CN108003244A - 一种提高葡萄糖氧化酶热稳定性的方法 - Google Patents

一种提高葡萄糖氧化酶热稳定性的方法 Download PDF

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CN108003244A CN201810069643.XA CN201810069643A CN108003244A CN 108003244 A CN108003244 A CN 108003244A CN 201810069643 A CN201810069643 A CN 201810069643A CN 108003244 A CN108003244 A CN 108003244A
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glucose oxidase
enzyme
ala
gly
small peptide
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堵国成
张娟
任春慧
陈坚
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    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
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    • C12N9/0004—Oxidoreductases (1.)
    • C12N9/0006—Oxidoreductases (1.) acting on CH-OH groups as donors (1.1)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Y—ENZYMES
    • C12Y101/00—Oxidoreductases acting on the CH-OH group of donors (1.1)
    • C12Y101/03—Oxidoreductases acting on the CH-OH group of donors (1.1) with a oxygen as acceptor (1.1.3)
    • C12Y101/03004—Glucose oxidase (1.1.3.4)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
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Abstract

本发明公开了一种提高葡萄糖氧化酶热稳定性的方法，属于酶工程领域。本发明的融合酶，是在黑曲霉来源的葡萄糖氧化酶的基础上在其N端融合双亲短肽得到的。本发明的融合葡萄糖氧化酶与初始酶相比，在60℃条件下孵育30min时，其残留酶活是初始酶的10.9倍，融合酶的热稳定性获得了显著的提高。通过本发明的方法，有效提高了葡萄糖氧化酶的热稳定性。

Description

一种提高葡萄糖氧化酶热稳定性的方法
技术领域
本发明涉及一种提高葡萄糖氧化酶热稳定性的方法，属于酶工程领域。
背景技术
葡萄糖氧化酶(glucose oxidase，GOD)是从特异青霉等霉菌和蜂蜜中发现的酶，是同型二聚体结构，每个亚基分为两个不同的结构域：一个区域主要由β-折叠组成，以非共价键与黄素腺嘌呤二核苷酸(FAD)辅酶分子紧密结合；另一个区域则由4个α-螺旋支撑1个反平行的β-折叠组成，可与底物β-D-葡萄糖结合。该酶能将β-D-葡萄糖催化氧化成葡萄糖酸内酯与过氧化氢，其中葡萄糖酸内酯能够在非酶促反应下转化成葡萄糖酸。葡萄糖氧化酶作为工业酶制剂中的重要成员之一，在食品工业、生物传感器和酶生物燃料电池方面都有广泛应用。
近年来，葡萄糖氧化酶作为替代抗生素的新型饲料酶制剂，具有保护动物肠道，促进消化吸收，提高动物机体免疫力等多种功能。葡萄糖氧化酶在饲料应用方面，年需可达30万吨，据估计葡萄糖氧化酶的年总产值在100亿元以上，同时其需求量也以每年10％-30％的速度逐年递增。但饲料在制作过程中通常需要经过造粒，在该过程中会由于瞬间高温而对酶活造成影响。另外，在工业上无论是利用葡萄糖氧化酶进行酶法转化，还是发酵生产葡萄糖氧化酶，罐上温度都得不到及时调控，罐上温度通常维持在40℃-45℃左右。这会造成罐体内的温度通常高于酶发酵的最适温度而造成酶活性的损失。因此，如果可以有效地提高GOD的热稳定性，可以较大程度地降低用于降温的能源消耗从而减少资源浪费。因此，提高葡萄糖氧化酶的热稳定性，在应用和研究中均具有重要的前景和意义。
