CN105950578A - 耐热的葡萄糖氧化酶突变体及其编码基因和应用 - Google Patents
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Abstract
本发明提供了耐热的葡萄糖氧化酶突变体及其编码基因和应用，本发明使用易错PCR方法对野生型葡萄糖氧化酶基因进行突变，再通过高通量筛选方法将正突变检出。经上述突变文库构建、筛选方法，获得3个热稳定性显著提高的葡萄糖氧化酶突变体，热稳定性比野生型提高1‑3倍，具有良好的市场应用前景和工业价值。
Description
技术领域
本发明属于基因工程和酶工程领域，具体内容涉及耐热的葡萄糖氧化酶突变体及其编码基因和应用。
背景技术
葡萄糖氧化酶(glucose oxidase,E.C.1.1.3.4,GOD)有氧条件下能专一性地催化β-D-葡糖生成葡萄糖酸和过氧化氢。葡萄糖氧化酶是目前主要的工具酶之一，被广泛应用于在食品工业、畜牧养殖和医疗检测等领域。葡萄糖氧化酶作为公认的安全抗氧剂应用于食品加工工艺中，在医疗产业中，葡萄糖氧化酶可以用于血糖测定等方向，作为一种饲料添加剂，葡萄糖氧化酶可以改善动物肠道环境，促进动物生长。随着葡萄糖氧化酶越来越多的被应用于各个领域，工业上尤其是饲料工业对其现有性能有了越来越高的要求，如在常温下较长时间保持酶活力不下降，对热和极端pH条件具有耐受性，对消化酶具有耐受性。其中酶的热稳定性对于葡萄糖氧化酶的应用非常关键，在酶的制备过程中和极端反应条件下(高温)，耐热性强的酶有着比较大的优势。
易错PCR(error-prone PCR)技术是一种在DNA序列中制造随机突变的方法，其基本原理是在PCR扩增目的基因时，通过改变传统PCR过程的反应条件(如提高酶离子浓度，改变体系中4种dNTP的浓度等)，使用较低保真度的Taq酶，从而以一定频率随机引入错误碱基，从而形成序列不同的突变体库。
发明内容
本发明提供了耐热的葡萄糖氧化酶突变体及其编码基因和应用，本发明提供的葡萄糖氧化酶突变体热稳定性有了显著的提升。
为实现上述发明目的，本发明采用以下技术方案予以实现：
本发明提供了一种耐热的葡萄糖氧化酶突变体GOD-H-1，所述的葡萄糖氧化酶突变体GOD-H-1的氨基酸序列如SEQ ID NO：3所示，所述的突变体GOD-H-1由氨基酸序列为SEQID NO：1的葡萄糖氧化酶的第122位氨基酸由赖氨酸变为天冬酰胺、第492位氨基酸由甘氨酸变为谷氨酸获得。
本发明提供了所述的葡萄糖氧化酶突变体GOD-H-1的葡萄糖氧化酶编码基因。
本发明提供了含有所述的葡萄糖氧化酶编码基因的重组菌株。
本发明提供了一种耐热的葡萄糖氧化酶突变体GOD-H-3，所述的葡萄糖氧化酶突变体GOD-H-3的氨基酸序列如SEQ ID NO：5所示，所述的突变体GOD-H-3由氨基酸序列为SEQID NO：1的葡萄糖氧化酶的第70位氨基酸由天冬氨酸变为谷氨酸、第122位氨基酸由赖氨酸变为天冬酰胺、第492位氨基酸由甘氨酸变为谷氨酸获得。
本发明提供了所述的葡萄糖氧化酶突变体GOD-H-3的葡萄糖氧化酶编码基因。
本发明提供了含有所述的葡萄糖氧化酶编码基因的重组菌株。
本发明提供了一种耐热的葡萄糖氧化酶突变体GOD-H-4，所述的葡萄糖氧化酶突变体GOD-H-4的氨基酸序列如SEQ ID NO：6所示，所述的突变体GOD-H-4由氨基酸序列为SEQID NO：1的葡萄糖氧化酶的第122位氨基酸由赖氨酸变为天冬酰胺、第263位氨基酸由谷氨酰胺变为脯氨酸、第341位氨基酸由精氨酸变为丝氨酸、第492位氨基酸由甘氨酸变为谷氨酸获得。
本发明提供了所述的葡萄糖氧化酶突变体GOD-H-4的葡萄糖氧化酶编码基因。
本发明提供了含有所述的葡萄糖氧化酶编码基因的重组菌株。
本发明提供了葡萄糖氧化酶突变体GOD-H-1、GOD-H-3和GOD-H-4在用于制备动物饲料添加剂中的应用。
本发明的优点和技术效果是：本发明的目的是采用定向进化技术对来源于黑曲霉(Aspergillus niger)的葡萄糖氧化酶进行蛋白质工程改造，为达到上述发明目的，本发明使用易错PCR方法对葡萄糖氧化酶基因进行突变，再通过高通量筛选方法将正突变检出，得到热稳定性提高的突变体，相比野生型葡萄糖氧化酶GOD-1，本发明的6个突变体GOD-H-1、GOD-H-2、GOD-H-3、GOD-H-4、GOD-H-5、GOD-H-6热稳定性明显提高，在80℃处理3min后，残余酶活分别提高了1.3、1.6、1.9、2.1、2.5、2.3倍。本发明提供的突变体具有良好的市场应用前景和工业价值
附图说明
图1是葡萄糖氧化酶突变体GOD-H-1与野生型氨基酸序列比对图；
图2是葡萄糖氧化酶突变体GOD-H-2与野生型氨基酸序列比对图；
图3是葡萄糖氧化酶突变体GOD-H-3与野生型氨基酸序列比对图；
图4是葡萄糖氧化酶突变体GOD-H-4与野生型氨基酸序列比对图；
图5是葡萄糖氧化酶突变体GOD-H-5与野生型氨基酸序列比对图；
图6是葡萄糖氧化酶突变体GOD-H-6与野生型氨基酸序列比对图；
图7为葡萄糖氧化酶突变体GOD-H-1、GOD-H-2、GOD-H-3、GOD-H-4、GOD-H-5、GOD-H-6在不同温度下的残余酶活。
具体实施方式
下面结合附图和具体实施例对本发明的技术方案做进一步详细的说明。
本发明用到了分子生物学领域使用的常规技术和方法。实施例仅是用于解释本发明，不限制本发明的保护范围。
实施例1：易错PCR(error–prone PCR)方法构建葡萄糖氧化酶GOD-1突变文库
来源于黑曲霉(Aspergillus niger)的葡萄糖氧化酶基因GOD-1由589个氨基酸构成(如SEQ ID NO：1所示)，采用全基因合成的方法合成了该葡萄糖氧化酶基因GOD-1(如SEQ IDNO：2所示)。合成的基因两端还带有EcoR I和Not I酶切位点。以合成的该基因为模板扩增葡萄糖氧化酶GOD-1基因，使用GeneMorph II随机突变PCR试剂盒(Stratagene)随机引入突变。
所用引物为：5′-GCGCGAATTCCGCTGCGGCCCTGCCACACTAC-3′(SEQ ID No：9)，5′-TAAAGCGGCCGCTCACTGCATGGAAGCATAATCTTCCAAGATAGCATCC-3′(SEQ ID No：10)。
下划线处分别为EcoR I和Not I酶切位点。
反应条件为：94℃预变性10min，94℃变性60s，58℃退火60s和72℃延伸2min，共30个循环，回收目的基因片段。
将目的片段用EcoR I和Not I双酶切消化后，与经过相同酶切的pET 21a(+)载体(氨苄抗性基因)用Ligase进行连接反应。将连接好的片段转化至大肠杆菌BL21-DE3，涂布含有氨苄青霉素的LB平板，37℃倒置培养，待平板上出现转化子后，挑取单克隆至96孔板，每孔中含有150uL LB培养基(含有1mM IPTG，50ng/mL氨苄青霉素)，30℃220rpm震荡培养12h，将孔板置于-20℃，反复冻融破壁，获得含有葡萄糖氧化酶的粗酶液。分别取出5ul裂解液至两块新的96孔板，其中一块于80℃处理3min，两块96孔板都加入含有邻联茴香胺甲醇缓冲液、葡萄糖缓冲液、辣根过氧化物酶溶液的显色液，37℃反应3min后加入100uL2M硫酸终止反应，根据显色反应测定残余酶活。
