CN114591939B

CN114591939B - 一种高耐热d-阿洛酮糖-3-差向异构酶突变体及其应用

Info

Publication number: CN114591939B
Application number: CN202210251205.1A
Authority: CN
Inventors: 秦慧民; 路福平; 李超
Original assignee: Tianjin University of Science and Technology
Current assignee: Tianjin University of Science and Technology
Priority date: 2022-03-15
Filing date: 2022-03-15
Publication date: 2023-11-28
Anticipated expiration: 2042-03-15
Also published as: CN114591939A

Abstract

本发明提供了一种高耐热D‑阿洛酮糖‑3‑差向异构酶突变体、其制备方法及应用。该突变体以源于菌株Sinorhizobium fredii的野生型DAEase为亲本，通过关键位点氨基酸残基的定点突变改造获得。与目前已有的同类酶相比，本发明高耐热D‑阿洛酮糖‑3‑差向异构酶突变体的热稳定性和催化活性都得到了进一步显著提高，本发明获得的突变体在65℃的半衰期(t_1/2)值较之野生酶的4.0h提高至12.0h，70℃的半衰期(t_1/2)值较之野生酶的1.0h提高至4.5h，适宜反应温度为70℃，相对酶活为野生型的130％，具有重要的工业应用价值。

Description

一种高耐热D-阿洛酮糖-3-差向异构酶突变体及其应用

技术领域：

本发明属于基因工程领域，特别涉及一种高耐热D-阿洛酮糖-3-差向异构酶的突变体及其应用。

背景技术：

在健康饮食观念日益加深的当今社会，安全稳定低热量的D-阿洛酮糖(D-allulose)因其具有多种独特的生理功能而引起了研究者的广泛关注。D-阿洛酮糖是稀有糖家族的重要成员，只存在于少数植物和某些细菌中，含量极低，其是D-果糖的一种C-3差向异构体，由于其生理特性的多样性，正成为制药、保健和食品工业的潜在功能成分。D-阿洛酮糖具有较高的甜度和较低的能量，被认为是一种理想的甜味剂和蔗糖的有效替代品，它具有蔗糖70％的甜度，但热量仅含约0.2千卡/克。此外，D-阿洛酮糖可以通过美拉德反应提高食物的持水性，改善其胶凝性能，并在食品加工过程中产生良好的风味。因此，D-阿洛酮糖作为低热量甜味剂在饮料、烘焙食品、冰淇淋和其他典型的高热量产品中具有潜在的商业用途。D-阿洛酮糖作为安全稳定低热量的新型功能性因子,其除了在食品中的重要应用价值外，还具有多种独特的的营养学和生理学功能：(1)抑制血糖，可作为Ⅱ型糖尿病人的辅助治疗剂、膳食补充剂和甜味剂；(2)降低血脂，减少脂肪合成酶活性，抑制腹腔内脂肪堆积；(3)抗氧化活性，具有很强的活性氧(ROS)清除能力及谷胱甘肽还原能力；(4)神经保和抗炎作用等。

阿洛酮糖的生产方法可分为2种：化学合成和生物合成。化学合成的方法具有诸多不利因素，例如产品的分离纯化困难，产生多种副产物及化学废料。利用生物合成法生产D-阿洛酮糖，是利用微生物所产特异性的酶，专一性的催化底物合成D-阿洛酮糖。由于更高的底物特异性和温和的反应条件提供了更高的可持续性，酶法合成D-阿洛酮糖在世界各地都是首选。D-阿洛酮糖-3-差向异构酶(D-allulose 3-epimerase,DAEase)家族则是实现D-阿洛酮糖生物法生产的重要生物催化剂，可以将D-果糖异构化为D-阿洛酮糖。目前为止，已经筛选并鉴定了至少20种DAEase，但其中大多数的酶对D-果糖的催化活性较低且热稳定性较差，大多数在60℃下的半衰期低于2小时，而工业生产需要较高的温度进行反应，这大大的限制了利用生物酶法生产D-阿洛酮糖的工业实际应用。

