Ala Ala Ser Pro

260 265 270

Asn Lys Glu Leu Ala Lys Glu Phe Leu Glu Asn Tyr Leu Leu Thr Asp

275 280 285

Glu Gly Leu Glu Ala Val Asn Lys Asp Lys Pro Leu Gly Ala Val Ala

290 295 300

Leu Lys Ser Tyr Glu Glu Glu Leu Val Lys Asp Pro Arg Ile Ala Ala

305 310 315 320

Thr Met Glu Asn Ala Gln Lys Gly Glu Ile Met Pro Asn Ile Pro Gln

325 330 335

Met Ser Ala Phe Trp Tyr Ala Val Arg Thr Ala Val Ile Asn Ala Ala

340 345 350

Ser Gly Arg Gln Thr Val Asp Glu Ala Leu Lys Asp Ala Gln Thr Asn

355 360 365

Ser Ser Ser Asn Asn Asn Asn Asn Asn Asn Asn Asn Asn Leu Gly Ile

370 375 380

Glu Gly Arg Ile Ser Glu Phe Met Lys Lys Ile Ile Val Asp Met Asp

385 390 395 400

Gly Arg Leu Gly Asn Gln Met Phe Gln Tyr Ala Tyr Ala Leu Lys Leu

405 410 415

Lys Lys Glu Ile Pro Glu Ser Glu Ile Ile Ile Asn Phe Tyr Arg Ile

420 425 430

Ser Leu Tyr Gly Asp Leu Ala Pro Asn Glu Gln Gly Trp Met Asn Asn

435 440 445

Leu Gln Tyr Phe His Ala Asp Tyr Gln Leu Asp Gln Gln Lys Leu Ser

450 455 460

Asn Phe Leu Ile Gln Tyr Leu Ser Lys Arg Gln Tyr Phe Trp Leu Arg

465 470 475 480

Val Thr Asn Arg Leu Leu His His Leu Ser Ser Phe Lys Arg His Ser

485 490 495

Tyr Phe Pro Phe Asp Lys Leu Pro Asn Phe Leu Lys Tyr Tyr Ser Arg

500 505 510

Phe Leu Tyr Arg Lys Gly Leu Leu Ile Tyr Pro Ser Lys Ile Lys Asp

515 520 525

Leu Asn Tyr Glu Pro Gln Asn Glu Thr Ile Leu Leu His Ser Tyr Phe

530 535 540

Glu Asp Ala Ser Phe Phe Glu Gly Met Gln Ala Glu Leu Gln Ala Thr

545 550 555 560

Phe Ser Pro Arg Glu Gly Leu Leu Glu Gln Asn Lys Glu Phe Tyr Arg

565 570 575

Lys Ile Gln Glu Ser Gln Ser Ile Cys Ile Thr Ile Arg Arg Gly Asp

580 585 590

Tyr Leu Ser Thr Glu Asn Arg Gln Ser Phe Phe Gln Cys Asp Glu Ser

595 600 605

Tyr Phe Ile Lys Gly Ile Glu Ile Leu Lys Ser Lys Ile Val Asn Pro

610 615 620

Val Phe Phe Phe Phe Cys Asp Asp Leu Glu Tyr Ala Lys Gln Phe Ala

625 630 635 640

Glu Asp Met Met Thr Glu Glu Asp Asn Phe Met Val Glu Lys Glu Gly

645 650 655

Asn Pro Val Trp Glu Lys Leu Arg Leu Met Ser Ala Cys Lys His Tyr

660 665 670

Ile Ile Ala Asn Ser Thr Phe Ser Trp Trp Cys Gln Phe Leu Ser Ala

675 680 685

Asn Pro Gln Lys Ile Val Val Gly Pro Lys Asn Trp Tyr Pro Lys Asp

690 695 700

Ser Ile Asn Lys Asn Asn Ala Leu Val Gln Ser Asp Trp Ile Gln Leu

705 710 715 720

<210> 5

<211> 903

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 人工序列描述：人工合成序列

<400> 5

atggctttta aagtagttca aatatgtgga ggtctgggca accagatgtt tcagtatgcg 60

tttgccaagt ccttacagaa gcactccaat accccggtac tgttggacat cacttcattt 120

gattggagcg atcgtaaaat gcagctggag ctgttcccga ttgacttgcc gtatgcgagc 180

gctaaagaga tcgcgattgc taagatgcag catctgccga aattggttcg cgacgccctc 240

aagtgcatgg gttttgaccg cgtgtcccaa gaaatcgtgt tcgagtatga accgaagttg 300

ctgaaaccgt ctcgtctgac ctacttcttt ggttacttcc aagatccgcg ttatttcgac 360

gcaatcagcc ctcttatcaa acagaccttt accctgccgc caccgccgga aaacaacaaa 420

aacaacaaca agaaggagga ggaataccag tgtaagctga gcctgattct ggcagcgaag 480

