CN104328098B - 一种β-葡萄糖苷酶及其制备方法与应用 - Google Patents

一种β-葡萄糖苷酶及其制备方法与应用 Download PDF

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Abstract

本发明属于基因工程技术及生物医药领域，具体涉及一种β‑葡萄糖苷酶及其制备方法与应用，尤其是应用于酶法转化制备人参皂苷20(S)‑Rg3的应用。本发明所述β‑葡萄糖苷酶能耐受高温，在70℃下保温3h酶活力几乎不变；本发明所述β‑葡萄糖苷酶对人参皂苷Rb1的转化能力强，本发明所述β‑葡萄糖苷酶与人参皂苷Rb1孵育60min，人参皂苷Rb1几乎完全转化为人参皂苷20(S)‑Rg3；本发明所述制备人参皂苷20(S)‑Rg3的方法酶促转化反应中间产物少，转化后产物人参皂苷20(S)‑Rg3纯度高。

Description

一种β-葡萄糖苷酶及其制备方法与应用
技术领域
本发明属于基因工程技术及生物医药领域，具体涉及一种β-葡萄糖苷酶及其制备方法与应用，尤其是应用于酶法转化制备人参皂苷20(S)-Rg3的应用。
背景技术
人参(Panax ginseng C.A.Meyer)是一种多年生五茄科人参属药用植物，是我国传统名贵中药材，对治疗心血管疾病、糖尿病、精神类等疾病有较好的疗效。现代药物学研究已证明人参皂苷是其主要活性成分[1]，其显著的抗肿瘤、抗炎、抗衰老活性一直以来都是研究的热点。
至今，已分离鉴定的人参皂苷有50余种，其中人参皂苷单体化合物Rg1、Rb1、Re、Rb2等含量较高，而人参皂苷Rd、Rg3、Rh2和Compound K等含量低，为稀有皂苷，但其药理活性优于上述高含量人参皂苷。其中，Rg3具有抗肿瘤、防治心脑血管疾病和冠心病、抑制癌细胞转移、保肝、保护神经、提高免疫力等多种药理活性。
然而Rg3不仅在天然人参中含量极其稀少，而且Rg3第20位的碳原子是手性碳，有两种旋光异构体：20(S)-Rg3和20(R)-Rg3。两者之间的理化及药理性质又具有较大的差异，特别是20(S)-Rg3的水溶性和生物利用度远远高于20(R)-Rg3，因此选择性的开发高效制备20(S)-Rg3的方法有重要的实际应用价值。
目前，制备20(S)-Rg3的方法主要包括化学方法、物理方法及生物转化法三种，其中有以20(S)-人参原三醇为原料通过化学合成制得20(S)-Rg3的报道，但是其反应步骤繁琐且得率很低，除此之外该方法所需原料本身也较难获得。而以人参中含量较高的Rb1，Rb2，Rc等人参皂苷通过热处理或酸处理等物理方法也能获得Rg3，但是所得产物为20(S)-Rg3和20(R)-Rg3的混合物，产品后期的分离耗时且成本较高。生物转化法主要有微生物转化法和酶法转化，微生物通过培养可以产生糖苷水解酶用于稀有人参皂苷的制备，但微生物产的酶种类复杂，各自专一性都有差异，使得微生物转化所得产物品质难以控制，对产品的纯度有一定影响。酶法转化能避免微生物转化法的缺陷，通过专一性的降解获得单一的转化产物。但是目前还没有用于生产人参皂苷20(S)-Rg3的糖苷水解酶被报道。
发明内容
本发明的一个目的在于提供一种β-葡萄糖苷酶，其氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示。
在一些实施方案中，本发明所述的β-葡萄糖苷酶，其核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示。
