CN112760299A

CN112760299A - 热稳定性提高的葡萄糖氧化酶突变体及其编码基因和应用

Info

Publication number: CN112760299A
Application number: CN202110175757.4A
Authority: CN
Inventors: 吴丹; 郑璞; 陈鹏程; 周寒蕾
Original assignee: Jiangnan University
Current assignee: Jiangnan University
Priority date: 2021-02-06
Filing date: 2021-02-06
Publication date: 2021-05-07
Anticipated expiration: 2041-02-06
Also published as: CN112760299B

Abstract

本发明公开了热稳定性提高的葡萄糖氧化酶突变体及其编码基因和应用，属于基因工程和酶工程技术领域。本发明以来源于黑曲霉(Aspergillus niger)的葡萄糖氧化酶GOD作为母本，经多位点定点突变后得到热稳定性提高的葡萄糖氧化酶GODm。与野生型GOD在75℃下处理5min后失活相比，本发明中的突变体仍然有52.37％的酶活残余，比酶活达到534.93U/mg月是野生型GOD的2倍。本发明的突变体酶GODm热稳定性具有明显优势，有利于运输与保存，大大拓宽该酶在高温下的应用潜力。

Description

热稳定性提高的葡萄糖氧化酶突变体及其编码基因和应用

技术领域

本发明涉及热稳定性提高的葡萄糖氧化酶突变体及其编码基因和应用，属于基因工程和酶工程技术领域。

背景技术

葡萄糖氧化酶(Glucose Oxidase，GOD)的系统命名为β-D-葡萄糖：氧化还原酶(EC1.1.3.4)。GOD是一类含有黄素腺嘌呤二核苷酸(flavine adenine dinucleotide，FAD)的二聚体蛋白酶。多种动植物、细菌和真菌都能够产生GOD，目前生产GOD的主要来源是曲霉属中的黑曲霉和青霉属。GOD是许多领域中的主要酶制剂之一，在食品饮料、饲料、医药化工等行业得到广泛的应用。食品工业中，GOD能除去脱水制品中残留的葡萄糖，避免因其与氨基化合物发生美拉德反应从而降低产品品质；GOD也可与过氧化氢酶(Catalase)结合，去除氧气来稳定食品的色泽及风味；由于其催化的反应具有消耗氧气并能产酸的特性，GOD也能增加酸奶中益生菌总量，防止食品腐败。在畜牧养殖中，由于饲料耐药性和药物残留等问题，抗生素替代品的开发已经成为近年来的研究热点。大量研究表明，饲料中添加GOD能够降低胃肠道pH，提高不同畜禽的消化酶活性和营养物质的消化率；GOD可以改善肠道形态结构；GOD能够消耗氧气创造利于有益厌氧菌生存的环境，产生H₂O₂从而抑制肠道病原菌并维持肠道微生态平衡，缓解氧化应激。在医药工业，GOD是制备血糖检测试剂盒的关键成分。由于在食品、饲料加工过程中较高的温度会使得葡萄糖氧化酶失活，因而提高葡萄糖氧化酶的热稳定性是目前亟待解决的问题。

发明内容

技术问题：本发明主要解决的技术问题是提高葡萄糖氧化酶在应用中的热稳定性，使其能在食品和饲料领域中有广泛应用。

技术方案：为解决上述技术问题，本发明采用以下技术方案予以实现：

本发明的第一个目的是提供一种葡萄糖氧化酶突变体GODm，所述突变体含有SEQID NO:2所示的氨基酸序列。

在一种实施方式中，所述葡萄糖氧化酶突变体GODm是由氨基酸序列为SEQ ID NO:1的野生型葡萄糖氧化酶的第30位氨基酸由T突变为V、第70位氨基酸由D突变为K、第162位氨基酸由A突变为T、第315位由D突变为K。