aacagcgttt tcgtccacat tcgtcgtggt gactatgtgg gcattggttg ccagctgggc 540

atcgactacc aaaaaaaagc cctggagtac atggcaaagc gcgttccgaa tatggaactg 600

ttcgtgttct gcgaggattt ggagttcacg cagaacctgg atctcggtta cccgtttatg 660

gatatgacca ccagagacaa agaagaggag gcgtattggg atatgctgct gatgcaaagc 720

tgtcaacacg gcattattgc taattctacg tacagctggt gggcggcgta cctgatcgag 780

aacccggaaa aaatcattat cggcccaaaa cattggttgt tcgggcatga aaatattctt 840

tgcaaggaat gggtgaaaat cgaaagccat tttgaggtta agtcgcaaaa gtacaatgcg 900

taa 903

<210> 6

<211> 912

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 人工序列描述：人工合成序列

<400> 6

atgaaaatag taaatattat agggggacta ggtaatcaaa tgtttgaata cgctatgtat 60

ttggcgttga aagatgcgca tccggacgag gagattgtgt gcacgactcg ttccttccgt 120

ggctacggcc tgcacaacgg ttacgaactg gaacgcatct tctcgattaa agttatagag 180

gcgagcctgt ggcagttgtg ccagctggcg tatccgtttt ggaactatcg tagttggcag 240

gttatcaatc atctgttacc gaagcgcaaa tctatgaccc tgagcattcc agagatcccg 300

tataacaagt acgacgtcga gcgcaacgac gacgtgttct atgatggtta ctggcaaaac 360

gaagattact tcaagaacat ccgtaagtcc atcctggatg cattttgttt tccggacatc 420

gtggatgaac gtaacaaaga acttatcgaa aaactgtacg gtaagaatag cgttagctgt 480

catgttcgtc gtggtgatta cttgaagcac agcatgatgt gcgtttgtac cccggagtat 540

tacgcccgtg caattggcaa aatgaatcaa caggtcaatc cggagctcta ctgcgttttt 600

tctgatgata tcgagtggtg tagagaaaac atcggcgtgc tgtgcaaggg catgaacgtg 660

atttatgttg actggaataa aggccaagag agcttccgtg acatgcagtt aatgagcctg 720

tgcaaacata atattatcgc caactccagc ttctcatggt ggggtgcttg gctgaatcag 780

aacaaggaca aagtggtgat ggcgcctaaa gactggatga acaagcgcgt cgcgaatgat 840

ccgatttgca aggactggat tcgcatcgag cgtggtatga tgaaaaacgt ggacaacatc 900

accgttctgt aa 912

<210> 7

<211> 945

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 人工序列描述：人工合成序列

<400> 7

atgcaagata tatttctatt aaattcaaca gaggataccg tcgtgatgaa aaagatcatt 60

attaacatca agggccaact gggtaaccag atgttccagt atgcgtgtgc aaaaaagctg 120

caatatatct acggcggtga aattattatc aacgaatact accttaagcg ctactgcccg 180

cagtatttca aaaacagtct gaccggcttt gaattgaatg gtcaggttag ctgctgcgat 240

atcaaaccgc ctctgttggc gaacgagcac aatattatca tccgtctgtt gaaaaaggtg 300

gttccgaata tttacttctc catggcgaac aagttcaact cgctgatgtg gaacagcgac 360

cgcatttaca agaagtttcc ggaattgatc gaccgtgaat acatatactt gactggctat 420

ttccaaagca cccgttattt tgacgacatc aagagcatta tcaccaaaga gttcaccccg 480

aaaaagccac tcaaggaggc gaacattgat ctgtataacc gtattaactc cacggaatcc 540

gtgtgtatta cgattcgtag aggtgatttt atgaataacg tgaacaagaa gaaactgtat 600

atctgcaacg aggagtattt ctacaaaggc atccgcttaa tcaagtctat tgtcccgaac 660

gccgttctgt ttgtatttag cgacgacatc gagtggtgta aggctaacct gaatttcgac 720

aacaacacct tctacgagag cggtatcgat gacgtttggg aaaaactgcg tctgatgtcc 780

agctgcaaac attttatcat cagcaattcg accttcagct ggtggtctca atacctgagc 840

gaaaatccga acaaaatcgt gattgcaccg agcaaatggt ataattttgg tgataattct 900

cagaatgata tttacgaaga gggttggaaa cttatcgagg tttaa 945