目前，提高酶热稳定性的方法主要有非理性设计如定向进化、饱和突变等，理性设计如借助计算机辅助设计突变位点进行定点突变等。前者需要建立高效的高通量筛选方法，而后者需要对酶分子结构进行大量的计算机计算，因此快速筛选目标菌株就变得很困难，快速筛选目标菌株就变得很困难。
双亲自组装肽(self-assembling peptides，SAPs)是由相互交替的亲水性和疏水性氨基酸组成，能够聚集形成有序的纳米结构，主要应用于纳米技术领域、细胞培养和分子电子学。其中双亲的特点有利于帮助酶分子与疏水性底物相结合，实现酶分子的定位等。但是，由于不同Linker连接、不同氨基酸长度的双亲短肽对融合酶热稳定性的影响不尽相同，因此双亲自组装肽的添加可能会导致融合酶热稳定性的升高或降低。
发明内容
本发明要解决的问题是提供一种稳定性提高的葡萄糖氧化酶，所述葡萄糖氧化酶为融合表达了双亲短肽的葡萄糖氧化酶。
在本发明的一种实施方式中，所述葡萄糖氧化酶为在N端融合表达了双亲短肽的葡萄糖氧化酶。
在本发明的一种实施方式中，所述双亲短肽的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示。
在本发明的一种实施方式中，所述葡萄糖氧化酶的氨基酸序列如SEQ ID NO.8所示。
一种融合双亲短肽葡萄糖氧化酶表达菌株的构建，所述方法的步骤如下：
(1)将葡萄糖氧化酶的基因与载体连接，扩增双亲短肽；
(2)线性化载体和要插入的短肽的序列利用一步克隆法进行同源重组，得到重组质粒；
(3)将重组后的质粒线性化后转化至宿主细胞。
在本发明的一种实施方式中，所述质粒为pPIC9K。
在本发明的一种实施方式中，所述宿主为毕赤酵母。
本发明还提供一种葡萄糖氧化酶的制备方法，所述方法具体步骤如下：
(1)将菌种活化得到种子液，将种子液按8-12％接入5BMGY培养基中，在28-30℃、200-240r/min条件下培养20-28h，发酵液离心，去除上清液，将全部菌体转入到BMMY培养基中；
(2)BMMY培养基初始甲醇添加量为体积分数1-3％，在28-30℃、200-240r/min条件下诱导产酶，之后每24h添加体积分数为1-3％的甲醇。
在本发明的一种实施方式中，所述BMGY培养基的成分10g/L酵母膏，20g/L蛋白胨，10g/L甘油，0.1mmol/LpH 6.0磷酸缓冲液，13.4g/LYNB，0.4mg/L生物素。
在本发明的一种实施方式中，所述BMMY培养基的成分10g/L酵母膏，20g/L蛋白胨，10g/L甲醇，0.1mmol/LpH 6.0磷酸缓冲液，13.4g/LYNB，0.4mg/L生物素。
本发明的有益效果：
(1)本发明所述融合酶与初始葡萄糖氧化酶相比，在60℃下孵育30min，其相对酶活为67％，是相同处理条件下初始酶相对酶活的10.9倍。
(2)本发明提供了一种简便的通过在葡萄糖氧化酶的N端融合双亲短肽来提高葡萄糖氧化酶热稳定性的方法。改造后的融合酶热稳定性有了明显的提高，为葡萄糖氧化酶在动物饲料方面的应用提供了方便。
附图说明
图1：初始葡萄糖氧化酶与融合酶的最适温度比较；
图2：初始葡萄糖氧化酶与融合酶在60℃孵育条件下的温度稳定性比较；
图3：pPIC9k-GOD-SAPs融合表达质粒的构建图；
具体实施方式
葡萄糖氧化酶酶活的测定：
葡萄糖氧化酶GOD酶活的测定：先后加入2.5ml邻联茴香胺，0.3ml 18％葡萄糖，0.1ml辣根过氧化物酶，于35℃条件下保温2min，然后加入0.1ml酶液，35℃条件下反应3min，并用2mol/L的硫酸终止反应。其中酶活测定过程中所需各溶液的配置如下：1.柠檬酸缓冲液(pH 6.0)：一水合柠檬酸(C6H8O7·H2O)3.95g/L，二水合柠檬酸钠(Na3C6H5O7·2H2O)23.82g/L，调节pH为6.0；2.邻联茴香胺溶液：1g邻联茴香胺加在100mL甲醇中搅拌溶解制成浓缩存储液。现用现配，取0.1mL浓缩液加入到上述柠檬酸缓冲液12ml中混匀；3.18％葡萄糖水溶液：葡萄糖180g/L；4.辣根过氧化物酶液(根据不同产品实际稀释至100Um/L)。
