CN113528480A - 一种α-1,2-岩藻糖基转移酶突变体及其构建方法和应用 - Google Patents

一种α-1,2-岩藻糖基转移酶突变体及其构建方法和应用 Download PDF

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Abstract

本发明属于蛋白质工程技术领域，公开了一种活性提高的α‑1,2‑岩藻糖基转移酶突变体及其构建方法和应用。通过定向进化的手段对幽门螺杆菌Helicobacter pylori NCTC11639来源的α‑1,2‑岩藻糖基转移酶进行蛋白质改造，获得如SEQ ID No.2‑4序列所示的糖基转移酶突变体，所述α‑1,2‑岩藻糖基转移酶突变体具有提高的将岩藻糖残基转移至寡糖活性，适合工业化生产的需要，具有广泛的应用前景。

Description

一种α-1,2-岩藻糖基转移酶突变体及其构建方法和应用
技术领域
本发明属于蛋白质工程技术领域，涉及一种α-1,2-岩藻糖基转移酶突变体及其构建方法和应用，具体涉及一种活性提高的α-1,2-岩藻糖基转移酶突变体及其重组载体、基因工程菌以及制备方法和应用。
背景技术
2′-岩藻糖基乳糖(2′-fucosyllactose)占人乳寡糖成分的30％左右，是母乳中的一类特殊益生元，对婴儿的大脑发育，免疫调节，炎症抑制及抗病原微生物感染发挥着重要作用。2′-岩藻糖基乳糖可以作为婴儿配方奶粉中添加的食品成分，膳食补充剂和医药成分，已被美国食品药品管理局(FDA)批准为安全通用食品(GRAS)，并被欧洲食品安全局(EFSA)批准为新型食品(NF)。2′-岩藻糖基乳糖在婴儿配方奶粉行业中具有广阔的市场前景。2′-岩藻糖基乳糖的合成方法包括化学合成，酶法合成和全细胞发酵合成。化学合成方法具有产量低，步骤繁杂和易污染等缺点，相比之下，酶法合成和全细胞发酵合成等生物合成方法条件较为温和，但也存在底物昂贵，合成效率较低等问题。由于合成产量不高，2′-岩藻糖基乳糖价格较为昂贵。
α-1,2-岩藻糖基转移酶是催化合成2′-岩藻糖基乳糖的关键生物催化剂。α-1,2-岩藻糖基转移酶属于GT11家族，以GDP-岩藻糖作为糖基供体，催化岩藻糖基转移到受体底物的半乳糖基上，形成α-1,2-糖苷键。研究表明幽门螺杆菌Helicobacter pyloriNCTC11639来源的α-1,2-岩藻糖基转移酶FutC在全细胞发酵合成中对2′-岩藻糖基乳糖的合成产量较高，具有极大的应用价值。但是，作为合成途径中的关键酶原，FutC催化活力极低，表达量低，溶解度差等缺陷限制了其在工业生产上的应用。目前尚无催化活力提高的α-1,2-岩藻糖基转移酶的报道，因此采用定向进化技术对其进行改造具有重要意义，为工业上的应用提供技术支持。
发明内容
为了克服现有技术的缺陷，本发明的目的是提供一种活性提高的α-1,2-岩藻糖基转移酶突变体及其制备方法和应用。通过定向进化的手段对幽门螺杆菌Helicobacterpylori NCTC11639来源的α-1,2-岩藻糖基转移酶进行蛋白质改造，获得α-1,2-岩藻糖基转移酶突变体，从而解决现有技术中α-1,2-岩藻糖基转移酶活性低，表达量低，溶解度差，应用受限，2′-岩藻糖基乳糖的合成产量低等的问题。
本发明提供了一种α-1,2-岩藻糖基转移酶突变体，所述突变体的氨基酸序列包括：
(a)以SEQ ID NO.1所示的野生型α-1,2-岩藻糖基转移酶为模板，进行如下突变中的一个或几个得到的氨基酸序列：
第102位的赖氨酸K突变为谷氨酸E；第105位的精氨酸R突变为半胱氨酸C；或第282位的赖氨酸K突变为谷氨酸E；
(b)将(a)中的氨基酸序列经过取代、缺失或添加一个或几个氨基酸(具体可以是1-50、1-30个、1-20个、1-10个、1-5个、1-3个、1个、2个、或3个)得到的氨基酸序列，且与(a)中的氨基酸序列所示的突变体具有相同或相似的功能。
在一优选实施方式中，以SEQ ID NO.1所示的野生型α-1,2-岩藻糖基转移酶为模板，至少进行第102位的赖氨酸K到谷氨酸E的突变。
在一优选实施方式中，以SEQ ID NO.1所示的野生型α-1,2-岩藻糖基转移酶为模板，至少进行第105位的精氨酸R到半胱氨酸C的突变。
在一优选实施方式中，以SEQ ID NO.1所示的野生型α-1,2-岩藻糖基转移酶为模板，至少进行第282位的赖氨酸K到谷氨酸E的突变。
具体地，以SEQ ID NO.1所示的野生型α-1,2-岩藻糖基转移酶为模板，只进行第102位的赖氨酸K到谷氨酸E的突变；或，只进行第105位的精氨酸R到半胱氨酸C的突变；或，只进行第282位的赖氨酸K到谷氨酸E的突变；或，进行第102位的赖氨酸K到谷氨酸E的突变，以及第105位的精氨酸R到半胱氨酸C的突变；或，第102位的赖氨酸K到谷氨酸E的突变，以及第282位的赖氨酸K到谷氨酸E的突变；或进行第105位的精氨酸R到半胱氨酸C的突变，以及第282位的赖氨酸K到谷氨酸E的突变；或，进行第102位的赖氨酸K到谷氨酸E的突变，第105位的精氨酸R到半胱氨酸C的突变，以及第282位的赖氨酸K到谷氨酸E的突变，得到的α-1,2-岩藻糖基转移酶突变体。
本发明还提供了一种α-1,2-岩藻糖基转移酶突变体，所述突变体与如上所述的α-1,2-岩藻糖基转移酶突变体的氨基酸序列具有90％、93％、95％、97％、或99％以上的序列同一性(例如，具有90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％以上的序列同一性)。在一优选实施方式中，所述突变体具有与如上所述的α-1,2-岩藻糖基转移酶突变体的氨基酸序列具有至少95％的同源性。
