CN107099565A

CN107099565A - 一种低聚龙胆糖的制备方法

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Publication number: CN107099565A
Application number: CN201710485406.7A
Authority: CN
Inventors: 吴敬; 陈晟; 汪飞
Original assignee: Jiangnan University
Current assignee: Jiangnan University
Priority date: 2017-06-23
Filing date: 2017-06-23
Publication date: 2017-08-29
Anticipated expiration: 2037-06-23
Also published as: CN107099565B

Abstract

本发明公开了一种低聚龙胆糖的制备方法，属于发酵工程技术领域。本发明以葡萄糖和纤维二糖为底物，以β‑葡萄糖苷酶为催化剂合成低聚龙胆糖。本发明以20％葡萄糖和40％纤维二糖为底物，加入β‑葡萄糖苷酶400U/g纤维二糖，在pH5、温度60℃下进行酶反应，反应周期为31h，低聚龙胆糖的产量能达到116g/L，转化率为19.4％。此外，本发明将绿色木霉来源的β‑葡萄糖苷酶异源表达到毕赤酵母中，得到一种高产β‑葡萄糖苷酶基因工程菌毕赤酵母KM71/pPIC9K‑bgl1。本发明菌株生产的β‑葡萄糖苷酶的最适pH为5、最适温度为60℃，酶活能达到1020U/ml，适合用于低聚龙胆糖的制备。

Description

一种低聚龙胆糖的制备方法

技术领域

本发明涉及一种低聚龙胆糖的制备方法，属于发酵工程技术领域。

背景技术

低聚龙胆糖是葡萄糖以β-1，6糖苷键结合而形成的新型功能性低聚糖，包括龙胆二糖，少量的三糖和四糖。低聚龙胆糖不被人体的酶所降解，低热量，适合肥胖症、高血脂、高血压、糖尿病等人群食用；其还具有高保湿性和吸湿性，有利于保持食品中的水分，可防止淀粉类食品的老化；同时低聚龙胆糖pH和热稳定性高，适用于高温和特殊pH条件下使用的食品；其水活性低，可以有效的防止食品被微生物污染；还具有柔和的提神苦味，可以添加在食品中增加口味的丰富性。目前，低聚龙胆糖被广泛的运用于巧克力、冰淇凌、咖啡、调味品、烘烤食品和饮料中。

制取低聚龙胆糖方法较多，早期的研究从龙胆属植物的根、茎中提取，也可以利用还原苦杏仁苯法和酸法水解淀粉后从其副产物中提纯获得；但由于原料、市场价格等的限制，使其难以工业化生产。目前利用酶转化方法生产低聚龙胆糖的研究集中在以高浓度的葡萄糖为原料，利用β-葡萄糖苷酶的逆水解活性合成低聚龙胆糖。但得到的低聚龙胆糖产量都不高，基本上都是在50g/L，转化率在8％左右。

β-葡萄糖苷酶又叫β-D-葡萄糖苷水解酶，别名龙胆二糖酶、纤维二糖酶。广泛存在于植物、动物和微生物中，其中微生物来源更为广泛，在原核微生物中有约氏黄杆菌，真核微生物中有清酒酵母、黑曲霉等，但是这些菌株产β-葡萄糖苷酶用于生产低聚龙胆糖时产量较低。因此，本发明的目的不仅在于提高低聚龙胆糖的产量及转化率，还要构建一种适用于低聚龙胆糖生产的基因工程菌。

发明内容

β-葡萄糖苷酶能水解非还原性β-D-糖苷键，游离β-D-糖苷键和配基。同时β-葡萄糖苷酶也具有转糖苷活性，可以将水解活性释放出的配基或葡萄糖体，以β-1，6糖苷键形式转移到其他糖底物上。

本发明的第一个目的是提供一种低聚龙胆糖的制备方法，所述方法是以葡萄糖和纤维二糖为底物，以β-葡萄糖苷酶为催化剂合成低聚龙胆糖。

在本发明的一种实施方式中，所述方法的反应条件为以终浓度为5-30g/100mL的葡萄糖和终浓度为10-60g/100mL的纤维二糖为底物，β-葡萄糖苷酶加酶量为100-500U/g纤维二糖，在pH4-6、温度50-70℃下进行酶反应，反应周期为24-48h。

