CN108103037B - 一种3-甾酮-δ1-脱氢酶突变体及其构建方法 - Google Patents

一种3-甾酮-δ1-脱氢酶突变体及其构建方法 Download PDF

Info

Publication number
CN108103037B
CN108103037B CN201810190182.1A CN201810190182A CN108103037B CN 108103037 B CN108103037 B CN 108103037B CN 201810190182 A CN201810190182 A CN 201810190182A CN 108103037 B CN108103037 B CN 108103037B
Authority
CN
China
Prior art keywords
delta
sterone
dehydrogenase
ala
gly
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Expired - Fee Related
Application number
CN201810190182.1A
Other languages
English (en)
Other versions
CN108103037A (zh
Inventor
魏磊
朱秋艳
魏文天
葛永斌
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Individual
Original Assignee
Individual
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Individual filed Critical Individual
Priority to CN201810190182.1A priority Critical patent/CN108103037B/zh
Publication of CN108103037A publication Critical patent/CN108103037A/zh
Application granted granted Critical
Publication of CN108103037B publication Critical patent/CN108103037B/zh
Expired - Fee Related legal-status Critical Current
Anticipated expiration legal-status Critical

Links

Images

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
    • C12N9/0004—Oxidoreductases (1.)
    • C12N9/001—Oxidoreductases (1.) acting on the CH-CH group of donors (1.3)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C12N15/66—General methods for inserting a gene into a vector to form a recombinant vector using cleavage and ligation; Use of non-functional linkers or adaptors, e.g. linkers containing the sequence for a restriction endonuclease
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C12N15/70—Vectors or expression systems specially adapted for E. coli
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
    • C12P33/00—Preparation of steroids
    • C12P33/02—Dehydrogenating; Dehydroxylating
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Y—ENZYMES
    • C12Y103/00—Oxidoreductases acting on the CH-CH group of donors (1.3)
    • C12Y103/99—Oxidoreductases acting on the CH-CH group of donors (1.3) with other acceptors (1.3.99)
    • C12Y103/99004—3-Oxosteroid 1-dehydrogenase (1.3.99.4)

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Plant Pathology (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
  • Enzymes And Modification Thereof (AREA)

Abstract

本发明提供了一种3‑甾酮‑Δ1‑脱氢酶突变体，属于基因工程和酶工程技术领域；所述3‑甾酮‑Δ1‑脱氢酶突变体的氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示。所述3‑甾酮‑Δ1‑脱氢酶突变体的构建方法，包括以下步骤：1)将3‑甾酮‑Δ1‑脱氢酶基因与表达载体连接获得野生型重组载体；2)以获得的野生型重组载体为模板，通过反向PCR定点突变获得3‑甾酮‑Δ1‑脱氢酶突变体重组载体；3)将获得的3‑甾酮‑Δ1‑脱氢酶突变体重组载体转化到表达菌株获得重组菌株，培养所述重组菌株获得3‑甾酮‑Δ1‑脱氢酶突变体。所述3‑甾酮‑Δ1‑脱氢酶突变体比酶活为85217.08U/mg，较野生型提高了227.35％。

