CN105936910B

CN105936910B - 一种优化的葡萄糖氧化酶基因god及其表达载体和应用

Info

Publication number: CN105936910B
Application number: CN201610525902.6A
Authority: CN
Inventors: 肖志壮; 张稳; 周莉芬; 杜彦龙
Original assignee: Qingdao Red Cherry Biotechnology Co Ltd
Current assignee: Qingdao Red Cherry Biotechnology Co Ltd
Priority date: 2016-07-06
Filing date: 2016-07-06
Publication date: 2019-11-26
Anticipated expiration: 2036-07-06
Also published as: CN105936910A

Abstract

本发明公开了一种优化的葡萄糖氧化酶基因GOD及其表达载体和应用，所述优化的葡萄糖氧化酶基因的核苷酸序列如SEQ ID NO：1所示。本发明以来源于黑曲霉的野生型葡萄糖氧化酶为基础，根据巴斯德毕赤酵母的密码子偏好性对其进行了优化，优化后的GOD基因与野生型葡萄糖氧化酶基因的相似性为75%。优化后的GOD基因在毕赤酵母中表达后，获得了77U/mL的表达酶活，与野生型基因相比，表达酶活明显提高。

Description

一种优化的葡萄糖氧化酶基因GOD及其表达载体和应用

技术领域

本发明属于基因工程领域，涉及一种优化的葡萄糖氧化酶基因及其表达载体和应用。

背景技术

葡萄糖氧化酶（glucose oxidase）是一种典型的氧化还原酶。它是一个分子量约160000道尔顿的蛋白质，有二个（或四个）多肽链构成，酶反应的最适pH 5-7，最适温度是30-40℃，催化时需要黄素腺嘌呤二核苷酸(FAD)作为辅酶参与作用。反应时葡萄糖先进行脱氢形成葡萄糖酸内酯，使FAD还原为还原型FAD，葡萄糖酸内酯进一步水解为葡萄糖酸。还原型FAD与空气中的氧反应形成过氧化氢。如果体系中存在过氧化物酶，过氧化氢则分解为水和氧。

葡萄糖氧化酶在工业生产中有诸多用途，在食品工业中，能够除氧保鲜，去葡萄糖，在饲料工业中，作为饲料添加剂，可以调节动物胃肠菌群平衡，增强机体免疫力，经过精制的葡萄糖氧化酶，可以用于医疗诊断, 如比色血糖试纸和基于生物传感器的血糖检测仪。葡萄糖氧化酶广泛存在于微生物中，工业上主要利用黑曲霉和青霉属菌株进行发酵生产。

发明内容

本发明的目的是提供了一个优化的葡萄糖氧化酶基因GOD及其表达载体应用，本发明对来源于黑曲霉（Aspergillus niger）的葡萄糖氧化酶的基因进行了密码子优化，与野生型基因相比，其在毕赤酵母中表达后获得的酶活有明显提高。

为达到以上目的，本发明采用的技术方案如下：

本发明提供了一种优化的葡萄糖氧化酶基因GOD，其核苷酸序列如SEQ ID NO：1所示。

本发明还提供了所述的葡萄糖氧化酶基因GOD产生的葡萄糖氧化酶，其具有序列表SEQ ID NO：2所示的氨基酸序列。

本发明还提供了含有所述的优化的葡萄糖氧化酶基因GOD的重组表达载体。

进一步的，所述重组表达载体为重组酵母表达质粒pPIC9K-GOD。

本发明还提供了含有所述的重组表达载体的重组菌株。

进一步的，所述重组菌株为重组毕赤酵母。

进一步的，所述重组毕赤酵母为重组毕赤酵母GS115。

本发明还提供了所述的优化的葡萄糖氧化酶基因GOD在用于生产葡萄糖氧化酶中的应用。

进一步的，将所述的优化的葡萄糖氧化酶基因GOD与表达载体连接构建重组表达载体，将重组表达载体转化到宿主细胞中，获得重组宿主菌株，培养重组宿主菌株并诱导重组葡萄糖氧化酶的表达，获得葡萄糖氧化酶。