葡萄糖氧化酶GOD酶活的定义：每分钟转化1μmol葡萄糖为葡萄糖酸和过氧化氢所需的酶量为一个单位，用U表示。其中葡萄糖氧化酶酶活的计算方法如下：
X＝[ΔA÷(7.5×t×0.1)]×5×n
其中，X表示酶活，单位为U；ΔA表示500nm吸光值；t表示酶活测定时间，单位为min；0.1表示样品体积，单位为mL；5表示终反映体积，单位为mL；7.5表示消光系数；n表示稀释倍数。
菌株经培养表达葡萄糖氧化酶的培养基：
LB：10g/L胰蛋白胨，5g/L酵母粉,10g/LNaCl，pH 7.0；
YPD：10g/L酵母膏,20g/L蛋白胨，10g/L葡萄糖；
MD：13.4g/LYNB，0.4mg/L生物素，20g/L葡萄糖；
BMGY：10g/L酵母膏，20g/L蛋白胨，10g/L甘油，0.1mmol/LpH 6.0磷酸缓冲液，13.4g/LYNB，0.4mg/L生物素；
BMMY：10g/L酵母膏，20g/L蛋白胨，10g/L甲醇，0.1mmol/LpH 6.0磷酸缓冲液，13.4g/LYNB，0.4mg/L生物素；
YPD-G418：YNB 13.4g/L，生物素0.4mg/L，葡萄糖20g/L。添加遗传霉素0.25mg/L，1mg/mL，2mg/mL，3mg/mL，4mg/mL，用于阳性转化子拷贝数的筛选。
实施例1：重组融合菌株的构建
第一步双亲短肽基因的获得
将双亲短肽，短肽的氨基酸序列分别为，短肽1氨基酸序列为SEQ ID NO.1所示；短肽2氨基酸序列为SEQ ID NO.2所示,短肽3氨基酸序列为SEQ ID NO.3所示，短肽4氨基酸序列为SEQ ID NO.4所示，短肽5氨基酸序列为SEQ ID NO.5所示，短肽6氨基酸序列为SEQIDNO.6所示，短肽7氨基酸序列为SEQ ID NO.7所示。利用如下表中的引物进行扩增。其中画线部分是与本实验室前面研究构建的重组质粒pPIC9k-GOD同源的序列，称为同源臂。
表1
第二步融合双亲短肽的重组葡萄糖氧化酶表达质粒的构建
将用SnaB I酶切线性化载体和要插入的短肽的序列利用一步克隆法进行同源重组，重组的反应体系为：5×CE II Buffer 2μl；线性化质粒pPIC9K-GOD 221ng；SAPs 20ng；ExnaseTM II 1μl，加dd水至10μl。将混合体系在37℃条件下孵育30min，冰浴备用。
第三步融合双亲短肽葡萄糖氧化酶表达菌株的构建
将重组后的质粒pPIC9k-SAPs-GOD转化至E.coliDH5α感受态细胞中,将转化后的菌液涂布到含有氨苄青霉素的固体LB平板中培养。菌落PCR验证后呈阳性的克隆菌株，提取其质粒送到上海生物工程有限公司进行测序。
将上述构建得到的重组质粒pPIC9k-SAPs-GOD用快切酶Bgl II线性化，将线性化之后的质粒按照毕赤酵母转化手册进行转化。挑取转化后MD板上的转化子25个到含G418抗性的YPD平板上(G418抗性浓度梯度为1mg/mL，2mg/mL，3mg/mL，4mg/mL),挑取4mg/ml浓度的抗性YPD板上的重组菌5-10个供之后发酵使用。
实施例2：重组融合菌株发酵产酶纯化
(1)粗酶液的制备及纯化
菌株经培养表达葡萄糖氧化酶的方法步骤：
挑取转化后MD板上的转化子25个到含G418抗性的YPD平板上(G418抗性浓度梯度为1mg/mL，2mg/mL，3mg/mL，4mg/mL),挑取4mg/ml浓度的抗性YPD板上的重组菌5-10个进行摇瓶发酵。
种子培养：挑取YPD平板上的单菌落到25mLYPD液体培养基(250ml摇瓶)中于30℃、220r/min条件下培养18-20h。
摇瓶发酵：将种子液按10％接入50ml BMGY培养基中(500ml摇瓶)，在30℃、220r/min条件下培养24h，将所有菌体离心并用等体积生理盐水洗涤两遍，离心，将全部菌体转入到BMMY培养基中。BMMY培养基初始甲醇添加量为1％，在30℃、220r/min条件下诱导产酶，之后每24h添加1％的甲醇。
