CN103571809A - 一种新的β-葡萄糖苷酶、其编码基因及其用途 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一种新型β-葡萄糖苷酶、其编码基因及其高效异源表达。本发明还涉及含有所述编码基因的表达载体和宿主细胞。本发明还涉及表达编码基因的宿主细胞及其诱导培养条件。本发明还涉及利用所述β-葡萄糖苷酶将纤维素降解过程中所生成的纤维二糖水解为葡萄糖的方法。本发明的β-葡萄糖苷酶具有弱酸性条件下稳定性好和活性高的特点，可良好地应用于工业生产。

Description

一种新的β-葡萄糖苷酶、其编码基因及其用途

技术领域

本发明属于生物技术领域，涉及一种新的β-葡萄糖苷酶、其编码基因、用途、及其高效异源表达。

背景技术

纤维素是多个葡萄糖残基以β-1,4-糖苷链连接而成的多聚物，是地球上最丰富的可再生的生物质资源。以木质纤维素为原料、用纤维素酶水解纤维素生成葡萄糖，进而发酵为燃料乙醇成为应对当今世界能源危机、环境污染等问题的重要出路。

纤维素酶是指能够将纤维素转化成葡萄糖的一系列酶的总称，主要包括内切葡聚糖酶(endo-β-1,4-glucanase，EC 3.2.1.4)、外切葡聚糖酶(exoglucanase，EC 3.2.1.91)和β-葡萄糖苷酶(β-glucosidase，EC 3.2.1.21)。内切葡聚糖酶作用于纤维素长链分子的内部将长纤维切成短纤维，外切葡聚糖酶作用于纤维素分子的一端，以两个葡萄糖残基为单位进行切割生成纤维二糖，β-葡萄糖苷酶切割纤维二糖及一些纤维寡糖最终生成单个的葡萄糖分子。

作为纤维素复合酶系的重要组成之一，β-葡萄糖苷酶的关键作用主要体现在两个方面：一方面，由于纤维二糖积累对其上游内切葡聚糖酶和外切葡聚糖酶的活性具有显著的反馈抑制作用，因此，β-葡萄糖苷酶对纤维二糖的高效水解能力对纤维素的彻底降解起到至关重要的作用。另一方面，除水解活性，β-葡萄糖苷酶还具有转糖苷活性，在一定的条件下可以通过转糖苷作用将两个葡萄糖分子合成一个槐糖分子，而已经发现槐糖是纤维素酶基因表达的强诱导物。一般认为丝状真菌中纤维素酶合成的诱导机制是：存在于分生孢子和菌丝表面的少量组成型纤维素酶首先降解纤维素生成纤维二糖等寡糖，然后在质膜结合的葡萄糖苷酶的转糖苷作用下，生成槐糖等诱导物，经细胞膜上的组成型透性酶系统进人细胞内，启动纤维素酶的合成。由此可见，提高β-葡萄糖苷酶在纤维素降解体系的催化活性，对于提高纤维素降解体系转化效率及降低纤维素乙醇产业生产成本，具有巨大的商业价值和现实意义。

β-葡萄糖苷酶底物专一性差异很大，除了作用于纤维二糖及纤维糊精而在纤维素产乙醇产业方面发挥重要作用外，还可作用于芳基葡萄糖苷(如熊果甙、水杨苷及生色化合物p-硝基苯基-β-D-吡喃葡萄糖苷)、烷基葡萄糖苷(甲基-β-D-葡萄糖苷)及β-1，3-葡萄糖苷(昆布二糖)等。因此在其他领域的应用也非常广泛。例如在食品行业中，由于它能将水果中糖苷前体的芳香族化合物释放变为具有浓郁香味的化合物，从而改善茶叶、果汁和果酒的风味，因此其作为特殊的风味酶已得到广泛应用；在医药保健品行业中，β-葡萄糖苷酶可通过生物转化功能，将某些广泛存在的天然产物转化为在自然界稀有甚至不存在的物质。例如，β-葡萄糖苷酶可将无活性的结合型大豆异黄酮转化为具有生理活性的游离型苷元，进而发挥改善更年期综合症、预防骨质疏松、抗氧化等生物学功能等。

β-葡萄糖苷酶广泛存在于自然界中许多植物和微生物体内。由于植物来源的β-葡萄糖苷酶活性远比微生物来源要低，所以其分离主要集中在微生物上。现有技术中的大部分，尤其是细菌来源的β-葡萄糖苷酶的活力较低，在产量、理化特性、催化效率等方面也远远不能满足现代工业生产的需求。因此在工业生产中研究较多的是曲霉，通过自然选育、诱变育种、原生质体诱变和基因工程手段，人们选育出了众多的高产黑曲霉和米曲霉等菌株并优化了产酶工艺(应用生态学报，1999，10(6)：732-734；Appl.Environ.Microbiol，1998，64(10)：3607-3614)。同时国外一些知名酶制剂公司还利用这些高酶活的β-葡萄糖苷酶在产纤维素酶的工程菌株中进行重组表达，提高了产量(European PatentEP1225227；EP0244234；EP0121397)。但是目前工业上β-葡萄糖苷酶产量还是远远不够的，因而有必要进一步扩大筛选对象，从中筛选出酶活较高、理化特性更趋多样化的新的β-葡萄糖苷酶，并进行高效分泌表达来降低工业生产成本。

发明内容

本发明的目的在于提供一种新的β-葡萄糖苷酶、其编码基因及其用途。

在本发明的第一方面，提供一种分离的多肽，该多肽选自下组：

(a)具有SEQ ID NO:2所示的氨基酸序列的多肽；

(b)具有SEQ ID NO:2中第22-736位所示的氨基酸序列的多肽；

(b)将(a)或(b)的多肽的氨基酸序列经过一个或多个(如1-20个，较佳地1-10个；更佳地1-5个；更佳地1-3个)氨基酸残基的取代、缺失或添加而形成的，且具有(a)或(b)多肽功能的衍生的多肽；

(c)具有(a)或(b)多肽功能的(a)或(b)的多肽的片段(较佳地，其与SEQ IDNO:2的序列相同性高于70%；更佳地高于75%；更佳地高于80%；更佳地高于85%；更佳地高于90%；更佳地高于95%；更佳地高于98%或99%)；或