<210> 8

<211> 1068

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 人工序列描述：人工合成序列

<400> 8

atgtggttaa gaagtcacag gcaactatca gtcatttttt tccttcacat ccatcaggat 60

tctttcccgc atggtcttgg cttgtcgatc ctgtgcccgg atcgccgtct ggttacccct 120

ccggtggcca tcttttgtct gccgggtaca gcgatgggtc cgaatgcgag cagcagctgc 180

ccgcagcatc cggcaagcct gagccgtacg tggacggttt acccgaacgg ccgttttggt 240

aatcagatgg gtcaatatgc taccttgctg gcgctcgcac agttgaatgg ccgccgcgcg 300

tttatcctgc cagcgatgca tgcagctctg gctccggtgt tccgcattac cctaccagtt 360

ctggctccgg aggtggattc acgtacccca tggcgtgagc tgcaattaca cgattggatg 420

agcgaggaat atgcagactt gcgtgatccg tttctgaagc tgagcggttt cccatgcagc 480

tggaccttct ttcatcactt gcgcgagcag attcgtagag agttcaccct gcacgatcat 540

ctgcgtgagg aggcgcagtc tgttttaggc caactgcgcc tgggccgtac tggtgaccgt 600

ccgcgtacct tcgtcggcgt gcatgttcgt cgaggtgact atctgcaggt aatgccgcaa 660

cgttggaaag gtgttgtcgg cgacagcgcg tacttgcgcc aggcaatgga ttggtttcgt 720

gcgcgtcatg aagcaccggt tttcgtggtg acctccaacg gtatggaatg gtgtaaagaa 780

aacattgata cctcgcaagg tgacgtgacg ttcgccggtg acggccaaga agccacgccg 840

tggaaggact ttgcgctgct gacccagtgc aaccacacca tcatgaccat tggcaccttc 900

ggcttctggg cggcttacct ggcgggtggt gacaccgtgt acttggcgaa ctttactttg 960

ccggactccg aatttctcaa gatcttcaaa ccggaggccg cgttcttgcc ggaatgggtt 1020

ggtatcaacg ccgacctgtc cccgctgtgg actctggcga aaccgtaa 1068

<210> 9

<211> 927

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 人工序列描述：人工合成序列

<400> 9

atgaatgaaa tacacgtact attaacagga cgtttgggca accaactgtt tcaatacgcg 60

tttgcgcgca gcctgcaaaa acagtacggc ggtcgcattg tttgcaatac tttcgatctg 120

gaccaccgtt ccgagaagag caaggtggcg gaccagaagt tcagctatgc gatgggtgat 180

ttcaaactcg acgagaacgt ggctttagag gacgctgccc tgccgtggta tgccgacttc 240

tccagcccgc tgatcaaacc ggtgaagaaa ctcttcccgc gtcgctactt cgatttcatg 300

gcacgtagag gttatctgat gtggcagcgt accgactata tgccaatccc gaaattggag 360

tgcgaggacg tgtttgcgtg gggctggtgg caagacatcc gttactttca agatgtccag 420

accgaattgt ccgacgaggt tgtgccggtt accgacccgc tgccagagaa ccaatacatc 480

tataacgctg ccagcggcga agagagcgtg tgtatttcga tccgctgcgg taattatttc 540

aacccgacgg tgaagaagtt gctgtacgtt tgtacccccg aatattttcg caatgcggtt 600

gagtcaatta ctaaacgttt gacgcatccg aaattcatcg ttttcaccga tgatgtcgat 660

tgggtcaagg aaaacattcg ctttgaatcg gcgtatccgc agtacgagtt cctgtacgaa 720

cgtggttctg ataccgttga ggaaaagatc cgtatgatga ccctttgcaa acattttatt 780

atcagcaatt ccacgtttag ctggtgggca cagtttctga gcaagtctga aaacaaaatt 840

gtgattgcac cggatcgttg gtttgttgac ggccgtcgta tcggcctgta catgcatggt 900

tggaccctga ttccggcggg tcagtaa 927

<210> 10

<211> 972

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 人工序列描述：人工合成序列

<400> 10

atgctagtat taaaatttaa gaaagatcaa ggcctgggca accagctgtg gaattacgtg 60

gtgctgcgca gcgcggcaga ttttaacaac ttaaagttca agatcatcga ctacgaaaat 120

tttaaggcga aggacttcct gaatatcgag ctgaccaact ccgaggaaga acatgaaacc 180