本发明还提供了所述的葡萄糖氧化酶在用于制备动物饲料添加剂中的应用。

与现有技术相比，本发明的优点和技术效果是：本发明按照巴斯德毕赤酵母的（Pichia pastoris）的密码子偏好性及基因二级结构优化对野生型GOD基因进行优化，优化后的GOD基因序列与野生型序列同源性为75%。其编码的蛋白质共605个氨基酸，氨基酸序列如SEQ ID NO：2所示。

本发明构建的含有经密码子优化的葡萄糖氧化酶基因的毕赤酵母工程菌能高效表达黑曲霉的葡萄糖氧化酶基因，摇瓶发酵酶活达到77 U/ml。与含有野生型基因的工程菌相比，酶活提高了79%。本发明提供的此优化的葡萄糖氧化酶基因以及产生的葡萄糖氧化酶具有良好的市场应用前景和工业价值。

附图说明

图1为野生型GOD基因与本发明优化的GOD基因序列比对图，其中图1-1到图1-6合起来为完整的序列比对图；

图2为野生型GOD基因和本发明优化的GOD基因在毕赤酵母中的表达情况比较。

具体实施方式

下面结合附图和具体实施例对本发明的技术方案做进一步详细的说明，实施例中未注明具体条件的实验方法，通常可按常规条件，如J.萨姆布鲁克（Sambrook）等编写的《分子克隆实验指南》中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件运行。本领域相关的技术人员可以借助实施例更好地理解和掌握本发明。但是，本发明的保护和权利要求范围不限于所提供的案例。

实施例1：葡萄糖氧化酶GOD基因的密码子优化

根据NCBI数据库中的野生葡萄糖氧化酶基因序列（Genbank ID KJ774107.1）进行密码子优化。在对野生葡萄糖氧化酶基因序列优化的过程中，从密码子的优化指标中选取以下几点进行控制：

1.密码子使用偏好。根据Pichia pastoris的密码子使用频率分布表，替换相应密码子，调整密码子适应指数（CAI）和最优密码子使用频率(FOP)。

2.控制GC含量，防止出现容易导致提前终止的高AT序列。

3.减少序列转录的mRNA二级结构中的稳定结构。

4.避免过多的重复序列。

5.避开密码子优化过程中产生的载体携带的限制性内切酶位点。

如图1所示，优化获得的葡萄糖氧化酶基因GOD，其核苷酸序列如SEQ ID NO：1所示，序列由上海捷瑞生物工程有限公司合成，并构建在其提供的pGHn质粒上，为了适合在pPIC9K中表达，合成的基因已将野生基因携带的信号肽去除，并在序列两端引入EcoR I/Not I酶切位点。产生的氨基酸序列如SEQ ID NO：2所示。

实施例2：毕赤酵母工程菌Pichia pastoris pPIC9K-GOD的构建

2.1 表达载体的构建

将合成的得到的葡萄糖氧化酶基因GOD片段（SEQ ID NO：1），用快速限制性内切酶EcoR I、Not I进行双酶切，100uL酶切体系为：PCR产物 30uL，10×buffer 10 uL，EcoR I 3uL，Not I 3 uL，ddH₂O 54 uL。37℃酶切2h后，琼脂糖凝胶电泳回收片段。

将表达载体pPIC9k用限制性内切酶EcoR I、Not I进行双酶切，100uL酶切体系为：载体30 uL，10×buffer 10 uL，EcoR I 3 uL，Not I 3 uL，ddH₂O 54uL。37℃酶切2h后，琼脂糖胶电泳回收片段。

将经限制性内切酶EcoR I和Not I双酶切的GOD片段和pPIC9k载体相连接构建表达载体pPIC9K-GOD。10uL连接体系为：GOD片段为2uL，pPIC9k载体为6uL，10×T4 DNAligase buffer1uL，T4 DNA ligase 1uL。22℃过夜连接，转化大肠杆菌DH5α，涂布含氨苄青霉素终浓度100ug/mL的LB平板，37℃过夜培养。挑取转化子测序验证，测序验证正确的转化子转接到LB液体培养基中，37℃过夜培养，提质粒，即为重组酵母表达质粒pPIC9K-GOD。