(d)在(a)或(b)多肽的N或C末端具有标签序列，或在(b)多肽的N末端具有信号肽序列的多肽。

在一个优选例中，所述的多肽来源于土曲霉(Aspergillus terreus)。

在本发明的另一方面，提供一种分离的多核苷酸，它包含一核苷酸序列，该核苷酸序列选自下组：

(1)编码所述多肽的多核苷酸；或

(2)与多核苷酸(1)互补的多核苷酸。

在一个优选例中，该多核苷酸编码如SEQ ID NO:2所示氨基酸序列的多肽，或编码SEQ ID NO:2中第22-736位所示的氨基酸序列的多肽。

在另一优选例中，该多核苷酸的核苷酸序列如SEQ ID NO:1所示；或如SEQ ID NO:1中第64-2211位所示。

在本发明的另一方面，提供一种载体，其含有所述的多核苷酸。

在另一优选例中，所述的载体是真核表达载体。

在另一优选例中，所述的载体是毕赤酵母表达载体，例如pPIC。

在另一优选例中，所述的载体是里氏木霉表达载体，例如骨架载体pHDt/sk。

在另一优选例中，所述的载体还含有与所述的多核苷酸操作性连接的启动子，所述的启动子具有SEQ ID NO:14所示的核苷酸序列。

在本发明的另一方面，提供一种遗传工程化的宿主细胞，它含有所述的载体，或其基因组中整合有所述的多核苷酸。

在另一优选例中，所述的宿主细胞为非生殖细胞。

在另一优选例中，所述的宿主细胞为真核细胞。

在另一优选例中，所述的宿主细胞为里氏木霉和毕赤酵母。

在本发明的另一方面，提供一种所述的多肽的制备方法，该方法包含：

(i)培养所述的宿主细胞，使之表达(较佳地，诱导其表达)所述的多肽；

(ii)收集含有所述的多肽的培养物；和

(iii)从培养物中分离出所述的多肽。

在本发明的另一方面，提供所述的多肽或所述的宿主细胞的培养物的用途，用于水解糖苷键；或用于形成简单糖(如葡萄糖)。

在另一优选例中，所述的多肽水解选自(但不限于)下述底物的糖苷键：水杨苷、纤维素、纤维二糖、熊果苷、芳基葡萄糖苷或烷基葡萄糖苷、β-1，4-葡萄糖苷、硝基苯-β-D-半乳糖、β-D-木糖苷、硝基苯-β-吡喃葡萄糖苷、硝基苯-β-盐藻糖苷、海带多糖、地衣多糖、或它们的混合物。

在本发明的另一方面，提供一种组合物，它含有所述的多肽或含有所含宿主细胞的培养物；以及食品学或工业上可接受的载体。

在另一优选例中，所述的组合物还含有调节酶活性的添加物，例如金属离子。

在本发明的另一方面，提供一种水解糖苷键或形成简单糖(如葡萄糖)的方法，该方法包含：用所述的多肽处理待水解的底物。

在另一优选例中，所述的底物选自(但不限于)：水杨苷、纤维素、纤维二糖、熊果苷、芳基葡萄糖苷或烷基葡萄糖苷、β-1，4-葡萄糖苷、硝基苯-β-D-半乳糖、β-D-木糖苷、硝基苯-β-吡喃葡萄糖苷、硝基苯-β-盐藻糖苷、海带多糖、地衣多糖、或它们的混合物。

在另一优选例中，在pH3.0-7.5条件下，用所述的多肽处理待水解的底物。

在另一优选例中，在pH4.0-7.0、更佳地pH4.5.0-6.5、更佳地pH5-5.5条件下，用所述的多肽处理待水解的底物。

在另一优选例中，在温度40-75℃条件下，用所述的多肽处理待水解的底物。

在另一优选例中，在温度45-70℃、更佳地50-65℃、更佳地55-60℃条件下，用所述的多肽处理待水解的底物。

在本发明的另一方面，提供所述多肽的用途，所述用途包括：

(1)催化人参皂苷Rg3水解为人参皂苷Rh2；

(2)水解β-糖苷型异黄酮为苷元型异黄酮；

(3)将白藜芦醇苷转化为白藜芦醇；

(4)水解乳糖的β-糖苷键；

(5)作为食品工业中调节风味的添加物；

(6)作为以纤维素为原料的乙醇发酵的添加物；或

(7)作为医药保健品的添加物(例如：将无活性的结合型大豆异黄酮转化为具有生理活性的游离型苷元)。

本发明的其它方面由于本文的公开内容，对本领域的技术人员而言是显而易见的。

附图说明

图1为重组里氏木霉和毕赤酵母基因组用验证引物PCR后的电泳图。图中，泳道M为λ-Hind III digest DNA marker的电泳结果(片段由上到下依次是23.13kb、9.416kb、6.557kb、4.361kb、2322bp、2027bp)，泳道1-3为3个里氏木霉BglS转化子基因组DNA为模板扩增bgls基因后的电泳图，泳道6-9为5个(P1-P5)毕赤酵母BglS转化子基因组DNA为模板扩增bgls基因后的电泳图。

图2为bgls基因的表达、表达产物的纯化SDS-PAGE图。其中，泳道M为蛋白Marker的电泳结果(分子量由上到下依次为94、66.2、45、26kDa)，泳道1为里氏木霉转化子A1的发酵上清液，泳道2为上清液挂镍柱后用含40mM咪唑缓冲液的洗脱液的电泳结果，泳道3为毕赤酵母转化子P1的发酵上清液，泳道4为上清液挂镍柱后用含40mM咪唑缓冲液的洗脱液的电泳结果，其他不相关泳道已去除。

图3为BglS在不同pH条件下的酶活力曲线。其中，◆表示柠檬酸钠缓冲液中的酶活力，■表示醋酸缓冲液中的酶活力，▲表示磷酸缓冲液中的酶活力，其中实线表示TrBgls重组蛋白，虚线表示PpBglS重组蛋白。

图4为BglS在不同温度条件下的酶活力曲线。■表示TrBglS重组蛋白的酶活力，▲为PpBglS重组蛋白的酶活力。

图5为重组BglS对不同温度的耐受性检测结果。其中，■表示50℃下的酶活力，▲表示60℃下的酶活力，实线表示TrBglS重组蛋白，虚线表示PpBglS重组蛋白。

图6为β葡萄糖苷酶水解糖苷键的位置示意图。

具体实施方式

本发明通过纤维素诱导培养土曲霉，得到mRNA并逆转录成cDNA单链，并以cDNA单链为模板，用聚合酶链式反应的方法得到β-葡萄糖苷酶基因bgls的编码序列，该β-葡萄糖苷酶基因编码序列可在宿主细胞中表达生产该β-葡萄糖苷酶，用于对硝基苯-β-D-葡萄糖苷(pNPG)及纤维二糖的降解。实验证明，与现有细菌来源的β-葡萄糖苷酶相比，本发明的β-葡萄糖苷酶BglS最适反应温度为60℃，在弱酸性条件下稳定性较好、活性较高，且能在里氏木霉中非常高效地分泌表达，具有良好地应用于工业生产的潜能。

如本文所用，术语“本发明的多肽”、“本发明的蛋白”、“本发明的β-葡萄糖苷酶”、“BglS蛋白”、“TrBglS蛋白”、“PpBglS蛋白”、“BglS多肽”、“TrBglS多肽”、“PpBglS多肽”或“β-葡萄糖苷酶BglS”可互换使用，都指具有β-葡萄糖苷酶BglS氨基酸序列(SEQ ID NO:2或其变异形式或衍生物)的蛋白或多肽。其包括含有或不含起始甲硫氨酸的β-葡萄糖苷酶BglS。其可含有或不含有信号肽序列。

如本文所用，术语“本发明的基因”、“bgls基因”、“bgls”指具有β-葡萄糖苷酶编码基因序列(SEQ ID NO:1或其变异形式或衍生物)的多核苷酸。其可含有或不含有信号肽编码序列。

如本文所用，术语“里氏木霉转化子”、“里氏木霉重组子”、“TrBglS里氏木霉重组子”或“TrBglS里氏木霉转化子”可互换使用，都指以里氏木霉为宿主，异源表达了土曲霉β-葡萄糖苷酶BglS氨基酸序列(SEQ ID NO:2或其变异形式或衍生物)。

如本文所用，术语“毕赤酵母转化子”、“毕赤酵母重组子”、“PpBglS毕赤酵母重组子”或“PpBglS毕赤酵母转化子”可互换使用，都指以毕赤酵母为宿主，异源表达了土曲霉β-葡萄糖苷酶BglS氨基酸序列(SEQ ID NO:2或其变异形式或衍生物)。

如本文所用，所述的“简单糖”指葡聚糖链(或多糖链)的糖苷键被切割后形成的一类糖的总称，其链长度低于被切割前。例如，所述的简单糖含有1-50个葡萄糖，较佳的，含有1-30个葡萄糖；更佳的，含有1-15个葡萄糖。所述的“简单糖”包括“葡萄糖”。