粗酶液纯化：将发酵液在8000r/min条件下离心10min，取上清。将上清液用25KDa的透析袋在0℃Tris-HCL缓冲液中透析过夜。将透析后所得的酶液用HitrapTM Q HP柱纯化。使用AKTA蛋白纯化仪进行蛋白分离纯化，柱纯化条件如下:用10倍柱体积的缓冲液A(20mmol/L Tris-HCL缓冲液，pH 7.0)平衡阴离子柱，并以1mL/min的流速进样；等待进样结束后，使用5个柱体积的缓冲液A冲平柱子；并以0-100％的缓冲液B(20mmol/L Tris-HCl+100mmol/L NaCl缓冲液，pH 7.0)以3mL/min的流速进行线性洗脱。在60-80mM NaCl浓度时出现紫外吸收峰，对出现紫外吸收峰的样品进行收集，其中连接了短肽1、短肽2、短肽3、短肽4、短肽5、短肽6、短肽7的重组菌分泌得到的融合酶1(SAP1-GS-GOD)、融合酶2(SAP1-PT-GOD)、融合酶3(SAP2-PT-GOD)、融合酶4(SAP3-PT-GOD)、融合酶5(SAP4-PT-GOD)、融合酶6(SAP5-PT-GOD)和融合酶7(SAP6-PT-GOD)。
实施例3：葡萄糖氧化酶的活力测定及融合酶与初始酶的热稳定性比较
最适反应温度的测定：将纯化后的GOD酶液置于相同的测定体系中，在不同的温度(20℃，25℃，30℃，35℃，40℃，45℃，50℃，55℃，60℃，65℃，70℃，80℃)条件下，测定其酶活。并将最高酶活值作为100％。
温度稳定性的测定：将纯化后的GOD酶液分别在60℃条件下热浴60min，每隔10min测定其相对酶活。将未热浴处理的酶活作为100％。
如图1所示，融合酶1的最适温度为45℃，融合酶2、融合酶3、融合酶4和融合酶5融合酶和初始酶的最适温度均为35℃，融合酶6的最适温度为40℃，融合酶7的最适温度为45℃。根据图2可得，将初始酶和融合酶在60℃条件下处理60min，60min后连接PTLinker的融合酶的酶活残留较初始酶均有所提高，只有连接GS Linker的融合酶2的酶活残留较初始酶降低。其中，融合酶1在60℃热处理30min后，其残留酶活为67％，是相同热处理条件下初始酶的10.9倍。其它融合酶2、融合酶3、融合酶4、融合酶5、融合酶6、融合酶7在60℃热处理30min后，相对初始酶的残留酶活分别提高了1.8倍、2.0倍、1.7倍、2.6倍和2.6倍。综上，通过对比融合酶2和融合酶3，可以看出双亲短肽与酶之间连接刚性Linker PT在热稳定性方面要比连接柔性Linker GS效果好。融合酶2、融合酶3、融合酶4、融合酶5、融合酶6的Km值较初始酶均明显降低，其中、融合酶3最为显著，Km值仅为初始酶的56％。同时，融合酶4、融合酶1的催化效率较初始酶提高最为显著，较初始酶分别提升了40％和27％。
表2
虽然本发明已以较佳实施例公开如上，但其并非用以限定本发明，任何熟悉此技术的人，在不脱离本发明的精神和范围内，都可做各种的改动与修饰，因此本发明的保护范围应该以权利要求书所界定的为准。
序列表
<110> 一种提高葡萄糖氧化酶热稳定性的方法
<120> 江南大学
<160> 8
<170> PatentIn version 3.3
<210> 1
<211> 60
<212> PRT
<213> 人工合成
<400> 1
Asp Trp Leu Lys Ala Phe Tyr Asp Lys Val Ala Glu Lys Leu Lys Glu
1 5 10 15
Ala Phe Lys Val Glu Pro Leu Arg Ala Asp Trp Leu Lys Ala Phe Tyr
20 25 30
Asp Lys Val Ala Glu Lys Leu Lys Glu Ala Phe Pro Thr Pro Pro Thr
35 40 45
Thr Pro Thr Pro Pro Thr Thr Pro Thr Pro Thr Pro
50 55 60
<210> 2
<211> 31
<212> PRT
<213> 人工合成
<400> 2
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1 5 10 15
Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser
20 25 30
<210> 3
<211> 33
<212> PRT
<213> 人工合成
<400> 3
Ala Glu Ala Glu Ala Lys Ala Lys Ala Glu Ala Glu Ala Lys Ala Lys
1 5 10 15
Pro Thr Pro Pro Thr Thr Pro Thr Pro Pro Thr Thr Pro Thr Pro Thr
20 25 30
Pro
<210> 4
<211> 65
<212> PRT
<213> 人工合成
<400> 4