取残余活性比野生型GOD-1高的菌株到新的96孔培养板中，进行重复筛选。筛选到2个突变体，分别为GOD-H-1和GOD-H-2，残余活性是野生型对照的1-3倍，对这两个突变体进行DNA测序。
测序结果显示，如图1和图2所示，本轮易错PCR获得了一个含K122N和G492E的两点突变的突变体GOD-H-1，其氨基酸序列为SEQ ID NO：3，一个含A143P和F461I的两点突变的突变体GOD-H-2，其氨基酸序列为SEQ ID NO：4。
GOD-H-1：该酶的第122位的赖氨酸K变为天冬酰胺N(AAG变为AAC)，第492位的甘氨酸G变为谷氨酸E(GGG变为GAG)。
GOD-H-2：该酶的第143位的丙氨酸A变为脯氨酸P(GCC变为CCC)，第461位的苯丙氨酸F变为异亮氨酸I(TTC变为ATC)。
实施例2：第二轮易错PCR突变文库的构建和筛选突变文库的构建
将第一轮易错PCR方法筛选到的耐热性提高的两个突变体GOD-H01和GOD-H02分别提取质粒作第二轮易错PCR的模板，突变文库的构建过程，使用的引物，PCR反应条件，同实施例1。
通过第二轮易错PCR，同样获得了大量的突变体基因片段。将构建得到的突变体转入大肠杆菌表达菌株BL21-DE3，筛选耐热性正突变时以GOD-H-1和GOD-H-2为对照，其余操作与实施例2相同，取残余活性比突变型GOD-H-1和GOD-H-2高的菌株到新的96孔培养板中，进行重复筛选。
本轮筛选共获得4个突变体，分别命名为GOD-H-3、GOD-H-4，GOD-H-5和GOD-H-6。其中GOD-H-3和GOD-H-4是以GOD-H01为模板获得的突变体，其热稳定性高于GOD-H01，GOD-H-5和GOD-H-6是以GOD-H02为模板获得的突变体，其热稳定性高于GOD-H02，挑取突变体菌株送测序公司测序。
测序结果显示，如图3、图4、图5、和图6所示，本轮易错PCR获得一个含D70Q、K122N和G492E的三点突变的突变体GOD-H-3，其氨基酸序列为SEQ ID NO：5。一个含K122N、Q263P、R341S和G492E的四点突变的突变体GOD-H-4，其氨基酸序列为SEQ ID NO：6。一个含I29L、A143P、G390R和F461I的四点突变的突变体GOD-H-5，其氨基酸序列为SEQ ID NO：7。一个含A143P、P241D、T359S和F461I的四点突变的突变体GOD-H-6，其氨基酸序列为SEQ ID NO：8。
GOD-H-3：该酶的第70位天冬氨酸D变为谷氨酸Q(DNA序列由GAC变为GAA)，第122位的赖氨酸K变为天冬酰胺N(AAG变为AAC)，第492位的甘氨酸G变为谷氨酸E(GGG变为GAG)。
GOD-H-4：该酶的第122位的赖氨酸K变为天冬酰胺N(AAG变为AAC)，第263为的谷氨酰胺Q变为脯氨酸P(CAG变为CCG)，第341位的精氨酸R变为丝氨酸S(CGC变为AGC)，第492位的甘氨酸G变为谷氨酸E(GGG变为GAG)。
GOD-H-5：该酶的第29位的异亮氨酸I变为亮氨酸L(AUC变为CUC)，第143位的丙氨酸A变为脯氨酸P(GCC变为CCC)，第390位的甘氨酸G变为精氨酸R(GGC变为CGC)，第461位的苯丙氨酸F变为异亮氨酸I(TTC变为ATC)。
GOD-H-6：该酶的第143位的丙氨酸A变为脯氨酸P(GCC变为CCC)，第241位的脯氨酸P变为天门冬氨酸D(CCC变为GAC)，第359位的苏氨酸T变为丝氨酸S(ACC变为UCC)，第461位的苯丙氨酸F变为异亮氨酸I(TTC变为ATC)。
实施例3：毕赤酵母工程菌株的构建
使用实施例1中所述引物，以实施例1和实施例2所获得的突变体作为模板进行PCR扩增，PCR反应条件与实施例1相同。
将扩增得到的实施例1及实施例2所述葡萄糖氧化酶突变体基因片段，以及野生型基因片段，通过EcoR I和Not I位点与表达载体pPIC9K相连接，构建表达载体pPIC9K-GOD-1、pPIC9K-GOD-H-1、pPIC9K-GOD-H-2、pPIC9K-GOD-H-3、pPIC9K-GOD-H-4、pPIC9K-GOD-H-5和pPIC9K-GOD-H-6。将表达载体转入大肠杆菌DH5α感受态，挑取转化子后大量提取质粒。
将以上表达质粒用SalI进行线性化，线性化片段用片段纯化试剂盒(TaKaRa MiniBESTDNA Fragment Purifibation Kit)纯化收集后，通过电转化方法转化毕赤酵母GS115，涂布MD平板。将在MD平板上生长出的菌落涂布到浓度依次逐渐升高(1mg/mL，2mg/mL，4mg/mL，8mg/mL)的遗传霉素的YPD平板上筛选多拷贝的阳性转化子，得到毕赤酵母重组菌株。
将7个基因的转化子分别命名为毕赤酵母GOD-1(Pichia pastoris GOD-1)、GOD-H-1(Pichia pastoris GOD-H-1)、毕赤酵母GOD-H-2(Pichia pastoris GOD-H-2)、毕赤酵母GOD-H-3(Pichia pastoris GOD-H-3)、毕赤酵母GOD-H-4(Pichia pastoris GOD-H-4)、毕赤酵母GOD-H-5(Pichia pastoris GOD-H-5)和毕赤酵母GOD-H-6(Pichia pastoris GOD-H-6)，分别挑取每个基因的转化子转接于BMGY培养基中，30℃，220rpm振荡培养18h后，离心获得菌体，将适量菌体转入BMMY培养基中，使菌体浓度达到OD600＝1，30℃，220rpm继续振荡培养，每24h添加培养体积1％的甲醇。诱导表达4d后，将培养液离心获得上清，将上清液进行葡萄糖氧化酶活力测定和热稳定性测定。
实施例4：突变体和野生型表达产物酶活力及热稳定性的测定
酶活力测定方法：
取邻联茴香胺缓冲液2.5mL(0.1mL1％邻联茴香胺甲醇储备液加入到12mL 0.1M pH6.0磷酸缓冲液配成)，18％葡萄糖溶液0.3mL，0.03％过氧化物酶溶液0.1mL，加入到比色管中37℃保温5min，再加入0.1mL葡萄糖氧化酶酶液(空白管加入0.1mL蒸馏水)，反应3min后，加入2M硫酸2mL，混匀以终止反应。以标准空白样为空白对照，在540nm波长处测定空白(A0)和试样溶液(A1)的吸光值。得出ΔA＝A1-A0
试样酶活力计算：
X＝(ΔA×n×3)/(11.3×t×0.1)
T—测定时间，min
0.1—样品体积，mL
11.3—消光系数
N—稀释倍数
3—反应液体积，mL
酶活单位与定义：在pH5.5、37℃的条件下，每分钟能把1.0μmol的β-D-葡萄糖氧化成葡萄糖酸和H2O2的酶量为一个单位。
将实施例3所述发酵上清液用pH 6.0的磷酸缓冲液稀释至约20U/mL，在80℃条件下处理3min后，测定残余酶活，以未处理样品的酶活为100％，计算相对酶活。结果如图7所示，野生型葡萄糖氧化酶在80℃条件下处理3min，酶活仅剩23％，而突变体GOD-H-1、GOD-H-2、GOD-H-3、GOD-H-4，GOD-H-5和GOD-H-6同样在80℃条件下处理3min仍能保持30-60％的酶活。其耐热性分别与野生型基因相比，分别提高了1.3、1.6、2.2、2.1、2.7、2.3倍。
由此可见，突变后的葡萄糖氧化酶的耐热性与野生型相比有了较大提高，更加有利于其在工农业中的应用。
实施例5：葡萄糖氧化酶的养殖应用实验
5.1实验设计