如本文所用，所述的“葡萄糖”指一种含有六个碳原子的单糖。分子式C₆H₁₂O₆。所述的“纤维二糖”是“两个葡萄糖”的聚合体。

如本文所用，“分离的”是指物质从其原始环境中分离出来(如果是天然的物质，原始环境即是天然环境)。如活体细胞内的天然状态下的多聚核苷酸和多肽是没有分离纯化的，但同样的多聚核苷酸或多肽如从天然状态中同存在的其他物质中分开，则为分离纯化的。

如本文所用，“分离的BglS蛋白或多肽”是指BglS多肽基本上不含天然与其相关的其它蛋白、脂类、糖类或其它物质。本领域的技术人员能用标准的蛋白质纯化技术纯化BglS蛋白。基本上纯的多肽在非还原聚丙烯酰胺凝胶上能产生单一的主带。BglS多肽的纯度能用氨基酸序列分析。

如本文所用，所述的“可操作地连接”或“操作性连接”是指两个或多个核酸区域或核酸序列的功能性的空间排列。例如：启动子区被置于相对于目的基因核酸序列的特定位置，使得核酸序列的转录受到该启动子区域的引导，从而，启动子区域被“可操作地连接”到该核酸序列上。

本发明的多肽可以是重组多肽、天然多肽、合成多肽，优选重组多肽。

本发明的多肽可以是天然纯化的产物，或是化学合成的产物，或使用重组技术从原核或真核宿主(例如，细菌、酵母、高等植物、昆虫和哺乳动物细胞)中产生。根据重组生产方案所用的宿主，本发明的多肽可以是糖基化的，或可以是非糖基化的。本发明的多肽还可包括或不包括起始的甲硫氨酸残基，还可包括或不包括信号肽序列。

本发明还包括BglS蛋白的片段、衍生物和类似物。如本文所用，术语“片段”、“衍生物”和“类似物”是指基本上保持本发明的天然BglS蛋白相同的生物学功能或活性的多肽。本发明的多肽片段、衍生物或类似物可以是(i)有一个或多个保守或非保守性氨基酸残基(优选保守性氨基酸残基)被取代的多肽，而这样的取代的氨基酸残基可以是也可以不是由遗传密码编码的，或(ii)在一个或多个氨基酸残基中具有取代基团的多肽，或(iii)成熟多肽与另一个化合物(比如延长多肽半衰期的化合物，例如聚乙二醇)融合所形成的多肽，或(iv)附加的氨基酸序列融合到此多肽序列而形成的多肽(如前导序列或分泌序列或用来纯化此多肽的序列或蛋白原序列，或与抗原IgG片段的形成的融合蛋白)。根据本文的教导，这些片段、衍生物和类似物属于本领域熟练技术人员公知的范围。

在本发明中，术语“BglS多肽”指具有BglS蛋白活性的SEQ ID NO:2序列的多肽。该术语还包括具有与BglS蛋白相同功能的、SEQ ID NO:2序列的变异形式。这些变异形式包括(但并不限于)：一个或多个(通常为1-50个，较佳地1-30个，更佳地1-20个，更佳地1-10个，最佳地1-5个)氨基酸的缺失、插入和/或取代，以及在C末端和/或N末端添加或缺失一个或数个(通常为20个以内，较佳地为10个以内，更佳地为5个以内)氨基酸。例如，在本领域中，用性能相近或相似的氨基酸进行取代时，通常不会改变蛋白质的功能。比如，在C末端和/或N末端添加或缺失一个或数个氨基酸通常也不会改变蛋白质的功能；又比如，仅表达该蛋白的催化结构域，而不表达碳水化合物结合结构域也能获得和完整蛋白同样的催化功能。因此该术语还包括BglS蛋白的活性片段和活性衍生物。例如，变异可以发生在SEQ ID NO:2的保守功能域(第40-313位，第356-604位，第655-725位氨基酸)之外。变异可以是1-3个氨基酸缺失、取代和插入。

该多肽的变异形式包括：同源序列、保守性变异体、等位变异体、天然突变体、诱导突变体、在高或低的严谨度条件下能与bgls DNA杂交的DNA所编码的蛋白、以及利用抗BglS多肽的抗体获得的多肽或蛋白。本发明还提供了其他多肽，如包含BglS多肽或其片段的融合蛋白。除了几乎全长的多肽外，本发明还包括了BglS多肽的片段。通常，该片段具有BglS多肽序列的至少约10个连续氨基酸，通常至少约30个连续氨基酸，较佳地至少约50个连续氨基酸，更佳地至少约80个连续氨基酸，最佳地至少约100个连续氨基酸。

发明还提供BglS蛋白或多肽的类似物。这些类似物与天然BglS多肽的差别可以是氨基酸序列上的差异，也可以是不影响序列的修饰形式上的差异，或者兼而有之。这些多肽包括天然或诱导的遗传变异体。诱导变异体可以通过各种技术得到，如通过辐射或暴露于诱变剂而产生随机诱变，还可通过定点诱变法或其他已知分子生物学的技术。类似物还包括具有不同于天然L-氨基酸的残基(如D-氨基酸)的类似物，以及具有非天然存在的或合成的氨基酸(如β、γ-氨基酸)的类似物。应理解，本发明的多肽并不限于上述例举的代表性的多肽。

修饰(通常不改变一级结构)形式包括：体内或体外的多肽的化学衍生形式如乙酰化或羧基化。修饰还包括糖基化，如那些在多肽的合成和加工中或进一步加工步骤中进行糖基化修饰而产生的多肽。这种修饰可以通过将多肽暴露于进行糖基化的酶(如哺乳动物的糖基化酶或去糖基化酶)而完成。修饰形式还包括具有磷酸化氨基酸残基(如磷酸酪氨酸，磷酸丝氨酸，磷酸苏氨酸)的序列。还包括被修饰从而提高了其抗蛋白水解性能或优化了溶解性能的多肽。

作为本发明的优选方式，所述的BglS蛋白的片段、衍生物、类似物、变异形式或修饰形式保留了发挥水解糖苷键功能的功能域；更佳地，所保留的功能域是：糖基水解酶第3家族氨基端保守功能域、糖基水解酶第3家族羧基端保守功能域和类纤维连接蛋白III结构域。更佳地，所保留的功能域是相应于SEQ ID NO:2氨基酸序列中第40-313位、第356-604位、第655-725位序列结构的功能域。

作为本发明的优选方式，“BglS蛋白保守性变异多肽”指与SEQ ID NO:2的氨基酸序列相比，有至多20个，较佳地至多10个，更佳地至多5个，最佳地至多3个氨基酸被性质相似或相近的氨基酸所替换而形成多肽。这些保守性变异多肽最好根据表1进行氨基酸替换而产生。

表1

最初的残基	代表性的取代	优选的取代
			Ala(A)	Val;Leu;Ile	Val
Arg(R)	Lys;Gln;Asn	Lys
			Asn(N)	Gln;His;Lys;Arg	Gln
Asp(D)	Glu	Glu
			Cys(C)	Ser	Ser
Gln(Q)	Asn	Asn
			Glu(E)	Asp	Asp
Gly(G)	Pro;Ala	Ala
			His(H)	Asn;Gln;Lys;Arg	Arg
Ile(I)	Leu;Val;Met;Ala;Phe	Leu
			Leu(L)	Ile;Val;Met;Ala;Phe	Ile
Lys(K)	Arg;Gln;Asn	Arg
			Met(M)	Leu;Phe;Ile	Leu
Phe(F)	Leu;Val;Ile;Ala;Tyr	Leu
			Pro(P)	Ala	Ala
Ser(S)	Thr	Thr
			Thr(T)	Ser	Ser
Trp(W)	Tyr;Phe	Tyr
			Tyr(Y)	Trp;Phe;Thr;Ser	Phe
Val(V)	Ile;Leu;Met;Phe;Ala	Leu