2.2 毕赤酵母工程菌的构建及验证

将重组质粒pPIC9K-GOD用SalI进行线性化，线性化片段用片段纯化试剂盒(TaKaRa MiniBEST DNA Fragment Purifibation Kit)纯化后，通过电转化方法转化毕赤酵母GS115，涂布MD平板。在MD平板上生长出的菌落即为毕赤酵母工程菌株。

挑取单个阳性转化子转接于BMGY培养基中，30℃，220rpm振荡培养18h后，离心获得菌体，将适量菌体转入BMMY培养基中，使菌体浓度达到OD600的数值等于1，30℃，220rpm振荡培养，每24h添加培养体积1%的甲醇。诱导表达4d后，将培养液离心获得上清，将上清液进行葡萄糖氧化酶活力测定。

酶活力检测方法：

取邻联茴香胺缓冲液2.5mL(0.1mL1%邻联茴香胺甲醇储备液加入到12mL 0.1MpH6.0磷酸缓冲液配成)，18%葡萄糖溶液0.3mL，0.03%过氧化物酶溶液0.1mL，加入到比色管中37℃保温5 min，再加入0.1 mL葡萄糖氧化酶酶液（空白管加入0.1mL蒸馏水），反应3min后，加入2M硫酸2mL，混匀以终止反应。以标准空白样为空白对照，在540 nm波长处测定空白（A₀）和试样溶液（A₁）的吸光值。得出ΔA= A₁- A₀

试样酶活力计算：

X=（ΔA×n×3）/(11.3×t×0.1)

T—测定时间，min

0.1—样品体积，mL

11.3—消光系数

N—稀释倍数

3—反应液体积，mL。

如图2所示，结果显示，摇瓶水平下工程菌中葡萄糖氧化酶的表达量能够达到77U/mL，与野生型葡萄糖氧化酶基因在毕赤酵母GS115中表达获得的转化子（酶活最高达到43U/Ml）相比，表达酶活明显提高，从而证明该菌株能够高效的表达重组葡萄糖氧化酶。

实施例3：葡萄糖氧化酶的养殖应用实验

3.1实验设计

实验过程选择体况相似、健康无病的罗斯308肉雏鸡160000只，分为对照组和实验组，每组80000只，每组设置4个重复，每个重复20000只鸡，1、3、5、7栋鸡舍为实验组，2、4、6、8栋鸡舍为对照组，其中实验组在日粮中添加本发明提供的葡萄糖氧化酶，饲养期40天，具体分组见表1。

表1：实验分组设计

处理组	日粮
		1舍	基础日粮+0.2%葡萄糖氧化酶
2舍	基础日粮
		3舍	基础日粮+0.2%葡萄糖氧化酶
4舍	基础日粮
		5舍	基础日粮+0.2%葡萄糖氧化酶
6舍	基础日粮
		7舍	基础日粮+0.2%葡萄糖氧化酶
8舍	基础日粮

3.2生产性能的测定

实验开始第1天和第21、40天清晨对各组鸡空腹称重，记录初始重和末重。饲养过程中，观察记录各组鸡的健康状况（采食、饮水、精神状态等），并详细记录每周每笼采食量，统计实验期内的平均日增重、平均日采食量和料重比。平均日采食量(g/d)=实验期每组采食量/实验天数·每组鸡数；平均日增重(g/d)=实验期每组增重/(实验天数·每组鸡数)；料重比=饲料消耗量/增重。

3.3 数据统计与分析

实验数据采用SPSS17.0统计软件进行ANOVA分析，并进行Duncan多重性比较，P<0.05为差异显著。数据以平均值±标准差（Mean±SE）表示。

3.4实验结果与分析

3.4.1平均日增重

肉鸡各阶段平均日增重见表2，对照组和实验组的肉鸡各阶段日增重差异均不显著（P>0.05）。但在1-40日龄整个饲养周期，实验组仍具有提高肉鸡日增重的趋势，可提高平均日增重3.90%。