本发明的第二个目的是提供编码所述葡萄糖氧化酶突变体的基因，所述基因的核苷酸序列为SEQ ID NO:3。

本发明的第三个目的是提供表达所述葡萄糖氧化酶突变体或含有SEQ ID NO:3所述基因的载体。

本发明的第四个目的是提供含有所述葡萄糖氧化酶突变体或载体的基因工程菌。

在一种实施方式中，所述基因工程菌以毕赤酵母为宿主。

在一种实施方式中，所述基因工程菌是以pPIC9K为表达载体。

在一个实施方式中，所述宿主毕赤酵母是GS115。

本发明的第五个目的是提供所述基因工程菌的构建方法。

在一种实施方式中，所述方法为：1)将SEQ ID NO:4所示基因序列插入到表达载体pUC57中，获得重组表达载体pUC57-opanGOD；2)以重组表达载体pUC57-opanGOD进行四轮单点突变，获得突变质粒pUC57-GODm；3)以突变质粒pUC57-GODm为模板，设计引物，PCR扩增获得基因序列如SEQ ID NO:3所示的目的片段并连接到表达载体pPIC9K，获得重组表达载体pPIC9K-GODm。

在一种实施方式中，用限制性内切酶SacⅠ线性化重组表达载体pPIC9K-GODm，电转到毕赤酵母Pichiapastoris GS115中，并涂布在MD-G418抗性平板上28-30℃培养约24-48h。然后挑取菌落转移至分别含有2.0、2.5、3.5mg/mLG418的YPD-G418抗性平板上，30℃培养24h进行梯度筛选。筛选正确的转化子，经摇瓶发酵筛选获得重组酶活性高的菌株。将获得重组酶活性高的菌株分别置于55℃保温10min、65℃保温10min、75℃保温5min，筛选热稳定性高的菌株，为Pichiapastoris GS115/pPIC9K-GODm。

本发明第六个目的是提供一种提高葡萄糖氧化酶热稳定性的方法，所述方法为将氨基酸序列为SEQ ID NO:1的葡萄糖氧化酶的第30位的苏氨酸突变为缬氨酸、第70位的天冬氨酸突变为赖氨酸、第162位的丙氨酸突变为苏氨酸、第315位的天冬氨酸突变为赖氨酸。

本发明第七个目的是提供所述的突变体或所述的基因工程菌在食品饮料、饲料、医药化工领域的应用。

附图说明

图1重组表达载体pPIC9K-GODm质粒图谱。

图2突变体酶GODm纯化后的SDS-PAGE图(图中M:marker；1:野生型；2:GODm)。

具体实施方式

本发明具体实施例所使用的实验材料和试剂如下：

菌株与载体：大肠杆菌JM109、毕赤酵母GS115、载体pPIC9K、载体pUC57。

主要试剂：实验中所用的葡萄糖氧化酶标准品购自Solarbio公司，PrimeSTAR MaxDNA Polymerase，Premix Taq(TAKARA Taq Version 2.0plus dye)，限制性内切酶Dpn I购自TAKARA公司，ClonExpress II One Step Cloning Kit购自Vazyme公司，核酸电泳marker，蛋白电泳marker，PCR产物纯化试剂盒，胶回收试剂盒，质粒提取试剂盒，卡那霉素、遗传霉素购自上海生物工程有限公司，引物合成及测序均由天霖有限公司完成，其他常规试剂为国产分析纯。

培养基配方：

LB：10g/L胰蛋白胨，5g/L酵母粉，10g/LNaCl。

YPD：10g/L酵母膏，20g/L蛋白胨，10g/L葡萄糖。

MD-G418：葡萄糖20g/L，YNB 13.4g/L，生物素0.4mg/L，琼脂粉20g/L。添加遗传霉素1.5mg/mL，用于阳性转化子初筛。

YPD-G418：10g/L酵母膏，20g/L蛋白胨，10g/L葡萄糖，分别添加2.0、2.5、3.5mg/mLG418，用于筛选高拷贝阳性转化子。

显色筛选培养基：下层：10g/L酵母膏，20g/L蛋白胨，20g/L琼脂，1％甲醇；上层：磷酸盐缓冲液(pH 6.0)，90U/mL辣根过氧化物酶，18％葡萄糖溶液，20g/L琼脂。