专利202010790290X公开了一种DAEase突变体V105I，其酶活为原始亲本的150％，然而该突变体在70℃下的半衰期t_1/2值仅为0.5h，相对于工业催化60～70℃的一般温度要求，其热稳定性仍有所欠缺，导致其在高温催化过程中活性及稳定性急剧下降。另外，由于DAEase催化存在热力学平衡，在保证热稳定的前提下高温也有助于正反应进行，而且将温度进一步提升也有利于工业催化过程中防止染菌。因此，进一步提升酶分子耐热性、开发具有高催化活性和高热稳定性的DAEase将对D-阿洛酮糖的生产具有重要的意义。

发明内容：

本发明的目的在于：1)利用基因工程和蛋白质工程提供一种高耐热D-阿洛酮糖-3-差向异构酶的突变体；2)提供表达所述高耐热D-阿洛酮糖-3-差向异构酶突变体的重组载体或宿主菌；3)提供所述高耐热D-阿洛酮糖-3-差向异构酶突变体的应用。

本发明以源于菌株Sinorhizobium fredii CCBAU 83666(登录号：ASY72161.1)的野生型DAEase(SfDAE)为亲本(其氨基酸序列和基因序列分别如SEQ ID NO:1和SEQ ID NO:2所示)，通过关键位点氨基酸残基的定点突变，改造获得高耐热D-阿洛酮糖-3-差向异构酶突变体。

所述高耐热D-阿洛酮糖-3-差向异构酶突变体的氨基酸序列如SEQ ID NO:3所示，是由如SEQ ID NO:1所示的氨基酸序列上第15位的氨基酸残基由甲硫氨酸(Met)变为甘氨酸(Gly)、第40位的氨基酸残基由脯氨酸(Pro)变为丝氨酸(Ser)、第245位的氨基酸残基由甲硫氨酸(Met)变为苏氨酸(Thr)，以及第254位的氨基酸残基由丙氨酸(Ala)变为半胱氨酸(Cys)制得。

本发明还提供一种编码所述高耐热D-阿洛酮糖-3-差向异构酶突变体的基因序列，如SEQ ID NO:4所示。

本发明还提供一种携带如SEQ ID NO:4所示的基因序列的表达载体。

本发明还提供含有上述表达载体的工程菌株。

优选地，上述表达载体为大肠杆菌表达载体pET-22b或枯草芽孢杆菌表达载体pMA5；工程菌株为大肠杆菌或枯草芽孢杆菌。

进一步地，本发明提供一种所述高耐热D-阿洛酮糖-3-差向异构酶突变体的制备方法，具体包括如下步骤：

1)根据如SEQ ID NO:1所示的氨基酸序列，合成对应的核苷酸编码序列，如SEQ IDNO:2所示；将核苷酸编码序列连接至表达载体的酶切位点之间，获得重组质粒；

2)以重组质粒为模板，设计定点突变的突变引物，进行定点突变PCR扩增反应，之后将反应产物进行环化连接，构建突变表达载体；所述突变引物包括以下4对引物：分别如SEQ ID NO:5和SEQ ID NO:6所示的上游和下游引物、分别如SEQ ID NO:7和SEQ ID NO:8所示的上游和下游引物、分别如SEQ IDNO:9和SEQ ID NO:10所示的上游和下游引物，以及分别如SEQ ID NO:11和SEQ ID NO:12所示的上游和下游引物；

3)将构建成功的突变表达载体导入工程菌株，挑选验证后的阳性单克隆进行诱导表达培养；

4)收集培养后的菌体，重悬于溶液后破碎菌体细胞，离心去除细胞碎片，获得的上清液经镍柱(Ni-NTA)亲和层析纯化后，获得高耐热D-阿洛酮糖-3-差向异构酶突变体。

进一步地，本发明提供一种氨基酸序列如SEQ ID NO:3所示的高耐热D-阿洛酮糖-3-差向异构酶突变体及其编码基因(序列如SEQ ID NO:4所示)在制备D-阿洛酮糖中的应用。