aaagactaca agcattataa agagtctgcg attttcgatt ccgacctcaa gtgcctgatt 240

tatctctttg acaaaaacat cttgaatatc tccgataaca ccattatcga gggcaacctg 300

caaagcgaga actacctgcg tccgaacatt gaaatcctga acaaatatat tgagctgaag 360

agcgttacga aaaacaaaaa aatcaagaaa aatacttgta ttttgaatat tcgcggtggt 420

gaatataagc tgcataaaaa cctgatactt ccgaaatcat attggctgaa tggtattaag 480

aacatcagca aaatcaacaa agacatcgag ttcaagatca ttaccgatga taatctctac 540

gccagcaaat tgctgccgaa ttacgagatc ttggaaggtg gcattaagga ggatttcatg 600

aacctgtaca gctgcaacta cgtcattctt agcaatagca gctttggcta cttcccggtt 660

aaattgggca tcaagcctga aattgttatt gctccgtatc agtggagccg ttttggtaat 720

acctataata gatgggcatc cccgtgcaac tactataaga attggttatg gcagaacatt 780

gatggtaact tggtgccgga atctgagatc atcaagtctc tgattaactc gcaaattatc 840

tacgaaagtt ataacattaa gacgaacatc aaagctctga aacgtttcaa ctttaaggac 900

ctgatcccac gtaaattgaa gatcccgatt aagaaattcc tggcgaaaat ctttccgctg 960

ttcattggtt aa 972

<210> 11

<211> 918

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 人工序列描述：人工合成序列

<400> 11

atgattacag tatcactaat agggggatta ggcaaccaaa tgtttcaata tgcagccggc 60

aaggcgctgg ctgagcgcca cagcgttcgt ttggcgctgg acgttagcgg ttttggtaat 120

gatccgctgc gtagcttcct gttggacaga ttgctggtcc cggaagcgat tgcgaccacg 180

gaaggcaagg ccgacgcacc aggcaagacc aaaggcaact tcgagcgcgc taaatggaaa 240

ggtcgtatcg accgcttgtt acgccgggca ggccttccgc agattgtgca gagcccgcac 300

gaatataggg aaccgcattt tcactacgac ccggtgttcg agggtctggg ctcccatacc 360

acgctgttcg gctatttcca aaccgagcgt tacttcgcac ctatcgccgc tcagctgcgt 420

ggttggttca gcctgcgtga accggttgtg gaaggtgcat cggaaatcct ggctcgtatt 480

gaagcctctc gcctgccggt atccgtgcac gtgcgtcgtg gcgattacct gaacccgggc 540

actgccgagt tccatggtat tgttggtgag ccgtattacc gccaggcgct cggccgtctg 600

gaacaggcga tcggcggtga ggcggagctg tttgtttttt ctgatgatcc ggctgcggca 660

gagtccgttc tgaattttgt cccgaaaagc cgtttggttc acgtgagagg tgcggctgag 720

cgtccgtggg aagatatggc attaatggcg cgttgccgcc atcacgtcat cgcgaactct 780

agctttagct ggtggggtgc gtggctgaat ggtggtgaag gtaagcaggt tatcgcgcca 840

cgtcaatggt tcgcgccggc ggagttgaaa aagctgaaca ccgctgacct gtaccccgcg 900

ggctggattg tggtgtaa 918

<210> 12

<211> 921

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 人工序列描述：人工合成序列

<400> 12

atgaaaatag taaatattac agggggacta ggaaaccaaa tgtttcagta cgcgttcgcc 60

atggcgttaa aatatcgtaa tccgcaggag gaggtgttcg tggacatcca acattataac 120

accattttct ttaaaaagtt caaaggcatc aacctgcata atggttatga aatcgataaa 180

gtgtttccga aggcgaaact gccggttgct ggtgttcgtc agctgatgaa attctcctac 240

tggattccga actatatctt gagccgtctg ggtcgtaagt tcctcccgat tcgtaagaag 300

gagtatatcc cgccttacag catgaactat agctacgacg agaaggcatt gaattggaaa 360

ggcgacggct actttgaagg ttactggcaa tcctacaacc actttggtga catcaaagaa 420

gagctgcaga aggtctacgc ccatccgaaa ccgaatcagt acaacgcggc actgattagc 480

aacttggaat cttgcaattc ggtgggtatt catgtacgcc gcggcgatta cctggcggaa 540

ccggagttcc gcggcatctg cggtctggat tattacgaga aaggcattaa agagatcctg 600