BMGY：10g/L酵母膏，20g/L蛋白胨，10g/L甘油，0.1mmol/L磷酸缓冲液(pH 6.0)，13.4g/LYNB，0.4mg/L生物素。

BMMY：10g/L酵母膏，20g/L蛋白胨，10g/L甲醇，0.1mmol/L磷酸缓冲液(pH 6.0)，13.4g/LYNB，0.4mg/L生物素。

葡萄糖氧化酶活性测定采用邻联茴香胺分光光度法。在葡萄糖氧化酶的作用下，葡萄糖和氧反应，生成葡萄糖酸和过氧化氢，过氧化氢和无色的还原型邻联茴香胺在过氧化物酶的作用下，生成水和红色的氧化型邻联茴香胺。在540nm下测定反应液吸光值，使用葡萄糖氧化酶标准品作标准曲线，再依据标准曲线计算葡萄糖氧化酶的酶活。

实施例1：构建突变质粒pUC57-GODm

1)构建重组质粒pUC57-opanGOD

根据NCBI公开的黑曲霉(Aspergillus niger)中葡萄糖氧化酶GOD的cDNA序列(SEQ ID NO:4)，送至天霖有限公司进行合成重组质粒。载体为pUC57，重组质粒命名为pUC57-opanGOD。

2)构建突变质粒

设计定点突变的突变引物，以携带葡萄糖氧化酶GOD基因的载体pUC57-opanGOD为模板进行四轮单点突变，构建突变质粒pUC57-GODm。每轮突变经PCR及模板消化反应两个步骤，测序验证结果正确后进行下一轮突变。突变后的目的片段葡萄糖氧化酶GODm核苷酸序列如SEQ ID NO:3所示。

表1 突变引物表

PCR反应体系如下：

表2 突变PCR反应体系

PCR反应条件为：98℃预变性5min，98℃变性10s，55℃退火5s和72℃延伸90s，共30个循环。

用限制性内切酶Dpn I消化后，回收目的基因片段。

模板消化反应体系如下：

表3 模板消化反应体系

反应条件：37℃，反应90min。

将目的片段回收后，转化大肠杆菌JM109获得转化子，将转化子涂布于氨苄抗性平板，37℃静置培养10-12h，待长出菌落后提质粒。将重组质粒送天霖有限公司用通用引物M13F(-77)和M13R(-88)测通。得到正确的突变质粒pUC57-GODm。

实施例2：毕赤酵母基因工程菌株构建及高通量筛选

1)构建重组质粒pPIC9K-GODm

以实施例1中测序成功的突变质粒pUC57-GODm为模板，设计引物T-F1：AGAGAGGCTGAAGCTAGTAATGGAATCGAAGCTAGTCTG，T-R1：GGGAATTCTACGTTATTGCATGGATGCGTAGTCTTC，PCR扩增获得目的片段葡萄糖氧化酶GODm；以pPIC9K为模板，设计引物Z-F:TAACGTAGAATTCCCTAGGGCGG，Z-R:AGCTTCAGCCTCTCTCTTTTCC，PCR扩增获得目的载体pPIC9K，用一步克隆试剂盒连接起来并转化大肠杆菌JM109，涂布Kana抗性平板，提质粒后进行测序，获得重组表达载体pPIC9K-GODm。质粒图谱如图1所示。

2)构建毕赤酵母基因工程菌株Pichia pastoris GS115/pPIC9K-GODm

将测序正确的载体pPIC9K-GODm用限制性内切酶Sac I线性化后，参考毕赤酵母表达实验手册电击转化毕赤酵母P.pastoris GS115，涂布MD-G418抗性平板，30℃培养36h直至转化子出现。阳性转化子筛选：挑取转化子，点种到分别添加2.0、2.5、3.5mg/mLG418的YPD-G418抗性平板上，30℃培养24h进行梯度筛选。