在本发明的一种实施方式中，所述葡萄糖和纤维二糖的摩尔比为1:1。

在本发明的一种实施方式中，所述方法的反应条件为以终浓度为20g/100mL的葡萄糖和终浓度为40g/100mL的纤维二糖为底物，β-葡萄糖苷酶加酶量为400U/g纤维二糖，在pH5、温度60℃下进行酶反应，反应周期为31h。

在本发明的一种实施方式中，所述方法是将氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示β-葡萄糖苷酶基因连接到表达载体pPIC9K上，导入毕赤酵母KM71中获得的基因工程菌，经发酵后得到的β-葡萄糖苷酶作为催化剂。

本发明的第二个目的是提供一种β-葡萄糖苷酶的毕赤酵母基因工程菌，所述毕赤酵母基因工程菌发酵得到的β-葡萄糖苷酶应用于上述低聚龙胆糖的制备方法中。

在本发明的一种实施方式中，所述毕赤酵母基因工程菌是将氨基酸序列如SEQ IDNO.1所示β-葡萄糖苷酶基因连接到表达载体pPIC9K上，导入毕赤酵母KM71中获得。

本发明的第三个目的是提供一种构建上述毕赤酵母基因工程菌的方法，所述方法是将核苷酸序列为SEQ ID NO.1的β-葡萄糖苷酶基因连接到表达载体pPIC9K上，然后再电化到毕赤酵母KM71中，得到基因工程菌毕赤酵母KM71/pPIC9K-bgl1。

本发明的第四个目的是提供一种应用上述毕赤酵母基因工程菌生产β-葡萄糖苷酶的方法，所述方法包括：(1)分批发酵阶段：将种子液以8％-10％接种量接种于发酵罐中，控制温度28-32℃、初始转速180-200rpm、初始通气量7L/min、溶氧28-32％、pH 4.5-5.5；(2)补料发酵阶段：待溶氧上升至80-100％，以恒速流加甘油的方式进行补料培养，控制温度28-30℃、溶氧28-32％、pH 4.5-5.5；(3)诱导培养阶段：当菌体细胞浓度达到OD₆₀₀为80-120时，用甲醇流加仪流加甲醇诱导产酶，甲醇浓度控制在0.5-1％，控制温度28-32℃、溶氧28-32％、pH 4.5-5.5，诱导96-144h。

在本发明的一种实施方式中，诱导培养阶段是当菌体细胞浓度达到OD600为100时，开始流加甲醇诱导产酶；诱导培养阶段控制温度为28℃。

本发明的第五个目的是提供上述基因工程菌在低聚龙胆糖制备中的应用。

本发明的第六个目的是提供所述低聚龙胆糖的制备方法在食品方面的应用。

本发明的有益效果

本发明将来源于绿色木霉的β-葡萄糖苷酶异源表达到毕赤酵母中，以pPIC9K为表达载体，以毕赤酵母KM71为表达宿主，得到一种高产β-葡萄糖苷酶基因工程菌毕赤酵母KM71/pPIC9K-bgl1。本发明菌株生产的β-葡萄糖苷酶的最适pH为5、最适温度为60℃，酶活能达到1020U/ml。利用本发明的β-葡萄糖苷酶以5-30％葡萄糖和10-60％纤维二糖为底物，β-葡萄糖苷酶加酶量为100-500U/g纤维二糖，在pH4-6、温度50-70℃下进行酶反应，反应24-48h，低聚龙胆糖产量最高能达到116g/L，转化率为19.4％。

同时本发明是首次提出以纤维二糖和葡萄糖为底物，利用β-葡萄糖苷酶的转苷活性来合成低聚龙胆糖。而且转苷得到的低聚龙胆糖产量也远高于目前以高浓度的葡萄糖为原料，利用β-葡萄糖苷酶的逆水解活性合成低聚龙胆糖的方法。

附图说明

图1是重叠PCR去除内含子示意图；

图2是重组菌发酵上清(上罐)SDS-PAGE电泳图；

图3是β-葡萄糖苷酶最适温度；

图4是β-葡萄糖苷酶最适pH值；

图5是β-葡萄糖苷酶加酶量对低聚龙胆糖产量的影响。

具体实施方式

培养基：

(1)MD培养基：YNB 13.4g/L，生物素4×10^-4g/L，葡萄糖20g/L，琼脂20g/L。

(2)YPD培养基：蛋白胨20g/L，酵母提取物10g/L，葡萄糖20g/L，固体培养基添加20g/L琼脂，用于筛选G418抗性时在YPD固体培养基加入所需浓度的G418即YPD-G418平板。