表2：肉鸡各阶段平均日增重（克）

处理	1-21日龄	22-40日龄	1-40日龄
				对照组	45.32±1.11	85.61±2.20	65.08±0.59
实验组	45.41±0.48	91.05±3.95	67.62±1.49

3.4.2平均日采食量

肉鸡各阶段平均日采食量见表3，在整养殖过程，实验组与对照组肉鸡日采食量差异不显著（P>0.05），且对照组和实验组日采食量基本一致。

表3：肉鸡各阶段平均日采食量（克）

处理	1-21日龄	22-40日龄	1-40日龄
				对照组	67.76±2.02	148.53±1.40	106.29±0.23
实验组	66.86±0.79	151.24±3.87	106.88±0.44

3.4.3料重比

肉鸡各阶段料重比见表4，在1-21日龄和22-40日龄实验组较之对照组都有不同程度的改善，分别降低了2.74%和4.05%。从全期（1-40日龄）来看，实验组FCR较对照组降低了3.98%（P>0.05）。

表4：肉鸡各阶段料肉比（FCR）

处理	1-21日龄	22-40日龄	1-40日龄
				对照组	1.46±0.056	1.73±0.028	1.635±0.007
实验组	1.42±0.007	1.66±0.028	1.57±0.014

从以上实验结果可以看出，添加了葡萄糖氧化酶的实验组与对照组相比，在采食量一致的情况下，平均日增重有所增加，而料重比有所下降，在日粮中添加葡萄糖氧化酶的情况下，可以有效提高饲料转化率，增加养殖效益。

本实施例3为了便于体现本发明所述的葡萄糖氧化酶的应用，并不限于肉鸡的应用，因为所述的葡萄糖氧化酶可以添加到基础日粮中，可以用于其他畜禽类的饲喂。通常可以在猪、兔和奶牛等养殖过程中在其配合饲料中添加。

以上实施例仅用以说明本发明的技术方案，而非对其进行限制；尽管参照前述实施例对本发明进行了详细的说明，对于本领域的普通技术人员来说，依然可以对前述实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分技术特征进行等同替换；而这些修改或替换，并不使相应技术方案的本质脱离本发明所要求保护的技术方案的精神和范围。