与目前已有的同类酶(及突变体)相比，本发明获得的高耐热D-阿洛酮糖-3-差向异构酶突变体的热稳定性和催化活性都得到了进一步显著提高，本发明获得的突变体在65℃的半衰期(t_1/2)值较之野生酶的4.0h提高至12.0h，在70℃的半衰期(t_1/2)值较之野生酶的1.0h提高至4.5h，本发明获得的突变体的适宜反应温度为70℃，相对酶活为野生型的130％。本发明突变体体现出优异的热稳定性和催化活性，具有重要的工业应用价值。

附图说明：

图1本发明突变体及野生型SfDAE的相对酶活比较。

图2本发明突变体及野生型SfDAE在65℃下的热稳定性比较。

图3本发明突变体及野生型SfDAE在70℃下的热稳定性比较。

具体实施方式：

下面通过具体的实施方案叙述本发明方法。除非特别说明，本发明具体实施方式中所用的技术手段均为本领域技术人员所公知的方法。

本发明具体实施方式中对获得的突变体采用如下定义：

突变体的标识(命名)原则：采用氨基酸序列中“原始氨基酸残基+残基位置+替换的氨基酸残基”来表示由该替换(突变)获得的突变体。例如：采用“M15G”表示氨基酸序列中第15位氨基酸残基由亲本SfDAE的甲硫氨酸(Met)替换为甘氨酸(Gly)获得的突变体；M15G/P40S则表示第15位和第40位(Pro替换为Ser)氨基酸残基均发生突变获得的突变体，由两个以上残基位置突变获得的多点突变体命名方式以此类推。

酶活定义(U)：标准反应条件下，单位时间(min)催化合成1μmol D阿洛酮糖所需的酶量。

DAEase酶活测定方法：以10g/L的D-果糖为底物，加入1μmol/L的纯酶，1mmol/LMgCl₂，在70℃，pH 7.5条件下反应5min后煮沸10min灭活。将反应产物离心过膜，稀释到一定浓度后进行HPLC检测，检测条件：色谱仪：Agilent1260；检测器：蒸发光散射检测器(Alltech Chrom，ELSD6000)；色谱柱：Prevail Carbohydrate ES column-W(5μm,4.6×250mm,Agela Technologies,China)；柱温40℃；流动相：75％乙腈；流速1mL/min。

实施例1：SfDAE酶突变体的制备

(1)重组质粒pET-22b(+)-SfDAE的构建

根据Sinorhizobium fredii CCBAU 83666(登录号：ASY72161.1)的野生型DAEase(SfDAE)氨基酸序列合成其基因序列(SEQ ID NO:2所示)，并连接至大肠杆菌表达载体pET-22b(+)的酶切位点Nde I和BamH I之间，获得重组质粒pET-22b(+)-SfDAE。

(2)突变表达载体的构建

以步骤(1)得到的重组质粒pET-22b(+)-SfDAE为模板，设计点突变的突变引物，之后进行定点突变PCR扩增反应，构建突变表达载体。

所述突变引物包括以下4对引物：M15G-F/R、P40S-F/R、M245T-F/R和A254C-F/R。其中，M15G-F上游引物和M15G-R下游引物分别如SEQ ID NO:5和SEQ ID NO:6所示；P40S-F上游引物和P40S-R下游引物分别如SEQ ID NO:7和SEQ ID NO:8所示；M245T-F上游引物和M245T-R下游引物分别如SEQ ID NO:9和SEQ ID NO:10所示；A254C-F上游引物和A254C-R下游引物分别如SEQ ID NO:11和SEQ ID NO:12所示。

PCR扩增：通过KOD-Plus突变体试剂盒(购自东洋纺(上海)生物科技有限公司)对pET-22b-SfDAE的目的基因进行突变，反应体系的总体积为25μL，反应体系各组分参照表1。