(3)BMGY培养基：YNB 13.4g/L，甘油10g/L，生物素4×10^-4g/L，0.1mol/L磷酸钾缓冲溶液(pH6.0)。

(4)BMMY培养基：YNB 13.4g/L，甲醇1％，生物素4×10^-4g/L，0.1mol/L磷酸钾缓冲溶液(pH6.0)

(5)种子培养基为：蛋白胨20g/L，酵母粉5g/L，甘油30g/L，YNB13.4g/L。

(6)发酵培养基为：甘油30g/L，MgSO₄·7H₂O14.9g/L，CaSO₄·2H₂O 0.939g/L，KOH4.13g/L，K₂SO₄18.2g/L，85％H₃PO₄26.7mL，微量元素4.32mL/L。

(7)补料培养基为：50％甘油，微量元素5mL/L。

(8)微量元素为：ZnCl₂20g/L，FeSO₄·7H₂O 65g/L，CuSO₄·5H₂O 6g/L，MnSO₄·H₂O3g/L，CoCl₂0.5g/L，KI 0.08g/L，Na₂MoO₃.2H₂O 0.2g/L，H₂SO₄5mL/L，生物素0.2g/L。

β-葡萄糖苷酶酶活力分析：

(1)酶活单位定义

每毫升酶液每分钟水解pNPG产生1μmol的对硝基苯酚的酶活力为一个酶活单位。

(2)酶活力测定步骤

反应体系为1.0mL，pH4.5的醋酸缓冲液960μL，加入适度稀释的粗酶液20μL，再加入20μL 100mmol/L的pNPG，在60℃恒温水浴中预热5～10min，用秒表精确计时，10min后立即加入200μL的1mol/L的Na₂CO₃溶液终止反应，室温放置5min，于400nm处测光吸收值。以加热失活的酶液按照同样的方法处理作空白。

实施例1：毕赤酵母KM71/pPIC9K-bgl1基因工程菌的构建

根据Genbank中的已知序列(accession NO.U09580)设计引物P1、P2(划线部分为酶切位点，分别是SnaB I和Not I)，以绿色木霉基因组为模板，进行PCR扩增，得到DNA片段bgl1。然后以P1(SEQ ID NO.2)，P2(SEQ ID NO.3)，P3(SEQ ID NO.4)，P4(SEQ ID NO.5)为引物，通过重叠PCR去除内含子，得到含有目的DNA片段bgl1(图1)，然后将β-葡萄糖苷酶基因bgl1与酵母表达载体pPIC9K相连，将重组质粒pPIC9K-bgl1电转整合到毕赤酵母KM71中。然后涂布到MD平板上，在MD平板长出单克隆，再经YPD-G418平板筛选多拷贝转化子，G418浓度筛选梯度依次为0.5mg/mL、1mg/mL、2mg/mL。挑取单菌落，经YPD液体培养基30℃培养24h后甘油保菌。

PCR扩增β-葡萄糖苷酶目的基因bgl1所用引物：

P1:5’-CCGTACGTAGTTGTACCTCCTGCAGGGAC-3’

P2:5’-ATAGCGGCCGCCGCTACCGACAGAGTGCT-3’

P3:5’-TTGGTGTAAGACAGTCCATAGCCGAACTCG-3’

P4:5’-TATGGACTGTCTTACACCAAGTTCAACTAC-3’

实施例2：发酵生产β-葡萄糖苷酶

1、(1)分批发酵阶段：将种子液以8％-10％接种量接种于发酵罐中，控制温度28-32℃、初始转速180-200rpm、初始通气量7L/min、溶氧28-32％、pH 4.5-5.5；(2)补料发酵阶段：待溶氧上升至80-100％，以恒速流加甘油的方式进行补料培养，控制温度28-30℃、溶氧28-32％、pH 4.5-5.5；(3)诱导培养阶段：当菌体细胞浓度达到OD₆₀₀为80-120时，用甲醇流加仪流加甲醇诱导产酶，甲醇浓度控制在0.5-1.5％，控制温度28-32℃、溶氧28-32％、pH4.5-5.5，诱导96-144h。将发酵液离心取上清液，得到粗酶液，测得重组β-葡萄糖苷酶酶活为1020U/mL，相比于目前报导的绿色木霉β-葡萄糖苷酶发酵得到的最高水平60U/ml提高了22.4倍。重组β-葡萄糖苷酶蛋白SDS-PAGE电泳图见图2。