本发明的BglS蛋白的氨基端或羧基端还可含有一个或多个多肽片段，作为蛋白标签。任何合适的标签都可以用于本发明。例如，所述的标签可以是FLAG，HA，HA1，c-Myc，Poly-His，Poly-Arg，Strep-TagII，AU1，EE，T7，4A6，ε，B，gE以及Ty1。这些标签可用于对蛋白进行纯化。表2列出了其中的一些标签及其序列。

表2、标签的序列

为了使翻译的蛋白分泌表达(如分泌到细胞外)，还可在所述BglS的氨基酸氨基末端用pelB等信号肽替换本身信号肽序列。信号肽在多肽从细胞内分泌出来的过程中可被切去。

本发明的多核苷酸可以是DNA形式或RNA形式。DNA形式包括cDNA、基因组DNA或人工合成的DNA。DNA可以是单链的或是双链的。DNA可以是编码链或非编码链。编码成熟多肽的编码区序列可以与SEQ ID NO:1所示的编码区序列相同或者是简并的变异体。如本文所用，“简并的变异体”在本发明中是指编码具有SEQ ID NO:2的蛋白质或其片段、衍生物、类似物、变异形式，但与SEQ ID NO:1所示的编码区序列有差别的核酸序列。

编码SEQ ID NO:2的成熟多肽的多核苷酸包括：只编码成熟多肽的编码序列；成熟多肽的编码序列和各种附加编码序列；成熟多肽的编码序列(和任选的附加编码序列)以及非编码序列。术语“编码多肽的多核苷酸”可以是包括编码此多肽的多核苷酸，也可以是还包括附加编码和/或非编码序列的多核苷酸。

本发明还涉及上述多核苷酸的变异体，其编码与本发明有相同的氨基酸序列的多肽或多肽的片段、类似物和衍生物。此多核苷酸的变异体可以是天然发生的等位变异体或非天然发生的变异体。这些核苷酸变异体包括取代变异体、缺失变异体和插入变异体。如本领域所知的，等位变异体是一个多核苷酸的替换形式，它可能是一个或多个核苷酸的取代、缺失或插入，但不会从实质上改变其编码的多肽的功能。

本发明还涉及与上述的序列杂交且两个序列之间具有至少50%，较佳地至少70%，更佳地至少80%相同性的多核苷酸。本发明特别涉及在严格条件(或严谨条件)下与本发明所述多核苷酸可杂交的多核苷酸。在本发明中，“严格条件”是指：(1)在较低离子强度和较高温度下的杂交和洗脱，如0.2×SSC，0.1%SDS，60℃；或(2)杂交时加有变性剂，如50%(v/v)甲酰胺，0.1%小牛血清/0.1%Ficoll，42℃等；或(3)仅在两条序列之间的相同性至少在90%以上，更好是95%以上时才发生杂交。并且，可杂交的多核苷酸编码的多肽与SEQ ID NO:2所示的成熟多肽有相同的生物学功能和活性。

本发明还涉及与上述的序列杂交的核酸片段。如本文所用，“核酸片段”的长度至少含15个核苷酸，较好是至少30个核苷酸，更好是至少50个核苷酸，最好是至少100个核苷酸以上。核酸片段可用于核酸的扩增技术(如PCR)以确定和/或分离编码BglS蛋白的多聚核苷酸。

本发明中的多肽和多核苷酸优选以分离的形式提供，更佳地被纯化至均质。

本发明的bgls核苷酸全长序列或其片段通常可以用PCR扩增法、重组法或人工合成的方法获得。对于PCR扩增法，可根据本发明所公开的有关核苷酸序列，尤其是开放阅读框序列来设计引物，并用市售的cDNA库或按本领域技术人员已知的常规方法所制备的cDNA库作为模板，扩增而得有关序列。当序列较长时，常常需要进行两次或多次PCR扩增，然后再将各次扩增出的片段按正确次序拼接在一起。

一旦获得了有关的序列，就可以用重组法来大批量地获得有关序列。这通常是将其克隆入载体，再转入细胞，然后通过常规方法从增殖后的宿主细胞中分离得到有关序列。此外，还可用人工合成的方法来合成有关序列，尤其是片段长度较短时。通常，通过先合成多个小片段，然后再进行连接可获得序列很长的片段。

目前，已经可以完全通过化学合成来得到编码本发明蛋白(或其片段，或其衍生物)的DNA序列。然后可将该DNA序列引入本领域中已知的各种现有的DNA分子(或如载体)和细胞中。此外，还可通过化学合成将突变引入本发明蛋白序列中。

应用PCR技术扩增DNA/RNA的方法被优选用于获得本发明的基因。特别是很难从文库中得到全长的cDNA时，可优选使用RACE法(RACE-cDNA末端快速扩增法)，用于PCR的引物可根据本文所公开的本发明的序列信息适当地选择，并可用常规方法合成。可用常规方法如通过凝胶电泳分离和纯化扩增的DNA/RNA片段。

本发明也涉及包含本发明的多核苷酸的载体，以及用本发明的载体或BglS蛋白编码序列经基因工程产生的宿主细胞，以及经重组技术产生本发明所述多肽的方法。

通过常规的重组DNA技术，可利用本发明的多聚核苷酸序列可用来表达或生产重组的BglS多肽。一般来说有以下步骤：

(1).用本发明的编码BglS多肽的多核苷酸(或变异体)，或用含有该多核苷酸的重组表达载体转化或转导合适的宿主细胞；

(2).在合适的培养基中培养的宿主细胞；

(3).从培养基或细胞中分离、纯化蛋白质。

本发明中，bgls多核苷酸序列可插入到重组表达载体中。术语“重组表达载体”指本领域熟知的细菌质粒、噬菌体、酵母质粒、植物细胞病毒、哺乳动物细胞病毒如腺病毒、逆转录病毒或其他载体。只要能在宿主体内复制和稳定，任何质粒和载体都可以用。表达载体的一个重要特征是通常含有复制起点、启动子、标记基因和翻译控制元件。

本领域的技术人员熟知的方法能用于构建含BglS编码DNA序列和合适的转录/翻译控制信号的表达载体。这些方法包括体外重组DNA技术、DNA合成技术、体内重组技术等。所述的DNA序列可有效连接到表达载体中的适当启动子上，以指导mRNA合成。这些启动子的代表性例子有：大肠杆菌的lac或trp启动子；λ噬菌体PL启动子；真核启动子包括CMV立即早期启动子、HSV胸苷激酶启动子、早期和晚期SV40启动子、反转录病毒的LTRs和其他一些已知的可控制基因在原核或真核细胞或其病毒中表达的启动子。作为本发明的优选方式，当采用里氏木霉作为表达宿主时，采用具有SEQ ID NO:14所示的核苷酸序列的启动子。表达载体还包括翻译起始用的核糖体结合位点和转录终止子。

此外，表达载体优选地包含一个或多个选择性标记基因，以提供用于选择转化的宿主细胞的表型性状，如真核细胞培养用的二氢叶酸还原酶、新霉素抗性以及绿色荧光蛋白(GFP)，或用于大肠杆菌的四环素或氨苄青霉素抗性。包含上述的适当DNA序列以及适当启动子或者控制序列的载体，可以用于转化适当的宿主细胞，以使其能够表达蛋白质。