agtgatgaaa agaagtacgt gttcttcatc ttcagcaacg acatgcagtg gtgtcaagag 660

aacatcgctc cgctggttgg tgacaaccgc attgttttta tctctggtaa taagggcaag 720

gacagctgct gggatatgtt tttaatgacg cattgtaaag acctgattat tgcgaacagc 780

tcctttagct ggtggggtgc atttttgaat aaaaaggtcg atcgtgttat ttgcccgaag 840

ccatggctga acagagattg taatattgac atttataacc cgagctggat cttggttcca 900

tgctattctg aagattggta a 921

<210> 13

<211> 1098

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 人工序列描述：人工合成序列

<400> 13

atgatgaaac tattttgtat aactacagga ggcggtctgg ggaaccagat tatgtcctac 60

tctctatggc tgtaccttaa acgtagcggc tttcgtaccg tactgtactt acgtaaaaat 120

gatctggaac gtatctttga tatcaaggac agcctgatca aaaaaatcta cttcgacttt 180

tttatctatt tgatcaagcg ctggtcaggt tgcacccgtt tttttaataa agtgtttggt 240

acggagaaga acaccgagta ttccagcctc ttgggcatta aagttattga ttacccggag 300

tggggtgact ataaattcat taacgagatc ttaccggagc tcaagaagaa attcaccttc 360

ccgaaggacg acaacgaaaa taacgttcgt atcatcaata tgatgcagaa cagcgactca 420

gttggcatcc acgtgcgtcg tggtgactac caaaacagcg tacattggcg tattatcttg 480

ggcgacatct gcgataccga gtattacggc aaagcaattg aaaaggcgta ttcttttttc 540

tccaaaccga cgttcttcgt gttctccgac gacatcgaat gggttaagag caacctgtac 600

ctgaccgatc cggttttcgt ggattggaat aagggtgaag atgcgtttcg cgatatacaa 660

ctgatgagct attgtaaaat gaatattatc gccaacagta cctttagcct gtgtgctagc 720

tggttgaacg tgaataagaa gccgattcgc atcgtcccga gcaagtggtt gaacagctct 780

agcgataaat tgctgtgcaa gtacattccg agcgattgga ttgtcgtgga caactcgaag 840

ccaacgatta gcattatctc taattccaaa ctgtccgagg acgcgattag aaacatcctg 900

aagcagcgct atagcgactt cgaactgatt ctgaacaaca atgataccgc gaaattcggc 960

gacgatcgta tcaagacttc ggaagttaac ggtaaatacg tttataacta cctgcaagat 1020

gactccctga agttccgcaa ccgcaactac ctgtggaatt ggctgagcga aaaatatgca 1080

aacgagttgt acggttaa 1098

<210> 14

<211> 72

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 人工序列描述：人工合成序列

<400> 14

aattcgagct cgaacaacaa caacaataac aataacaaca acctcgggat cgagggaagg 60

atttcagaat tc 72

<210> 15

<211> 24

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 人工序列描述：人工合成序列

<400> 15

Asn Ser Ser Ser Asn Asn Asn Asn Asn Asn Asn Asn Asn Asn Leu Gly

1 5 10 15

Ile Glu Gly Arg Ile Ser Glu Phe

20

Claims

1.一种1，2-岩藻糖基转移酶融合蛋白，其特征在于，所述融合蛋白包含氨基酸序列SEQID NO.2所示的1，2-岩藻糖基转移酶。

2.根据权利要求1所述的融合蛋白，其特征在于，所述融合蛋白包括MBP蛋白标签、氨基酸序列SEQ ID NO.2所示的1，2-岩藻糖基转移酶以及连接肽。

3.根据权利要求1所述的融合蛋白，其特征在于，所述编码氨基酸序列SEQ ID NO.2所示的1，2-岩藻糖基转移酶的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。

4.一种基因工程菌，其特征在于，所述基因工程菌表达包含权利要求1-5任一项中所述的融合蛋白。

5.根据权利要求4所述的基因工程菌，其特征在于，以大肠杆菌为宿主，所述大肠杆菌选自BL21、BL21(DE3)、JM109、JM109(DE3)或K12MG1655，优选为K12MG1655，进一步优选为敲除lacZ基因的K12 MG1655。

6.一种核酸分子，其特征在于，所述核苷酸是编码权利要求1-3任一项中所示的1，2-岩藻糖基转移酶融合蛋白的多核苷酸。

7.根据权利要求6所述的核酸分子，其特征在于，所述核苷酸序列如SEQ ID NO：3所示。

8.含有权利要求6或7所述核酸分子的重组载体。

9.一种2’-岩藻糖基乳糖的生产方法，其特征在于，所述方法由权利要求4或5所述的基因工程菌合成获得2’-岩藻糖基乳糖。

10.权利要求1-3任一项所述的融合蛋白和权利要求4或5所述的基因工程菌在表达2’-岩藻糖基乳糖中的应用。