3)高通量筛选重组菌株

挑取饱满、形态较好的菌落点种至显色筛选培养基筛选高产葡萄糖氧化酶的重组菌株，先在下层平板上28℃培养36h，再在55℃静置培养10min，最后倒入上层培养基在28℃放置2h后观察显色圈。将显色圈呈深棕色且直径大于1cm的酵母单菌落分别接种于30mL液体生长培养基YPD中进行摇瓶发酵。置于摇床中，培养温度为30℃，转速为220r/min，培养24h后离心收集全部菌体。使用5mLBMMY培养基重悬菌体并全部转入25mL液体诱导培养基BMMY中，置于30℃、220r/min摇床培养96h，每24小时补加体积分数1％的甲醇，诱导产酶。结束发酵后，离心取发酵液测定酶活及蛋白含量。

4)重组菌株热稳定性的筛选

再以表达野生型为对照菌株进行热稳定性的筛选。筛选方法：将野生型及实施例2中步骤3)筛选到的三个突变菌株的发酵粗酶液分别置于55℃保温10min、65℃保温10min、75℃保温5min后测定其酶活，与未经处理的发酵液比较，计算残余酶活率。三个突变体与野生型GOD的热稳定性对比如下表。筛选得到在75℃残余酶活率最高为52.37％的葡萄糖氧化酶突变体。

表4 重组菌株的热稳定性

实施例3突变体酶的纯化与酶学性质测定

1)摇瓶发酵生产葡萄糖氧化酶

挑取实施例2筛选得到的热稳定最高的基因工程菌Pichiapastoris GS115/pPIC9K-GODm单菌落接种于30mLYPD液体培养基中进行摇瓶发酵。置于30℃，转速为220r/min，培养24h获得种子液。将种子液离心并收集全部菌体。使用5mL重悬菌体并全部转入25mL液体诱导培养基BMMY中，置于30℃、220r/min摇床培养96h，每24小时补加体积分数1％的甲醇，诱导产酶。

2)突变体酶的纯化

将发酵液于4℃下，8000r/min离心10min，收集发酵上清液，使用20mmol/L的NaH₂PO₄-Na₂HPO₄(pH 6.5)缓冲液、10kDa的超滤膜包对粗酶液进行脱盐。收集透析后的发酵液，4℃、12000r/min离心30min，收集上清液。蛋白质的纯化采用Hitrap^TM Q FP(5mL)阴离子交换层析柱。使用AKTA蛋白纯化仪进行蛋白分离纯化，柱纯化条件如下：用10倍柱体积的缓冲液A(20mmol/L NaH₂PO₄-Na₂HPO₄缓冲液，pH 6.5)平衡阴离子柱，并以1mL/min的流速进样；等待进样结束后，使用5个柱体积的缓冲液A冲平柱子；并以0-100％的缓冲液B(20mmol/LNaH₂PO₄-Na₂HPO₄+1mol/LNaCl缓冲液，pH 6.5)以1mL/min的流速进行线性洗脱。收集洗脱峰中的样品，经过酶活测定，确定目的样品所在的收集管，得到电泳纯的目标蛋白质。结果如图2所示。

3)突变体酶的性质研究

经纯化后测定葡萄糖氧化酶的比酶活，野生型GOD的比酶活为254.47U/mg，突变体GODm的比酶活为534.93U/mg。突变体GODm的比酶活是野生型的2.1倍。

将纯化后的重组GOD稀释至50μg/mL，分别在55℃、65℃下保温0-180min，然后在标准条件下测定各保温时长下样品的酶活力，以保温0min样品酶活力计为100％，计算半衰期(t1/2)。结果如表5所示，野生型在60℃半衰期为1.4min，突变体在60℃半衰期为6.1min，突变体较野生型提高了4.4倍。