表1PCR扩增反应体系

PCR反应程序为：94℃，2min(预变性)；98℃，10s(变性)；68℃，7min(延伸)；循环7次；4℃，∞(保存)。

反应后取2uL的PCR产物进行琼脂糖凝胶电泳条带验证。向验证正确的PCR产物中加入0.4μL的Dpn I，于37℃进行1h酶切消化反应。酶切反应结束后,对酶切产物基因片段进行环化连接，环化体系总体积为15μL，各组分如表2所示。

表2环化连接反应体系

将上述环化体系轻轻混匀后，置于37℃下反应1h。

反应完成后，将上述反应产物转化至E.coliJM109感受态细胞。然后挑取阳性克隆子进行质粒抽提和DNA测序，测序正确的个体为构建成功的突变表达载体。本发明通过前述步骤共获得5种突变表达载体，包括4种单点突变表达载体：pET-22b(+)-M15G、pET-22b(+)-P40S、pET-22b(+)-M245T、pET-22b(+)-A254C，以及一种多点(四点)突变表达载体pET-22b(+)-M15G/P40S/M245T/A254C。

(3)突变体酶的表达纯化

将重组载体pET-22b(+)-SfDAE、pET-22b(+)-M15G、pET-22b(+)-P40S、pET-22b(+)-M245T、pET-22b(+)-A254C、pET-22b(+)-M15G/P40S/M245T/A254C分别转化至大肠杆菌BL21(DE3)细胞，挑取阳性转化子在LB培养基中37℃、200rpm摇培过夜，获得种子液；将种子液以体积比2％接入LB培养基37℃培养至OD₆₀₀值为0.6～0.8，之后降温至16℃，加入终浓度为1.0mM的IPTG诱导16～18h，获得发酵液。

将6种发酵液分别于4℃、8000rpm离心20min，收集菌体；用溶液A(20mM Tris-HCl,pH 8.0,500mM NaCl,20mM咪唑,2mM DTT)重悬后，加入溶菌酶(终溶度为200μg/mL)、IPTG(终溶度为1mM)后于冰上放置30min，之后继续于冰上超声破碎(破碎2s，间隔5s，功率400W)，最后低温高速离心(4℃，12000r/min)去除细胞碎片得到上清液。

取6种上清液分别进行Ni亲和层析：取6个开放柱(Open-Column)，各加入1mL Ni-NTA树脂(QIAGEN)；用20mL溶液A平衡树脂，之后将上清液与1mL树脂置于4℃下结合40～60min；将混合液过开放柱，结合有蛋白的树脂被截留；之后用20mL溶液A漂洗树脂；最后用15mL溶液B(20mM Tris-HCl,pH 8.0,300mM NaCl,400mM咪唑,2mM DTT)洗脱下蛋白。将洗脱的蛋白利用超滤管置换到1×PBS缓冲液(pH 7.4)中，以除去洗脱液中的咪唑以及其他金属离子，得到的6种蛋白于4℃冰箱保存，备用。6种蛋白包括：野生型SfDAE(亲本)和5种SfDAE的突变体，5种突变体分别为：M15G、P40S、M245T、A254C和M15G/P40S/M245T/A254C，其中突变体M15G/P40S/M245T/A254C的氨基酸序列和基因序列分别如SEQ ID NO:3和SEQ ID NO:4所示。

实施例2：酶活性及热稳定性测定

1.野生型SfDAE及酶突变体的相对酶活测定

在标准反应条件下(1×PBS缓冲液(pH7.4)、1mM MgCl₂、10g/L D-果糖、1μM纯酶，于70℃下反应5min)，突变体的相对酶活是以野生型酶活为100％，参照前述HPLC检测酶反应体系的方法测定纯化后突变体和野生型的相对酶活，结果如图1所示，单点突变体酶M15G、P40S、M245T、A254C和四点突变体M15G/P40S/M245T/A254C的相对酶活分别是野生型的95％、115％、120％、97％和130％(图1所示)，其中突变体M15G/P40S/M245T/A254C极大提高了对果糖的催化活性，极具工业应用价值。