优选地，本发明提供的α-1,2-岩藻糖基转移酶突变体，其氨基酸序列如SEQ IDNo.2-4任一序列所示。具体地，所述突变体为α-1,2-岩藻糖基转移酶突变体K102E，其氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示；或所述突变体为α-1,2-岩藻糖基转移酶突变体R105C，其氨基酸序列如SEQ ID NO.3所示；或所述突变体为α-1,2-岩藻糖基转移酶突变体K282E，其氨基酸序列如SEQ ID NO.4所示。
SEQ ID No.1FutC野生型氨基酸序列
MAFKVVQICGGLGNQMFQYAFAKSLQKHSNTPVLLDITSFDWSDRKMQLELFPIDLPYASAKEIAIAKMQHLPKLVRDALKCMGFDRVSQEIVFEYEPKLLKPSRLTYFFGYFQDPRYFDAISPLIKQTFTLPPPPENNKNNNKKEEEYQCKLSLILAAKNSVFVHIRRGDYVGIGCQLGIDYQKKALEYMAKRVPNMELFVFCEDLEFTQNLDLGYPFMDMTTRDKEEEAYWDMLLMQSCQHGIIANSTYSWWAAYLIENPEKIIIGPKHWLFGHENILCKEWVKIESHFEVKSQKYNALD
SEQ ID No.2FutC突变体氨基酸序列K102E
MAFKVVQICGGLGNQMFQYAFAKSLQKHSNTPVLLDITSFDWSDRKMQLELFPIDLPYASAKEIAIAKMQHLPKLVRDALKCMGFDRVSQEIVFEYEPKLLEPSRLTYFFGYFQDPRYFDAISPLIKQTFTLPPPPENNKNNNKKEEEYQCKLSLILAAKNSVFVHIRRGDYVGIGCQLGIDYQKKALEYMAKRVPNMELFVFCEDLEFTQNLDLGYPFMDMTTRDKEEEAYWDMLLMQSCQHGIIANSTYSWWAAYLIENPEKIIIGPKHWLFGHENILCKEWVKIESHFEVKSQKYNALD
SEQ ID No.3FutC突变体氨基酸序列R105C
MAFKVVQICGGLGNQMFQYAFAKSLQKHSNTPVLLDITSFDWSDRKMQLELFPIDLPYASAKEIAIAKMQHLPKLVRDALKCMGFDRVSQEIVFEYEPKLLKPSCLTYFFGYFQDPRYFDAISPLIKQTFTLPPPPENNKNNNKKEEEYQCKLSLILAAKNSVFVHIRRGDYVGIGCQLGIDYQKKALEYMAKRVPNMELFVFCEDLEFTQNLDLGYPFMDMTTRDKEEEAYWDMLLMQSCQHGIIANSTYSWWAAYLIENPEKIIIGPKHWLFGHENILCKEWVKIESHFEVKSQKYNALD
SEQ ID No.4FutC突变体氨基酸序列K282E
MAFKVVQICGGLGNQMFQYAFAKSLQKHSNTPVLLDITSFDWSDRKMQLELFPIDLPYASAKEIAIAKMQHLPKLVRDALKCMGFDRVSQEIVFEYEPKLLKPSRLTYFFGYFQDPRYFDAISPLIKQTFTLPPPPENNKNNNKKEEEYQCKLSLILAAKNSVFVHIRRGDYVGIGCQLGIDYQKKALEYMAKRVPNMELFVFCEDLEFTQNLDLGYPFMDMTTRDKEEEAYWDMLLMQSCQHGIIANSTYSWWAAYLIENPEKIIIGPKHWLFGHENILCEEWVKIESHFEVKSQKYNALD
SEQ ID No.5FutC野生型DNA序列
ATGGCCTTTAAGGTGGTGCAAATCTGTGGAGGGCTGGGTAATCAGATGTTTCAGTATGCTTTCGCAAAATCATTGCAGAAACACAGTAATACCCCTGTCCTGTTAGATATCACTTCTTTTGATTGGAGCGATCGTAAGATGCAATTAGAACTTTTCCCGATTGATCTGCCGTATGCGAGTGCGAAAGAAATTGCCATAGCGAAAATGCAACACCTCCCCAAACTAGTACGCGATGCGTTGAAGTGTATGGGATTCGACCGTGTTAGTCAGGAGATTGTTTTTGAGTACGAACCTAAGCTGCTCAAACCATCGCGCCTGACATATTTTTTTGGCTACTTCCAGGATCCACGATACTTTGACGCTATATCACCGCTGATTAAGCAAACCTTTACGCTGCCGCCACCACCTGAAAATAATAAAAATAATAATAAAAAAGAGGAAGAGTACCAGTGCAAGCTGTCTTTGATTTTGGCCGCTAAAAACAGCGTGTTTGTTCATATCAGACGTGGCGATTATGTGGGGATCGGTTGTCAGCTGGGTATTGACTATCAAAAAAAGGCGCTTGAGTATATGGCAAAACGCGTGCCGAACATGGAACTGTTTGTTTTTTGCGAAGACCTGGAATTCACGCAGAATCTCGATCTTGGCTACCCTTTTATGGACATGACCACACGGGATAAAGAAGAAGAGGCCTATTGGGACATGCTGCTGATGCAGTCTTGTCAGCACGGCATTATAGCCAACTCGACTTATAGCTGGTGGGCAGCATACCTGATCGAGAACCCGGAAAAAATCATTATTGGTCCCAAACATTGGCTGTTCGGTCATGAAAACATCCTTTGCAAAGAATGGGTCAAAATAGAATCCCATTTCGAGGTAAAATCCCAGAAGTATAACGCTTTAGATTGA