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Ala Glu Ala Glu Ala Lys Ala Lys Ala Glu Ala Glu Ala Lys Ala Lys
20 25 30
Ala Glu Ala Glu Ala Lys Ala Lys Ala Glu Ala Glu Ala Lys Ala Lys
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Pro Thr Pro Pro Thr Thr Pro Thr Pro Pro Thr Thr Pro Thr Pro Thr
50 55 60
Pro
65
<210> 5
<211> 33
<212> PRT
<213> 人工合成
<400> 5
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Pro Thr Pro Pro Thr Thr Pro Thr Pro Pro Thr Thr Pro Thr Pro Thr
20 25 30
Pro
<210> 6
<211> 82
<212> PRT
<213> 人工合成
<400> 6
Val Asn Tyr Gly Asn Gly Val Ser Cys Ser Lys Thr Lys Ala Pro Thr
1 5 10 15
Gly Ala Arg His Ser Lys Asn Val Ile Leu Pro Glu Pro Thr Ala Leu
20 25 30
Phe Leu Val Ser Pro Ala Leu Leu Val Arg Val Ala Ser Ala Val Ala
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His Leu Leu Arg Arg Arg Pro Arg Pro Arg Arg Pro Pro Arg Leu Arg
50 55 60
Pro Pro Thr Pro Pro Thr Thr Pro Thr Pro Pro Thr Thr Pro Thr Pro
65 70 75 80
Thr Pro
<210> 7
<211> 60
<212> PRT
<213> 人工合成
<400> 7
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Ala Phe Asn Gly Gly Ala Arg Leu Ala Asp Trp Leu Lys Ala Phe Tyr
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Asp Lys Val Ala Glu Lys Leu Lys Glu Ala Phe Pro Thr Pro Pro Thr
35 40 45
Thr Pro Thr Pro Pro Thr Thr Pro Thr Pro Thr Pro
50 55 60
<210> 8
<211> 582
<212> PRT
<213> 人工合成
<400> 8
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1 5 10 15
Arg Thr Val Asp Tyr Ile Ile Ala Gly Gly Gly Leu Thr Gly Leu Thr
20 25 30
Thr Ala Ala Arg Leu Thr Glu Asn Pro Asn Ile Ser Val Leu Val Ile
35 40 45
Glu Ser Gly Ser Tyr Glu Ser Asp Arg Gly Pro Ile Ile Glu Asp Leu
50 55 60
Asn Ala Tyr Gly Asp Ile Phe Gly Ser Ser Val Asp His Ala Tyr Glu
65 70 75 80
Thr Val Glu Leu Ala Thr Asn Asn Gln Thr Ala Leu Ile Arg Ser Gly
85 90 95
Asn Gly Leu Gly Gly Ser Thr Leu Val Asn Gly Gly Thr Trp Thr Arg
100 105 110
Pro His Lys Ala Gln Val Asp Ser Trp Glu Thr Val Phe Gly Asn Glu