2.野生型SfDAE及酶突变体的热稳定性测定

将纯化得到的SfDAE突变体及野生型在65℃或70℃温度下孵育不同时间(0.5、1、2、4、6、8、10、12、14、16h)，测定SfDAE突变体及野生型在孵育不同时间后的残余酶活，得到65℃和70℃下的半衰期。通过测定发现突变体在65℃和70℃下的半衰期有相比野生型显著提高，结果如图2和3所示。其中单点突变体酶M15G、A254C和四点突变体M15G/P40S/M245T/A254C在65℃的半衰期(t_1/2)由野生酶的4.0h分别增加到7.5h、6.5h和12.0h分别是野生型的1.8、1.6和3.0倍以上，在70℃的半衰期(t_1/2)由野生酶的1.0h分别增加到2.0h、2.5h和4.5h分别是野生型的2.0、2.5和4.5倍以上，表明本发明获得的部分突变体具有很高的工业应用价值。

实施例3：利用野生型SfDAE及四点突变体制备D-阿洛酮糖

向1L三角瓶中加入500mL 50％的D-果糖、1mM MgCl₂，以及10μM的酶液，于70℃水浴锅内反应，在不同时间取样，最后通过煮沸10min终止该反应，通过HPLC检测反应产物中的D-阿洛酮糖浓度。SfDAE突变体和四突变体在不同反应时间下转化D果糖生产D-阿洛酮糖的产率如表3所示，反应1h后，野生型的转化率20.6％，四突变体M15G/P40S/M245T/A254C的转化率为33.3％，是野生型的1.6倍，D-阿洛酮糖产量达到167g/L。

表3野生型SfDAE酶及四点突变体酶催化D-阿洛酮糖的产率

实施例4：重组枯草芽孢杆菌基因工程菌构建及应用

1)基因工程菌株的构建：将重组载体pET-22b(+)-SfDAE、pET-22b(+)-M15G/P40S/M245T/A254C以及质粒pMA5分别用Nde I和BamH I双酶切，回收酶切后的SfDAE、四突变体及质粒pMA5的序列，将SfDAE和四突变体序列分别与质粒pMA5连接后得到新的重组质粒pMA5-SfDAE和pMA5-M15G/P40S/M245T/A254C。利用化学转化法将重组质粒pMA5-SfDAE和pMA5-M15G/P40S/M245T/A254C转入枯草芽孢杆菌WB600，经卡那霉素抗性筛选得到可以表达野生型SfDAE酶的工程菌B.subtilis/pMA5-SfDAE和可以表达四突变体酶的工程菌B.subtilis/pMA5-M15G/P40S/M245T/A254C。

2)利用工程菌株制备D-阿洛酮糖：分别挑取重组菌B.subtilis/pMA5-SfDAE和B.subtilis/pMA5-M15G/P40S/M245T/A254C单菌落接种于5mL含有50μg/mL硫酸卡那霉素的液体LB培养基中，37℃、220r/min振荡培养过夜；之后按2％的接种量将过夜培养物接种于50mL含有50μg/mL硫酸卡那霉素的液体LB培养基中，37℃、220r/min振荡培养24-72h，进行组成表达。取组成表达后的菌体离心、收集沉淀，将菌体用0.8％的生理盐水清洗两次后用1×PBS缓冲液(pH 7.4)重悬菌体，向重悬菌液中添加500g/L果糖作为底物在60℃下进行催化反应，反应2h后，收集转化后的上清液进行HPLC分析。结果如表4所示：菌株B.subtilis/pMA5-SfDAE和B.subtilis/pMA5-M15G/P40S/M245T/A254C的D-阿洛酮糖的产量分别为108g/L和162g/L。相比野生型酶的基因重组菌B.subtilis/pMA5-SfDAE，B.subtilis/pMA5-M15G/P40S/M245T/A254C工程菌的D-阿洛酮糖转化产量提升了1.48倍，说明该工程菌株能够有效转化D-果糖生成D-阿洛酮糖。