突变体酶GODm的K_cat/K_m值是野生型GOD的2.4倍，显著提高了催化效率。

表5 酶学性质研究

实施例4葡萄糖氧化酶突变体在鸡饲料中的应用

将GODm制成10000U/g酶粉，按照100g/t添加进所有原料混合后调质制粒，通过制粒机加工生产成颗粒饲料，加工条件是制粒温度75℃、调质时间30s、制粒机环模模孔直径3mm、长径比10:1。通过添加GODm的鸡饲料喂养雏鸡发现可以有效改善动物肠道健康和消化能力，提高动物对饲料营养物质消化和吸收，促进动物生长。

对比例1：

取实施例1中构建成功的其他突变体与最终筛选得到的GODm进行比较，实施方式同实施例2所述。结果如下表所示，与野生酶相比，其他突变体在75℃孵育5min酶活最高残留43.20％，而四点突变体GODm在75℃孵育5min酶活残留52.37％；其他突变体比酶活最高为528.87U/mg，而四点突变体GODm比酶活为534.93U/mg。由此可见，与野生酶或其他突变体酶相比，该四点突变体GODm的热稳定性明显更具有优势，这有利于运输与保存，也将大大拓宽该酶在高温下的应用潜力。

表6 不同突变体热稳定性与比酶活的测定结果

虽然本发明已以较佳实施例公开如上，但其并非用以限定本发明，任何熟悉此技术的人，在不脱离本发明的精神和范围内，都可做各种的改动与修饰，因此本发明的保护范围应该以权利要求书所界定的为准。