Description

一种3-甾酮-Δ1-脱氢酶突变体及其构建方法
技术领域
本发明属于基因工程和酶工程技术领域，尤其涉及一种3-甾酮-Δ1-脱氢酶突变体及其构建方法。
背景技术
甾体激素类药物是临床上不可缺少的一类药物，对机体起着非常重要的调节作用，全世界对甾体激素类药物的需求量仅次于抗生素，主要包括肾上腺皮质激素和性激素两大类。根据其具体药理性质，可作为麻醉药、抗心率失常、抗细菌和真菌药、抗胆碱酯酶药、抗凝血剂、抗肿瘤药、胆汁分泌剂、神经调节阻断剂、胆石分散剂、脂调节剂、神经病治疗药、泻药等。目前主要以化学合成法来合成甾体激素类药物，但由于步骤繁多、得率低、污染环境、分离纯化困难，故利用微生物转化法合成甾体药物成为一个非常有前景的方向。微生物转化指利用微生物的酶对甾体底物的某一部位进行特定化学反应从而获得目标产物，如C1，2脱氢、11α-羟化、11β-羟化、C1，4脱氢、A环芳构化、C17位的不对称还原以及甾醇侧链的选择性降解等。随着现代生物技术的发展，微生物对甾体药物的特定，高效，低耗的转化特性受各大制药厂青睐，并已成为研究重点，未来必将广泛应用。
戈登氏菌(Gordonia neofelifaecis)来源的3-甾酮-Δ1-脱氢酶(KstD)，催化甾体A环C1,2脱氢，并形成双键。KstD含有1563bp长度的DNA序列，并编码520个氨基酸，但目前野生型的3-甾酮-Δ1-脱氢酶的催化活性较低。
发明内容
有鉴于此，本发明的目的在于提供一种催化活性高的3-甾酮-Δ1-脱氢酶突变体及其构建方法。
为了实现上述发明目的，本发明提供以下技术方案：一种3-甾酮-Δ1-脱氢酶突变体，具有如SEQ ID NO.2所示的氨基酸序列。
本发明还提供了编码所述的3-甾酮-Δ1-脱氢酶突变体的基因，具有如SEQ IDNO.4所示的核苷酸序列。
本发明还提供了携带所述基因的重组载体。
本发明还提供了携带所述基因或上述技术方案所述重组载体的重组菌株。
本发明还提供了所述3-甾酮-Δ1-脱氢酶突变体的构建方法，包括以下步骤：1)将3-甾酮-Δ1-脱氢酶基因与表达载体连接获得野生型重组载体，所述3-甾酮-Δ1-脱氢酶基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示；2)以步骤1)获得的野生型重组载体为模板，通过反向PCR定点突变获得上述技术方案所述3-甾酮-Δ1-脱氢酶突变体重组载体；所述反向PCR定点突变用引物为F307A_F和F307A_R；所述F307A_F的序列如SEQ ID NO.6所示；所述F307A_R的序列如SEQ ID NO.7所示；3)将步骤2)获得的3-甾酮-Δ1-脱氢酶突变体重组载体转化到表达菌株获得上述技术方案所述重组菌株，培养所述重组菌株获得3-甾酮-Δ1-脱氢酶突变体。
优选的，所述反向PCR定点突变的体系包括：0.1ng/μL的野生型重组载体1μL；10pmol/μL的F307A_F 1μL；10pmol/μL的F307A_R 1μL；2×PrimeSTARMaxPremix 12.5μL；ddH2O 9.5μL。
优选的，所述反向PCR定点突变的程序为：98℃预变性30sec；98℃变性10sec；55℃退火20sec；72℃延伸6min；30个循环后72℃再延伸10min，4℃保存。
优选的，步骤1)所述表达载体为pCold质粒。
优选的，步骤3)所述表达菌株为大肠杆菌BL21(DE3)。
优选的，步骤3)所述培养后还包括以下步骤：
A)将所述培养得到的重组菌株破碎，固液分离，收集上清液；
B)将所述上清液经Ni亲和层析分离纯化获得3-甾酮-Δ1-脱氢酶突变体。
本发明还提供了所述3-甾酮-Δ1-脱氢酶突变体在微生物合成甾体药物中的应用。
本发明的有益效果：本发明提供的3-甾酮-Δ1-脱氢酶突变体的氨基酸序列如SEQID NO.2所示，所述3-甾酮-Δ1-脱氢酶突变体是通过定点突变改造野生型3-甾酮-Δ1-脱氢酶基因，将酶活性催化中心氨基酸突变，使第307位苯丙氨酸突变为丙氨酸，突变后的产物对甾体A环C1,2脱氢反应的活性提高；本发明提供的3-甾酮-Δ1-脱氢酶突变体比酶活为85217.08U/mg，较野生型提高了227.35％。
本发明提供的3-甾酮-Δ1-脱氢酶突变体对雄烯二酮的催化活性高，应用到微生物合成甾体药物中，能够促进甾体药物的生产。
附图说明
图1为3-甾酮-Δ1-脱氢酶突变体基因的琼脂糖凝胶电泳检测图；
图2为分离纯化后的3-甾酮-Δ1-脱氢酶突变体的SDS-PAGE图；
图3为3-甾酮-Δ1-脱氢酶基础酶学性质测定图，其中图3A为温度对3-甾酮-Δ1-脱氢酶酶活影响曲线图；图3B为pH对3-甾酮-Δ1-脱氢酶酶活性影响的曲线图；
图4为3-甾酮-Δ1-脱氢酶KstD和3-甾酮-Δ1-脱氢酶突变体F307A的酶动力学曲线图。
具体实施方式
本发明提供了一种3-甾酮-Δ1-脱氢酶突变体，所述3-甾酮-Δ1-脱氢酶突变体的氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示。本发明中，所述3-甾酮-Δ1-脱氢酶突变体是通过定点突变改造野生型3-甾酮-Δ1-脱氢酶基因，将酶活性催化中心氨基酸突变，使第307位苯丙氨酸突变为丙氨酸。
本发明还提供了所述3-甾酮-Δ1-脱氢酶突变体的基因，所述3-甾酮-Δ1-脱氢酶突变体基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.4所示。本发明中所述野生型3-甾酮-Δ1-脱氢酶基因是戈登氏菌(Gordonia neofelifaecis)来源的3-甾酮-Δ1-脱氢酶基因(KstD)；所述野生型的3-甾酮-Δ1-脱氢酶基因(KstD)的核苷酸序列如SEQ ID NO.5所示。
在本发明中优选的将所述野生型的KstD的核苷酸序列进行优化；所述优化是为适用大肠杆菌BL21(DE3)菌株的表达宿主为基准的密码子优化；所述优化方法采用本领域常规的密码子优化方法即可，无其他特殊要求。在本发明中，所述优化后得到3-甾酮-Δ1-脱氢酶基因如SEQ ID NO.3所示。根据本发明的预设目标，即将所述3-甾酮-Δ1-脱氢酶第307位苯丙氨酸突变为丙氨酸，设计定点突变引物，进行反向PCR定点突变获得核苷酸序列如SEQ ID NO.4所示的3-甾酮-Δ1-脱氢酶突变体的基因。
本发明还提供了携带所述3-甾酮-Δ1-脱氢酶突变体基因的重组载体。在本发明中将所述3-甾酮-Δ1-脱氢酶突变体基因与原始载体连接获得重组载体。在本发明中所述原始载体为本领域常规的表达载体，优选的为大肠杆菌表达载体，更优选的为pCold质粒。
本发明还提供了携带所述3-甾酮-Δ1-脱氢酶突变体基因或所述重组载体的重组菌株。在本发明中将所述3-甾酮-Δ1-脱氢酶突变体基因或所述重组载体与原始菌株重组获得重组菌株；在本发明中所述重组菌株优选的为大肠杆菌，更优选的为大肠杆菌BL21(DE3)。
本发明还提供了所述3-甾酮-Δ1-脱氢酶突变体的构建方法，包括以下步骤：1)将3-甾酮-Δ1-脱氢酶基因与表达载体连接获得野生型重组载体；2)以步骤1)获得的野生型重组载体为模板，通过反向PCR定点突变获得3-甾酮-Δ1-脱氢酶突变体重组载体；3)将步骤2)获得的3-甾酮-Δ1-脱氢酶突变体重组载体转化到表达菌株获得重组菌株，培养所述重组菌株获得3-甾酮-Δ1-脱氢酶突变体；所述3-甾酮-Δ1-脱氢酶基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示；所述反向PCR定点突变的引物为F307A_F和F307A_R；所述F307A_F的序列如SEQ ID NO.6所示；所述F307A_R的序列如SEQ ID NO.7所示。
在本发明中，将3-甾酮-Δ1-脱氢酶基因与表达载体连接获得野生型重组载体。在本发明中所述3-甾酮-Δ1-脱氢酶基因的序列优选的为戈登氏菌(Gordonianeofelifaecis)来源的3-甾酮-Δ1-脱氢酶基因(KstD)；所述KstD基因的核苷酸序列如SEQID NO.5所示；更优选为密码子优化后的3-甾酮-Δ1-脱氢酶基因，如SEQ ID NO.3所示；所述如SEQ ID NO.3所示的核苷酸序列为以大肠杆菌BL21(DE3)菌株表达宿主为基准的密码子优化后的序列。在本发明中，所述密码子优化方法采用本领域常规的密码子优化方法即可，无其他特殊要求。在本发明中，所述表达载体优选的为大肠杆菌表达载体；更优选的为pCold质粒；所述pCold质粒的来源为市售商品。
在本发明中，将核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示的基因与pCold质粒连接获得重组载体pCold I-KstD。在本发明中，所述连接具体为将目的基因和原始质粒pCold I用限制性内切酶切割后用连接酶连接。在本发明中所述限制性内切酶优选的为Bam HI和Nde I，所述连接酶优选为Solution I(TAKARA,Lot#A7901-1)。在本发明中所述连接的具体体系如表1所示。在本发明中所述连接的温度优选的为14～20℃，更优选的为16℃；所述连接的时间优选的为6～12h；更优选的为10h。
表1 3-甾酮-Δ1-脱氢酶基因与表达载体连接体系
本发明在获得野生型重组载体后，以获得的野生型重组载体为模板，通过反向PCR定点突变获得3-甾酮-Δ1-脱氢酶突变体重组载体。在本发明中所述反向定点PCR的引物优选的为为F307A_F和F307A_R；所述F307A_F的序列如SEQ ID NO.6所示；所述F307A_R的序列如SEQ ID NO.7所示。