表4重组枯草芽孢杆菌基因工程菌的D-阿洛酮糖产率

序列表

<120> 一种高耐热D-阿洛酮糖-3-差向异构酶突变体及其应用

<160> 12

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 284

<212> PRT

<213> 弗氏中华根瘤菌(Sinorhizobium fredii)

<400> 1

Met Thr Met Gln Gly Phe Gly Val His Thr Ser Met Trp Thr Met Asn

1 5 10 15

Trp Asp Arg Pro Gly Ala Glu Arg Ala Val Ala Ala Ala Leu Lys Tyr

20 25 30

Glu Val Asp Phe Ile Glu Ile Pro Met Leu Asn Pro Pro Ala Val Asp

35 40 45

Thr Glu His Thr Arg Ala Leu Leu Glu Lys Asn Glu Leu Arg Ala Leu

50 55 60

Cys Ser Leu Gly Leu Pro Glu Arg Ala Trp Ala Ser Val Arg Pro Asp

65 70 75 80

Ala Ala Ile Glu His Leu Lys Val Ala Ile Asp Lys Thr Ala Asp Leu

85 90 95

Gly Gly Glu Ala Leu Ser Gly Val Ile Tyr Gly Gly Ile Gly Glu Arg

100 105 110

Thr Gly Val Pro Pro Thr Glu Ala Glu Tyr Asp Asn Ile Ala Arg Val

115 120 125

Leu Ser Ala Ala Ala Lys His Ala Lys Ser Arg Gly Ile Glu Leu Gly

130 135 140

Val Glu Ala Val Asn Arg Tyr Glu Asn His Leu Ile Asn Thr Gly Trp

145 150 155 160

Gln Ala Val Gln Met Ile Glu Arg Val Gly Ala Asp Asn Ile Phe Val

165 170 175

His Leu Asp Thr Tyr His Met Asn Ile Glu Glu Lys Gly Val Gly Asn

180 185 190

Gly Ile Leu Asp Ala Arg Glu His Leu Lys Tyr Ile His Leu Ser Glu

195 200 205

Ser Asp Arg Gly Thr Pro Gly Tyr Gly Thr Cys Gly Trp Asp Glu Ile

210 215 220

Phe Ser Thr Leu Ala Ala Ile Gly Phe Lys Gly Gly Leu Ala Met Glu

225 230 235 240

Ser Phe Ile Asn Met Pro Pro Glu Val Ala Tyr Gly Leu Ala Val Trp

245 250 255

Arg Pro Val Ala Lys Asp Glu Glu Glu Val Met Gly Asn Gly Leu Pro

260 265 270

Phe Leu Arg Asn Lys Ala Lys Gln Tyr Gly Leu Ile

275 280

<210> 2

<211> 852

<212> DNA

<213> 费氏中华根瘤菌(Sinorhizobium fredii)

