CN113862233A - 提高葡萄糖氧化酶的酸稳定性的方法及突变体q241e/r499e、基因和应用 - Google Patents

提高葡萄糖氧化酶的酸稳定性的方法及突变体q241e/r499e、基因和应用 Download PDF

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Abstract

本发明涉及基因工程领域，具体涉及提高葡萄糖氧化酶的酸稳定性的方法及突变体Q241E/R499E、基因和应用。高热稳定性葡萄糖氧化酶突变体GODM10经定点突变后得到酸稳定性提高的突变体。本发明的葡萄糖氧化酶突变体具有良好的酶学性质，可以应用于食品和饲料等行业。

Description

提高葡萄糖氧化酶的酸稳定性的方法及突变体Q241E/R499E、 基因和应用
技术领域
本发明涉及基因工程领域，具体涉及提高葡萄糖氧化酶的酸稳定性的方法及突变体Q241E/R499E、基因和应用。
背景技术
葡萄糖氧化酶(Glucose oxidase, GOD)是一种需氧脱氢酶，能专一地氧化β-D-葡萄糖成为葡萄糖酸和过氧化氢。葡萄糖氧化酶广泛分布于动植物和微生物体内，微生物是其主要来源，主要生产菌株为黑曲霉和青霉。葡萄糖氧化酶作为替代抗生素的新型饲料酶制剂，具有改善动物肠道微生态平衡以及肠道消化环境、保护肠道健康、提高饲料利用率、促进动物生长、提高机体免疫力等多种功能，已被广泛应用于饲料工业。
中国专利申请CN201910835766.4提供了来源于Aspergillus niger的葡萄糖氧化酶GOD的突变体，其中，突变体GOD-M10的最适温度以及最适pH分别为40℃，pH 6.0。
作为饲料用酶，要求其在酸性和中性pH条件下维持较高的酶活性。但是上述葡萄糖氧化酶突变体GOD-M10发挥最大酶活性的pH条件为6.0，pH稳定性在pH 2.5-3.0条件下酶活性极低。为了获得酸稳定的GOD，采用蛋白质工程改造技术对高热稳定性葡萄糖氧化酶GODM10进行酸稳定性的改良成为实现这一目的的重要手段。
发明内容
为了进一步优化来源于Aspergillus niger的高热稳定性葡萄糖氧化酶突变体GODM10的酶学特性，提出并完成了本发明。
本发明的目的是提供酸稳定性提高的葡萄糖氧化酶突变体。
本发明的再一目的是提供上述葡萄糖氧化酶突变体的编码基因。
本发明的再一目的是提供包含上述葡萄糖氧化酶突变体编码基因的重组载体。
本发明的再一目的是提供包含上述葡萄糖氧化酶突变体编码基因的重组菌株。
本发明的再一目的是提供一种制备酸稳定性提高的葡萄糖氧化酶的方法。
本发明的再一目的是提供上述葡萄糖氧化酶突变体的应用。
本发明对高热稳定性葡萄糖氧化酶突变体GODM10进行突变，得到酸稳定性提高的葡萄糖氧化酶突变体，其中，母本葡萄糖氧化酶突变体GODM10的氨基酸序列如SEQ ID NO:1所示。
根据本发明的具体实施方式，将葡萄糖氧化酶突变体GODM10的第241位氨基酸由谷氨酰胺突变为谷氨酸得到突变体Q241E或者第499位氨基酸由精氨酸突变为谷氨酸得到突变体R499E。
根据本发明的具体实施方式，将葡萄糖氧化酶突变体GODM10的第241位和第499位氨基酸由谷氨酰胺和精氨酸突变为谷氨酸得到突变体Q241E/R499E。
根据本发明的具体实施方式，所述葡萄糖氧化酶突变体Q241E的氨基酸序列SEQID NO:2所示。
根据本发明的具体实施方式，所述葡萄糖氧化酶突变体R499E的氨基酸序列SEQID NO:3所示。
根据本发明的具体实施方式，所述葡萄糖氧化酶突变体Q241E/R499E的氨基酸序列SEQ ID NO:4所示。
本发明提供了编码上述葡萄糖氧化酶突变体GODM10的基因。根据本发明的具体实施方式，葡萄糖氧化酶突变体GODM10的基因序列如SEQ ID NO：5所示。
根据本发明的具体实施方式，葡萄糖氧化酶突变体Q241E的编码基因序列如SEQID NO:6所示。
根据本发明的具体实施方式，葡萄糖氧化酶突变体R499E的编码基因序列如SEQID NO:7所示。
根据本发明的具体实施方式，葡萄糖氧化酶突变体Q241E/R499E的编码基因序列如SEQ ID NO:8所示。
根据本发明的提高葡萄糖氧化酶的酸热稳定性的方法包括以下步骤：