本发明的另一个目的在于提供本发明所述的β-葡萄糖苷酶的制备方法，为获得本发明所述的β-葡萄糖苷酶的DNA分子，将该DNA分子插入表达载体获得重组质粒，将重组质粒转化表达宿主菌诱导表达，分离纯化即得。
在一些实施方案中，本发明所述的β-葡萄糖苷酶的制备方法，具体包括如下步骤：
1)、以提取的Thermotoga petrophila DSM 13995基因组DNA为模板，用具有SEQID NO:3所示的核苷酸序列的上游引物和具有SEQ ID NO:4所示的核苷酸序列的下游引物扩增，PCR扩增得到权利要求1所述的β-葡萄糖苷酶的DNA分子；
2)、将得到的本发明所述的β-葡萄糖苷酶的基因和pET-20b分别用Nde I和Xho I进行双酶切，连接得到含有本发明所述的β-葡萄糖苷酶的DNA分子的重组质粒；
3)、将步骤2)得到的重组质粒转化表达宿主菌JM109(DE3)，IPTG诱导本发明所述的β-葡萄糖苷酶表达，离心收集菌体，破碎菌体后经Ni亲和层析柱纯化即得。
本发明还提供了一种包含本发明所述的β-葡萄糖苷酶的DNA分子的重组质粒。
在一些实施方案中，所述的重组质粒其核苷酸序列如SEQ ID NO.5所示。
本发明的另一个目的在于提供本发明所述β-葡萄糖苷酶在制备人参皂苷20(S)-Rg3中的应用。
本发明的另一个目的在于提供一种制备人参皂苷20(S)-Rg3的方法，本发明所述β-葡萄糖苷酶在下pH 5.0，90℃条件下专一性酶解人参皂苷Rb1制备得到人参皂苷20(S)-Rg3。
在一些实施方案中，本发明所述制备人参皂苷20(S)-Rg3的方法中，所述酶解时间≥5min。
在一些优选实施方案中，本发明所述制备人参皂苷20(S)-Rg3的方法中，所述酶解时间≥60min。
与现有技术相比，本发明具有如下有益效果之一：
(1)本发明所述β-葡萄糖苷酶能耐受高温，在70℃下保温3h酶活力几乎不变；
(2)本发明所述β-葡萄糖苷酶对人参皂苷Rb1的转化能力强，本发明所述β-葡萄糖苷酶与人参皂苷Rb1孵育60min，人参皂苷Rb1几乎完全转化为人参皂苷20(S)-Rg3；
(3)本发明所述制备人参皂苷20(S)-Rg3的方法酶促转化反应中间产物少，转化后产物人参皂苷20(S)-Rg3纯度高。
附图说明
为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍。
图1示本发明所述β-葡萄糖苷酶转化人参皂苷Rb1生成人参皂苷20(S)-Rg3的水解线路图；
图2示实施例2纯化的β-葡萄糖苷酶的纯度鉴定结果图；其中泳道M为蛋白Marker(购自Thermo scientific公司，货号2661)，泳道1为纯化的β-葡萄糖苷蛋白，泳道2为诱导表达后全细胞裂解液，泳道3为PET-20b转化宿主菌空白对照的全细胞裂解液；
图3示实施例3本发明所述述β-葡萄糖苷酶的定性测定结果图，其中图a为最适反应温度的测定结果图，横坐标为温度，单位摄氏度(℃)，纵坐标为相对酶活力，单位％；图b为最适反应pH的测定结果图，横坐标为pH，纵坐标为相对酶活力，单位％；图c为温度稳定性的测定结果图，其中为在90℃下保温不同时间的相对酶活结果图，为在80℃下保温不同时间的相对酶活结果图，为在70℃下保温不同时间的相对酶活结果图，横坐标为保温时间，单位小时(hour)，纵坐标为相对酶活力，单位％；图d为pH稳定性的测定结果图，横坐标为pH，纵坐标为相对酶活力，单位％。
具体实施方式
下面将结合本发明实施例，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