<400> 2

atgaccatgc aaggcttcgg cgtgcacacc agcatgtgga ccatgaactg ggatcgtccg 60

ggcgccgaac gtgcggttgc cgccgccctc aagtacgagg tggacttcat cgagatccca 120

atgctgaacc cgccggccgt tgataccgaa catacccgcg cgctgctgga gaaaaatgaa 180

ctgcgtgcgc tgtgtagtct gggtctgccg gaacgtgcgt gggcgagtgt tcgtccagat 240

gcggcgatcg agcatctgaa ggtggcgatc gacaaaaccg ccgatctggg cggtgaagcg 300

ctgagtggcg tgatttacgg tggtatcggc gaacgtaccg gtgtgccgcc aacggaagcg 360

gaatacgaca atatcgcccg tgtgctgagt gccgccgcga aacacgccaa gagccgtggc 420

atcgaactgg gcgttgaagc cgtgaaccgc tacgagaacc acctcatcaa caccggctgg 480

caagccgttc agatgattga acgcgttggc gccgacaaca tcttcgttca tctggatacc 540

taccacatga acatcgagga gaagggcgtg ggcaatggca ttctggacgc gcgcgagcat 600

ctgaaataca tccatctgag cgagagtgac cgcggtacgc cgggttacgg cacgtgcggc 660

tgggatgaaa tcttcagtac gctggccgcc atcggtttca aaggtggcct cgcgatggag 720

agtttcatca acatgccgcc agaagtggcg tatggtctgg ccgtttggcg tccagtggcc 780

aaggacgaag aagaagttat gggcaacggt ctgccgtttc tgcgcaacaa ggccaaacag 840

tacggtctga tc 852

<210> 3

<211> 284

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 3

Met Thr Met Gln Gly Phe Gly Val His Thr Ser Met Trp Thr Gly Asn

1 5 10 15

Trp Asp Arg Pro Gly Ala Glu Arg Ala Val Ala Ala Ala Leu Lys Tyr

20 25 30

Glu Val Asp Phe Ile Glu Ile Ser Met Leu Asn Pro Pro Ala Val Asp

35 40 45

Thr Glu His Thr Arg Ala Leu Leu Glu Lys Asn Glu Leu Arg Ala Leu

50 55 60

Cys Ser Leu Gly Leu Pro Glu Arg Ala Trp Ala Ser Val Arg Pro Asp

65 70 75 80

Ala Ala Ile Glu His Leu Lys Val Ala Ile Asp Lys Thr Ala Asp Leu

85 90 95

Gly Gly Glu Ala Leu Ser Gly Val Ile Tyr Gly Gly Ile Gly Glu Arg

100 105 110

Thr Gly Val Pro Pro Thr Glu Ala Glu Tyr Asp Asn Ile Ala Arg Val

115 120 125

Leu Ser Ala Ala Ala Lys His Ala Lys Ser Arg Gly Ile Glu Leu Gly

130 135 140

Val Glu Ala Val Asn Arg Tyr Glu Asn His Leu Ile Asn Thr Gly Trp

145 150 155 160

Gln Ala Val Gln Met Ile Glu Arg Val Gly Ala Asp Asn Ile Phe Val

165 170 175

His Leu Asp Thr Tyr His Met Asn Ile Glu Glu Lys Gly Val Gly Asn

180 185 190

Gly Ile Leu Asp Ala Arg Glu His Leu Lys Tyr Ile His Leu Ser Glu

195 200 205

Ser Asp Arg Gly Thr Pro Gly Tyr Gly Thr Cys Gly Trp Asp Glu Ile

210 215 220

Phe Ser Thr Leu Ala Ala Ile Gly Phe Lys Gly Gly Leu Ala Met Glu

225 230 235 240

Ser Phe Ile Asn Thr Pro Pro Glu Val Ala Tyr Gly Leu Cys Val Trp

245 250 255

Arg Pro Val Ala Lys Asp Glu Glu Glu Val Met Gly Asn Gly Leu Pro

260 265 270

Phe Leu Arg Asn Lys Ala Lys Gln Tyr Gly Leu Ile

275 280

<210> 4

<211> 852

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 4

atgaccatgc aaggcttcgg cgtgcacacc agcatgtgga ccgggaactg ggatcgtccg 60