将葡萄糖氧化酶突变体GODM10进行单点突变，将第241位氨基酸由谷氨酰胺和精氨酸突变为谷氨酸，或第499位氨基酸由谷氨酰胺和精氨酸突变为谷氨酸。
将葡萄糖氧化酶突变体GODM10进行双点突变，将第241位和第499位氨基酸由谷氨酰胺和精氨酸突变为谷氨酸。
本发明提供了包含上述葡萄糖氧化酶突变体的编码基因的重组载体。优选的，所述重组表达载体的出发载体具体为pPIC9。
本发明还提供了包含上述葡萄糖氧化酶突变体的编码基因的重组菌株。优选的，所述重组菌的出发菌株具体为GS115(pPIC9-godm10)。
根据本发明的具体实施方式，制备酸稳定性提高的葡萄糖氧化酶的方法如下所述：
(1)用含有葡萄糖氧化酶突变体的编码基因的重组载体转化宿主细胞，得到重组菌株；
(2)培养重组菌株，诱导葡萄糖氧化酶表达；
(3)回收并纯化所表达的葡萄糖氧化酶。
本发明的有益效果：
本发明通过在葡萄糖氧化酶的结构中引入两个谷氨酸来达到提高酸稳定性，结果表明引入谷氨酸后明显提高了酶的酸稳定性。本发明的葡萄糖氧化酶突变体与突变母本高热稳定性葡萄糖氧化酶突变体GODM10相比，在不影响酶活性和热稳定性的前提下有效改善了其酸稳定性，3个突变体的最适pH均降低1个单位，同时其酸稳定性也增强，纯化后酶液在pH 2.5和37℃处理60min后保留酶活力分别为9.2%，12.06%和15.89%左右，与GODM10相比分别提高了41.54%，85.55%和144.46%。因此，本发明提供的葡萄糖氧化酶突变体可以很好的应用于食品和饲料行业中，有广阔的应用前景。
附图说明
图1显示本申请的突变体和GODM10的酶活力对比；
图2显示本申请的突变体和GODM10最适反应温度对比；
图3显示本申请的突变体和GODM10最适反应pH对比；
图4显示本申请的突变体和GODM10在75℃和80℃下处理的热稳定性对比；
图5显示本申请的突变体和GODM10在pH 2-8下处理的酸稳定性对比；
图6显示本申请的突变体和GODM10在pH 2.5下处理的酸稳定性对比；
图7显示本申请的突变体和GODM10在pH 2.5和37℃处理下的酶活力对比；
图8显示突变体和GODM10在胃肠道模拟液中pH 2-7下的酶活力对比；
图9显示突变体和GODM10在胃肠道模拟液中pH 2.5-3下的酸稳定性对比。
具体实施方式
试验材料和试剂
1、菌株及载体：表达宿主为Pichia pastoris GS115，表达质粒载体为pPIC9。
2、酶类及其它生化试剂：内切酶购自TaKaRa公司，连接酶购自Invitrog
公司。其它都为国产试剂（均可从普通生化试剂公司购买得到）。
3、培养基：
（1）大肠杆菌培养基LB（1 %蛋白胨、0.5 %酵母提取物、1 % NaCl， pH自然）。
（2）毕赤酵母培养基YPD（Yeast Extract 1 %, Trytone 2 %，Glucose 2 % pH自然）。
（3）BMGY培养基 (Yeast Extract 1 %, Trytone 2 %, YNB10 %, 生物素0.1 %,pH自然)。
（4）BMMY培养基（Yeast Extract 1 %， Trytone 2 %， 甲醇0.5 %， YNB 10 %， 生物素0.1 %，pH自然）。
说明：以下实施例中未作具体说明的分子生物学实验方法，均参照《分子克隆实验指南》（第三版）J.萨姆布鲁克一书中所列的具体方法进行，或者按照试剂盒和产品说明书进行。
实施例1、重组菌株GS115(pPIC9-godm10)的制备
（1）扩增母本高热稳定性葡萄糖氧化酶突变体GODM10的核酸序列godm10
采用PCR的方法扩增godm10基因片段，采用双酶切方法获得载体pPIC9核酸片段，通过重组试剂盒将两者连接，获得重组质粒pPIC9-godm10，并转化毕赤酵母GS115，获得重组毕赤酵母菌株GS115(pPIC9-godm10)。PCR所用引物如下：
godm10-pPIC9-F（GOD ID No: 9, 40bp）：GGTATTGAGGCTTCCTTGTTGACTGACCCAAAGGAGGTCG
godm10-pPIC9-R（GOD ID No: 10, 40bp）：TTGCATGGAGGCGTAGTCAGCCAAAACAGCGTCTGCGATC