本发明提供了一种β-葡萄糖苷酶，其氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示，命名为TPEBGL3。
本发明也提供了编码本发明所述β-葡萄糖苷酶的DNA分子。由于密码子的简并性，可以存在很多种能够编码本发明所述的β-葡萄糖苷酶的核苷酸序列。
在一些实施方案中，本发明提供了可以编码所述的β-葡萄糖苷酶TPEBGL3的DNA分子，其核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示。
为了制备本发明所述蝎活性多肽，本发明还提供了本发明所述的β-葡萄糖苷酶的制备方法
在一些实施方案中，本发明所述的β-葡萄糖苷酶的制备方法，为获得本发明所述的β-葡萄糖苷酶的DNA分子，将该DNA分子插入表达载体获得重组质粒，将重组质粒转化表达宿主菌，诱导表达，分离纯化即得。
目前利用基因工程技术获得DNA分子的方法有很多种，包括利用限制性内切酶酶切具有编码所述β-葡萄糖苷酶DNA分子的载体或以具有编码所述β-葡萄糖苷酶DNA分子的cDNA为模板PCR扩增。
在一个实施方案中，本发明提供了以提取的Thermotoga petrophila DSM 13995基因组DNA为模板PCR扩增获取具有编码本发明所述的β-葡萄糖苷酶的DNA分子。
本发明所述β-葡萄糖苷酶的制备方法在获得具有编码本发明所述的β-葡萄糖苷酶的DNA分子后，将其插入表达载体获得重组质粒。具体操作为所得DNA分子通过凝胶电泳回收，然后将所得DNA分子和表达载体分别双酶切后连接转化感受态细胞，筛选阳性克隆，提取重组质粒。
其中，本发明所述表达载体包括pGEX系列、pET系列、pQE系列和pMAL系列。在一个优选实施方案中，表达载体为pET系列中的pET-20b。
本发明所述转化感受态细胞为大肠杆菌感受态细胞，包括DH5α菌株、TOP10菌株、JM109系列菌株和BL21系列菌株。在一个优选实施方案中，感受态细胞为JM109感受态细胞。
进一步，本发明所述β-葡萄糖苷酶的制备方法还包括对筛选的阳性克隆进行序列鉴定的步骤。
本发明同时还提供了一种包含本发明所述的β-葡萄糖苷酶的DNA分子的重组质粒。
在一些实施方案中，所述的重组质粒为pET-TPEBGL3，其核苷酸序列如SEQ IDNO.5所示。
本发明所述β-葡萄糖苷酶的制备方法在获得重组质粒后将其转化表达宿主菌，诱导表达分离纯化即得。
本发明所述转化表达宿主菌为大肠杆菌表达菌株，包括Rosetta系列和BL21、JM109系列菌株。在一个优选实施方案中，宿主细胞为JM109(DE3)菌株。
本发明所述β-葡萄糖苷酶的制备方法所述诱导表达分离纯化具体为IPTG诱导培养含重组质粒的表达宿主菌，收集菌体超声波破碎，取上清亲和层析得到融合蛋白。
其中，所述亲和层析的层析介质为根据表达载体的选择性标签选择的与之相匹配的层析介质。在一个优选实施方案中，表达载体为pET-20b，采用Ni亲和层析柱纯化。
在一些优选实施方案中，本发明所述的β-葡萄糖苷酶的制备方法，具体包括如下步骤：
1)、以提取的Thermotoga petrophila DSM 13995基因组DNA为模板，用具有SEQID NO.3所示的核苷酸序列的上游引物和具有SEQ ID NO.4所示的核苷酸序列的下游引物扩增，PCR扩增得到本发明所述的β-葡萄糖苷酶的DNA分子；
2)、将得到的本发明所述的β-葡萄糖苷酶的基因和pET-20b分别用Nde I和Xho I进行双酶切，连接得到含有本发明所述的β-葡萄糖苷酶的DNA分子的重组质粒；