白羽肉鸡苗购自某种禽厂，共分为8栋鸡舍，每一鸡舍20000只鸡，其中1、2、3、4为对照组，5、6、7、8为实验组，实验组在基础日粮中添加0.2U/g本发明提供的葡萄糖氧化酶GOD-H-3，实验为期40天。
5.2生产性能测定
分别在实验开始第2、40天对各组鸡空腹称重，记录初始重和末重。饲养过程中，观察记录各组鸡的健康状况，并记录每周每笼采食量，统计实验期内的成活率、料重比及计算欧洲指数。
实验结果如表1和表2所示：
表1对照组生产性能数据
表2实验组生产性能数据
表1实验结果表明：与对照组相比，实验组的均重增加了3.2％，成活率也有所增加，而料重比有所下降，经过计算欧洲指数上升了5.5％，表明在日粮中添加了葡萄糖氧化酶GOD-H-3使养殖效益有所增加。
本实施例5为了便于体现本发明所述的葡萄糖氧化酶的应用，并不限于肉鸡的应用，因为所述的葡萄糖氧化酶可以添加到基础日粮中，可以用于其他畜禽类的饲喂。通常可以在猪、兔和奶牛等养殖过程中在其配合饲料中添加。
以上实施例仅用以说明本发明的技术方案，而非对其进行限制；尽管参照前述实施例对本发明进行了详细的说明，对于本领域的普通技术人员来说，依然可以对前述实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分技术特征进行等同替换；而这些修改或替换，并不使相应技术方案的本质脱离本发明所要求保护的技术方案的精神和范围。
SEQUENCE LISTING
<110> 青岛红樱桃生物技术有限公司
<120> 耐热的葡萄糖氧化酶突变体及其编码基因和应用
<160> 10
<170> PatentIn version 3.3
<210> 1
<211> 589
<212> PRT
<213> 黑曲霉
<400> 1
Leu Pro His Tyr Ile Arg Ser Asn Gly Ile Glu Ala Ser Leu
Leu Thr
1
5
10
15
Asp Pro Lys Asp Val Ser Gly Arg Thr Val Asp Tyr Ile Ile
Ala Gly
20
25
30
Gly Gly Leu Thr Gly Leu Thr Thr Ala Ala Arg Leu Thr Glu
Asn Pro
35
40
45
Asn Ile Ser Val Leu Val Ile Glu Ser Gly Ser Tyr Glu Ser
Asp Arg
50
55
60
Gly Pro Ile Ile Glu Asp Leu Asn Ala Tyr Gly Asp Ile Phe Gly
Ser
65
70
75
80
Ser Val Asp His Ala Tyr Glu Thr Val Glu Leu Ala Thr Asn
Asn Gln
85
90
95
Thr Ala Leu Ile Arg Ser Gly Asn Gly Leu Gly Gly Ser Thr
Leu Val
100
105
110
Asn Gly Gly Thr Trp Thr Arg Pro His Lys Ala Gln Val Asp
Ser Trp
115
120
125
Glu Thr Val Phe Gly Asn Glu Gly Trp Asn Trp Asp Asn Val
Ala Ala
130
135
140
Tyr Ser Leu Gln Ala Glu Arg Ala Arg Ala Pro Asn Ala Lys
Gln Ile
145
150
155
160
Ala Ala Gly His Tyr Phe Asn Ala Ser Cys His Gly Thr Asn
Gly Thr
165
170
175
Val His Ala Gly Pro Arg Asp Thr Gly Asp Asp Tyr Ser Pro
Ile Val
180
185
190
Lys Ala Leu Met Ser Ala Val Glu Asp Arg Gly Val Pro Thr
Lys Lys
195
200
205
Asp Phe Gly Cys Gly Asp Pro His Gly Val Ser Met Phe Pro
Asn Thr
210
215
220
Leu His Glu Asp Gln Val Arg Ser Asp Ala Ala Arg Glu Trp
Leu Leu
225
230
235
240
Pro Asn Tyr Gln Arg Pro Asn Leu Gln Val Leu Thr Gly Gln
Tyr Val
245
250
255
Gly Lys Val Leu Leu Ser Gln Asn Gly Thr Thr Pro Arg Ala
Val Gly
260
265
270
Val Glu Phe Gly Thr His Lys Gly Asn Thr His Asn Val Tyr
Ala Glu
275
280
285
His Glu Val Leu Leu Ala Ala Gly Ser Ala Val Ser Pro Thr
Ile Leu
290
295
300
Glu Tyr Ser Gly Ile Gly Met Lys Ser Ile Leu Glu Pro Leu
Gly Ile
305
310
315
320
Asp Thr Val Val Asp Leu Pro Val Gly Leu Asn Leu Gln Asp
Gln Thr
325
330
335
Thr Ala Thr Val Arg Ser Arg Ile Thr Ser Ala Gly Ala Gly
Gln Gly
340
345
350
Gln Ala Ala Trp Phe Ala Thr Phe Asn Glu Thr Phe Gly Asp
Tyr Ser
355
360
365
Glu Lys Ala His Glu Leu Leu Asn Thr Lys Leu Glu Gln Trp
Ala Glu
370
375
380
Glu Ala Val Ala Arg Gly Gly Phe His Asn Thr Thr Ala Leu
Leu Ile
385
390
395
400
Gln Tyr Glu Asn Tyr Arg Asp Trp Ile Val Asn His Asn Val
Ala Tyr
405
410
415
Ser Glu Leu Phe Leu Asp Thr Ala Gly Val Ala Ser Phe Asp
Val Trp
420
425
430
Asp Leu Leu Pro Phe Thr Arg Gly Tyr Val His Ile Leu Asp Lys
Asp
435
440
445
Pro Tyr Leu His His Phe Ala Tyr Asp Pro Gln Tyr Phe Leu
Asn Glu
450
455
460
Leu Asp Leu Leu Gly Gln Ala Ala Ala Thr Gln Leu Ala Arg
Asn Ile
465
470
475
480
Ser Asn Ser Gly Ala Met Gln Thr Tyr Phe Ala Gly Glu Thr
Ile Pro
485
490
495
Gly Asp Asn Leu Ala Tyr Asp Ala Asp Leu Ser Ala Trp Thr