在本发明中所述反向PCR定点突变的体系优选的包括：0.1ng/μL的野生型重组载体1μL；10pmol/μL的F307A_F 1μL；10pmol/μL的F307A_R 1μL；2×PrimeSTARMax Premix12.5μL；ddH2O 9.5μL。在本发明中，所述反向PCR定点突变的程序优选的为：98℃预变性30sec；98℃变性10sec；55℃退火20sec；72℃延伸6min；30个循环后72℃再延伸10min，4℃保存。
本发明中，所述反向PCR定点突变后获得的突变体名称为F307A，经过测序鉴定所述突变位点已成功按照预设目标得到突变，突变后的KstD基因的核苷酸序列如SEQ IDNO.4所示。
本发明在获得3-甾酮-Δ1-脱氢酶突变体重组载体后，将获得的3-甾酮-Δ1-脱氢酶突变体重组载体转化到表达菌株获得重组菌株，培养所述重组菌株获得3-甾酮-Δ1-脱氢酶突变体。在本发明中，所述表达菌株优选的为大肠杆菌，更优选的为大肠杆菌BL21(DE3)。
在本发明中所述的转化优选的采用化学转化法，具体为将所述3-甾酮-Δ1-脱氢酶突变体重组载体冰浴下与感受态细胞E.coli BL21(DE3)混匀冰浴放置，然后置于42℃水浴锅中热激，最后再冰浴冷敷获得转化后的重组菌株。在本发明中所述冰浴放置的时间优选的10～20min，更优选的为15min；所述热激的时间优选的为85～95s；更优选的为90s；所述冰浴冷敷的时间优选的为4～6min，更优选的为5min。
本发明在获得重组菌株后，对获得的重组菌株进行诱导发酵培养获得大量重组菌株。在本发明中，所述诱导发酵培养前优选的将上述冰浴冷敷后的重组菌株接种于LB种子培养基进行种子培养；所述LB种子培养基中含有50～80μg/mL氨苄青霉素；所述种子培养的温度优选的为35～38℃，更优选的为37℃；所述种子培养的转速优选的为200～250rpm，更优选的为220rpm；所述种子培养的时间优选的为10～14h，更优选的为12h。
本发明在所述种子培养结束后获得种子培养液，以1-2％的接种量将所述种子培养液接于LB发酵培养基中进行诱导发酵培养获得大量重组菌株。在本发明中所述发酵培养基中含有50～80μg/mL氨苄青霉素；本发明中当所述发酵培养液的OD600在0.6～1.0时，加入IPTG(异丙基硫代半乳糖苷)诱导培养。在本发明中所述IPTG终溶度优选的为0.15～0.25mM，更优选的为0.2mM，在本发明中所述IPTG诱导培养的温度优选的为23～27℃，更优选的为25℃；所述IPTG诱导培养的转速优选为150～170rpm，更优选的为160rpm；所述IPTG诱导培养的时间优选为14～16h，更优选的为15h。本发明在所述IPTG诱导培养结束后获得大量表达3-甾酮-Δ1-脱氢酶突变体的重组菌株。
本发明在所述IPTG诱导培养后，优选的还包括收集重组菌株。在本发明中所述收集重组菌株的方法优选的为离心。在本发明中所述离心的温度优选的为4℃；所述离心的转速优选的为6000～8000rpm，更优选的为7000rpm；所述离心的时间优选的为10～20min，更优选的为15min。
本发明在收集获得重组菌株后，优选的还包括以下步骤：A)将所述重组菌株破碎，固液分离，收集上清液；B)将所述上清液经Ni亲和层析分离纯化获得3-甾酮-Δ1-脱氢酶突变体。
在本发明中所述重组菌株破碎的方法优选的为超声波破碎法；在本发明具体实施过程中，优选的将所述收集到的重组菌株用缓冲溶液重悬后，进行超声波破碎。在本发明中所述缓冲溶液优选的为BufferA；所述BufferA优选的包括以下组分：50mM Tris-HCl,pH7.5，300mM NaCl，10mM咪唑，2mM DTT。本发明对重悬时缓冲溶液的用量没有特殊限定，只要能够实现所述重组菌株重悬即可。在本发明中所述超声波破碎的程序优选的为间歇式程序：超声破破碎1～3s，间歇3～8s。所述超声波破碎的功率优选的为350～600W；所述超声波破碎的时间优选的为15～25min，更优选的为20min。在本发明中所述固液分离的方法优选的为离心；所述离心的转速优选的为17000～19000rpm；更优选的为18000rpm。本发明在所述离心后收集上清液；所述上清液中含有3-甾酮-Δ1-脱氢酶突变体。
本发明在获得上清液后，将所述上清液经Ni亲和层析分离纯化获得3-甾酮-Δ1-脱氢酶突变体。在本发明中所述Ni亲和层析分离纯化采用本领域常规的方法即可，在本发明具体实施过程中，首先用BufferA平衡Ni-NTA superflow树脂，将所述上清液与平衡后树脂混匀置于冰水孵育，然后将所述孵育后的样品流经纯化柱，用BufferA洗去杂质蛋白后，用BufferB溶出目的蛋白。在本发明中所述孵育的时间优选的为0.8～1.2h，更优选的为1h。所述Buffer B优选的包括以下组分：50mM Tris-HCl,pH 7.5，300mM NaCl，300mM咪唑和2mM DTT。
下面结合实施例对本发明提供的一种3-甾酮-Δ1-脱氢酶突变体及其构建方法和应用进行详细的说明，但是不能把它们理解为对本发明保护范围的限定。
实施例1
3-甾酮-Δ1-脱氢酶野生型及突变体的制备
以来源戈登氏菌的3-甾酮-Δ1-脱氢酶基因为野生型，GenBank号为WP_009680993.1，通过适用于大肠杆菌BL21(DE3)菌株的表达宿主为基准优化得到3-甾酮-Δ1-脱氢酶基因，如SEQ ID NO.3所示。
获得突变体F307A：以SEQ ID NO.3所示的野生型3-甾酮-Δ1-脱氢酶基因为模板，以F307A_F(核苷酸序列如SEQ ID NO.6所示，具体为CTGCTTTCGCTCTGTGGGCCACCGGTGGTATCTTCG)；F307A_R(核苷酸序列如SEQ ID NO.7所示，具体为CGAAGATACCACCGGTGGCCCACAGAGCGAAAGCAG)为引物，进行反向PCR获得SEQ ID NO.4所示突变体核苷酸序列。
(1)PCR反应体系如下：模板(0.1ng/μL)1μL，F307A_F(10pmol/μL)1μL，F307A_R(10pmol/μL)1μL，PrimeSTARMax Premix(2×)，12.5μL，ddH2O9.5μL。
PCR反应程序：98℃预变性30sec；98℃变性10sec；55℃退火20sec；72℃延伸6min；30个循环后72℃再延伸10min，最后4℃下保存。通过0.8％的琼脂糖凝胶电泳检测目标条带，如图1所示。
(2)模板消化
在PCR反应体系中(25μL)加入1μL Dpn I，混匀后，37℃水浴下反应1-2h。
(3)取(2)中15μL PCR产物，通过化学转化法转入E.coli JM109中扩增，37℃下培养12h后，挑取转化子，提取质粒测序验证，所用提质粒试剂盒为TIANprep MiniPlasmidKit(TIANGEN,Lot#P4414)。经测序，突变位点已按照预设目标得到突变。-80℃保存质粒及相关菌株。
野生型重组载体pCold I-KstD含有SEQ ID NO.3所示的核苷酸序列，SEQ ID NO.3所示的核苷酸序列编码SEQ ID NO.1所示的氨基酸序列。
突变体重组载体pCold I-F307A含有SEQ ID NO.4所示的核苷酸序列，SEQ IDNO.4所示的核苷酸序列编码SEQ ID NO.2所示的突变体。
实施例2
3-甾酮-Δ1-脱氢酶及其突变体F307A的表达及纯化
蛋白异源表达：将重组载体pCold I-KstD和pCold I-F307A分别转入大肠杆菌BL21(DE3)中，获得BL21/KstD和BL21/F307A重组菌株。
将上述2种重组菌分别接于10mLLB种子培养基(含有50μg/mL卡那霉素)，37℃下220r/min培养12h。以2％的接种量接于1.0L LB发酵培养基(含有50μg/mL卡那霉素)，待菌浓度OD600＝0.8，加入IPTG，终溶度为0.2mM，在25℃，160r/min下诱导15h。
分离纯化：在7000r/min下离心10min收集诱导后的菌体，用BufferA(50mM Tris-HCl,pH 7.5,300mMNaCl,10mM咪唑,2mM DTT)重悬菌体，并加入200mg溶菌酶、PMSF(终溶度为1mM)冰上放置30min，冰上超声破碎20分钟(2s开,3s关,400W功率)，低温高速离心15分钟(4℃,18000r/min)去除沉淀得到上清。
用BufferA平衡Ni-NTAsuperflow树脂，并将上述上清与平衡后树脂混匀，置于冰水孵育结合1h。使混合的样品流经纯化柱，用洗杂缓冲液Buffer A洗去杂质蛋白。再用洗脱缓冲液BufferB(50mM Tris-HCl,pH 7.5,300mM NaCl,300mM咪唑,2mM DTT)溶出目的蛋白。最后通过12％非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)，鉴定蛋白大小与纯度，结果如图2所示，得到蛋白分子量约55.49kDa，与预测大小一致。
实施例3
3-甾酮-Δ1-脱氢酶酶活的测定
1.3-甾酮-Δ1-脱氢酶酶活测定方法
通过硫酸甲酯吩嗪(PMS)反应法测定3-甾酮-Δ1-脱氢酶酶活。3-甾酮-Δ1-脱氢酶能通过一系列人工电子受体，如与PMS(吩嗪二甲酯硫酸盐)，DCPIP(2，6-二氯酚靛酚)等发生反应，而借助这些中间产物的颜色变化，通过分光光度计检测即可加以定量反映，其反应式为：①FADH2+PMS→FAD+PMSH2；②PMSH2+DCPIP→PMS+DCPIPH2。DCPIP呈蓝色，标准的吸收光谱在600nm处，这种色泽可因其还原而渐次变淡，从而600nm处的光密度的变化与DCPIP含量成正比，测定2,6-DCPIP的还原速度可以推算出脱氢酶的活力。故可测定此反应系统在600nm处的吸收光度变化，来计算脱氢酶的活性。设定1mL酶活测定的反应体系，各物质溶度如表2所示。