SEQUENCE LISTING

<110> 江南大学

<120> 热稳定性提高的葡萄糖氧化酶突变体及其编码基因和应用

<130> BAA210136A

<160> 4

<170> PatentIn version 3.3

<210> 1

<211> 583

<212> PRT

<213> 人工序列

<400> 1

Ser Asn Gly Ile Glu Ala Ser Leu Leu Thr Asp Pro Lys Asp Val Ser

1 5 10 15

Gly Arg Thr Val Asp Tyr Ile Ile Ala Gly Gly Gly Leu Thr Gly Leu

20 25 30

Thr Thr Ala Ala Arg Leu Thr Glu Asn Pro Asn Ile Ser Val Leu Val

35 40 45

Ile Glu Ser Gly Ser Tyr Glu Ser Asp Arg Gly Pro Ile Ile Glu Asp

50 55 60

Leu Asn Ala Tyr Gly Asp Ile Phe Gly Ser Ser Val Asp His Ala Tyr

65 70 75 80

Glu Thr Val Glu Leu Ala Thr Asn Asn Gln Thr Ala Leu Ile Arg Ser

85 90 95

Gly Asn Gly Leu Gly Gly Ser Thr Leu Val Asn Gly Gly Thr Trp Thr

100 105 110

Arg Pro His Lys Ala Gln Val Asp Ser Trp Glu Thr Val Phe Gly Asn

115 120 125

Glu Gly Trp Asn Trp Asp Asn Val Ala Ala Tyr Ser Leu Gln Ala Glu

130 135 140

Arg Ala Arg Ala Pro Asn Ala Lys Gln Ile Ala Ala Gly His Tyr Phe

145 150 155 160

Asn Ala Ser Cys His Gly Val Asn Gly Thr Val His Ala Gly Pro Arg

165 170 175

Asp Thr Gly Asp Asp Tyr Ser Pro Ile Val Lys Ala Leu Met Ser Ala

180 185 190

Val Glu Asp Arg Gly Val Pro Thr Lys Lys Asp Phe Gly Cys Gly Asp

195 200 205

Pro His Gly Val Ser Met Phe Pro Asn Thr Leu His Glu Asp Gln Val

210 215 220

Arg Ser Asp Ala Ala Arg Glu Trp Leu Leu Pro Asn Tyr Gln Arg Pro

225 230 235 240

Asn Leu Gln Val Leu Thr Gly Gln Tyr Val Gly Lys Val Leu Leu Ser

245 250 255

Gln Asn Gly Thr Thr Pro Arg Ala Val Gly Val Glu Phe Gly Thr His

260 265 270

Lys Gly Asn Thr His Asn Val Tyr Ala Lys His Glu Val Leu Leu Ala

275 280 285

Ala Gly Ser Ala Val Ser Pro Thr Ile Leu Glu Tyr Ser Gly Ile Gly

290 295 300

Met Lys Ser Ile Leu Glu Pro Leu Gly Ile Asp Thr Val Val Asp Leu

305 310 315 320

Pro Val Gly Leu Asn Leu Gln Asp Gln Thr Thr Ala Thr Val Arg Ser

325 330 335

Arg Ile Thr Ser Ala Gly Ala Gly Gln Gly Gln Ala Ala Trp Phe Ala

340 345 350

Thr Phe Asn Glu Thr Phe Gly Asp Tyr Ser Glu Lys Ala His Glu Leu

355 360 365

Leu Asn Thr Lys Leu Glu Gln Trp Ala Glu Glu Ala Val Ala Arg Gly

370 375 380

Gly Phe His Asn Thr Thr Ala Leu Leu Ile Gln Tyr Glu Asn Tyr Arg

385 390 395 400

Asp Trp Ile Val Asn His Asn Val Ala Tyr Ser Glu Leu Phe Leu Asp

405 410 415

Thr Ala Gly Val Ala Ser Phe Asp Val Trp Asp Leu Leu Pro Phe Thr

420 425 430

Arg Gly Tyr Val His Ile Leu Asp Lys Asp Pro Tyr Leu His His Phe

435 440 445

Ala Tyr Asp Pro Gln Tyr Phe Leu Asn Glu Leu Asp Leu Leu Gly Gln

450 455 460

Ala Ala Ala Thr Gln Leu Ala Arg Asn Ile Ser Asn Ser Gly Ala Met

465 470 475 480

Gln Thr Tyr Phe Ala Gly Glu Thr Ile Pro Gly Asp Asn Leu Ala Tyr

485 490 495

Asp Ala Asp Leu Ser Ala Trp Thr Glu Tyr Ile Pro Tyr His Phe Arg

500 505 510

Pro Asn Tyr His Gly Val Gly Thr Cys Ser Met Met Pro Lys Glu Met

515 520 525

Gly Gly Val Val Asp Asn Ala Ala Arg Val Tyr Gly Val Gln Gly Leu

530 535 540

Arg Val Ile Asp Gly Ser Ile Pro Pro Thr Gln Met Ser Ser His Val

545 550 555 560

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565 570 575

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<212> PRT

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Gly Arg Thr Val Asp Tyr Ile Ile Ala Gly Gly Gly Leu Val Gly Leu

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Thr Thr Ala Ala Arg Leu Thr Glu Asn Pro Asn Ile Ser Val Leu Val

35 40 45

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50 55 60

Leu Asn Ala Tyr Gly Lys Ile Phe Gly Ser Ser Val Asp His Ala Tyr

65 70 75 80

Glu Thr Val Glu Leu Ala Thr Asn Asn Gln Thr Ala Leu Ile Arg Ser

85 90 95

Gly Asn Gly Leu Gly Gly Ser Thr Leu Val Asn Gly Gly Thr Trp Thr

100 105 110

Arg Pro His Lys Ala Gln Val Asp Ser Trp Glu Thr Val Phe Gly Asn

115 120 125

Glu Gly Trp Asn Trp Asp Asn Val Ala Ala Tyr Ser Leu Gln Ala Glu

130 135 140

Arg Ala Arg Ala Pro Asn Ala Lys Gln Ile Ala Ala Gly His Tyr Phe

145 150 155 160

Asn Thr Ser Cys His Gly Val Asn Gly Thr Val His Ala Gly Pro Arg

165 170 175

Asp Thr Gly Asp Asp Tyr Ser Pro Ile Val Lys Ala Leu Met Ser Ala

180 185 190

Val Glu Asp Arg Gly Val Pro Thr Lys Lys Asp Phe Gly Cys Gly Asp

195 200 205

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Arg Ser Asp Ala Ala Arg Glu Trp Leu Leu Pro Asn Tyr Gln Arg Pro