宿主细胞可以是原核细胞，如细菌细胞；或是低等真核细胞，如酵母细胞；或是高等真核细胞，如哺乳动物细胞。代表性例子有：大肠杆菌，链霉菌属；鼠伤寒沙门氏菌的细菌细胞；真菌细胞如酵母；植物细胞；果蝇S2或Sf9的昆虫细胞；CHO、COS、293细胞、或Bowes黑素瘤细胞的动物细胞等。作为本发明的优选方式，所述的宿主细胞是真菌细胞，例如酵母细胞、霉菌细胞；更佳地为毕赤酵母细胞或里氏木霉细胞。

本发明的多核苷酸在高等真核细胞中表达时，如果在载体中插入增强子序列时将会使转录得到增强。增强子是DNA的顺式作用因子，通常大约有到300个碱基对，作用于启动子以增强基因的转录。可举的例子包括在复制起始点晚期一侧的100到270个碱基对的SV40增强子、在复制起始点晚期一侧的多瘤增强子以及腺病毒增强子等。

用重组DNA转化宿主细胞可用本领域技术人员熟知的常规技术进行。当宿主是真核生物，可选用如下的DNA转染方法：磷酸钙共沉淀法，常规机械方法如显微注射、电穿孔、脂质体包装等。获得的转化子可以用常规方法培养，表达本发明的基因所编码的多肽。根据所用的宿主细胞，培养中所用的培养基可选自各种常规培养基。在适于宿主细胞生长的条件下进行培养。

在上面的方法中的重组多肽可在细胞内、或在细胞膜上表达、或分泌到细胞外。如果需要，可利用其物理的、化学的和其它特性通过各种分离方法分离和纯化重组的蛋白。这些方法的例子包括但并不限于：常规的复性处理、用蛋白沉淀剂处理(盐析方法)、离心、渗透破菌、超处理、超离心、分子筛层析(凝胶过滤)、吸附层析、离子交换层析、高效液相层析(HPLC)和其它各种液相层析技术及这些方法的结合。

为了使该蛋白便于纯化，可在SEQ ID NO:2所示的氨基酸序列组成的蛋白质或其变体或衍生物的氨基末端或者羧基末端连接上如表1所示的标签。为了便于蛋白在各种宿主中分泌表达，还可在SEQ ID NO:2的第1-21位信号肽序列用其他信号肽序列替换。

在本发明的优选实施方式中，本发明人经过对曲霉、木霉、青霉、草菇、元基因组或其他细菌来源的GH3家族基因进行分离克隆并在里氏木霉表达系统进行表达，在表达土曲霉β-葡萄糖苷酶BglS时，筛选到三株β-葡萄糖苷酶增加100倍以上的里氏木霉转化子A1、A2和A3，转化子的发酵液中含有大量的β葡萄糖苷酶，将其纯化分离后获得TrBglS，其最适pH为5.0，最适温度为60℃，和里氏木霉的纤维素酶酶系和β葡萄糖苷酶特性较为一致，以pNPG为底物，比活可达454.8±3.85U/mg,可良好地应用于里氏木霉纤维素酶系的复配或直接应用于如食品、纺织等行业中。同时发明人进一步将所述的土曲霉β-葡萄糖苷酶BglS在更为成熟的毕赤酵母表达系统进行分泌表达也获得了成功，纯化分离得到的PpBglS最适pH为5.0，最适温度为60℃，以pNPG为底物，比活为297.5±10.9U/mg，也具有一定的应用价值。本发明的β-葡萄糖苷酶BglS是首次在里氏木霉和毕赤酵母系统中首次成功获得分泌表达，特别是里氏木霉转化子的TrBglS分泌表达效率尤为突出，非常具有应用价值。

里氏木霉是商业纤维素酶的主要生产微生物，但其纤维素酶系中的β-葡糖苷酶比例与活性都偏低，成为高效水解纤维素，特别是工业上预处理秸秆的限制因子。因此，目前的商品化纤维素酶，都是在里氏木霉生产的酶制剂中再添加或复配从其他真菌(例如高产β-葡萄糖苷酶的黑曲霉)生产的β-葡糖苷酶。本发明利用构建的表达系统，在里氏木霉中异源表达多来源的β-葡糖苷酶，并通过比较和评价，获得异源表达土曲霉BglS木霉转化子，并筛选得到具有高分泌效率特性的转化子A1、A2、A3，加上转化子发酵培养的碳源是麸皮等简单易得的农用废弃物，在提高纤维素酶制剂的水解效率方面有着十分明显的作用，如应用在食品其他行业生产中，也将大大降低其生产成本。另外在毕赤酵母中的成功表达，也说明发明人分离筛选到的土曲霉GH3家族β-葡萄糖苷酶基因bgls可在多种宿主中表达，有着更为广泛的工业应用潜力。

本发明的β-葡萄糖苷酶和宿主发酵液可作用于纤维二糖，将纤维素内切酶和外切酶共同作用的产物进一步水解成葡萄糖，最终实现木质纤维素的降解。

本发明的β-葡萄糖苷酶(BglS)的用途包括(但不限于)：水解纤维素，将纤维二糖水解为葡萄糖；水解芳基葡萄糖苷、烷基葡萄糖苷、β-1，3-葡萄糖苷等；催化人参皂苷Rg3水解为抗癌活性更高的人参皂苷Rh2；把β-糖苷型异黄酮水解成苷元型异黄酮；使虎杖中白藜芦醇苷转化为白藜芦醇；水解牛奶中乳糖的β-糖苷键得到低乳糖牛奶；作为风味酶，水解风味物质与糖类形成的糖苷，释放出风味物质，改善果汁果酒茶叶风味等。大部分已知产β-葡萄糖苷酶的宿主都低于本发明的BglS里氏木霉转化子的产酶能力，加上里氏木霉发酵液中分离纯化的重组蛋白TrBglS本身活力也较高，预期通过蛋白分子改造等手段可以进一步提高BglS的酶活力、或扩大BglS适用的PH值范围、温度范围及热稳定性，通过对表达宿主进行进一步的遗传改造也有可能进一步提高BglS的产量，因此其应用前景良好。一些蛋白和宿主的分子改造技术是本领域人员熟知的，因此采用这些技术改造后生成的β-葡萄糖苷酶及宿主也包含在本发明中。

用表达的重组BglS蛋白筛选多肽库可用于寻找有治疗价值的能抑制或刺激BglS蛋白功能的多肽分子。

另一方面，本发明还包括对bgls DNA或是其片段编码的多肽具有特异性的多克隆抗体和单克隆抗体，尤其是单克隆抗体。这里，“特异性”是指抗体能结合于bgls基因产物或片段。较佳地，指那些能与bgls基因产物或片段结合但不识别和结合于其它非相关抗原分子的抗体。本发明中抗体包括那些能够结合并抑制BglS蛋白的分子，也包括那些并不影响BglS蛋白功能的抗体。本发明还包括那些能与修饰或未经修饰形式的bgls基因产物结合的抗体。

利用本发明蛋白，通过各种常规筛选方法，可筛选出与BglS蛋白发生相互作用的物质，如抑制剂、激动剂或拮抗剂等。

本发明还提供了一种组合物，它含有有效量的本发明的BglS多肽以及食品学上或工业上可接受的载体或赋形剂。这类载体包括(但并不限于)：水、缓冲液、葡萄糖、水、甘油、乙醇、及其组合。本领域技术人员可根据组合物的实际用途确定组合物中BglS多肽的有效量。