表2酶活测定的反应体系中各物质溶度
Figure BDA0001591459500000091
将上述除酶以外的混合液加入48孔板中，置于30℃下恒温孵育5min，后迅速加入适量酶液，并在30℃条件下测定2min内600nm下的吸光度变化。
对照：加入等体积酶所处的缓冲液。
酶活性定义：1U定义为每分钟内1μmol DCPIP被还原，单位为μmol·min-1。
2、测定3-甾酮-Δ1-脱氢酶野生型和突变体比酶活
测得的酶活除以反应体系中酶浓度即为比酶活，野生型与突变体比酶活见表3。突变体(F307A)比酶活较野生型提高了227.35％。
表3野生型与突变体比酶活
Figure BDA0001591459500000102
实施例4
3-甾酮-Δ1-脱氢酶基础酶学性质测定
1.3-甾酮-Δ1-脱氢酶最适反应温度测定
在不同温度(20-60℃)下测定3-甾酮-Δ1-脱氢酶的酶活，定义最高酶活的温度为100％，计算在其他温度下残留比酶活。其余操作与上述酶活测定方法一致。绘制得到如图3A所示的温度对酶活性影响的曲线图，可以看出3-甾酮-Δ1-脱氢酶在30℃下，酶催化活性最高。
2.3-甾酮-Δ1-脱氢酶最适反应pH测定
在1mL酶活测定反应体系中，不同pH的缓冲液分别为50mM的磷酸盐缓冲液(pH6.0-8.0)、HEPES(pH 7.0-8.0)、Tris(pH 7.0-9.0)、MES(pH 5.5-6.5)、甘氨酸(pH 8.5-9.0)。其余操作与上述酶活测定方法一致。绘制得到如图3B所示的pH对酶活性影响的曲线图，可以看出3-甾酮-Δ1-脱氢酶在Tris缓冲液pH＝7.5时，酶活力最高。
实施例5
3-甾酮-Δ1-脱氢酶及其突变体的酶动力学参数测定
以不同浓度的雄烯二酮(0-500μM)作为底物，测定3-甾酮-Δ1-脱氢酶KstD及其突变体F307A的初始反应速度。借助GraphPadPrism软件非线性拟合计算酶的Km及Vmax，进而计算酶的催化常数kcat(最大反应速度与酶溶度的比值)。3-甾酮-Δ1-脱氢酶KstD及其突变体F307A的动力学参数如表4所示，其动力学曲线图如图4所示。
表4 3-甾酮-Δ1-脱氢酶KstD及其突变体F307A的动力学参数
Figure BDA0001591459500000111
由上述实施例可知，本发明提供的3-甾酮-Δ1-脱氢酶突变体是通过定点突变改造野生型3-甾酮-Δ1-脱氢酶基因，将酶活性催化中心氨基酸突变，使第307位苯丙氨酸突变为丙氨酸，其对甾体A环C1,2脱氢反应的活性提高；本发明提供的3-甾酮-Δ1-脱氢酶突变体比酶活为85217.08U/mg，较野生型提高了227.35％，具有广泛的应用前景。
以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。
序列表
<110> 亳州学院
<120> 一种3-甾酮-Δ1-脱氢酶突变体及其构建方法
<160> 7
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 520
<212> PRT
<213> Gordonia neofelifaecis
<400> 1
Met Pro Met Thr Thr Thr Thr Pro Glu Trp Thr Gln Glu Tyr Asp Val
1 5 10 15
Ile Val Ala Gly Ser Gly Ala Gly Gly Val Thr Gly Thr Tyr Thr Ala
20 25 30
Ala Arg Glu Gly Leu Ser Val Leu Met Val Glu Ala Ser Asp Lys Phe
35 40 45
Gly Gly Thr Thr Ala Tyr Ser Gly Gly Gly Gly Met Trp Phe Pro Cys
50 55 60
Asn Pro Val Leu Leu Arg Ala Gly Ala Glu Asp Ser Ile Glu Asp Ala
65 70 75 80
Leu Thr Tyr Tyr Arg Ala Val Val Gly Asp Arg Thr Pro Val Glu Leu
85 90 95
Gln Glu Thr Tyr Val Arg Gly Gly Ala Pro Leu Ile Glu Tyr Leu Glu
100 105 110
Gln Asp Lys His Leu Glu Phe Val Pro Leu Pro Trp Pro Asp Tyr Phe
115 120 125
Gly Lys Ala Pro Lys Ala Lys Leu Asp Gly Met Arg His Thr Met Pro
130 135 140
Asn Pro Leu Pro Val Ser Asp Ala Pro Glu Tyr Lys Asp Ile Val Arg
145 150 155 160
Gly Pro Leu Asp Val Asp Arg His Gly Ala Pro Thr Pro Asp Asp Leu
165 170 175
Phe Ile Gly Gly Arg Ala Leu Val Ala Arg Phe Leu Lys Ala Ile Ala
180 185 190
Glu Phe Asp Asn Ala Lys Val Gln Leu Asn Ser Pro Val Val Asp Leu
195 200 205
Val Val Glu Asp Gly Ala Val Thr Gly Val Ile Ile Glu Val Asp Gly
210 215 220
Glu Arg Gln Ala Ile Arg Ala Arg Arg Gly Val Val Leu Ala Ala Gly
225 230 235 240
Gly Phe Glu Gly Asn Asp Ala Met Arg Lys Glu Phe Gly Val Pro Gly
245 250 255
Val Ala Arg Asp Thr Met Gly Pro Asp Thr Asn Gln Gly Leu Thr His
260 265 270
Gln Ala Gly Ile Ala Ala Gly Ala Asp Thr Asp Leu Met Asp Gln Ala
275 280 285
Trp Trp Ser Pro Gly Leu Thr His Pro Asp Gly Arg Ser Ala Phe Ala
290 295 300
Leu Trp Phe Thr Gly Gly Ile Phe Val Asn Gln Asp Gly Lys Arg Phe
305 310 315 320
Val Asn Glu Ser Ala Pro Tyr Asp Arg Ile Gly Arg Glu Ala Leu Lys
325 330 335
Gln Ile Ala Asp Asp Gln Leu Thr Leu Pro Phe Trp Met Ile Tyr Asp
340 345 350
Asp Lys Glu Gly Glu Val Pro Pro Ile Lys Ala Ala Asn Val Glu Phe
355 360 365
Phe Pro Thr Glu Glu Tyr Arg Glu Ala Gly Leu Trp His Thr Ala Asp
370 375 380
Thr Ile Glu Glu Leu Ala Glu Lys Ile Gly Val Pro Ala Asp Ala Leu
385 390 395 400
Ala Ala Thr Val Ala Arg Phe Asn Glu Gln Val Pro Thr Gly Val Asp
405 410 415
Pro Asp Phe Gly Arg Gly Asp Glu Ala Tyr Asp Arg Ala Phe Ser Ala
420 425 430
Gly Glu Pro Pro Leu Phe Ala Val Asp Gln Gly Pro Phe His Ala Ala
435 440 445
Val Phe Gly Leu Ser Asp Leu Gly Thr Lys Gly Gly Leu Lys Thr Asn
450 455 460
Thr Ala Gly Asn Val Leu Arg Thr Asp Gly Ser Thr Ile Thr Gly Leu
465 470 475 480
Tyr Ala Ala Gly Asn Thr Met Ala Ala Pro Ser Gly Leu Ala Tyr Pro
485 490 495
Gly Gly Gly Asn Pro Ile Gly Thr Ser Met Leu Phe Ser His Leu Ala
500 505 510
Val Arg Asp Ile Leu Ala Arg Gly
515 520
<210> 2
<211> 520
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 2
Met Pro Met Thr Thr Thr Thr Pro Glu Trp Thr Gln Glu Tyr Asp Val
1 5 10 15
Ile Val Ala Gly Ser Gly Ala Gly Gly Val Thr Gly Thr Tyr Thr Ala
20 25 30