Glu Tyr
500
505
510
Ile Pro Tyr His Phe Arg Pro Asn Tyr His Gly Val Gly Thr
Cys Ser
515
520
525
Met Met Pro Lys Glu Met Gly Gly Val Val Asp Asn Ala Ala
Arg Val
530
535
540
Tyr Gly Val Gln Gly Leu Arg Val Ile Asp Gly Ser Ile Pro
Pro Thr
545
550
555
560
Gln Met Ser Ser His Val Met Thr Val Phe Tyr Ala Met Ala
Leu Lys
565
570
575
Ile Ser Asp Ala Ile Leu Glu Asp Tyr Ala Ser Met Gln
580
585
<210> 2
<211> 1770
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 2
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cagtgggccg aagaggccgt cgcccgtggc ggattccaca acactaccgc
cttgctcatc 1200
cagtacgaga actaccgcga ctggattgtc aaccacaacg tcgcgtactc
ggaactcttc 1260
ctcgacactg ccggagtagc cagcttcgat gtgtgggacc ttctgccctt
cacccgagga 1320
tacgttcaca tcctcgacaa ggacccctac cttcaccact tcgcctacga
ccctcagtac 1380
ttcctcaacg agctggacct gctcggtcag gctgccgcta ctcaactggc
ccgcaacatc 1440
tccaactccg gtgccatgca gacctacttc gctggggaga
ctatccccgg tgataacctc 1500
gcgtatgatg ccgatttgag cgcctggact gagtacatcc cgtaccactt
ccgtcctaac 1560
taccatggcg tgggtacttg ctccatgatg ccgaaggaga tgggcggtgt
tgttgataat 1620
gctgcccgtg tgtatggtgt gcagggactg cgtgtcattg atggttctat
tcctcctacg 1680
caaatgtcgt cccatgtcat gacggtgttc tatgccatgg cgctaaaaat
ttcggatgct 1740
atcttggaag attatgcttc
catgcagtga
1770
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<211> 589
<212> PRT
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<400> 3
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Leu Thr
1
5
10
15
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Ala Gly
20
25
30
Gly Gly Leu Thr Gly Leu Thr Thr Ala Ala Arg Leu Thr Glu
Asn Pro
35
40
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Asn Ile Ser Val Leu Val Ile Glu Ser Gly Ser Tyr Glu Ser
Asp Arg
50
55
60
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Gly Ser
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Lys Lys
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200
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Asn Thr
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Leu Leu
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230
235
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Tyr Val
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250
255
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Val Gly
260
265
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Ala Glu
275
280
285
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Ile Leu
290
295
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Gly Ile
305
310
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320
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Gln Thr
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330
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Thr Ala Thr Val Arg Ser Arg Ile Thr Ser Ala Gly Ala Gly
Gln Gly
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Gln Ala Ala Trp Phe Ala Thr Phe Asn Glu Thr Phe Gly Asp
Tyr Ser
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Ala Glu
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375
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Leu Ile
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Ala Tyr