实施例3：β-葡萄糖苷酶的酶学性质

将得到的β-葡萄糖苷酶酶液用上述所述的酶活测定方法进行酶学定性，以pNPG为底物，在不同的温度下测酶活，结果表明β-葡萄糖苷酶的最适温度为60℃(图3)。然后在最适温度条件下设置不同pH梯度测β-葡萄糖苷酶的酶活，得出该酶的最适pH为5(图4)。

实施例4：β-葡萄糖苷酶在低聚龙胆糖制备中的应用

以葡萄糖和纤维二糖为底物，在pH5、60℃反应条件，β-葡萄糖苷酶添加量为400U/g纤维二糖，设置葡萄糖和纤维二糖的摩尔比为4:1、2:1、1:1和1:2，转化31h，探究以葡萄糖和纤维二糖为底物利用转苷活性合成低聚龙胆糖时底物葡萄糖和纤维二糖的摩尔配比，实验结果见表1，当葡萄糖与纤维二糖摩尔比为1:1时，低聚龙胆糖的产量最高，随着纤维二糖所占的比例的增大低聚龙胆糖的产量也会有一定幅度的增加，但幅度很小，而且纤维二糖价格高于葡萄糖，综合成本和产量考虑选择葡萄糖与纤维二糖摩尔比为1:1最为合适。此时低聚龙胆糖的产量能达到25g/L，转化率为16.7％。实施例4、5、6中葡萄糖浓度与纤维二糖浓度均是质量比体积浓度，5％葡萄糖即为终浓度为5g/100mL的葡萄糖。

表1葡萄糖与纤维二糖摩尔比对低聚龙胆糖产量的影响

实施例5：β-葡萄糖苷酶在低聚龙胆糖制备中的应用

以葡萄糖和纤维二糖为底物，在pH5，60℃反应条件，在葡萄糖浓度为5％、纤维二糖浓度为10％的溶液中添加不同添加量的β-葡萄糖苷酶转化31h，研究加酶量对低聚龙胆糖产量的影响。结果如图5所示，确定β-葡萄糖苷酶的最适加酶量为400U/g纤维二糖。

实施例6：β-葡萄糖苷酶在低聚龙胆糖制备中的应用

在实施例4和实施例5优化的最优条件下探究不同浓度的葡萄糖和纤维二糖溶液对酶反应的影响，最终低聚龙胆糖累积含量如表2所示，低聚龙胆糖累积含量在一定范围内随底物浓度的升高而增加，但当底物浓度达到20％葡萄糖、40％纤维二糖时，增加葡萄糖和纤维二糖已经不能显著增加低聚龙胆糖的产量了，转化率有所降低。所以从节约成本和低聚龙胆糖产量的角度来考虑，选择底物浓度为20％葡萄糖、40％纤维二糖时最合适，此时低聚龙胆糖的产量能达到116g/L，转化率为19.4％。

表2底物浓度对低聚龙胆糖产量的影响

虽然本发明已以较佳实施例公开如上，但其并非用以限定本发明，任何熟悉此技术的人，在不脱离本发明的精神和范围内，都可做各种的改动和修饰，因此本发明的保护范围应该以权利要求书所界定的为准。