Ala Arg Glu Gly Leu Ser Val Leu Met Val Glu Ala Ser Asp Lys Phe
35 40 45
Gly Gly Thr Thr Ala Tyr Ser Gly Gly Gly Gly Met Trp Phe Pro Cys
50 55 60
Asn Pro Val Leu Leu Arg Ala Gly Ala Glu Asp Ser Ile Glu Asp Ala
65 70 75 80
Leu Thr Tyr Tyr Arg Ala Val Val Gly Asp Arg Thr Pro Val Glu Leu
85 90 95
Gln Glu Thr Tyr Val Arg Gly Gly Ala Pro Leu Ile Glu Tyr Leu Glu
100 105 110
Gln Asp Lys His Leu Glu Phe Val Pro Leu Pro Trp Pro Asp Tyr Phe
115 120 125
Gly Lys Ala Pro Lys Ala Lys Leu Asp Gly Met Arg His Thr Met Pro
130 135 140
Asn Pro Leu Pro Val Ser Asp Ala Pro Glu Tyr Lys Asp Ile Val Arg
145 150 155 160
Gly Pro Leu Asp Val Asp Arg His Gly Ala Pro Thr Pro Asp Asp Leu
165 170 175
Phe Ile Gly Gly Arg Ala Leu Val Ala Arg Phe Leu Lys Ala Ile Ala
180 185 190
Glu Phe Asp Asn Ala Lys Val Gln Leu Asn Ser Pro Val Val Asp Leu
195 200 205
Val Val Glu Asp Gly Ala Val Thr Gly Val Ile Ile Glu Val Asp Gly
210 215 220
Glu Arg Gln Ala Ile Arg Ala Arg Arg Gly Val Val Leu Ala Ala Gly
225 230 235 240
Gly Phe Glu Gly Asn Asp Ala Met Arg Lys Glu Phe Gly Val Pro Gly
245 250 255
Val Ala Arg Asp Thr Met Gly Pro Asp Thr Asn Gln Gly Leu Thr His
260 265 270
Gln Ala Gly Ile Ala Ala Gly Ala Asp Thr Asp Leu Met Asp Gln Ala
275 280 285
Trp Trp Ser Pro Gly Leu Thr His Pro Asp Gly Arg Ser Ala Phe Ala
290 295 300
Leu Trp Ala Thr Gly Gly Ile Phe Val Asn Gln Asp Gly Lys Arg Phe
305 310 315 320
Val Asn Glu Ser Ala Pro Tyr Asp Arg Ile Gly Arg Glu Ala Leu Lys
325 330 335
Gln Ile Ala Asp Asp Gln Leu Thr Leu Pro Phe Trp Met Ile Tyr Asp
340 345 350
Asp Lys Glu Gly Glu Val Pro Pro Ile Lys Ala Ala Asn Val Glu Phe
355 360 365
Phe Pro Thr Glu Glu Tyr Arg Glu Ala Gly Leu Trp His Thr Ala Asp
370 375 380
Thr Ile Glu Glu Leu Ala Glu Lys Ile Gly Val Pro Ala Asp Ala Leu
385 390 395 400
Ala Ala Thr Val Ala Arg Phe Asn Glu Gln Val Pro Thr Gly Val Asp
405 410 415
Pro Asp Phe Gly Arg Gly Asp Glu Ala Tyr Asp Arg Ala Phe Ser Ala
420 425 430
Gly Glu Pro Pro Leu Phe Ala Val Asp Gln Gly Pro Phe His Ala Ala
435 440 445
Val Phe Gly Leu Ser Asp Leu Gly Thr Lys Gly Gly Leu Lys Thr Asn
450 455 460
Thr Ala Gly Asn Val Leu Arg Thr Asp Gly Ser Thr Ile Thr Gly Leu
465 470 475 480
Tyr Ala Ala Gly Asn Thr Met Ala Ala Pro Ser Gly Leu Ala Tyr Pro
485 490 495
Gly Gly Gly Asn Pro Ile Gly Thr Ser Met Leu Phe Ser His Leu Ala
500 505 510
Val Arg Asp Ile Leu Ala Arg Gly
515 520
<210> 3
<211> 1563
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 3
atgccgatga ccaccaccac cccggaatgg acccaggaat acgacgttat cgttgctggt 60
tctggtgctg gtggtgttac cggtacctac accgctgctc gtgaaggtct gtctgttctg 120
atggttgaag cttctgacaa attcggtggt accaccgctt actctggtgg tggtggtatg 180
tggttcccgt gcaacccggt tctgctgcgt gctggtgctg aagactctat cgaagacgct 240
ctgacctact accgtgctgt tgttggtgac cgtaccccgg ttgaactgca ggaaacctac 300
gttcgtggtg gtgctccgct gatcgaatac ctggaacagg acaaacacct ggaattcgtt 360
ccgctgccgt ggccggacta cttcggtaaa gctccgaaag ctaaactgga cggtatgcgt 420
cacaccatgc cgaacccgct gccggtttct gacgctccgg aatacaaaga catcgttcgt 480
ggtccgctgg acgttgaccg tcacggtgct ccgaccccgg acgacctgtt catcggtggt 540
cgtgctctgg ttgctcgttt cctgaaagct atcgctgaat tcgacaacgc taaagttcag 600
ctgaactctc cggttgttga cctggttgtt gaagacggtg ctgttaccgg tgttatcatc 660
gaagttgacg gtgaacgtca ggctatccgt gctcgtcgtg gtgttgttct ggctgctggt 720
ggtttcgaag gtaacgacgc tatgcgtaaa gaattcggtg ttccgggtgt tgctcgtgac 780
accatgggtc cggacaccaa ccagggtctg acccaccagg ctggtatcgc tgctggtgct 840
gacaccgacc tgatggacca ggcttggtgg tctccgggtc tgacccaccc ggacggtcgt 900
tctgctttcg ctctgtggtt caccggtggt atcttcgtta accaggacgg taaacgtttc 960
gttaacgaat ctgctccgta cgaccgtatc ggtcgtgaag ctctgaaaca gatcgctgac 1020
gaccagctga ccctgccgtt ctggatgatc tacgacgaca aagaaggtga agttccgccg 1080
atcaaagctg ctaacgttga attcttcccg accgaagaat accgtgaagc tggtctgtgg 1140
cacaccgctg acaccatcga agaactggct gaaaaaatcg gtgttccggc tgacgctctg 1200
gctgctaccg ttgctcgttt caacgaacag gttccgaccg gtgttgaccc ggacttcggt 1260
cgtggtgacg aagcttacga ccgtgctttc tctgctggtg aaccgccgct gttcgctgtt 1320
gaccagggtc cgttccacgc tgctgttttc ggtctgtctg acctgggtac caaaggtggt 1380
ctgaaaacca acaccgctgg taacgttctg cgtaccgacg gttctaccat caccggtctg 1440
tacgctgctg gtaacaccat ggctgctccg tctggtctgg cttacccggg tggtggtaac 1500