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410
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Val Trp
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425
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Lys Asp
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Asn Glu
450
455
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Asn Ile
465
470
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480
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Ile Pro
485
490
495
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Glu Tyr
500
505
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Cys Ser
515
520
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Arg Val
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Pro Thr
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Leu Lys
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570
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Leu Thr
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Ala Gly
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Asn Pro
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Asp Arg
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55
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Gly Ser
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Asn Gln
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Leu Val
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Ser Trp
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Pro Ala
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Gln Ile
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Lys Lys
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200
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Asn Thr
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Leu Leu
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Tyr Val
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250
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Val Gly
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Ala Glu
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280
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Ile Leu
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Gly Ile
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310
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320
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Gln Thr
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Thr Ala Thr Val Arg Ser Arg Ile Thr Ser Ala Gly Ala Gly
Gln Gly
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Gln Ala Ala Trp Phe Ala Thr Phe Asn Glu Thr Phe Gly Asp
Tyr Ser
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Ala Glu
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Leu Ile
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Ala Tyr
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Val Trp
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Lys Asp
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Asn Glu
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Ile
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Ile Pro
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Glu Tyr
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Cys Ser
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Arg Val
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Pro Thr
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Leu Lys
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570
575
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580
585
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Leu Pro His Tyr Ile Arg Ser Asn Gly Ile Glu Ala Ser Leu
Leu Thr
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Ala Gly
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Gly Gly Leu Thr Gly Leu Thr Thr Ala Ala Arg Leu Thr Glu
Asn Pro
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Asn Ile Ser Val Leu Val Ile Glu Ser Gly Ser Tyr Glu Ser
Asp Arg
50
55
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Gly Pro Ile Ile Glu Gln Leu Asn Ala Tyr Gly Asp Ile Phe
Gly Ser
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Asn Gln
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Thr Ala Leu Ile Arg Ser Gly Asn Gly Leu Gly Gly Ser Thr
Leu Val
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Ser Trp
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Ala Ala
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Gln Ile
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Gly Thr
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Lys Lys
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200
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Asn Thr
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Leu Leu
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230
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240
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Tyr Val
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250
255
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Val Gly
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Ala Glu
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Ile Leu
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Gly Ile
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Gln Thr
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Thr Ala Thr Val Arg Ser Arg Ile Thr Ser Ala Gly Ala Gly
Gln Gly
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Gln Ala Ala Trp Phe Ala Thr Phe Asn Glu Thr Phe Gly Asp
Tyr Ser
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Ala Glu
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Leu Ile
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Ala Tyr
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Val Trp
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Asp
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Asn Glu
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Asn Ile
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Ile Pro
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Glu Tyr
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Arg Val
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Pro Thr
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Leu Lys
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570