其中，godm10-pPIC9-F及godm10-pPIC9-R用于扩增葡萄糖氧化酶M10的基因编码序列；载体pPIC9通过将保存的菌种接瓶培养后，提取得到。扩增结束后，将PCR产物以及提取质粒进行核酸电泳检测，godm10与载体pPIC9条带大小分别为1746bp、8088bp，将载体用EcoR I和Not I进行酶切后，将PCR产物与酶切产物分别回收纯化。
（2）构建重组菌株GS115(pPIC9-godm10)
将回收的godm10与pPIC9基因片段通过试剂盒重组酶进行重组连接，然后将重组产物转化大肠杆菌JM109感受态，并涂布于LB（含100 μg/mL Ampicillin）进行筛选。待测序正确后，利用BglⅡ限制性内切酶将重组质粒pPIC9-godm10进行酶切，回收产物电击转化毕赤酵母感受态细胞GS115进行诱导表达，得到重组表达菌株GS115(pPIC9-godm10)。
实施例2、重组菌株GS115(pPIC9-godm10-Q241E，pPIC9-godm10-R499E，pPIC9- godm10-Q241E/R499E)的制备
（1）重组质粒pPIC9-godm10-Q241E，pPIC9-godm10-R499E，pPIC9-godm10-Q
241E/R499E的构建
经优化，突变位点设计为，分别将241和499位的谷氨酰胺和精氨酸突变为谷氨酸，通过点突变试剂盒的方法引入突变位点，并对其进行测序验证，获得葡萄糖氧化酶突变质粒pPIC9-godm10-Q241E，pPIC9-godm10-R499E，pPIC9-godm10-Q241E/R499E。所用引物如下所示：
Q241E-F（God ID No：10）AGACCTAACTTGGAGGTTTTGACCGGTCAATACGT
Q241E-R（God ID No：11）ACCGGTCAAAACCTCCAAGTTAGGTCTTTGGTAGT
R499E-F（God ID No：12）GATGCTGACTTGGAGGCTTGGGTTGAATACATTCC
R499E-R（God ID No：13）TTCAACCCAAGCCTCCAAGTCAGCATCGTAGGCCA
其中，首先使用引物Q241E-F和Q241E-R构建突变质粒pPIC9-godm10-Q241E，使用引物R499E-F和R499E-R构建突变质粒pPIC9-godm10-R499E和，待测序正确后以此为模板，利用引物R499E-F和R499E-R构建突变质粒pPIC9-godm10-Q241E/R499E。
（2）构建重组菌株GS115 (pPIC9-godm10-Q241E，pPIC9-godm10-R499E，pPIC9-godm10-Q241E/R499E)
利用BglⅡ将重组质粒pPIC9-godm10-Q241E，pPIC9-godm10-R499E，pPIC9-godm10-Q241E/R499E进行酶切，回收产物电击转化毕赤酵母感受态细胞GS115进行诱导表达，得到重组表达菌株GS115 (pPIC9-godm10-Q241E，pPIC9-godm10-R499E，pPIC9-godm10- Q241E/R499E)。
实施例3、高热稳定性葡萄糖氧化酶M10及Q241E，R499E，Q241E/R499E的获得
1. GODM10及Q241E，R499E，Q241E/R499E的诱导表达
将得到的重组表达菌株GS115 (pPIC9-godm10)及GS115 (pPIC9-godm10-Q241E，pPIC9-godm10-R499E，pPIC9-godm10-Q241E/R499E)接种至YPD培养基中进行种子培养，200rpm，30℃培养48 h后，以1%接种量转接至BMGY培养基中，200 rpm，30℃培养48 h，富集足够的菌体后收集菌体并加入到含有1%甲醇的BMMY培养基中进行诱导表达。
2. GODM10及Q241E，R499E，Q241E/R499E的纯化
将诱导表达后的菌液12000 rpm, 10 min离心，收集上清进行浓缩，再用10 mM磷酸氢二钠溶液（柠檬酸调pH至6.5）进行透析，然后将透析后的酶进行离子交换层析，A液为10 mM磷酸氢二钠溶液（柠檬酸调pH至6.5），B液为A液加1 M NaCl，纯化蛋白，收集洗脱液，进行SDS-PAGE分析。