本发明还提供了一种如上所述的α-1,2-岩藻糖基转移酶突变体的编码基因。
本发明还提供了一种包含如上所述的α-1,2-岩藻糖基转移酶突变体基因的重组载体。所述重组载体通过在载体质粒上插入所述α-1,2-岩藻糖基转移酶突变体的编码基因构成，所述载体质粒包括：pET系列、pQE系列、pRSET系列、pGEX系列、pBV系列、pTrc系列、pTwin系列、pEZZ系列、pKK系列以及pUC系列等。
本发明还提供了一种包含上述α-1,2-岩藻糖基转移酶突变体的编码基因或重组载体的重组工程菌(基因工程菌)或重组工程细胞。所述重组工程菌或重组工程细胞由如上所述的重组载体转化至宿主微生物或宿主细胞中获得。
本发明提供了如上所述所述的α-1,2-岩藻糖基转移酶突变体或如上所述的α-1,2-岩藻糖基转移酶突变体的编码基因或如上所述的重组载体或如上所述的重组菌或重组细胞在制备将岩藻糖残基转移至寡糖(形成糖苷键或形成α-1,2-糖苷键)的催化剂或药物中的应用。
本发明提供了如上所述的所述的α-1,2-岩藻糖基转移酶突变体或如上所述的α-1,2-岩藻糖基转移酶突变体的编码基因或如上所述的重组载体或如上所述的重组菌或重组细胞在细胞内合成岩藻糖基化寡糖中的应用。
本发明提供了如上所述的所述的α-1,2-岩藻糖基转移酶突变体或如上所述的α-1,2-岩藻糖基转移酶突变体的编码基因或如上所述的重组载体或如上所述的重组菌或重组细胞在体外酶法合成中/在细胞外酶法合成中作为将岩藻糖残基转移至单糖或寡糖的催化剂(形成糖苷键或形成α-1,2-糖苷键)中的应用。
本发明中，所述体外酶法可以在宿主细胞工厂中进行。对于适宜的宿主细胞没有特别的限制，任何能够实现本发明所述α-1,2-岩藻糖基转移酶的表达的宿主细胞均可适用。在具体实施方式中，所述宿主细胞包括大肠杆菌，酿酒酵母和地衣芽孢杆菌。
本发明中，所述应用用于制备岩藻糖基化寡糖。所述岩藻糖基化寡糖包括人乳寡糖成分、ABH血型抗原或Lewis抗原。所述人乳寡糖成分为2'-岩藻糖基乳糖；所述ABH血型抗原为Globo H；所述Lewis抗原为Lewis b和/或Lewis Y。
在一具体实施方式中，所述岩藻糖基化寡糖为α-1,2-岩藻糖基化寡糖。
在另一具体实施方式中，所述应用为将岩藻糖残基转移至乳糖制备α-1,2-岩藻糖基化乳糖。
本发明还提供了一种体外酶法合成岩藻糖基化寡糖的方法，所述方法包括
(1)提供如上所述的α-1,2-岩藻糖基转移酶；
(2)提供供体底物和受体底物，在允许生产所述岩藻糖基化寡糖的适宜营养条件、以及允许所述α-1,2-岩藻糖基转移酶表达的条件下，培养宿主细胞，使所述α-1,2-岩藻糖基转移酶与所述供体底物和所述受体底物接触，制备所述岩藻糖基化寡糖。
本发明中，所述体外酶法在宿主细胞工厂中进行，所述酶通过基因工程菌进行诱导表达，其中，所述酶的序列是所述宿主细胞的外源序列，所述序列整合在所述宿主细胞的基因组中，或者所述宿主细胞含有所述包含编码所述酶的基因的重组载体；其中，所述酶的核酸序列可操作地连接至由所述载体转化的宿主细胞识别的控制序列。
本发明中，对于适宜的宿主细胞没有特别的限制，任何能够实现本发明所述α-1,2-岩藻糖基转移酶的表达的宿主细胞均可适用。在具体实施方式中，所述宿主细胞包括大肠杆菌，酿酒酵母和地衣芽孢杆菌。
本发明中，所述供体底物包括岩藻糖糖基。在一具体实施方式中，所述供体底物为GDP-岩藻糖。所述GDP-岩藻糖残基通过在所述宿主细胞中同时表达的酶或所述宿主细胞的代谢提供。
本发明中，所述受体底物包括单糖或寡糖；所述单糖或寡糖选自由以下各项组成的组：乳糖、乳果糖、LacNAc Typ I、LacNAc Typ II、D-半乳糖和β-苄基乳糖，Galβ1,3-为起始的寡糖。
本发明中，所述岩藻糖基化寡糖包括人乳寡糖成分、ABH血型抗原或Lewis抗原。所述人乳寡糖成分为2'-岩藻糖基乳糖；所述ABH血型抗原为Globo H；所述Lewis抗原为Lewisb和/或Lewis Y。
本发明所述方法还包括从所述宿主细胞或其生长培养基中分离所述岩藻糖基化寡糖的步骤。
本发明提供了利用所述的α-1,2-岩藻糖基转移酶制备岩藻糖基化寡糖在食品或保健品中的应用。所述食品例如包括婴幼儿奶粉等；所述保健品例如包括益生元产品等。
本发明所使用的术语“同一性”是指与基础核酸序列的序列相似性。同一性可以用肉眼或计算机软件进行评价。使用计算机软件，两个或多个序列之间的同一性可以用百分比(％)表示，其可以用来评价相关序列之间的同一性。
本发明具有下列优点和积极效果：
本发明人经过大量实践研究，利用基因定向诱变技术，对幽门螺杆菌Helicobacter pylori NCTC11639来源的α-1,2-岩藻糖基转移酶进行蛋白质改造，从而显著改善了酶的活性，得到的突变体K102E、R105C、K282E对于天然底物乳糖的催化活力提高，由114.5mU/mg分别提升至139mU/mg，148.6mU/mg和174.1mU/mg，对2′-岩藻糖基乳糖的生物合成具有重要意义，适合工业化生产的需要，具有广泛的应用前景。