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585
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<211> 589
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Leu Thr
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Ala Gly
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Asn Pro
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Asn Ile Ser Val Leu Val Ile Glu Ser Gly Ser Tyr Glu Ser
Asp Arg
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Gly Ser
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Asn Gln
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Leu Val
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Ser Trp
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Ala Ala
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Gln Ile
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Val
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Lys Lys
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200
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Leu Leu
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230
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Tyr Val
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Ile Leu
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Gly Ile
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Gln Gly
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Leu Ile
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Asn Ile
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Ile Pro
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Glu Tyr
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505
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Ser
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Arg Val
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Pro Thr
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Asp Arg
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Gly Ser
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Leu Val
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Leu Leu
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Val Gly
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Ile Leu
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Gly Ile
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Gln Thr
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Gln Gly
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Leu Ile
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Asn Ile
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Pro
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Glu Tyr
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Ile Pro Tyr His Phe Arg Pro Asn Tyr His Gly Val Gly Thr
Cys Ser
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Arg Val
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Pro Thr
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Leu Lys
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Ser Trp
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Pro Ala
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Gln Ile
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175
Val His Ala Gly Pro Arg Asp Thr Gly Asp Asp Tyr Ser Pro
Ile Val
180
185
190
Lys Ala Leu Met Ser Ala Val Glu Asp Arg Gly Val Pro Thr
Lys Lys
195
200
205
Asp Phe Gly Cys Gly Asp Pro His Gly Val Ser Met Phe Pro
Asn Thr
210
215
220
Leu His Glu Asp Gln Val Arg Ser Asp Ala Ala Arg Glu Trp
Leu Leu
225
230
235
240
Asp Asn Tyr Gln Arg Pro Asn Leu Gln Val Leu Thr Gly Gln
Tyr Val
245
250
255
Gly Lys Val Leu Leu Ser Gln Asn Gly Thr Thr Pro Arg Ala Val
Gly
260
265
270
Val Glu Phe Gly Thr His Lys Gly Asn Thr His Asn Val Tyr
Ala Glu
275
280
285
His Glu Val Leu Leu Ala Ala Gly Ser Ala Val Ser Pro Thr
Ile Leu
290
295
300
Glu Tyr Ser Gly Ile Gly Met Lys Ser Ile Leu Glu Pro Leu
Gly Ile
305
310
315
320
Asp Thr Val Val Asp Leu Pro Val Gly Leu Asn Leu Gln Asp
Gln Thr
325
330
335
Thr Ala Thr Val Arg Ser Arg Ile Thr Ser Ala Gly Ala Gly
Gln Gly
340
345
350
Gln Ala Ala Trp Phe Ala Ser Phe Asn Glu Thr Phe Gly Asp
Tyr Ser
355
360
365
Glu Lys Ala His Glu Leu Leu Asn Thr Lys Leu Glu Gln Trp
Ala Glu
370
375
380
Glu Ala Val Ala Arg Gly Gly Phe His Asn Thr Thr Ala Leu
Leu Ile
385
390
395
400
Gln Tyr Glu Asn Tyr Arg Asp Trp Ile Val Asn His Asn Val
Ala Tyr
405
410
415
Ser Glu Leu Phe Leu Asp Thr Ala Gly Val Ala Ser Phe Asp
Val Trp
420
425
430
Asp Leu Leu Pro Phe Thr Arg Gly Tyr Val His Ile Leu Asp
Lys Asp
435
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Pro Tyr Leu His His Phe Ala Tyr Asp Pro Gln Tyr Ile Leu
Asn Glu
450
455
460
Leu Asp Leu Leu Gly Gln Ala Ala Ala Thr Gln Leu Ala Arg
Asn Ile
465
470
475
480
Ser Asn Ser Gly Ala Met Gln Thr Tyr Phe Ala Gly Glu Thr
Ile Pro
485
490
495
Gly Asp Asn Leu Ala Tyr Asp Ala Asp Leu Ser Ala Trp Thr
Glu Tyr
500
505
510
Ile Pro Tyr His Phe Arg Pro Asn Tyr His Gly Val Gly Thr
Cys Ser
515
520
525
Met Met Pro Lys Glu Met Gly Gly Val Val Asp Asn Ala Ala
Arg Val
530
535
540
Tyr Gly Val Gln Gly Leu Arg Val Ile Asp Gly Ser Ile Pro
Pro Thr
545
550
555 560
Gln Met Ser Ser His Val Met Thr Val Phe Tyr Ala Met Ala
Leu Lys
565
570
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Ile Ser Asp Ala Ile Leu Glu Asp Tyr Ala Ser Met Gln
580
585
<210> 9
<211> 32
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 9
gcgcgaattc cgctgcggcc ctgccacact
ac
32
<210> 10
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<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 10
taaagcggcc gctcactgca tggaagcata atcttccaag
atagcatcc
49
Claims (10)
1.一种耐热的葡萄糖氧化酶突变体GOD-H-1，其特征在于：所述的葡萄糖氧化酶突变体GOD-H-1的氨基酸序列如SEQ ID NO：3所示，所述的突变体GOD-H-1由氨基酸序列为SEQ ID NO：1的葡萄糖氧化酶的第122位氨基酸由赖氨酸变为天冬酰胺、第492位氨基酸由甘氨酸变为谷氨酸获得。
2.权利要求1所述的葡萄糖氧化酶突变体GOD-H-1的葡萄糖氧化酶编码基因。
3.含有权利要求2所述的葡萄糖氧化酶编码基因的重组菌株。
4.一种耐热的葡萄糖氧化酶突变体GOD-H-3，其特征在于：所述的葡萄糖氧化酶突变体GOD-H-3的氨基酸序列如SEQ ID NO：5所示，所述的突变体GOD-H-3由氨基酸序列为SEQ ID NO：1的葡萄糖氧化酶的第70位氨基酸由天冬氨酸变为谷氨酸、第122位氨基酸由赖氨酸变为天冬酰胺、第492位氨基酸由甘氨酸变为谷氨酸获得。
5.权利要求4所述的葡萄糖氧化酶突变体GOD-H-3的葡萄糖氧化酶编码基因。
6.含有权利要求5所述的葡萄糖氧化酶编码基因的重组菌株。
7.一种耐热的葡萄糖氧化酶突变体GOD-H-4，其特征在于：所述的葡萄糖氧化酶突变体GOD-H-4的氨基酸序列如SEQ ID NO：6所示，所述的突变体GOD-H-4由氨基酸序列为SEQ ID NO：1的葡萄糖氧化酶的第122位氨基酸由赖氨酸变为天冬酰胺、第263位氨基酸由谷氨酰胺变为脯氨酸、第341位氨基酸由精氨酸变为丝氨酸、第492位氨基酸由甘氨酸变为谷氨酸获得。
8.权利要求7所述的葡萄糖氧化酶突变体GOD-H-4的葡萄糖氧化酶编码基因。
9.含有权利要求8所述的葡萄糖氧化酶编码基因的重组菌株。
10.葡萄糖氧化酶突变体GOD-H-1、GOD-H-3和GOD-H-4在用于制备动物饲料添加剂中的应用。
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