3. 本申请的突变体和母本GODM10的性质测定
3.1 本申请的突变体和母本GODM10的酶活性测定
中国专利申请 CN201910835766.4中，已对母本高热稳定性葡萄糖氧化酶突变体GODM10进行了详细的酶学性质分析，其最适温度以及最适pH分别为40℃，pH 6.0。并依此结论对突变体的酶活性质进行了测定。将纯化的GODM10和突变体在pH 6.0、40℃下进行酶促反应以测定其酶活性。如图1所示，GODM10的酶活力为393.63 U/mg，本申请的突变酶Q241E，R499E，Q241E/R499E的酶活力分别为485.424 U/mg，414.573 U/mg和447.406 U/mg，较GODM10分别提高了23.32%, 5.32%和13.66%。
3.2本申请的突变体和母本GODM10最适温度测定
本申请的突变体和GODM10的最适温度测定为在0.1mol/L柠檬酸-磷酸氢二钠缓冲液(pH 6.0)缓冲液体系、不同的温度（20、50、60、65、70、75和80℃）下对酶比活进行测定。如图2所示，分别以GODM10和突变体的最高比活作为对照，将不同温度下测得酶活数据作图后发现，GODM10和突变体的最适温度都为40℃。
3.3本申请的突变体和母本GODM10最适pH测定
本申请的突变体和GODM10的最适pH测定为在30℃不同pH (pH 2.0-9.0，0.1mol/L磷酸氢二钠-柠檬酸缓冲液)的底物下进行酶促反应以测定其最适pH。如图3所示，分别以GODM10和突变体的最高比活作为对照，将不同温度下测得酶活数据作图后发现，GODM10的最适pH为6.0，突变体的最适pH为5.0下降了一个单位。
3.4本申请的突变体和母本GODM10的热稳定性测定
本申请的突变体和GODM10的热稳定性测定为在0.1 mol/L柠檬酸-磷酸氢二钠缓冲液(pH 6.0)缓冲液体系、不同温度（80℃或75℃）下处理不同时间（75℃下分别处理5min；80℃下分别处理2 min），然后在30℃下进行剩余酶活性测定。如图4所示，GODM10在75℃下处理5 min之后，剩余酶活相当于处理前的63.82 %；突变体Q241E，R499E和Q241E/R499E在75℃下处理5 min之后，剩余酶活相当于处理前的71.21%，56.59%和69.33%。GODM10在80℃下处理2 min之后，剩余酶活相当于处理前的78.04 %；突变体Q241E，R499E和Q241E/R499E在80℃下处理2 min之后，剩余酶活相当于处理前的87.36%，73.06%和81.35%。其中Q241E和Q241E/R499E的热稳定性小幅提高，R499E的热稳定性略有降低。
3.5本申请的突变体和母本GODM10的酸稳定性测定
本申请的突变体和GODM10的酸稳定性测定为在37℃和不同0.1 mol/L柠檬酸-磷酸氢二钠缓冲液(pH 2-8)体系下处理60 min，以及在pH 2.5缓冲液中处理不同时间（10、20、30、40、50、60 min）再在pH 6.0 和30℃下进行剩余酶活性测定。如图5所示，在pH 3.0和37℃处理60 min后，突变体R499E保留酶活力约为83.34%，突变体Q241E/R499E保留酶活力约为86.74%，突变体Q241E保留酶活力约为89.77%，与M10相比分别提高了12.27%，16.83 %和20.92%。如图6、图7所示，在pH 2.5和37℃处理60 min后，突变体Q241E保留酶活力为9.2%，突变体R499E保留酶活力为12.06%，突变体Q241E/R499E保留酶活力为15.89%，与M10相比分别提高了41.54%，85.55%和144.46%。
3.6本申请的突变体和GODM10的胃肠道模拟液中的稳定性测定
本申请的突变体和GODM10的胃肠道模拟液中的稳定性测定为在胃模拟液中（含有200 mM Gly-HCl、200 mM乙酸-乙酸钠缓冲液、2.0 mg·mL-1 NaCl和2.0 mg·mL-1胃蛋白酶，用HCl或者乙酸钠依次调整pH为2.0、2.5、3.0、4.0、5.0、6.0）和肠道模拟液（6.8 mg·mL-1 KH2PO4、77 mL的0.2 mM NaOH和10 mg·mL-1胰蛋白酶的混合液，pH为6.8），分别在37°C处理20 min。最后在pH 6.0和30℃下进行剩余酶活性测定。如图8、图9所示，在pH 2.5的胃模拟液中处理20 min后，突变体R499E保留酶活力为13.19%，突变体Q241E保留酶活力为13.35%，突变体Q241E/R499E保留酶活力为18.27%，与M10相比分别提高了22.07%，23.56 %和69.05%。突变体和GODM10在pH3.0-7.0范围内可维持80%以上的相对剩余酶活性。