所述的组合物中还可添加调节本发明的BglS酶活性的物质。任何具有提高酶活性功能的物质均是可用的。本领域技术人员可根据组合物的实际用途确定添加改善酶活特性的物质。

在获得了本发明的BglS酶后，根据本发明的提示，本领域人员可以方便地应用该酶来发挥水解底物的作用。作为本发明的优选方式，还提供了一种形成葡萄糖的方法，该方法包含：用本发明所述的BglS酶处理待水解的底物，所述的底物包括对硝基苯-β-D-葡萄糖苷、对硝基苯纤维二糖苷、水杨苷和纤维二糖等，以及它们的混合物。通常，在pH4.5-6.5、优选为pH5条件下，用所述的BglS酶处理待水解的底物。通常在40-70℃、优选为60℃条件下，用所述的BglS酶处理待水解的底物。

本发明的多肽对于糖苷键具有识别和水解作用，因此，一系列糖链中具有糖苷键的物质均可作为本发明的多肽的底物。这些具有糖苷键的物质包括但不限于：水杨苷、纤维素、纤维二糖、熊果苷、芳基葡萄糖苷或烷基葡萄糖苷、β-1，4-葡萄糖苷、硝基苯-β-D-半乳糖、β-D-木糖苷、硝基苯-β-吡喃葡萄糖苷、硝基苯-β-盐藻糖苷、海带多糖、地衣多糖、或它们的混合物。本发明的多肽水解糖苷键的位置见图6，图中方框区内所示为带有葡萄糖苷键的结构，已该结构结合其它基团形成的物质都能用β葡萄糖苷酶水解。

在本发明的一个实例中，提供了一种分离的多核苷酸，它编码具有SEQ IDNO:2所示氨基酸序列的多肽，该多核苷酸是从土曲霉在纤维素诱导培养下通过mRNA逆转录成的cDNA中通过PCR分离出的。其序列如SEQ ID NO:1所示，它包含的多核苷酸序列全长为2211个碱基，编码全长为736个氨基酸的BglS蛋白(SEQ ID NO:2)。所述的BglS蛋白(SEQ ID NO:2)序列中，自氨基端的第40-313位氨基酸为糖基水解酶第3家族氨基端保守功能域，第356-604位为糖基水解酶第3家族羧基端保守功能域，第655-725位为类纤维连接蛋白III结构域。所述的BglS重组蛋白在里氏木霉重组子中用纤维素诱导能够高效分泌表达，在毕赤酵母有甲醇诱导后能分泌表达，宿主发酵液均具有很强的β-葡萄糖苷酶活性，证明是一种高效的β-葡萄糖苷酶。更佳地，在里氏木霉宿主中能够在纤维素和麸皮共同诱导下更高效的分泌表达。

实验证明本发明的β-葡萄糖苷酶具有很高的β-葡萄糖苷酶活性，在宿主中能很高效的分泌表达，因而具有巨大的应用前景。

下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件如J.萨姆布鲁克等编著，分子克隆实验指南，科学出版社，2002中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。除非另外说明，否则百分比和份数按重量计算。

实施例1、β-葡萄糖苷酶及其编码基因的分离

在37℃下，用含有纤维素的察氏培养基诱导培养土曲霉(NIH2624，购自购自美国菌种保藏中心)2天，抽提RNA，再逆转录成cDNA，通过土曲霉基因组数据库搜寻bgls基因号Gene：ATEG_07931(http://www.cadre-genomes.org.uk/Aspergillus_terreus)，以cDNA为模板，用聚合酶链式反应分离合成双链DNA，分离获得的基因具有SEQ ID NO:1的核苷酸序列，即为bgls编码序列。自SEQ ID NO:1的5’端第1至2211位核苷酸为bgls的开放阅读框(Open Reading Frame，ORF)，自SEQ ID NO:1的5’端的第1-3位核苷酸为bgls基因的起始密码子ATG，自SEQ ID NO:1的5’端的第2209至2211位核苷酸为bgls基因的终止密码子TGA。

β-葡萄糖苷酶基因bgls编码一个含有736个氨基酸的蛋白质BglS，具有SEQ ID NO:2的氨基酸残基序列，用软件预测到该蛋白质的理论分子量大小为76.28kDa，等电点pI为4.50。

自SEQ ID NO:2氨基端的第40-313位氨基酸为糖基水解酶第3家族氨基端保守功能域，第356-604位为糖基水解酶第3家族羧基端保守功能域，第655-725位为类纤维连接蛋白III结构域。所述的BglS重组蛋白在里氏木霉重组子中用纤维素诱导能够高效分泌表达，在毕赤酵母用甲醇诱导后能分泌表达，宿主发酵液均具有很强的β-葡萄糖苷酶活性，证明是一种高效的β-葡萄糖苷酶。更佳地，在里氏木霉宿主中能够在纤维素和麸皮共同诱导下更高效的分泌表达。

实施例2、bgls在宿主里氏木霉中的分泌表达

1、针对bgls优化表达的宿主改造

对木霉菌株RC30-8(参见Microbial Cell Factories，2012，11:21)的cbh1启动子(SEQ ID NO:13)进行定点突变。cbh1启动子存在三处碳代谢阻遏(CCR)蛋白Cre1的结合位点(5’-SYGGRG-3’或其互补序列)，导致其在葡萄糖阻遏条件下表达强度不够。在第一轮突变中，利用点突变将-724处的Cre1结合位点转化为转录激活因子Ace2的结合位点(5’-GGCTAA-3’)；在第二轮突变中，将-698和-690两处的CRE1结合位点都突变成Hap蛋白复合体的结合位点(5’-CCAAT-3’)，获得了突变启动子pchb1m2(SEQ ID NO:14)。以eGFP为报告基因，发现启动子经过第二次突变后，eGFP的相对转录水平增加提高了7.4倍。

通过PCR，以pcbh1m2为模版克隆启动子序列，所用正向引物为：5’GGACTAGTTTTCCCTGATTCAGCGTACCCG3’(SEQID NO:15)，其5’端添加Spe I识别位点：ACTAGT；反向引物为5’GCTCTAGAGATGCGCAGTCCGCGGTTGAC3’(SEQ ID NO:16)，其5’端添加Xba I识别位点：TCTAGA。将PCR产物纯化后用Spe I/Xba I双酶切后，应用Axygen PCR产物柱回收试剂盒回收酶切的DNA片段，将该DNA片段和XbaI单酶切的回收的载体pHDt/sk(参见Microbial Cell Factories，2012，11:21)去磷酸化处理后，用T4 DNA连接酶在16℃下连接过夜，得到重组表达载体pHDt/sk-pcbh1m2。

2.宿主里氏木霉中重组表达载体的构建

通过PCR，以上述分离到的基因为模板克隆β-葡萄糖苷酶ORF编码基因，所用正向引物为：5’GTATCTAGAATGAACTACCGTGTCCCCTC3’(SEQ IDNO:3)，其5’端添加Xba I识别位点：TCTAGA；反向引物为5’GCGTCTAGATCAAACAGTAAAAGACCCATC3’(SEQ ID NO:4)，其5’端添加Xba I识别位点：TCTAGA，并在终止密码子TCA的3’引入His标签(6×His-Tag)编码序列ATGATGATGATGATGATG。

将PCR产物纯化后用Xba I酶切，应用Axygen PCR产物柱回收试剂盒回收酶切的DNA片段，将该DNA片段和经同样酶切的回收的载体pHDt/sk-pcbh1m2去磷酸化处理后，用T4 DNA连接酶在16℃下连接过夜，得到重组表达载体pHDt/sk-pcbh1m2-trbgls。表达产物的C末端提供的His标签(6×His-Tag)，便于后续纯化。