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Asn Leu Gln Val Leu Thr Gly Gln Tyr Val Gly Lys Val Leu Leu Ser

245 250 255

Gln Asn Gly Thr Thr Pro Arg Ala Val Gly Val Glu Phe Gly Thr His

260 265 270

Lys Gly Asn Thr His Asn Val Tyr Ala Lys His Glu Val Leu Leu Ala

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Ala Gly Ser Ala Val Ser Pro Thr Ile Leu Glu Tyr Ser Gly Ile Gly

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Thr Phe Asn Glu Thr Phe Gly Asp Tyr Ser Glu Lys Ala His Glu Leu

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Leu Asn Thr Lys Leu Glu Gln Trp Ala Glu Glu Ala Val Ala Arg Gly

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atcatcgagg atttgaatgc atatggcaag atattcggaa gttctgttga tcacgcctac 240

gaaactgttg agttggcaac taacaaccag acggctctga ttaggtccgg taacggtttg 300

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ttacaggccg aaagggctag ggctcccaac gcaaagcaga ttgccgcagg tcattatttt 480

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tacagtgaga aggcccacga acttttgaac acaaagttag agcagtgggc agaagaggcc 1140

gtggctaggg gtggttttca caacacaaca gccctgttga tccagtatga aaattacagg 1200

gactggatcg tgaaccataa cgttgcatac tcagaactat ttttagatac tgccggcgtt 1260

gcttctttcg atgtctggga tctactaccc ttcactaggg gctatgttca cattctagat 1320

aaggaccctt atttgcatca cttcgcttat gaccctcagt acttcctgaa cgaattagat 1380

ctattaggtc aggccgccgc cactcaattg gctaggaata taagtaactc aggagccatg 1440

caaacctatt ttgctggtga aacaattcca ggcgacaatc tggcttatga tgccgatctt 1500

agtgcctgga ctgaatatat accctaccat ttcagaccta actatcatgg agttggcact 1560

tgtagtatga tgcctaaaga gatgggcggt gtagttgata atgctgccag ggtgtatggt 1620

gtccagggtc taagagtgat tgacggctca atcccaccca cgcaaatgag ttctcacgta 1680

atgacggttt tttacgcaat ggcattaaag atctcagacg caatacttga agactacgca 1740

tccatgcaa 1749

<210> 4

<211> 1749

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 4

agtaatggaa tcgaagctag tctgttgacg gaccccaagg acgtatcagg caggaccgta 60

gattatatta ttgcaggcgg aggattgaca ggcttgacaa cagctgccag gttgaccgag 120

aatccaaaca tttcagtact tgtgatcgaa tcaggcagtt atgaatccga ccgtggacct 180

atcatcgagg atttgaatgc atatggcgat atattcggaa gttctgttga tcacgcctac 240

gaaactgttg agttggcaac taacaaccag acggctctga ttaggtccgg taacggtttg 300

ggcggaagta ctctggttaa tggtggaacg tggacgagac ctcataaggc ccaagtcgat 360

tcatgggaaa cagtcttcgg caacgagggc tggaactggg ataacgtggc tgcttattct 420