序列表
<110> 中国农业科学院北京畜牧兽医研究所
<120> 提高葡萄糖氧化酶的酸稳定性的方法及突变体Q241E/R499E、基因和应用
<160> 10
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 581
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
Gly Ile Glu Ala Ser Leu Leu Thr Asp Pro Lys Glu Val Ala Gly Arg
1 5 10 15
Thr Val Asp Tyr Ile Ile Ala Gly Gly Gly Leu Thr Gly Leu Val Val
20 25 30
Ala Ala Arg Leu Thr Glu Asn Pro Asp Ile Thr Val Leu Val Ile Glu
35 40 45
Ser Gly Ser Tyr Glu Ser Asp Arg Gly Pro Ile Ile Glu Asp Leu Asn
50 55 60
Ala Tyr Gly Lys Ile Phe Gly Ser Ser Val Asp His Ala Tyr Glu Thr
65 70 75 80
Val Cys Leu Ala Thr Asn Asn Arg Thr Ala Leu Ile Arg Ala Gly Asn
85 90 95
Gly Leu Gly Gly Ser Thr Leu Val Asn Gly Gly Thr Trp Thr Arg Pro
100 105 110
His Lys Ala Gln Val Asp Ser Trp Glu Thr Val Phe Gly Asn Glu Gly
115 120 125
Trp Asn Trp Asp Ser Val Ala Ala Tyr Ser Leu Gln Ala Glu Arg Ala
130 135 140
Arg Ala Pro Asn Ala Lys Gln Ile Ala Ala Gly His Tyr Phe Asn Ala
145 150 155 160
Ser Cys His Gly Ile Asn Gly Thr Val His Ala Gly Pro Arg Asp Thr
165 170 175
Gly Asp Asp Tyr Ser Pro Ile Val Lys Ala Leu Met Ser Ala Val Glu
180 185 190
Asp Arg Gly Val Pro Thr Lys Lys Asp Leu Gly Cys Gly Asp Pro His
195 200 205
Gly Val Ser Met Phe Pro Asn Thr Leu His Glu Asp Gln Val Arg Ser
210 215 220
Asp Ala Ala Arg Glu Trp Leu Leu Pro Asn Tyr Gln Arg Pro Asn Leu
225 230 235 240
Gln Val Leu Thr Gly Gln Tyr Val Gly Lys Val Leu Leu Ser Gln Asn
245 250 255
Ala Thr Thr Pro Arg Ala Val Gly Val Glu Phe Gly Thr His Lys Gly
260 265 270
Asn Phe His Asn Val Thr Ala Lys His Glu Val Leu Leu Ala Ala Gly
275 280 285
Ser Ala Val Ser Pro Thr Ile Leu Glu Tyr Ser Gly Ile Gly Met Lys
290 295 300