3.bgls基因在里氏木霉中的表达

将上述构建好的质粒pHDt/sk-pcbh1m2-trbgls转化入根癌农杆菌AGL1(参见Microbial Cell Factories，2012，11:21)中，在根癌农杆菌的介导下转化入里氏木霉RC30-8菌株中，将长出的转化子接种于SDB培养液(购自上海莲冠生物化工有限公司)中，2天后抽提DNA为模板，通过载体上的启动子处设计正向引物5’CTCCAGGAGACTTGTACACCATC3’(SEQ ID NO:5)，通过bgls基因设计反向引物为5’GCGTCTAGATCAATGATGATGATGATGATGAACAGTAAAAGACCCATC3’(SEQ ID NO:4)，PCR鉴定阳性转化子。结果如图1所示，3个阳性转化子A1、A2、A3中均有目的片段扩出。

4.trbgls的表达和表达产物TrBglS的纯化

(1)trbgls的表达

接种里氏木霉转化子A1于10ml SDB培养液中，28℃200rpm培养2天。取1ml培养液到10ml含有诱导物(3%(w/v)微晶纤维素和2%(w/v)麸皮)的无机盐培养液(按照重量体积比(w/v)，0.4%KH₂PO₄，0.28%(NH₄)₂SO₄，0.06%MgSO₄·7H₂O，0.05%CaCl₂，0.06%尿素，0.3%蛋白胨，0.001%FeSO₄·7H₂O，0.00032% MnSO₄·H₂O，0.00028% ZnSO₄·7H₂O，0.0004% CoCl₂，pH调至5.5)中，28℃ 200rpm培养7天。4℃离心收集发酵上清液。上清做SDS-PAGE可检测目的蛋白，如图2。

(2)表达产物BglS蛋白的提取纯化

用结合缓冲液(binding buffer：NaH₂PO₄ 20mmol/L，Na₂HPO₄ 20mmol/L，0.5M NaCl，pH7.4)预处理购自GE公司的Ni柱(Ni-NTA Column)后，直接用发酵上清液过柱，在用含有不同浓度咪唑的洗脱液梯度洗脱，并收集。各浓度的洗脱液为上述裂解液分别加入终浓度20、40、60、80、100、200及500mM的咪唑，保持pH7.4不变。各咪唑浓度收集液，超滤去除咪唑后，用5μl洗脱液进行蛋白SDS-PAGE电泳检测，如图2所示。其中泳道M为蛋白分子量marker(分子量从大到小依次为94、66.2、45、26kDa)，泳道1为待纯化发酵液上清成分，泳道2为40mM咪唑洗脱液，从图中可见，咪唑浓度40mM时可将几乎全部杂蛋白去除。

实施例3、bgls在宿主毕赤酵母中的分泌表达

1.宿主毕赤酵母中重组表达载体的构建

通过PCR从上述分离到的基因为模板克隆β-葡萄糖苷酶ORF编码基因(信号肽编码序列除外)，所用正向引物为：5’ATATCGATTCTGACCACCTGGGACGCGGC3’(SEQ ID NO:6)，其5’端添加Cla I识别位点：ATCGAT；反向引物为5’GCTCTAGAGGAACAGTAAAAGACCCATCC3’(SEQ ID NO:7)，其5’端添加Xba I识别位点：TCTAGA。

将PCR产物纯化后用Cla I和Xba I双酶切，应用Axygen PCR产物柱回收试剂盒回收酶切的DNA片段，将该DNA片段和经同样双酶切的回收的载体pPICZαC(购自Invitrogen)，用T4DNA连接酶在16℃下连接过夜，得到重组表达载体pPICZαC-ppbgls。表达产物的C末端带有表达载体提供的His标签(6×His-Tag)，便于后续纯化。

2.bgls基因在毕赤酵母中的表达

将上述构建好的质粒pPICZαC-ppbgls转化入毕赤酵母KM71H(Invitrogen，CA，USA)菌株中，将在含有Zeocin的YPD平板上长出的菌落，用正向引物5’ATATCGATTCTGACCACCTGGGACGCGGC3’(SEQ ID NO:6)和反向引物5’GCTCTAGAGGAACAGTAAAAGACCCATCC3’(SEQ ID NO:7)为菌落PCR鉴定阳性转化子。结果如图1所示，5个阳性转化子P1、P2、P3、P4和P5中均有目的片段扩出。

3.ppbgls的表达和表达产物PpBglS的纯化

(1)ppbgls的表达

接种毕赤酵母转化子P1于50ml BMGY培养液（EasySelect PichiaExpression Kit，Invitrogen，CA，USA）中，30℃200rpm培养至OD₆₀₀ 4-5左右。3000×g离心5min收集菌体，用5ml BMMY（EasySelect Pichia ExpressionKit，Invitrogen，CA，USA）重悬后，在30℃下200rpm培养，每24小时补加至终浓度为0.5%(v/v)的甲醇，4天后4℃离心收集发酵上清液。上清做SDS-PAGE可检测目的蛋白(如图2)。

(2)表达产物BglS蛋白的提取纯化

用结合缓冲液(binding buffer：NaH₂PO₄ 20mmol/L，Na₂HPO₄ 20mmol/L，0.5M NaCl，pH7.4)预处理购自GE公司的Ni柱(Ni-NTA Column)后，直接用发酵上清液过柱，在用含有不同浓度咪唑的洗脱液梯度洗脱，并收集。各浓度的洗脱液为上述裂解液分别加入终浓度20、40、60、80、100、200及500mM的咪唑，保持pH7.4不变。各咪唑浓度收集液，超滤去除咪唑后，用5μl洗脱液进行蛋白SDS-PAGE电泳检测，如图2所示。其中泳道M为蛋白分子量marker(分子量从大到小依次为94、66.2、45、26kDa)，泳道3为发酵液上清成分，泳道4为40mM咪唑洗脱液，从图中可见，咪唑浓度40mM时可将几乎全部杂蛋白去除。

实施例4、重组BglS蛋白酶学性质的分析

以对硝基苯-β-D-葡萄糖苷(pNPG)为底物检测β-葡萄糖苷酶的酶活及理化特性，具体操作如下：

(1)对硝基苯酚(pNP)标准曲线制备

取8*3排列的PCR板，按表4加入溶液，共8组，每组3个平行重复。

表4

pNP浓度为10mg/ml。上表每份标样加100μl 1M NaCO₃，终止反应并显色，每管吸取100μl于酶标板中，用酶标仪测405nm光吸收，标样编号0为空白对照。各样品值减空白后制备标线。

(2)标准酶活测定

在100μl反应体系中，加入50μl浓度为4mM的pNPG，然后加入浓度为0.1M的NaAc/HAc(pH5.0)缓冲液稀释至一定稀释度的酶液50μl，60℃反应10分钟，再加入100μl1M NaCO₃终止反应并显色(对照为在上述反应体系中先加入100μl1M NaCO₃后再加酶液)，用酶标仪测405nm光吸收值，样品测定值减去对照后利用标准曲线计算酶活单位(U)。

酶活单位(U)定义：1U为每分钟催化pNPG产生1μmolpNP所需的酶量。

比活力单位的定义：每毫克蛋白质所含的酶活力(U/mg)。

结果表明TrBglS对pNPG在pH5.0，60℃下的比活力为454.8±3.85U/mg；而PpBglS，对pNPG在pH5.0，60℃下的比活力为297.5±10.9U/mg。且在不同宿主里面表达的Bgls重组蛋白的糖基化修饰程度不同导致比活力不一样。