3)、将步骤2)得到的重组质粒转化表达宿主菌JM109(DE3)，IPTG诱导本发明所述的β-葡萄糖苷酶表达，离心收集菌体，破碎菌体后经Ni亲和层析柱纯化即得。
在一些实施方案中，本发明分别在不同条件下测定制备得到的β-葡萄糖苷酶TPEBGL3的酶活以对制备得到的β-葡萄糖苷酶TPEBGL3的性质进行检测。结果显示本发明所述β-葡萄糖苷酶TPEBGL3最适pH为5.0，最适反应温度为90℃。本发明所述β-葡萄糖苷酶TPEBGL3在pH5.0-7.0条件下70℃保温1h后仍能具有80％－96％的残余酶活力，在70℃下保温3h酶活力几乎不变，在90℃保温3h仍具有50％以上的残余酶活力。
本发明还提供了一种制备人参皂苷20(S)-Rg3的方法，具体为本发明所述β-葡萄糖苷酶在下pH 5.0，90℃条件下专一性酶解人参皂苷Rb1制备得到人参皂苷20(S)-Rg3。
其中，在一些实施方案中，本发明所述制备人参皂苷20(S)-Rg3的方法中，所述酶解时间≥5min。
在一些优选实施方案中，本发明所述制备人参皂苷20(S)-Rg3的方法中，所述酶解时间≥60min。
进一步的，本发明所述制备人参皂苷20(S)-Rg3的方法中，本发明所述β-葡萄糖苷酶的添加量为0.009μg/μL。
实验表明，本发明所述β-葡萄糖苷酶可以专一性酶解人参皂苷Rb1制备得到人参皂苷20(S)-Rg3。在反应5min后即有人参皂苷Rb1转化为人参皂苷20(S)-Rg3，且随着反应时间的延长，转化率提高。在反应60min后，人参皂苷Rb1几乎完全转化为人参皂苷20(S)-Rg3，人参皂苷20(S)-Rg3得率约为96％。因此本发明还提供了本发明所述β-葡萄糖苷酶在制备人参皂苷20(S)-Rg3中的应用。
为了进一步理解本发明，下面结合实施例对本发明进行详细阐述，其中，如无特殊说明，实施例中涉及的各种反应试剂均可以通过商业渠道购买得到；如无特殊说明，实施例中涉及的具体操作参见《分子克隆实验指南第三版》。
实施例1：本发明所述β-葡萄糖苷酶基因的获得及重组质粒pET-TPEBGL3的构建
1.1Thermotoga petrophila DSM 13995的培养
Thermotoga petrophila DSM 13995购于DSMZ菌种保藏中心(www.dsmz.de)编号为13995，其培养基配方为：10g/L淀粉、5g/L胰蛋白胨、3g/L酵母提取物、5g/L肉浸液、10g/L2-马啉乙磺酸、10mg/L七水合硫酸铁、1mg/L刃天青,调整pH为7.2。用注射器按照0.5％接种量接种，85℃静止培养24h，收集细胞。
1.2基因组DNA的提取
(1)静置培养Thermotoga petrophila DSM 13995约24小时，取30mL菌液4,000g离心10min收集细胞。
(2)用9.5mL TE缓冲液重悬菌体，加入0.5mL 10％十二烷基硫酸钠(SDS)和50μL蛋白酶K(20mg/mL)，混合均匀，37℃保温1h。
(3)加入1.8mL 5mol/L NaCl，1.5mL十六烷基三乙基溴化铵(CTAB)/NaCl，混匀，65℃温育20min。
(4)加入等体积氯仿/异戊醇，混匀，6,000g离心10min。
(5)为防止剪切力造成基因组DNA断裂，用粗口吸管将上清转入另一离心管中，加入等体积酚/氯仿/异戊醇混匀，6,000g离心10min。
(6)另一离心管中，加入0.6倍体积异丙醇，轻轻晃动至白色丝状DNA沉淀清晰可见。
(7)用吸管将DNA缠绕其上，在70％酒精中清洗。
(8)用无菌牙签将DNA从吸管上刮下，转入1.5mL离心管中。