附图说明
图1为乳糖和2’-岩藻糖基乳糖的HPLC分析结果。
图2为产物2’-岩藻糖基乳糖测定标准曲线。
图3为FutC野生型及突变体蛋白纯化SDS-PAGE胶图。
具体实施方式
下面通过具体实施例，对本发明的技术方案作进一步的具体说明。应当理解，本发明的实施并不局限于下面的实施例，对本发明所做的任何形式上的变通或改变都将落入本发明保护范围。
实施例1：
本发明选择了从菌株Helicobacter pylori NCTC11639来源的α-1,2-岩藻糖基转移酶基因futC；该酶的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示，编码基因核苷酸序列如SEQ IDNO.5所示。
1.随机突变库构建
1.1引物设计
本发明以包含野生型α-1,2-岩藻糖基转移酶futC基因的pET24a-FutC质粒作为模板，通过易错PCR构建FutC随机突变库。引物设计如下：
Figure BDA0003151441940000071
1.2PCR体系如下：
20ng pET24a-FutC，0,0.4,0.6,1μL MnCl2(10mmol/L)，2μL Primer For和PrimerRev(20μmol/L)，10μL dNTP(2.5mmol/L)，2μL dCTP(10mmol/L)，2μL dTTP(10mmol/L)，1μLDreamTaq DNA polymerase，10μL 10×DreamTaq buffer，用ddH2O补足至100μL。
1.3PCR扩增条件为：
预变性95℃3min；变性95℃30s；退火58℃30s；延伸72℃90s；30个循环；后延伸72℃10min。
1.4PCR产物纯化和载体双酶切
PCR反应结束后，进行产物纯化。
将PCR产物和载体pUC18分别用Sac I和Hind III在37℃双酶切2h。其中载体双酶切后用FastAP去磷酸化2h。将PCR产物和载体pUC18分别纯化后按照如下体系16℃连接过夜：200ng pUC18线性载体，1200ng插入片段FutC，2μL10×T4 DNA ligase buffer，1μL T4DNA ligase，dd H2O补足至20μL。
1.5电击转化感受态细胞及培养
将连接产物进行纯化，取1μL连接产物电击转化E.coli 10G感受态细胞，37℃220r/min复苏45min后，用LB培养基将10μL复苏菌液稀释1000倍，取200μL涂布LB抗性平板，37℃倒置培养过夜。剩余复苏菌液接于5mL含有100μg/mL氨苄青霉素的LB液体培养基中，37℃220r/min生长12-14h，提取质粒为突变文库并保存。第二天通过平板计数计算库容量。随机从平板上挑取20个转化子，送测序，计算突变率。将最终获得的4个不同突变率(0.77个/基因、1.2个/基因，2个/基因、4.3个/基因)的突变库按照1:1:1:1的摩尔比混合，计算得到最终库容量和突变率，得到平均突变率为2.1个/基因，最终库容量为5.6×105的FutC随机突变文库。
2.突变库的FACS筛选
取1μL随机突变库质粒，电转化JM107-pUCKC18-FKP感受态细胞，复苏菌液接于5mL含有100μg/mL氨苄青霉素和25μg/mL氯霉素的LB液体培养基中，37℃220r/min生长12h，按照4％的比例转接至5mL的M9液体培养基的试管中，37℃220r/min培养至OD600nm为0.8-1.0，加入终浓度为0.8mmol/L的IPTG，20℃220r/min诱导18h。取2.4mL菌体，与荧光底物反应，反应体系为50μL，其中含有终浓度为5mmol/L的岩藻糖，0.5mmol/L的lactose-bodipy/lactose-coumarin，25mmol/L的5×M9缓冲液。37℃220r/min反应1h，将未反应的荧光底物清洗至胞外。清洗流程如下：将反应体系4000r/min离心3min，弃上清，加入1mL LB培养基轻轻重悬EP管底部的菌体，4000r/min离心3min，重复上步操作，将LB培养基重悬的细菌置于37℃220r/min摇床清洗10min，4000r/min离心3min，弃上清，用1mL预冷的PBS重悬菌体，重复该操作一次，最后将收集的菌体重悬于50μL预冷的PBS溶液中，放置于冰上保存。
FACS筛选条件如下：1×PBS作为鞘液，使用85μm的喷嘴，分选流速为4000-5000evt/s；分选选择双荧光阳性最强的占1％左右的区域。总共进行三轮分选，将第三轮分选得到的5000个细菌复苏后涂布平板，随机挑取平板上100个突变体进入复筛。将突变体在试管中诱导表达，离心取菌体，通过反复冻融获得粗酶，粗酶与lactose-bodipy反应20min后，用TLC初步鉴定反应产物。对活力提高的突变体进行测序，得到活力提高的3个突变位点为K102E、R105C和K282E。
3.FutC野生型和突变体的表达纯化及活力测定
3.1FutC野生型和突变体的表达
以pET24a-FutC作为模板，用全质粒PCR构建获得的突变体，引物设计如下：
Figure BDA0003151441940000091