115 120 125
Gly Trp Asn Trp Asp Asn Val Ala Ala Tyr Ser Leu Gln Ala Glu Arg
130 135 140
Ala Arg Ala Pro Asn Ala Lys Gln Ile Ala Ala Gly His Tyr Phe Asn
145 150 155 160
Ala Ser Cys His Gly Val Asn Gly Thr Val His Ala Gly Pro Arg Asp
165 170 175
Thr Gly Asp Asp Tyr Ser Pro Ile Val Lys Ala Leu Met Ser Ala Val
180 185 190
Glu Asp Arg Gly Val Pro Thr Lys Lys Asp Phe Gly Cys Gly Asp Pro
195 200 205
His Gly Val Ser Met Phe Pro Asn Thr Leu His Glu Asp Gln Val Arg
210 215 220
Ser Asp Ala Ala Arg Glu Trp Leu Leu Pro Asn Tyr Gln Arg Pro Asn
225 230 235 240
Leu Gln Val Leu Thr Gly Gln Tyr Val Gly Lys Val Leu Leu Ser Gln
245 250 255
Asn Gly Thr Thr Pro Arg Ala Val Gly Val Glu Phe Gly Thr His Lys
260 265 270
Gly Asn Thr His Asn Val Tyr Ala Lys His Glu Val Leu Leu Ala Ala
275 280 285
Gly Ser Ala Val Ser Pro Thr Ile Leu Glu Tyr Ser Gly Ile Gly Met
290 295 300
Lys Ser Ile Leu Glu Pro Leu Gly Ile Asp Thr Val Val Asp Leu Pro
305 310 315 320
Val Gly Leu Asn Leu Gln Asp Gln Thr Thr Ala Thr Val Arg Ser Arg
325 330 335
Ile Thr Ser Ala Gly Ala Gly Gln Gly Gln Ala Ala Trp Phe Ala Thr
340 345 350
Phe Asn Glu Thr Phe Gly Asp Tyr Ser Glu Lys Ala His Glu Leu Leu
355 360 365
Asn Thr Lys Leu Glu Gln Trp Ala Glu Glu Ala Val Ala Arg Gly Gly
370 375 380
Phe His Asn Thr Thr Ala Leu Leu Ile Gln Tyr Glu Asn Tyr Arg Asp
385 390 395 400
Trp Ile Val Asn His Asn Val Ala Tyr Ser Glu Leu Phe Leu Asp Thr
405 410 415
Ala Gly Val Ala Ser Phe Asp Val Trp Asp Leu Leu Pro Phe Thr Arg
420 425 430
Gly Tyr Val His Ile Leu Asp Lys Asp Pro Tyr Leu His His Phe Ala
435 440 445
Tyr Asp Pro Gln Tyr Phe Leu Asn Glu Leu Asp Leu Leu Gly Gln Ala
450 455 460
Ala Ala Thr Gln Leu Ala Arg Asn Ile Ser Asn Ser Gly Ala Met Gln
465 470 475 480
Thr Tyr Phe Ala Gly Glu Thr Ile Pro Gly Asp Asn Leu Ala Tyr Asp
485 490 495
Ala Asp Leu Ser Ala Trp Thr Glu Tyr Ile Pro Tyr His Phe Arg Pro
500 505 510