(9)室温下风干，加500μL TE缓冲液溶解。
(10)取50μL用核酸蛋白检测仪检测DNA浓度。
1.3重组质粒pET-BGL的构建
按照已知的Thermotoga petrophila DSM 13995耐高糖β-葡萄糖苷酶基因(登录号：YP_001244492.1)设计引物，引物由上海生物工程有限公司合成。引物序列如下：
P1：CGCCATATGATGGGAAAGATCGATGAAA，下划线表示Nde I位点(SEQ ID NO.3)。
P2：CCGCTCGAGTGGTTTGAATCTCTTCTCT，下划线表示Xho I位点，并去除终止密码子(SEQ ID NO.4)。
以提取的Thermotoga petrophila DSM 13995的基因组DNA为模板，用合成的引物进行PCR扩增，扩增的条件是95℃，5min；暂停计时，加Pyrobest聚合酶，加40μL石蜡油密封；30次循环(94℃，30s；58℃，30s；72℃，2.6min)；72℃，10min；反应停止，4℃保温。通过凝胶回收试剂盒对PCR扩增产物进行纯化。得到β-葡萄糖苷酶TPEBGL3的DNA分子。
将得到的β-葡萄糖苷酶TPEBGL3的DNA分子和pET-20b分别用Nde I和Xho I进行双酶切，并分别割胶回收，浓缩后16℃连接过夜，将连接产物转化大肠杆菌JM109感受态细胞，筛选阳性克隆，进行序列分析；挑选序列正确的克隆提取质粒，获得含有耐高温β-葡萄糖苷酶DNA分子的重组质粒pET-TPEBGL3，其核苷酸序列如SEQ ID NO.5所示。
实施例2：本发明所述β-葡萄糖苷酶的制备
将重组质粒pET-TPEBGL3转化大肠杆菌JM109(DE3)宿主菌(购自Novagen公司)，在含有氨苄青霉素(50μg/mL)的LB平板(LB培养基：胰蛋白胨10g/L，酵母提取物5g/L，NaCl5g/L，琼脂15g/L)上经过37℃培养过夜，挑转化子到200mL的LB培养基中(50μg/mL氨苄青霉素)37℃，200rpm振荡培养至OD600为0.6时，加入终浓度为0.5mM异丙基β-D-硫代吡喃半乳糖苷(IPTG)诱导剂，30℃培养6h，用高速冷冻离心机将培养液在4℃下，以13,000rpm离心15min，收集菌体。
由于重组质粒pET-TPEBGL3中含有His-tag标签，通过His·Bind PurificationKit(购自Novagen公司)进行纯化，得到纯化的重组酶。具体操作过程：
A.样品的处理
(1)将洗涤过的菌体，用1×Binding Buffer 8mL重悬，超声波破壁。
(2)破壁后，13,000g离心30min，取上清即为样品。
B.处理柱子
(1)取1mL填料装柱。
(2)用3mL的无菌水洗柱子。
(3)用5mL的1×Charge Buffer洗柱子。
(4)用3mL的1×Binding Buffer洗柱子。
C.上样
(1)将样品加入柱子，控制流速约每分钟6滴。
(2)用3mL 1×Binding Buffer洗柱子，除去未结合的蛋白质。
(3)用4mL含有20mM咪唑的洗脱液洗柱子，除去杂蛋白。
(4)用80mmol/L咪唑的洗脱液洗柱子，将目的蛋白洗脱下来。
(5)用4mL 1×Strip Buffer洗柱子。
通过此过程得到纯化的β-葡萄糖苷酶，纯化的β-葡萄糖苷酶的纯度鉴定采用SDS-PAGE方法进行，结果如图2所示。
由图2结果可见，TpeBgl3基因在宿主菌JM109(DE3)中表达量较高，且目的蛋白通过HisTag标签纯化后，其洗脱液中β-葡萄糖苷酶TpeBgl3纯度较高，达到电泳纯级别。