ttacaggccg aaagggctag ggctcccaac gcaaagcaga ttgccgcagg tcattatttt 480

aacgcttcct gccatggcgt taatggtaca gtccatgctg gtccccgtga tactggcgat 540

gactattcac ctatagtgaa ggctctgatg tccgctgtcg aggacagagg agtacctact 600

aaaaaggact ttggttgcgg tgatcctcac ggagtttcca tgttcccaaa tactctacat 660

gaagaccaag taagatctga cgccgcccgt gaatggctgc tgcctaatta tcaaagacct 720

aatctacagg tactgaccgg ccaatacgtg ggaaaagttc tactgagtca gaacggcacg 780

acacctagag ctgtaggtgt cgagttcggt actcataaag gaaataccca taacgtttat 840

gccaaacatg aggttcttct tgcagctgga tcagcagtgt ctcccactat actggagtat 900

agtggtattg gtatgaagtc aatcttggaa cctctgggca ttgatacggt cgtcgacctt 960

cccgtgggac ttaaccttca ggaccagacg acagcaaccg tcaggtcccg tataacctct 1020

gcaggcgcag gccagggcca ggccgcatgg ttcgccacgt ttaatgaaac attcggcgac 1080

tacagtgaga aggcccacga acttttgaac acaaagttag agcagtgggc agaagaggcc 1140

gtggctaggg gtggttttca caacacaaca gccctgttga tccagtatga aaattacagg 1200

gactggatcg tgaaccataa cgttgcatac tcagaactat ttttagatac tgccggcgtt 1260

gcttctttcg atgtctggga tctactaccc ttcactaggg gctatgttca cattctagat 1320

aaggaccctt atttgcatca cttcgcttat gaccctcagt acttcctgaa cgaattagat 1380

ctattaggtc aggccgccgc cactcaattg gctaggaata taagtaactc aggagccatg 1440

caaacctatt ttgctggtga aacaattcca ggcgacaatc tggcttatga tgccgatctt 1500

agtgcctgga ctgaatatat accctaccat ttcagaccta actatcatgg agttggcact 1560

tgtagtatga tgcctaaaga gatgggcggt gtagttgata atgctgccag ggtgtatggt 1620

gtccagggtc taagagtgat tgacggctca atcccaccca cgcaaatgag ttctcacgta 1680

atgacggttt tttacgcaat ggcattaaag atctcagacg caatacttga agactacgca 1740

tccatgcaa 1749

Claims

1.一种葡萄糖氧化酶突变体，其特征在于，含有SEQ ID NO:2所示的氨基酸序列。

2.编码权利要求1所述葡萄糖氧化酶突变体的基因。

3.如权利要求2所述基因，其特征在于，核苷酸序列为SEQ ID NO:3。

4.一种载体，其特征在于，表达权利要求1所述的葡萄糖氧化酶突变体或含有权利要求3所述基因。

5.一种基因工程菌，其特征在于，含有权利要求1所述葡萄糖氧化酶突变体或权利要求4所述载体。

6.如权利要求5所述的基因工程菌，其特征在于，以毕赤酵母GS115为宿主，以pPIC9K为表达载体。

7.构建权利要求5或6所述基因工程菌的方法，包括以下步骤：

(1)在表达载体pUC57上插入SEQ ID NO:4所示基因，构建重组表达载体pUC57-opanGOD；(2)以重组表达载体pUC57-opanGOD进行四轮单点突变，获得突变质粒pUC57-GODm；3)以突变质粒pUC57-GODm为模板，扩增获得基因序列如SEQ ID NO:3所示的目的片段并连接到表达载体pPIC9K，获得重组表达载体pPIC9K-GODm；4)将所述重组表达载体导入毕赤酵母GS115中获得表达葡萄糖氧化酶突变体的基因工程菌。

8.一种提高葡萄糖氧化酶热稳定性的方法，其特征在于，将氨基酸序列为SEQ ID NO:1的葡萄糖氧化酶的第30位的苏氨酸突变为缬氨酸、第70位的天冬氨酸突变为赖氨酸、第162位的丙氨酸突变为苏氨酸、第315位的天冬氨酸突变为赖氨酸。

9.权利要求5或6所述基因工程菌在制备葡萄糖氧化酶中的应用。

10.权利要求1所述突变体或权利要求5或6所述基因工程菌制备的葡萄糖氧化酶在在食品饮料、饲料、医药化工领域的应用。