ccgatcggta cctctatgct gttctctcac ctggctgttc gtgacatcct ggctcgtggt 1560
taa 1563
<210> 4
<211> 1563
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 4
atgccgatga ccaccaccac cccggaatgg acccaggaat acgacgttat cgttgctggt 60
tctggtgctg gtggtgttac cggtacctac accgctgctc gtgaaggtct gtctgttctg 120
atggttgaag cttctgacaa attcggtggt accaccgctt actctggtgg tggtggtatg 180
tggttcccgt gcaacccggt tctgctgcgt gctggtgctg aagactctat cgaagacgct 240
ctgacctact accgtgctgt tgttggtgac cgtaccccgg ttgaactgca ggaaacctac 300
gttcgtggtg gtgctccgct gatcgaatac ctggaacagg acaaacacct ggaattcgtt 360
ccgctgccgt ggccggacta cttcggtaaa gctccgaaag ctaaactgga cggtatgcgt 420
cacaccatgc cgaacccgct gccggtttct gacgctccgg aatacaaaga catcgttcgt 480
ggtccgctgg acgttgaccg tcacggtgct ccgaccccgg acgacctgtt catcggtggt 540
cgtgctctgg ttgctcgttt cctgaaagct atcgctgaat tcgacaacgc taaagttcag 600
ctgaactctc cggttgttga cctggttgtt gaagacggtg ctgttaccgg tgttatcatc 660
gaagttgacg gtgaacgtca ggctatccgt gctcgtcgtg gtgttgttct ggctgctggt 720
ggtttcgaag gtaacgacgc tatgcgtaaa gaattcggtg ttccgggtgt tgctcgtgac 780
accatgggtc cggacaccaa ccagggtctg acccaccagg ctggtatcgc tgctggtgct 840
gacaccgacc tgatggacca ggcttggtgg tctccgggtc tgacccaccc ggacggtcgt 900
tctgctttcg ctctgtgggc caccggtggt atcttcgtta accaggacgg taaacgtttc 960
gttaacgaat ctgctccgta cgaccgtatc ggtcgtgaag ctctgaaaca gatcgctgac 1020
gaccagctga ccctgccgtt ctggatgatc tacgacgaca aagaaggtga agttccgccg 1080
atcaaagctg ctaacgttga attcttcccg accgaagaat accgtgaagc tggtctgtgg 1140
cacaccgctg acaccatcga agaactggct gaaaaaatcg gtgttccggc tgacgctctg 1200
gctgctaccg ttgctcgttt caacgaacag gttccgaccg gtgttgaccc ggacttcggt 1260
cgtggtgacg aagcttacga ccgtgctttc tctgctggtg aaccgccgct gttcgctgtt 1320
gaccagggtc cgttccacgc tgctgttttc ggtctgtctg acctgggtac caaaggtggt 1380
ctgaaaacca acaccgctgg taacgttctg cgtaccgacg gttctaccat caccggtctg 1440
tacgctgctg gtaacaccat ggctgctccg tctggtctgg cttacccggg tggtggtaac 1500
ccgatcggta cctctatgct gttctctcac ctggctgttc gtgacatcct ggctcgtggt 1560
taa 1563
<210> 5
<211> 1563
<212> DNA
<213> Gordonia neofelifaecis
<400> 5
atgccgatga ccacaaccac ccccgaatgg acgcaggaat acgacgtcat cgtcgccgga 60
tcaggagcgg gcggcgtcac cggcacctac accgccgcgc gcgagggcct gtcggtcctg 120
atggtcgagg cctcggacaa gttcggcggc accaccgcct actcgggcgg cggcggcatg 180
tggttcccgt gcaacccggt gctcctccgc gccggcgccg aggactcgat cgaggacgcg 240
ctcacctact accgcgcagt ggtcggcgat cgcacccccg tcgaactcca ggagacctac 300
gtccgcggcg gcgccccgct gatcgagtac ctcgagcagg acaagcacct cgagttcgtc 360
cccctcccct ggccggacta cttcggaaag gcaccgaagg ccaagctcga cggtatgcgg 420
cacaccatgc ccaacccgct gcccgtctcc gacgctcccg agtacaagga catcgtccgc 480
ggcccgctgg acgtggaccg ccacggcgcg cccaccccgg acgacctctt catcggcggc 540
cgcgcgctcg tcgcccgctt cctcaaggcg atcgccgagt tcgacaacgc gaaggttcag 600
ctgaacagcc cggtcgtcga cctggtcgtc gaggacggcg ccgtgaccgg tgtgatcatc 660
gaggtcgacg gcgagcgcca ggccatccgc gcccgccgcg gcgtcgtgct cgccgcaggt 720
ggcttcgagg gcaacgacgc catgcgcaag gagttcggtg tgcccggcgt cgcccgcgac 780
accatgggcc ccgacaccaa ccagggcctg acccaccagg cgggcatcgc cgcaggcgcc 840
gacaccgacc tgatggatca ggcgtggtgg tcgcccggcc tgacccaccc ggatggtcgt 900
agcgcgttcg ctctctggtt caccggcggc atcttcgtca atcaggacgg caagcgcttc 960
gtcaacgagt cggccccgta cgaccgcatc ggccgcgagg ccctcaagca gatcgccgac 1020
gaccagctca cgctcccgtt ctggatgatc tacgacgaca aggagggcga ggtcccgccg 1080
atcaaggccg cgaacgtcga gttcttcccg accgaggagt accgcgaggc gggtctgtgg 1140
cacaccgcgg acactatcga ggagctcgcc gagaagatcg gcgtccccgc cgacgcgctc 1200
gccgcgaccg tcgcccgctt caacgagcag gtccccaccg gcgtcgaccc cgacttcggc 1260
cgcggcgacg aggcctacga ccgcgcgttc tccgccggcg agccgccgct gttcgcggtg 1320
gaccagggcc cgttccacgc tgccgtcttc ggtctgtcgg acctcggcac caagggcgga 1380
ctgaagacca acaccgcggg caacgtgctg cgtaccgacg gctcgaccat caccggcctg 1440
tacgccgcgg gcaacaccat ggcggccccc agcggactcg cctaccccgg tggcggcaac 1500
ccgatcggca cctcgatgct gttcagccac ctcgcagtcc gcgacattct cgcgcgcggc 1560
tga 1563
<210> 6
<211> 36
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 6
ctgctttcgc tctgtgggcc accggtggta tcttcg 36
<210> 7
<211> 36
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 7
cgaagatacc accggtggcc cacagagcga aagcag 36