SEQUENCE LISTING

<110> 青岛红樱桃生物技术有限公司

<120> 一种优化的葡萄糖氧化酶基因GOD及其表达载体和应用

<130>

<160> 2

<170> PatentIn version 3.3

<210> 1

<211> 1770

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 1

ttgccacatt acattagatc caacggtatt gaagcatcct tgttgactga tcctaaggat 60

gtttcaggta gaactgttga ttacattatt gctggaggtg gattgactgg tttgactact 120

gctgctagat tgactgaaaa cccaaacatt tcagttttgg ttattgaatc aggttcttac 180

gaatccgata gaggtcctat tattgaagat ttgaacgctt acggggacat ttttggttct 240

tccgttgatc atgcttacga aactgttgaa ttggctacta acaaccaaac tgctttgatt 300

agatccggta acggattggg tggttccact ttggttaacg gaggtacttg gactagacct 360

cataaggctc aagttgattc ctgggaaact gtttttggta acgaaggatg gaactgggat 420

aacgttgctg cttactcctt gcaagctgaa cgagcgcggg cccctaacgc taagcaaatt 480

gctgctggtc attactttaa cgcttcctgt catggaacta acggaactgt tcatgctggt 540

ccaagagata ctggagacga ttactcccca attgttaagg ctttgatgtc cgctgttgaa 600

gataggggtg ttccaactaa gaaggatttt ggatgtggcg acccacatgg agtttctatg 660

tttccaaaca ctttgcatga agatcaagtt agatccgatg ctgctagaga atggttgttg 720

cctaactacc aaagacctaa cttgcaagtt ttgactggtc aatacgttgg taaagttttg 780

ttgtcacaaa acggaactac tcctagagct gttggagttg aatttggtac tcataagggt 840

aacactcata acgtttacgc tgaacatgaa gttttgttgg ctgctggttc cgctgtttca 900

ccaactattt tggaatactc cggtattggt atgaagtcta ttttggaacc attgggtatt 960

gatactgttg ttgatttgcc agttggattg aacttgcaag atcaaactac tgctactgtt 1020

agatccagaa ttacttccgc tggagctgga caaggacaag ctgcttggtt tgctactttt 1080

aacgaaactt ttggagatta ctccgaaaag gctcatgaat tgttgaacac taagttggaa 1140

caatgggctg aagaagctgt tgctagaggt ggttttcata acactactgc tttgttgatt 1200

caatacgaaa actacagaga ttggattgtt aaccataacg ttgcttactc agaattgttt 1260

ttggatactg ctggagttgc ttcctttgat gtttgggatt tgttgccctt cactagagga 1320

tacgttcata ttttggataa agacccatac ttgcatcatt ttgcttacga tccacaatac 1380

tttttgaacg aattggattt gttgggacaa gctgctgcta ctcaattggc tagaaacatt 1440

tctaactcgg gtgctatgca aacttacttt gctggagaaa ctattccagg tgacaacttg 1500

gcttacgatg ctgatttgtc cgcttggact gaatacattc cataccattt tagacctaac 1560

taccacggag ttggtacttg ttctatgatg ccaaaggaaa tgggaggtgt tgttgataac 1620

gctgctagag tttacggagt tcaaggattg agagttattg atggttcaat tccaccaact 1680

caaatgtctt cacatgttat gactgtgttt tacgctatgg ctttgaagat ttcagatgct 1740

attttggaag attacgcttc tatgcaataa 1770

<210> 2

<211> 589

<212> PRT

<213> 人工序列

<400> 2

Leu Pro His Tyr Ile Arg Ser Asn Gly Ile Glu Ala Ser Leu Leu Thr

1 5 10 15

Asp Pro Lys Asp Val Ser Gly Arg Thr Val Asp Tyr Ile Ile Ala Gly

20 25 30

Gly Gly Leu Thr Gly Leu Thr Thr Ala Ala Arg Leu Thr Glu Asn Pro

35 40 45

Asn Ile Ser Val Leu Val Ile Glu Ser Gly Ser Tyr Glu Ser Asp Arg

50 55 60

Gly Pro Ile Ile Glu Asp Leu Asn Ala Tyr Gly Asp Ile Phe Gly Ser

65 70 75 80

Ser Val Asp His Ala Tyr Glu Thr Val Glu Leu Ala Thr Asn Asn Gln

85 90 95

Thr Ala Leu Ile Arg Ser Gly Asn Gly Leu Gly Gly Ser Thr Leu Val