PCR体系如下：20ng pET24a-FutC，1μL Primer For和Primer Rev(20μmol/L)，25μL Phanta Max Mix DNA polymerase，用ddH2O补足至50μL。
PCR扩增条件为：预变性95℃3min；变性95℃30s；退火58℃30s；延伸72℃4min；30个循环；后延伸72℃10min。
PCR反应结束后，用DNA凝胶电泳检测PCR条带，并进行产物纯化。纯化后的PCR产物转化入E.coli BL21(DE3)，挑取测序验证正确的转化子接入5mL LB液体培养基，37℃220r/min过夜培养12h，将1mL菌液转接到100μg/mL卡那霉素的250mL 2YT培养基的摇瓶中，37℃220r/min培养至OD600nm为0.8时，加入终浓度为0.8mmol/L的IPTG，20℃诱导21h，5000r/min收集菌体，使用高压均质仪破碎并用镍柱纯化蛋白。
3.2FutC野生型和突变体的纯化
纯化步骤如下：在细胞破碎仪中破碎菌体，4℃800mbar，破碎6min，将细胞破碎液转入原离心管中，12000rpm离心30min，收集上清粗酶液，使用镍柱纯化。
取4℃保存的Ni柱，打开封闭的柱头，流尽原柱液。使用50mL去离子水冲洗Ni柱。使用10mL的1×Binding Buffer冲洗Ni柱。
将粗酶液上柱两次。使用10mL Binding Buffer(含20mM咪唑)冲洗Ni柱。使用10mLWash Buffer(含40mM咪唑)冲洗Ni柱。使用5mL Elution Buffer(含80mM咪唑)洗脱杂蛋白，再使用5mL的Elution Buffer(含250mM咪唑)洗脱纯蛋白。使用30kDa的Millipore超滤浓缩管浓缩除盐。其中，FutC野生型及突变体蛋白纯化SDS-PAGE胶图如图3所示。
3.3FutC野生型和突变体的活力测定
将纯化获得的野生型及突变体纯酶进行催化反应，测定活性：反应体系20μL，其中包括终浓度5mM的GDP-岩藻糖，5mM的lactose，25mM HEPES缓冲液(pH5.6)，0.08mg/mL的FutC纯酶，37℃反应20min。沸水浴终止反应6min。将反应体系12000rpm高速离心1min，加入100μL衍生缓冲液(含有10mg/mL对氨基苯甲酸和10mg/mL羟基硼氢化钠)，80℃水浴中衍生化40min。12000rpm高速离心30min后，取上清HPLC分析。其中，乳糖和2’-岩藻糖基乳糖的HPLC分析结果如图1所示。
产物标准曲线的测定：配制终浓度为0.2mM，0.4mM，0.8mM，1mM，1.6mM，2.4mM的2’-岩藻糖基乳糖标准品溶液。取20μL标准品加入100μL衍生缓冲液，80℃水浴中衍生化40min。12000rpm高速离心30min后，取上清进行HPLC分析。测定的标准曲线，如图2所示。
比活力公式：R＝(A-6.3088)/1433.152。R：比活力U/mg；A：产物HPLC峰面积。
HPLC检测条件：
流动相A：50mM甲酸铵溶液(pH4.4)
流动相C：乙腈
色谱柱：Tsk gel Amide-80正向亲和色谱柱(4.6×250nm，5μm)
洗脱条件：0-30min，流动相A：流动相C＝25：75，流速1mL/min，柱温：25℃
荧光检测器FLD：Ex＝313nm，Em＝358nm
紫外检测器DAD：Ex＝303/4nm，参比360/100nm。
测定结果：野生型α-1,2-岩藻糖基转移酶的催化活力为114.5mU/mg；α-1,2-岩藻糖基转移酶突变体K102E的催化活力为139mU/mg；α-1,2-岩藻糖基转移酶突变体R105C的催化活力为148.6mU/mg；α-1,2-岩藻糖基转移酶突变体K282E的催化活力为174.1mU/mg。
3.4FutC野生型和突变体的活力蛋白表达量测定
用BCA法对纯化得到的野生型和突变型蛋白浓度进行精确测定，结果显示野生型的蛋白表达量为1.84mg/L，突变体K102E蛋白表达量提高1.6倍，为3mg/L；R105C蛋白表达量提高1.7倍，为3.1mg/L；K282E蛋白表达量提高2.5倍，为4.62mg/L。本发明所述的3个突变体的蛋白表达量相比野生型均有所提升。
以上所述的实施例是本发明的较佳方案，并非对本发明作任何形式上的限制，在不超出权利要求所记载的技术方案的前提下还有其它的变体及改型。
序列表
<110> 上海交通大学
<120> 一种α-1,2-岩藻糖基转移酶突变体及其构建方法和应用
<160> 13
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 302
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
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1 5 10 15
Phe Gln Tyr Ala Phe Ala Lys Ser Leu Gln Lys His Ser Asn Thr Pro
20 25 30
Val Leu Leu Asp Ile Thr Ser Phe Asp Trp Ser Asp Arg Lys Met Gln
35 40 45
Leu Glu Leu Phe Pro Ile Asp Leu Pro Tyr Ala Ser Ala Lys Glu Ile
50 55 60
Ala Ile Ala Lys Met Gln His Leu Pro Lys Leu Val Arg Asp Ala Leu