(3)重组BglS最适pH测定

pH范围为3.0-7.5，每0.5个单位为一个梯度，不同pH值的缓冲液配制为：pH3.0-5.0用浓度为100mM的柠檬酸钠缓冲液；pH5.0-6.0用浓度为100mM的NaAc/HAc缓冲液；pH6.0-7.5用浓度为100mM Na₂HPO₄/NaH₂PO₄。将酶液加入各pH缓冲液的体系中稀释，按如前所述标准酶活测定步骤测定酶活。在60℃反应条件下，TrBglS和PpBglS均在pH5.0的NaAc/HAc缓冲液中的比活力最高，以此为100%，换算各pH值下的相对酶活力。

结果如图3所示，TrBglS和PpBglS最适pH为pH5.0的NaAc/HAc冲液，在pH4.5-6.5之间均具有最高活力40%以上的活力，说明BglS的反应pH范围偏酸性，能够适应酸性的反应环境，最适值约为pH5.0。

(4)重组BglS最适温度测定

在最适pH5.0条件下，在温度范围为40-75℃之间，按如前所述标准酶活测定方法步骤测定。结果如图4所示，重组BglS的最适温度为55-65℃，以60℃下酶活力为100%，换算各个温度下的相对酶活力后可知BglS在55-65℃的温度范围内可保持最高活力80%以上的活力。

(5)重组BglS温度耐受性测定

将BglS酶液保存于最适pH缓冲液中，在50℃和60℃下水浴温育，每隔30分钟后取样，在pH 5.0，60℃下测定酶活力。其对照是未热处理的酶液在pH 5.0，60℃下所测定的活力，以此为100%，换算在不同温度下保温每30分钟后的剩余相对活力。结果如图5所示，在60℃下保温30分钟后相对最大酶活TrBglS在40%以上，而PpBglS仅有30%左右，保温3小时之后，重组BglS相对最大酶活均在5%以下。在50℃的温度范围内保温30分钟后，约能剩余最大活力的70%左右，且3小时后，TrBglS能稳定在最大酶活的50%以上，而PpBglS稳定在最大酶活的40%以上；表明该酶50℃条件有较好的酶活稳定性，而在60℃条件下有较高酶促反应效率。

(6)重组BglS对不同底物的水解情况

将各种底物与适量酶在pH 5.0及60℃下作用10min，测定酶活力。其中，测定重组BglS对水杨苷的酶活力时，与测定对pNPG(对硝基苯-β-D-葡萄糖苷)的酶活力的体系相同，水杨苷的终浓度为1%(w/v)；测定BglS对纤维二糖的酶活力时，根据Sigma公司Glucose(GO)AssayKit(GAGO20)试剂盒说明书测定。结果如表5所示。

表5

实施例5、重组BglS蛋白变异体的活性分析

本发明人研究发现，自SEQ ID NO:2的氨基端的第1-21位为信号肽序列，第40-313位为糖基水解酶第3家族氨基末端保守功能域，第356-604位为糖基水解酶第3家族羧基末端保守功能域，第655-725位为类纤维连接蛋白III结构域。

用一编码序列替换表达载体pPICZαC-ppbgls中的BglS编码区，所述编码序列编码的蛋白具有SEQ ID NO:2中信号肽以外的编码区序列类似的序列，不同处仅在于第33位(以含信号肽的SEQ ID NO:2的序列位数计算)为Ile(BglS野生型蛋白中为Leu)。Ile和Leu同属于脂肪族中性氨基酸且结构相似，该位点变异对酶活性影响不大。

用一编码序列替换表达载体pPICZαC-ppbgls中的BglS编码区，所述编码序列编码的蛋白具有SEQ ID NO:2中信号肽以外的编码区序列类似的序列，不同处仅在于第628位(以含信号肽的SEQ ID NO:2的序列位数计算)为Ala(BglS野生型蛋白中为Val)。Ala和Val同属于脂肪族中性氨基酸且结构相似，该位点变异对酶活性影响不大。

用一编码序列替换表达载体pPICZαC-ppbgls中的BglS编码区，所述编码序列编码的蛋白具有SEQ ID NO:2中信号肽以外的编码区序列类似类似的序列，不同处仅在于第36位(以含信号肽的SEQ ID NO:2的序列位数计算)后面插入为一个氨基酸Gly。Gly为氨基酸中最小的且为中性，插入位点靠近蛋白氨基端，该位点插入对蛋白的三维结构基本没有变化，不会影响酶活。

将上述获得的纯化的重组BglS蛋白变异体如实施例4进行酶活测定，结果发现，它们的酶活与BglS野生型蛋白基本相同，在pH5、60℃下催化pNPG的比活力为250-350U/mg。

在本发明提及的所有文献都在本申请中引用作为参考，就如同每一篇文献被单独引用作为参考那样。此外应理解，在阅读了本发明的上述讲授内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。

Claims (12)

1.一种分离的多肽，其特征在于，该多肽选自下组：

(a)具有SEQ ID NO:2所示的氨基酸序列的多肽；

(b)具有SEQ ID NO:2中第22-736位所示的氨基酸序列的多肽；

(b)将(a)或(b)的多肽的氨基酸序列经过一个或多个氨基酸残基的取代、缺失或添加而形成的，且具有(a)或(b)多肽功能的衍生的多肽；

(c)具有(a)或(b)多肽功能的(a)或(b)的多肽的片段；或

(d)在(a)或(b)多肽的N或C末端具有标签序列，或在(b)多肽的N末端具有信号肽序列的多肽。

2.一种分离的多核苷酸，其特征在于，它包含一核苷酸序列，该核苷酸序列选自下组：

(1)编码如权利要求1所述多肽的多核苷酸；或

(2)与多核苷酸(1)互补的多核苷酸。

3.一种载体，其特征在于，其含有权利要求2所述的多核苷酸。

4.如权利要求3所述的载体，其特征在于，其还含有与权利要求2所述的多核苷酸操作性连接的启动子，所述的启动子具有SEQ ID NO:14所示的核苷酸序列。

5.一种遗传工程化的宿主细胞，其特征在于，它含有权利要求3或4所述的载体，或其基因组中整合有权利要求2所述的多核苷酸。

6.一种权利要求1所述的多肽的制备方法，其特征在于，该方法包含：

(i)培养权利要求5所述的宿主细胞，使之表达权利要求1所述的多肽；

(ii)收集含有权利要求1所述的多肽的培养物；和

(iii)从培养物中分离出权利要求1所述的多肽。

7.权利要求1所述的多肽或权利要求6所述的宿主细胞的培养物的用途，用于水解糖苷键；或用于形成简单糖。

8.一种组合物，其特征在于，它含有权利要求1所述的多肽或含有权利要求5所含宿主细胞的培养物；以及食品学或工业上可接受的载体。

9.一种水解糖苷键或形成简单糖的方法，其特征在于，该方法包含：用权利要求1所述的多肽处理待水解的底物。

10.如权利要求9所述的方法，其特征在于，在pH 3.0-7.5条件下，用权利要求1所述的多肽处理待水解的底物。

11.如权利要求9所述的方法，其特征在于，在温度40-75℃条件下，用权利要求1所述的多肽处理待水解的底物。

12.权利要求1所述多肽的用途，其特征在于，所述用途包括：

(1)催化人参皂苷Rg3水解为人参皂苷Rh2；

(2)水解β-糖苷型异黄酮为苷元型异黄酮；

(3)将白藜芦醇苷转化为白藜芦醇；

(4)水解乳糖的β-糖苷键；

(5)作为食品工业中调节风味的添加物；

(6)作为以纤维素为原料的乙醇发酵的添加物；或

(7)作为医药保健品的添加物。

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