序列表

<110> 江南大学

<120> 一种低聚龙胆糖的制备方法

<160> 5

<170> PatentIn version 3.3

<210> 1

<211> 713

<212> PRT

<213> Trichoderma viride

<400> 1

Val Val Pro Pro Ala Gly Thr Pro Trp Gly Thr Ala Tyr Asp Lys Ala

1 5 10 15

Lys Ala Ala Leu Ala Lys Leu Asn Leu Gln Asp Lys Val Gly Ile Val

20 25 30

Ser Gly Val Gly Trp Asn Gly Gly Pro Cys Val Gly Asn Thr Ser Pro

35 40 45

Ala Ser Lys Ile Ser Tyr Pro Ser Leu Cys Leu Gln Asp Gly Pro Leu

50 55 60

Gly Val Arg Tyr Ser Thr Gly Ser Thr Ala Phe Thr Pro Gly Val Gln

65 70 75 80

Ala Ala Ser Thr Trp Asp Val Asn Leu Ile Arg Glu Arg Gly Gln Phe

85 90 95

Ile Gly Glu Glu Val Lys Ala Ser Gly Ile His Val Ile Leu Gly Pro

100 105 110

Val Ala Gly Pro Leu Gly Lys Thr Pro Gln Gly Gly Arg Asn Trp Glu

115 120 125

Gly Phe Gly Val Asp Pro Tyr Leu Thr Gly Ile Ala Met Gly Gln Thr

130 135 140

Ile Asn Gly Ile Gln Ser Val Gly Val Gln Ala Thr Ala Lys His Tyr

145 150 155 160

Ile Leu Asn Glu Gln Glu Leu Asn Arg Glu Thr Ile Ser Ser Asn Pro

165 170 175

Asp Asp Arg Thr Leu His Glu Leu Tyr Thr Trp Pro Phe Ala Asp Ala

180 185 190

Val Gln Ala Asn Val Ala Ser Val Met Cys Ser Tyr Asn Lys Val Asn

195 200 205

Thr Thr Trp Ala Cys Glu Asp Gln Tyr Thr Leu Gln Thr Val Leu Lys

210 215 220

Asp Gln Leu Gly Phe Pro Gly Tyr Val Met Thr Asp Trp Asn Ala Gln

225 230 235 240

His Thr Thr Val Gln Ser Ala Asn Ser Gly Leu Asp Met Ser Met Pro

245 250 255

Gly Thr Asp Phe Asn Gly Asn Asn Arg Leu Trp Gly Pro Ala Leu Thr

260 265 270

Asn Ala Val Asn Ser Asn Gln Val Pro Thr Ser Arg Val Asp Asp Met

275 280 285

Val Thr Arg Ile Leu Ala Ala Trp Tyr Leu Thr Gly Gln Asp Gln Ala

290 295 300

Gly Tyr Pro Ser Phe Asn Ile Ser Arg Asn Val Gln Gly Asn His Lys

305 310 315 320

Thr Asn Val Arg Ala Ile Ala Arg Asp Gly Ile Val Leu Leu Lys Asn

325 330 335

Asp Ala Asn Ile Leu Pro Leu Lys Lys Pro Ala Ser Ile Ala Val Val

340 345 350

Gly Ser Ala Ala Ile Ile Gly Asn His Ala Arg Asn Ser Pro Ser Cys

355 360 365

Asn Asp Lys Gly Cys Asp Asp Gly Ala Leu Gly Met Gly Trp Gly Ser

370 375 380

Gly Ala Val Asn Tyr Pro Tyr Phe Val Ala Pro Tyr Asp Ala Ile Asn

385 390 395 400

Thr Arg Ala Ser Ser Gln Gly Thr Gln Val Thr Leu Ser Asn Thr Asp

405 410 415

Asn Thr Ser Ser Gly Ala Ser Ala Ala Arg Gly Lys Asp Val Ala Ile

420 425 430

Val Phe Ile Thr Ala Asp Ser Gly Glu Gly Tyr Ile Thr Val Glu Gly

435 440 445

Asn Ala Gly Asp Arg Asn Asn Leu Asp Pro Trp His Asn Gly Asn Ala

450 455 460

Leu Val Gln Ala Val Ala Gly Ala Asn Ser Asn Val Ile Val Val Val

465 470 475 480

His Ser Val Gly Ala Ile Ile Leu Glu Gln Ile Leu Ala Leu Pro Gln

485 490 495

Val Lys Ala Val Val Trp Ala Gly Leu Pro Ser Gln Glu Ser Gly Asn