65 70 75 80
Lys Cys Met Gly Phe Asp Arg Val Ser Gln Glu Ile Val Phe Glu Tyr
85 90 95
Glu Pro Lys Leu Leu Lys Pro Ser Arg Leu Thr Tyr Phe Phe Gly Tyr
100 105 110
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115 120 125
Thr Phe Thr Leu Pro Pro Pro Pro Glu Asn Asn Lys Asn Asn Asn Lys
130 135 140
Lys Glu Glu Glu Tyr Gln Cys Lys Leu Ser Leu Ile Leu Ala Ala Lys
145 150 155 160
Asn Ser Val Phe Val His Ile Arg Arg Gly Asp Tyr Val Gly Ile Gly
165 170 175
Cys Gln Leu Gly Ile Asp Tyr Gln Lys Lys Ala Leu Glu Tyr Met Ala
180 185 190
Lys Arg Val Pro Asn Met Glu Leu Phe Val Phe Cys Glu Asp Leu Glu
195 200 205
Phe Thr Gln Asn Leu Asp Leu Gly Tyr Pro Phe Met Asp Met Thr Thr
210 215 220
Arg Asp Lys Glu Glu Glu Ala Tyr Trp Asp Met Leu Leu Met Gln Ser
225 230 235 240
Cys Gln His Gly Ile Ile Ala Asn Ser Thr Tyr Ser Trp Trp Ala Ala
245 250 255
Tyr Leu Ile Glu Asn Pro Glu Lys Ile Ile Ile Gly Pro Lys His Trp
260 265 270
Leu Phe Gly His Glu Asn Ile Leu Cys Lys Glu Trp Val Lys Ile Glu
275 280 285
Ser His Phe Glu Val Lys Ser Gln Lys Tyr Asn Ala Leu Asp
290 295 300
<210> 2
<211> 302
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 2
Met Ala Phe Lys Val Val Gln Ile Cys Gly Gly Leu Gly Asn Gln Met
1 5 10 15
Phe Gln Tyr Ala Phe Ala Lys Ser Leu Gln Lys His Ser Asn Thr Pro
20 25 30
Val Leu Leu Asp Ile Thr Ser Phe Asp Trp Ser Asp Arg Lys Met Gln
35 40 45
Leu Glu Leu Phe Pro Ile Asp Leu Pro Tyr Ala Ser Ala Lys Glu Ile
50 55 60
Ala Ile Ala Lys Met Gln His Leu Pro Lys Leu Val Arg Asp Ala Leu
65 70 75 80
Lys Cys Met Gly Phe Asp Arg Val Ser Gln Glu Ile Val Phe Glu Tyr
85 90 95
Glu Pro Lys Leu Leu Glu Pro Ser Arg Leu Thr Tyr Phe Phe Gly Tyr
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Asn Ser Val Phe Val His Ile Arg Arg Gly Asp Tyr Val Gly Ile Gly
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Arg Asp Lys Glu Glu Glu Ala Tyr Trp Asp Met Leu Leu Met Gln Ser
225 230 235 240
Cys Gln His Gly Ile Ile Ala Asn Ser Thr Tyr Ser Trp Trp Ala Ala
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Tyr Leu Ile Glu Asn Pro Glu Lys Ile Ile Ile Gly Pro Lys His Trp
260 265 270
Leu Phe Gly His Glu Asn Ile Leu Cys Lys Glu Trp Val Lys Ile Glu
275 280 285
Ser His Phe Glu Val Lys Ser Gln Lys Tyr Asn Ala Leu Asp
290 295 300
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<211> 302