Ser Ile Leu Glu Pro Leu Gly Ile Lys Thr Val Val Asp Leu Pro Val
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attgttaagg ataacgtcgc ttactctgaa ttgttcttgg acactgccgg tgaggcttcc 1260
ttcgacgtct gggacttgct gccattcact agaggatacg ttcacatctt ggacaaggac 1320
ccatacttga gacacttcgc ttacgatcct caatacttct tgaacgagtt ggacttgctt 1380
ggtcaggctg ccgctactca attggctaga aacatctcta actccggtgc catgcaaact 1440
tactttgctg gtgaaaccat tccaggtgac aacttggcct acgatgctga cttggaggct 1500
tgggttgaat acattccata ccacttcaga cctaactacc atggtgtcgg aacctgttct 1560
atgatgccaa aggagatggg tggtgtcgtt gacaacgccg ctagagttta cggtgtccag 1620
ggattgagag ttatcgacgg ttctatccca cctactcaaa tgtcctctca cgttatgacc 1680
gtcttctacg ctatggcttt gaagatcgca gacgctgttt tggctgacta cgcctccatg 1740
caataa 1746
<210> 9
<211> 40
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 9
ggtattgagg cttccttgtt gactgaccca aaggaggtcg 40
<210> 10
<211> 40
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 10
ttgcatggag gcgtagtcag ccaaaacagc gtctgcgatc 40

Claims (7)

1.一种提高酸稳定性的葡萄糖氧化酶突变体，其特征在于，将氨基酸序列如SEQ IDNO:1所示的高热稳定性葡萄糖氧化酶突变体GODM10进行如下突变而得，
第241位氨基酸由谷氨酰胺突变为谷氨酸得到突变体Q241E；或
第499位氨基酸由精氨酸突变为谷氨酸得到突变体R499E。
2.一种提高酸稳定性的葡萄糖氧化酶突变体，其特征在于，将氨基酸序列如SEQ IDNO:1所示的高热稳定性葡萄糖氧化酶突变体GODM10进行如下突变而得，
第241位和第499位氨基酸由谷氨酰胺和精氨酸突变为谷氨酸得到突变体Q241E/R499E。
3.一种提高葡萄糖氧化酶的酸稳定性的方法，其特征在于，所述方法包括以下步骤：将葡萄糖氧化酶突变体GODM10进行以下突变，
第241位氨基酸由谷氨酰胺突变为谷氨酸；
第499位氨基酸由精氨酸突变为谷氨酸；或
第241位和第499位氨基酸由谷氨酰胺和精氨酸突变为谷氨酸。
4.葡萄糖氧化酶突变体基因，其特征在于，编码权利要求1或2所述的酸稳定性提高的葡萄糖氧化酶突变体。
5.根据权利要求4所述的葡萄糖氧化酶突变体基因，其特征在于，
所述突变体Q241E的核苷酸序列如SEQ ID NO:6所示；
所述突变体R499E的核苷酸序列如SEQ ID NO:7所示；
所述突变体Q241E/R499E的核苷酸序列如SEQ ID NO:8所示。
6.制备酸稳定性提高的葡萄糖氧化酶的方法，其特征在于，包括以下步骤：
(1)用包含编码权利要求1或2所述的酸稳定性提高的葡萄糖氧化酶突变体的基因的重组载体转化宿主细胞，得重组菌株；
(2)培养重组菌株，诱导表达葡萄糖氧化酶；
(3)回收并纯化所表达的葡萄糖氧化酶。
7.权利要求1或2所述的酸稳定性提高的葡萄糖氧化酶突变体在食品和饲料领域的应用。
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