实施例3：本发明所述β-葡萄糖苷酶的定性测定
1、酶活的测定方法
反应体系100μL，5μL 20mmol/L对硝基苯β-D葡萄糖苷(pNPG)中加入85μL100mmol/L柠檬酸-磷酸氢二钠缓冲液(pH 5.0)，先在90℃孵育3min，再加入10μL酶液(稀释到合适的倍数)反应10min，显色后再加入1mol/L的碳酸钠溶液600μL终止反应。在405nm下测定吸光值。酶活力单位(U)定义为：在测定条件下，每分钟产生1μmol p-硝基苯酚所需要的酶量为1个酶活力单位。
2、最适反应温度的测定
在60-100℃范围内，每隔5℃，分别测定酶活。缓冲为100mmol/L柠檬酸-磷酸氢二钠缓冲液，pH 5.0，结果如图3a所示。
由图3a结果可见，本发明所述β-葡萄糖苷酶的最适反应温度为90℃。
3、最适反应pH的测定
在不同的pH(3.5-7.5，100mmol/L柠檬酸-磷酸氢二钠缓冲液)条件下，90℃分别测定酶活，结果如图3b所示。
由图3b结果可见，本发明所述β-葡萄糖苷酶的最适反应pH为5.0。
4、温度稳定性的测定
在pH 5.0下，使酶在70℃，80℃，90℃温度下分别保温不同的时间(0，30，60，90，120，150，180min)，再测定相对酶活，以未保温(4℃保存)的酶活性为100％，结果如图3c所示。
由图3c结果可见，本发明所述β-葡萄糖苷酶在70℃下保温3h酶活力几乎不变，在90℃下保温3h仍具有50％以上的残余酶活力。
5、pH稳定性的测定
将纯化的重组酶TPEBGL3在不同的pH(3.0-7.5，100mmol/L柠檬酸-磷酸氢二钠缓冲液)下70℃处理1h，与不保温酶的酶活相比，结果如图3d所示。
由图3d结果可见，本发明所述β-葡萄糖苷酶在pH5.0-7.0条件下70℃保温1h后仍能具有80％-96％的残余酶活力。
实施例4：本发明所述β-葡萄糖苷酶转化人参皂苷Rb1制备20(S)-Rg3
酶转化反应体系为50μL，其中Rb1浓度为5mg/mL，酶添加量为0.45μg，反应在pH5.0，90℃下进行，分别对不同反应时间(0，10，20，30，40，50，60min)下的样品利用HPLC进行成分检测。其中人参皂苷Rb1标准品、人参皂苷Rd标准品和人参皂苷20(S)-Rg3标准品均购自成都曼斯特生物科技有限公司。
其中HPLC检测条件为:Agilent 1260Infinity；DAD检测器检测波长为203nm，柱温30℃，流动相流速为1.2mL/mim(A:水，B:乙腈；0min，A:B为68:32；20min，A:B为40:60；21min，A:B为40:60；22min A:B为68:32)，
检测结果可见，在反应5min后即有人参皂苷Rb1转化为人参皂苷20(S)-Rg3，且随着反应时间的延长，转化率提高。在反应60min后，人参皂苷Rb1几乎完全转化为人参皂苷20(S)-Rg3，人参皂苷20(S)-Rg3得率约为96％。

Claims (4)

1.SEQ ID NO.1所示的β-葡萄糖苷酶在制备人参皂苷20(S)-Rg3中的应用。
2.一种制备人参皂苷20(S)-Rg3的方法，SEQ ID NO.1所示的β-葡萄糖苷酶在pH 5.0，90℃条件下专一性酶解人参皂苷Rb1制备得到人参皂苷20(S)-Rg3。
3.根据权利要求2所述的方法，其中所述酶解时间≥5min。
4.根据权利要求3所述的方法，其中所述酶解时间≥60min。
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