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
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Phe Gln Tyr Ala Phe Ala Lys Ser Leu Gln Lys His Ser Asn Thr Pro
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Leu Glu Leu Phe Pro Ile Asp Leu Pro Tyr Ala Ser Ala Lys Glu Ile
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Ala Ile Ala Lys Met Gln His Leu Pro Lys Leu Val Arg Asp Ala Leu
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Ser His Phe Glu Val Lys Ser Gln Lys Tyr Asn Ala Leu Asp
290 295 300
<210> 4
<211> 302
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 4
Met Ala Phe Lys Val Val Gln Ile Cys Gly Gly Leu Gly Asn Gln Met
1 5 10 15
Phe Gln Tyr Ala Phe Ala Lys Ser Leu Gln Lys His Ser Asn Thr Pro
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Val Leu Leu Asp Ile Thr Ser Phe Asp Trp Ser Asp Arg Lys Met Gln
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Ala Ile Ala Lys Met Gln His Leu Pro Lys Leu Val Arg Asp Ala Leu
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Thr Phe Thr Leu Pro Pro Pro Pro Glu Asn Asn Lys Asn Asn Asn Lys
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Cys Gln Leu Gly Ile Asp Tyr Gln Lys Lys Ala Leu Glu Tyr Met Ala
180 185 190
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Phe Thr Gln Asn Leu Asp Leu Gly Tyr Pro Phe Met Asp Met Thr Thr
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Cys Gln His Gly Ile Ile Ala Asn Ser Thr Tyr Ser Trp Trp Ala Ala
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Tyr Leu Ile Glu Asn Pro Glu Lys Ile Ile Ile Gly Pro Lys His Trp
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Leu Phe Gly His Glu Asn Ile Leu Cys Glu Glu Trp Val Lys Ile Glu
275 280 285
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<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
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atggccttta aggtggtgca aatctgtgga gggctgggta atcagatgtt tcagtatgct 60
ttcgcaaaat cattgcagaa acacagtaat acccctgtcc tgttagatat cacttctttt 120
gattggagcg atcgtaagat gcaattagaa cttttcccga ttgatctgcc gtatgcgagt 180
gcgaaagaaa ttgccatagc gaaaatgcaa cacctcccca aactagtacg cgatgcgttg 240
aagtgtatgg gattcgaccg tgttagtcag gagattgttt ttgagtacga acctaagctg 300
ctcaaaccat cgcgcctgac atattttttt ggctacttcc aggatccacg atactttgac 360
gctatatcac cgctgattaa gcaaaccttt acgctgccgc caccacctga aaataataaa 420