Claims (9)

1.一种3-甾酮-Δ1-脱氢酶突变体，其氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示。
2.编码权利要求1所述的3-甾酮-Δ1-脱氢酶突变体的基因，其核苷酸序列如SEQ IDNO.4所示。
3.携带权利要求2所述基因的重组载体。
4.携带权利要求2所述基因或权利要求3所述重组载体的重组菌株。
5.权利要求1所述3-甾酮-Δ1-脱氢酶突变体的构建方法，包括以下步骤：
1)将3-甾酮-Δ1-脱氢酶基因与表达载体连接获得野生型重组载体，所述3-甾酮-Δ1-脱氢酶基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示；
2)以步骤1)获得的野生型重组载体为模板，通过反向PCR定点突变获得权利要求3所述3-甾酮-Δ1-脱氢酶突变体重组载体；所述反向PCR定点突变用引物为F307A_F和F307A_R；所述F307A_F的序列如SEQ ID NO.6所示；所述F307A_R的序列如SEQ ID NO.7所示；
3)将步骤2)获得的3-甾酮-Δ1-脱氢酶突变体重组载体转化到表达菌株获得权利要求4所述重组菌株，培养所述重组菌株获得3-甾酮-Δ1-脱氢酶突变体。
6.根据权利要求5所述的构建方法，其特征在于，步骤1)所述表达载体为pCold质粒。
7.根据权利要求5所述的构建方法，其特征在于，步骤3)所述表达菌株为大肠杆菌BL21(DE3)。
8.根据权利要求5所述的构建方法，其特征在于，步骤3)所述培养后还包括以下步骤：
A)将所述培养得到的重组菌株破碎，固液分离，收集上清液；
B)将所述上清液经Ni亲和层析分离纯化获得3-甾酮-Δ1-脱氢酶突变体。
9.权利要求1所述的3-甾酮-Δ1-脱氢酶突变体或权利要求5～8任意一项所述的构建方法构建获得的3-甾酮-Δ1-脱氢酶突变体在微生物合成甾体药物中的应用。
CN201810190182.1A 2018-03-08 2018-03-08 一种3-甾酮-δ1-脱氢酶突变体及其构建方法 Expired - Fee Related CN108103037B (zh)