500 505 510

Ala Leu Val Asp Val Leu Trp Gly Asp Val Ser Pro Ser Gly Lys Leu

515 520 525

Val Tyr Thr Ile Ala Lys Ser Pro Asn Asp Tyr Asn Thr Arg Ile Val

530 535 540

Ser Gly Gly Ser Asp Ser Phe Ser Glu Gly Leu Phe Ile Asp Tyr Lys

545 550 555 560

His Phe Asp Asp Ala Asn Ile Thr Pro Arg Tyr Glu Phe Gly Tyr Gly

565 570 575

Leu Ser Tyr Thr Lys Phe Asn Tyr Ser Arg Leu Ser Val Leu Ser Thr

580 585 590

Ala Lys Ser Gly Pro Ala Thr Gly Ala Val Val Pro Gly Gly Pro Ser

595 600 605

Asp Leu Phe Gln Asn Val Ala Thr Val Thr Val Asp Ile Ala Asn Ser

610 615 620

Gly Gln Val Thr Gly Ala Glu Val Ala Gln Leu Tyr Ile Thr Tyr Pro

625 630 635 640

Ser Ser Ala Pro Arg Thr Pro Pro Lys Gln Leu Arg Gly Phe Ala Lys

645 650 655

Leu Asn Leu Thr Pro Gly Gln Ser Gly Thr Ala Thr Phe Asn Ile Arg

660 665 670

Arg Arg Asp Leu Ser Tyr Trp Asp Thr Ala Ser Gln Lys Trp Val Val

675 680 685

Pro Ser Gly Ser Phe Gly Ile Ser Val Gly Ala Ser Ser Arg Asp Ile

690 695 700

Arg Leu Thr Ser Thr Leu Ser Val Ala

705 710

<210> 2

<211> 29

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 2

ccgtacgtag ttgtacctcc tgcagggac 29

<210> 3

<211> 29

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 3

atagcggccg ccgctaccga cagagtgct 29

<210> 4

<211> 30

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 4

ttggtgtaag acagtccata gccgaactcg 30

<210> 5

<211> 30

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 5

tatggactgt cttacaccaa gttcaactac 30

Claims

1.一种低聚龙胆糖的制备方法，其特征在于，所述方法是以葡萄糖和纤维二糖为底物，以β-葡萄糖苷酶为催化剂合成低聚龙胆糖。

2.根据权利要求1所述方法，其特征在于，所述方法的反应条件为以终浓度为5-30g/100mL的葡萄糖和终浓度为10-60g/100mL的纤维二糖为底物，β-葡萄糖苷酶加酶量为100-500U/g纤维二糖，在pH4-6、温度50-70℃下进行酶反应，反应周期为24-48h。

3.根据权利要求2所述方法，其特征在于，所述葡萄糖和纤维二糖的摩尔比为1:1。

4.根据权利要求1所述方法，其特征在于，所述方法的反应条件为以终浓度为20g/100mL的葡萄糖和终浓度为40g/100mL的纤维二糖为底物，β-葡萄糖苷酶加酶量为400U/g纤维二糖，在pH5、温度60℃下进行酶反应，反应周期为31h。

5.根据权利要求1所述方法，其特征在于，所述方法是毕氏酵母基因工程菌经发酵后得到的β-葡萄糖苷酶作为催化剂，所述基因工程菌是将氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示β-葡萄糖苷酶基因连接到表达载体pPIC9K上，导入毕赤酵母KM71中获得。

6.一种高产β-葡萄糖苷酶的毕赤酵母基因工程菌，其特征在于，所述毕赤酵母基因工程菌能够表达氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示β-葡萄糖苷酶基因。

7.根据权利要求6所述毕赤酵母基因工程菌，其特征在于，所述毕赤酵母基因工程菌是将氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示β-葡萄糖苷酶基因连接到表达载体pPIC9K上，导入毕赤酵母KM71中获得。

8.一种应用权利要求6所述毕赤酵母基因工程菌生产β-葡萄糖苷酶的方法，其特征在于，所述方法包括：(1)分批发酵阶段：将种子液以8％-10％接种量接种于发酵罐中，控制温度28-32℃、初始转速180-200rpm、初始通气量7L/min、溶氧28-32％、pH 4.5-5.5；(2)补料发酵阶段：待溶氧上升至80-100％，以恒速流加甘油的方式进行补料培养，控制温度28-30℃、溶氧28-32％、pH 4.5-5.5；(3)诱导培养阶段：当菌体细胞浓度达到OD₆₀₀为80-120时，用甲醇流加仪流加甲醇诱导产酶，甲醇浓度控制在0.5-1％，控制温度28-32℃、溶氧28-32％、pH 4.5-5.5，诱导96-144h。

9.根据权利要求8所述的方法，其特征在于，诱导培养阶段是当菌体细胞浓度达到OD600为100时，开始流加甲醇诱导产酶；诱导培养阶段控制温度为28℃。

10.权利要求1所述方法在食品方面的应用。