ggcgccgaac gtgcggttgc cgccgccctc aagtacgagg tggacttcat cgagatctca 120

atgctgaacc cgccggccgt tgataccgaa catacccgcg cgctgctgga gaaaaatgaa 180

ctgcgtgcgc tgtgtagtct gggtctgccg gaacgtgcgt gggcgagtgt tcgtccagat 240

gcggcgatcg agcatctgaa ggtggcgatc gacaaaaccg ccgatctggg cggtgaagcg 300

ctgagtggcg tgatttacgg tggtatcggc gaacgtaccg gtgtgccgcc aacggaagcg 360

gaatacgaca atatcgcccg tgtgctgagt gccgccgcga aacacgccaa gagccgtggc 420

atcgaactgg gcgttgaagc cgtgaaccgc tacgagaacc acctcatcaa caccggctgg 480

caagccgttc agatgattga acgcgttggc gccgacaaca tcttcgttca tctggatacc 540

taccacatga acatcgagga gaagggcgtg ggcaatggca ttctggacgc gcgcgagcat 600

ctgaaataca tccatctgag cgagagtgac cgcggtacgc cgggttacgg cacgtgcggc 660

tgggatgaaa tcttcagtac gctggccgcc atcggtttca aaggtggcct cgcgatggag 720

agtttcatca acacgccgcc agaagtggcg tatggtctgt gcgtttggcg tccagtggcc 780

aaggacgaag aagaagttat gggcaacggt ctgccgtttc tgcgcaacaa ggccaaacag 840

tacggtctga tc 852

<210> 5

<211> 19

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 5

accgggaact gggatcgtc 19

<210> 6

<211> 19

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 6

ccacatgctg gtgtgcacg 19

<210> 7

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 7

atctcaatgc tgaacccgcc 20

<210> 8

<211> 25

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 8

ctcgatgaag tccacctcgt acttg 25

<210> 9

<211> 19

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 9

aacacgccgc cagaagtgg 19

<210> 10

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 10

gatgaaactc tccatcgcga gg 22

<210> 11

<211> 19

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 11

ctgtgcgttt ggcgtccag 19

<210> 12

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 12

accatacgcc acttctggcg 20

Claims

1.一种高耐热D-阿洛酮糖-3-差向异构酶突变体，其氨基酸序列如SEQ ID NO:3所示，是由如SEQ ID NO:1所示的氨基酸序列上第15位的氨基酸残基由甲硫氨酸变为甘氨酸、第40位的氨基酸残基由脯氨酸变为丝氨酸、第245位的氨基酸残基由甲硫氨酸变为苏氨酸，以及第254位的氨基酸残基由丙氨酸变为半胱氨酸制得。

2.一种编码权利要求1所述的高耐热D-阿洛酮糖-3-差向异构酶突变体的基因，该基因序列如SEQ ID NO:4所示。

3.一种表达载体，其特征在于，所述表达载体携带如权利要求2所述的基因。

4.根据权利要求3所述的表达载体，其特征在于，所述表达载体为大肠杆菌表达载体pET-22b或枯草芽孢杆菌表达载体pMA5。

5.含有权利要求3所述的表达载体的宿主细胞。

6.含有权利要求4所述的表达载体的宿主细胞。

7.根据权利要求6所述的宿主细胞，其特征在于，所述宿主细胞为大肠杆菌或枯草芽孢杆菌。

8.一种权利要求1所述的高耐热D-阿洛酮糖-3-差向异构酶突变体的制备方法，其特征在于包括如下步骤：

1)根据如SEQ ID NO:1所示的氨基酸序列，合成对应的核苷酸编码序列，如SEQ ID NO:2所示；将核苷酸编码序列连接至表达载体的酶切位点之间，获得重组质粒；

2)以重组质粒为模板，设计定点突变的突变引物，进行定点突变PCR扩增反应，之后将反应产物进行环化连接，构建突变表达载体；所述突变引物包括以下4对引物：分别如SEQID NO:5和SEQ ID NO:6所示的上游和下游引物、分别如SEQ ID NO:7和SEQ ID NO:8所示的上游和下游引物、分别如SEQ ID NO:9和SEQ ID NO:10所示的上游和下游引物，以及分别如SEQ ID NO:11和SEQ ID NO:12所示的上游和下游引物；

4)收集培养后的菌体，重悬于溶液后破碎菌体细胞，离心去除细胞碎片，获得的上清液经镍柱Ni-NTA亲和层析纯化后，获得高耐热D-阿洛酮糖-3-差向异构酶突变体。

9.如权利要求1所述的高耐热D-阿洛酮糖-3-差向异构酶突变体在制备D-阿洛酮糖中的应用。

10.如权利要求2所述的基因在制备D-阿洛酮糖中的应用。