Priority Applications (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN201810190182.1A CN108103037B (zh) 2018-03-08 2018-03-08 一种3-甾酮-δ1-脱氢酶突变体及其构建方法

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN201810190182.1A CN108103037B (zh) 2018-03-08 2018-03-08 一种3-甾酮-δ1-脱氢酶突变体及其构建方法

Publications (2)

Publication Number Publication Date
CN108103037A CN108103037A (zh) 2018-06-01
CN108103037B true CN108103037B (zh) 2020-01-21

Family

ID=62206039

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN201810190182.1A Expired - Fee Related CN108103037B (zh) 2018-03-08 2018-03-08 一种3-甾酮-δ1-脱氢酶突变体及其构建方法

Country Status (1)

Country Link
CN (1) CN108103037B (zh)

Families Citing this family (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN111471736B (zh) * 2020-04-22 2022-01-11 武汉艾默佳华生物科技有限公司 制备c1,2-位脱氢甾体化合物的方法
CN111500549B (zh) * 2020-04-22 2023-05-30 湖北工业大学 制备c1,2-位脱氢甾体化合物的酶及其应用
CN114107235B (zh) * 2021-10-28 2023-07-14 浙江工业大学 一种3-甾酮-δ1-脱氢酶突变体、编码基因、载体及应用
CN114621965B (zh) * 2022-02-15 2023-10-03 复旦大学 一种3-甾酮-δ1-脱氢酶突变体及应用

Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN107586762A (zh) * 2017-09-18 2018-01-16 天津科技大学 一种3‑甾酮‑δ1‑脱氢酶突变体及其应用

Patent Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN107586762A (zh) * 2017-09-18 2018-01-16 天津科技大学 一种3‑甾酮‑δ1‑脱氢酶突变体及其应用

Non-Patent Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
登录号：EGD53402.1;无;《GenBank》;20110315;第1页 *
简单节杆菌3-甾酮-Δ1 脱氢酶基因的克隆表达及定点突变研究;李婕等;《现代生物医学进展》;20170910;第17卷(第25期);第4801-4806页 *

Also Published As

Publication number Publication date
CN108103037A (zh) 2018-06-01

Similar Documents

Publication Publication Date Title
CN108103037B (zh) 一种3-甾酮-δ1-脱氢酶突变体及其构建方法
CN111635898B (zh) 谷氨酸脱羧酶突变体及其在制备γ-氨基丁酸中的应用
CN111676203B (zh) 一种亮氨酸脱氢酶突变体及其应用
CN108795916B (zh) 一种赖氨酸脱羧酶突变体、其编码基因及其表达和应用
CN112391372B (zh) 一种谷氨酸脱羧酶突变体、基因工程菌及其应用
CN108865962B (zh) 一种可高效可溶性表达4-α-糖基转移酶的大肠杆菌工程菌
CN111172142B (zh) 一种热稳定性高的头孢菌素c酰化酶突变体
CN108251391A (zh) 新型葡萄糖氧化酶突变体
CN113862233A (zh) 提高葡萄糖氧化酶的酸稳定性的方法及突变体q241e/r499e、基因和应用
CN114591939B (zh) 一种高耐热d-阿洛酮糖-3-差向异构酶突变体及其应用
CN114525268B (zh) 一种pH耐受性提高的谷氨酸脱羧酶突变体及其在γ-氨基丁酸合成中的应用
CN114250205B (zh) 一种具有高热稳定性的7α-羟基类固醇脱氢酶突变体及其应用
CN113462678B (zh) 一种谷氨酸脱羧酶突变体
CN108118036A (zh) 新型葡萄糖氧化酶突变体
CN107828768B (zh) 一种l-天冬酰胺酶突变体及其构建方法
CN112746067A (zh) 用于制备d-鸟氨酸的赖氨酸脱羧酶突变体
CN110129305B (zh) 一种用于制备7-aca的头孢菌素c酰化酶突变体
CN115058408B (zh) 一种宏基因组来源的高比活耐酸性d-阿洛酮糖3-差向异构酶及其编码基因和应用
CN114231508B (zh) 一种7β-羟基类固醇脱氢酶突变体及其应用
CN112824527A (zh) 人工设计的赖氨酰内切酶及编码序列和发酵方法
CN111808836B (zh) 耐热的i型普鲁兰酶的突变体酶及其制备方法与应用
CN105087520B (zh) 一种促进重组极端耐热α-淀粉酶可溶性表达的方法
CN114395543B (zh) 一种海藻糖合酶突变体及其应用
CN112080503B (zh) 一种优化启动子提高γ-谷氨酰胺转肽酶表达量的方法
CN111826368B (zh) I型普鲁兰酶的突变体酶及其制备方法与应用

Legal Events

Date Code Title Description
PB01 Publication
PB01 Publication
SE01 Entry into force of request for substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination
GR01 Patent grant
GR01 Patent grant
CF01 Termination of patent right due to non-payment of annual fee
CF01 Termination of patent right due to non-payment of annual fee

Granted publication date: 20200121

Termination date: 20210308