100 105 110

Asn Gly Gly Thr Trp Thr Arg Pro His Lys Ala Gln Val Asp Ser Trp

115 120 125

Glu Thr Val Phe Gly Asn Glu Gly Trp Asn Trp Asp Asn Val Ala Ala

130 135 140

Tyr Ser Leu Gln Ala Glu Arg Ala Arg Ala Pro Asn Ala Lys Gln Ile

145 150 155 160

Ala Ala Gly His Tyr Phe Asn Ala Ser Cys His Gly Thr Asn Gly Thr

165 170 175

Val His Ala Gly Pro Arg Asp Thr Gly Asp Asp Tyr Ser Pro Ile Val

180 185 190

Lys Ala Leu Met Ser Ala Val Glu Asp Arg Gly Val Pro Thr Lys Lys

195 200 205

Asp Phe Gly Cys Gly Asp Pro His Gly Val Ser Met Phe Pro Asn Thr

210 215 220

Leu His Glu Asp Gln Val Arg Ser Asp Ala Ala Arg Glu Trp Leu Leu

225 230 235 240

Pro Asn Tyr Gln Arg Pro Asn Leu Gln Val Leu Thr Gly Gln Tyr Val

245 250 255

Gly Lys Val Leu Leu Ser Gln Asn Gly Thr Thr Pro Arg Ala Val Gly

260 265 270

Val Glu Phe Gly Thr His Lys Gly Asn Thr His Asn Val Tyr Ala Glu

275 280 285

His Glu Val Leu Leu Ala Ala Gly Ser Ala Val Ser Pro Thr Ile Leu

290 295 300

Glu Tyr Ser Gly Ile Gly Met Lys Ser Ile Leu Glu Pro Leu Gly Ile

305 310 315 320

Asp Thr Val Val Asp Leu Pro Val Gly Leu Asn Leu Gln Asp Gln Thr

325 330 335

Thr Ala Thr Val Arg Ser Arg Ile Thr Ser Ala Gly Ala Gly Gln Gly

340 345 350

Gln Ala Ala Trp Phe Ala Thr Phe Asn Glu Thr Phe Gly Asp Tyr Ser

355 360 365

Glu Lys Ala His Glu Leu Leu Asn Thr Lys Leu Glu Gln Trp Ala Glu

370 375 380

Glu Ala Val Ala Arg Gly Gly Phe His Asn Thr Thr Ala Leu Leu Ile

385 390 395 400

Gln Tyr Glu Asn Tyr Arg Asp Trp Ile Val Asn His Asn Val Ala Tyr

405 410 415

Ser Glu Leu Phe Leu Asp Thr Ala Gly Val Ala Ser Phe Asp Val Trp

420 425 430

Asp Leu Leu Pro Phe Thr Arg Gly Tyr Val His Ile Leu Asp Lys Asp

435 440 445

Pro Tyr Leu His His Phe Ala Tyr Asp Pro Gln Tyr Phe Leu Asn Glu

450 455 460

Leu Asp Leu Leu Gly Gln Ala Ala Ala Thr Gln Leu Ala Arg Asn Ile

465 470 475 480

Ser Asn Ser Gly Ala Met Gln Thr Tyr Phe Ala Gly Glu Thr Ile Pro

485 490 495

Gly Asp Asn Leu Ala Tyr Asp Ala Asp Leu Ser Ala Trp Thr Glu Tyr

500 505 510

Ile Pro Tyr His Phe Arg Pro Asn Tyr His Gly Val Gly Thr Cys Ser

515 520 525

Met Met Pro Lys Glu Met Gly Gly Val Val Asp Asn Ala Ala Arg Val

530 535 540

Tyr Gly Val Gln Gly Leu Arg Val Ile Asp Gly Ser Ile Pro Pro Thr

545 550 555 560

Gln Met Ser Ser His Val Met Thr Val Phe Tyr Ala Met Ala Leu Lys

565 570 575

Ile Ser Asp Ala Ile Leu Glu Asp Tyr Ala Ser Met Gln

580 585

Claims

1.一种优化的葡萄糖氧化酶基因GOD，其特征在于其核苷酸序列如SEQ ID NO：1所示。

2.权利要求1所述的葡萄糖氧化酶基因GOD产生的葡萄糖氧化酶，其特征在于其具有序列表SEQ ID NO：2所示的氨基酸序列。

3.含有权利要求1所述的优化的葡萄糖氧化酶基因GOD的重组表达载体，其特征在于所述优化的葡萄糖氧化酶基因GOD的重组表达载体为重组酵母表达质粒pPIC9K-GOD。

4.含有权利要求3所述的重组表达载体的重组菌株，所述重组菌株为重组毕赤酵母。

5.根据权利要求4所述的重组菌株，其特征在于所述重组毕赤酵母为重组毕赤酵母GS115。

6.权利要求1所述的优化的葡萄糖氧化酶基因GOD在用于生产葡萄糖氧化酶中的应用，其特征在于将所述的优化的葡萄糖氧化酶基因GOD与表达载体连接构建重组表达载体，将重组表达载体转化到宿主细胞中，获得重组宿主菌株，培养重组宿主菌株并诱导重组葡萄糖氧化酶的表达，获得葡萄糖氧化酶。

7.权利要求2所述的葡萄糖氧化酶在用于制备动物饲料添加剂中的应用。