aataataata aaaaagagga agagtaccag tgcaagctgt ctttgatttt ggccgctaaa 480
aacagcgtgt ttgttcatat cagacgtggc gattatgtgg ggatcggttg tcagctgggt 540
attgactatc aaaaaaaggc gcttgagtat atggcaaaac gcgtgccgaa catggaactg 600
tttgtttttt gcgaagacct ggaattcacg cagaatctcg atcttggcta cccttttatg 660
gacatgacca cacgggataa agaagaagag gcctattggg acatgctgct gatgcagtct 720
tgtcagcacg gcattatagc caactcgact tatagctggt gggcagcata cctgatcgag 780
aacccggaaa aaatcattat tggtcccaaa cattggctgt tcggtcatga aaacatcctt 840
tgcaaagaat gggtcaaaat agaatcccat ttcgaggtaa aatcccagaa gtataacgct 900
ttagattga 909
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<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
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tcctttgcga agaatgggtc aaaatag 27
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<211> 27
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
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acccattctt cgcaaaggat gttttca 27

Claims (10)

1.一种α-1,2-岩藻糖基转移酶突变体，其特征在于，所述突变体的氨基酸序列包括：
(a)相比SEQ ID NO.1所示的野生型α-1,2-岩藻糖基转移酶，包含如下突变中的一个或多个：
第102位的赖氨酸K突变为谷氨酸E；第105位的精氨酸R突变为半胱氨酸C；或第282位的赖氨酸K突变为谷氨酸E；
(b)将所述(a)中的氨基酸序列经过取代、缺失或添加一个或几个氨基酸得到的氨基酸序列，与所述(a)中的氨基酸序列具有至少95％的同源性，且与所述(a)中的氨基酸序列所示的突变体具有相同或相似的功能。
2.如权利要求1所述的α-1,2-岩藻糖基转移酶突变体，其特征在于，所述突变体为α-1,2-岩藻糖基转移酶突变体K102E，其氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示；或所述突变体为α-1,2-岩藻糖基转移酶突变体R105C，其氨基酸序列如SEQ ID NO.3所示；或所述突变体为α-1,2-岩藻糖基转移酶突变体K282E，其氨基酸序列如SEQ ID NO.4所示。
3.一种如权利要求1或2所述的α-1,2-岩藻糖基转移酶突变体的编码基因。
4.一种包含如权利要求3所述的α-1,2-岩藻糖基转移酶突变体的编码基因的重组载体，其特征在于，所述重组载体包含如权利要求3所述的α-1,2-岩藻糖基转移酶突变体的编码基因构成。
5.一种包含如权利要求3所述的α-1,2-岩藻糖基转移酶突变体的编码基因或如权利要求4所述的重组载体的重组工程菌或重组工程细胞。
6.如权利要求1或2所述的α-1,2-岩藻糖基转移酶突变体或如权利要求3所述的α-1,2-岩藻糖基转移酶突变体的编码基因或如权利要求4所述的重组载体或如权利要求5所述的重组菌或重组细胞在制备将岩藻糖残基转移至单糖或寡糖的催化剂或药物中的应用。
7.如权利要求1或2所述的α-1,2-岩藻糖基转移酶突变体或如权利要求3所述的α-1,2-岩藻糖基转移酶突变体的编码基因或如权利要求4所述的重组载体或如权利要求5所述的重组菌或重组细胞在细胞内合成岩藻糖基化寡糖或在细胞外制备岩藻糖基化寡糖中的应用。
8.一种体外酶法制备岩藻糖基化寡糖的方法，其特征在于，所述方法包括
(1)提供如权利要求1或2所述的α-1,2-岩藻糖基转移酶；
(2)提供供体底物和受体底物，在允许生产所述岩藻糖基化寡糖的适宜营养条件、以及允许α-1,2-岩藻糖基转移酶表达的条件下，培养宿主细胞，使步骤(1)中的α-1,2-岩藻糖基转移酶与所述供体底物和受体底物接触，制备所述岩藻糖基化寡糖。
9.如权利要求8所述的方法，其特征在于，所述供体底物包括岩藻糖糖基；和/或，所述受体底物包括单糖或寡糖，所述单糖或寡糖选自由以下各项组成的组：乳糖、乳果糖、LacNAc Typ I、LacNAc Typ II、D-半乳糖和β-苄基乳糖，Galβ1,3-为起始的寡糖。
10.利用如权利要求1或2所述的α-1,2-岩藻糖基转移酶制备的岩藻糖基化寡糖在食品或保健品中的应用。
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