Asn Tyr His Gly Val Gly Thr Cys Ser Met Met Pro Lys Glu Met Gly
515 520 525
Gly Val Val Asp Asn Ala Ala Arg Val Tyr Gly Val Gln Gly Leu Arg
530 535 540
Val Ile Asp Gly Ser Ile Pro Pro Thr Gln Met Ser Ser His Val Met
545 550 555 560
Thr Val Phe Tyr Ala Met Ala Leu Lys Ile Ser Asp Ala Ile Leu Glu
565 570 575
Asp Tyr Ala Ser Met Gln
580
<210> 9
<211> 38
<212> DNA
<213> 人工合成
<400> 9
gaggctgaag cttacgattg gctgaaggct ttttatga 38
<210> 10
<211> 31
<212> DNA
<213> 人工合成
<400> 10
ttcaatgcca tttactgggg tcggagtcgg g 31
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<211> 35
<212> DNA
<213> 人工合成
<400> 11
gaggctgaag cttacgcaga agcagaagcg aaagc 35
<210> 12
<211> 31
<212> DNA
<213> 人工合成
<400> 12
ttcaatgcca tttactgggg tcggagtcgg g 31
<210> 13
<211> 35
<212> DNA
<213> 人工合成
<400> 13
gaggctgaag cttacgcaga agcagaagcg aaagc 35
<210> 14
<211> 36
<212> DNA
<213> 人工合成
<400> 14
ttcaatgcca tttacagatc cacctccacc agaacc 36
<210> 15
<211> 39
<212> DNA
<213> 人工合成
<400> 15
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Claims (10)

1.一种稳定性提高的葡萄糖氧化酶，其特征在于，所述葡萄糖氧化酶在N端融合表达了双亲短肽。
2.根据权利要求1所述的葡萄糖氧化酶，其特征在于，所述双亲短肽的氨基酸序列如SEQID NO.1所示。
3.根据权利要求1所述的葡萄糖氧化酶，其特征在于，所述葡萄糖氧化酶的氨基酸序列如SEQ ID NO.8所示。
4.一种融合双亲短肽葡萄糖氧化酶表达菌株的构建，其特征在于，所述方法的步骤如下：
(1)将葡萄糖氧化酶的基因与载体连接，扩增双亲短肽；
(2)线性化载体和要插入的短肽的序列利用一步克隆法进行同源重组，得到重组质粒；
(3)将重组后的质粒线性化后转化至宿主细胞。
5.根据权利要求4所述的葡萄糖氧化酶，其特征在于，所述质粒为pPIC9K。
6.根据权利要求4所述的葡萄糖氧化酶，其特征在于，所述宿主为毕赤酵母。
7.一种葡萄糖氧化酶的制备方法，其特征在于，所述方法具体步骤如下：
(1)将权利要求5所述的融合双亲短肽葡萄糖氧化酶表达菌株活化得到种子液，将种子液按8-12％接入5BMGY培养基中，在28-30℃、200-240r/min条件下培养20-28h，发酵液离心，去除上清液，将全部菌体转入到BMMY培养基中；
(2)BMMY培养基初始甲醇添加量为体积分数1-3％，在28-30℃、200-240r/min条件下诱导产酶，之后每24h添加体积分数为1-3％的甲醇。
8.根据权利要求7所述方法，其特征在于，所述BMGY培养基的成分10g/L酵母膏，20g/L蛋白胨，10g/L甘油，0.1mmol/L pH 6.0磷酸缓冲液，13.4g/L YNB，0.4mg/L生物素。
9.根据权利要求8所述方法，其特征在于，所述BMMY培养基的成分10g/L酵母膏，20g/L蛋白胨，10g/L甲醇，0.1mmol/L pH 6.0磷酸缓冲液，13.4g/L YNB，0.4mg/L生物素。
10.权利要求1所述的葡萄糖氧化酶在食品工业、生物传感器、酶生物燃料电池上的应用。
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