CN108220309A

CN108220309A - 一种内切纤维素酶编码基因及其制备与应用

Info

Publication number: CN108220309A
Application number: CN201611133421.7A
Authority: CN
Inventors: 尹恒; 李悝悝; 王文霞; 谭海东
Original assignee: Dalian Institute of Chemical Physics of CAS
Current assignee: Dalian Institute of Chemical Physics of CAS
Priority date: 2016-12-10
Filing date: 2016-12-10
Publication date: 2018-06-29
Anticipated expiration: 2036-12-10
Also published as: CN108220309B

Abstract

本发明公开了一种来源于多粘类芽孢杆菌(Paenibacilluspolymyxa)的内切纤维素酶基因及其酶的制备方法与应用，即利用基因工程的技术方法，将该内切纤维素酶的基因克隆到大肠杆菌表达载体上，获得可异源表达该酶的大肠杆菌重组菌株，该菌株异源表达制备的内切纤维素酶，能高效降解魔芋多糖(又称魔芋葡甘聚糖)。本发明提供的内切纤维素酶可广泛应用于农业、食品、饲料添加剂、医药及葡甘露低聚糖制备等领域。

Description

一种内切纤维素酶编码基因及其制备与应用

技术领域

本发明涉及一种内切纤维素酶的基因序列及其制备方法和应用。本发明提供了该内切纤维素酶的重组质粒和重组基因工程菌株及其在多糖降解方面的应用。本发明提供的内切纤维素酶可广泛应用于农业、食品、饲料添加、医药及寡糖制备等领域。

背景技术

蒟蒻(Amorphophalluskonjac)，俗称魔芋，天南星科魔芋属多年生草本植物。魔芋中主要成分为魔芋多糖(又称魔芋葡甘露聚糖)，由葡萄糖与甘露糖组成。魔芋葡甘露聚糖通过β-1,4吡喃糖苷键将β-D-葡萄糖和β-D-甘露糖按1∶1.6或1∶1.69的摩尔比连接而成，每19个糖残基上有一个乙酰基团存在，其特殊的结构使其虽具有多种生物学功能。但是其在水中为胶体，粘度大、溶解度小，在后续加工利用上带来不便；其在各种食品中添加量小，影响了其生物活性。目前我国魔芋产业多停留在魔芋初级食品开发层面，亟需高值化加工技术，对魔芋主要成分魔芋葡甘露聚糖的深加工是魔芋下游产业的主要方向。

将魔芋多糖降解成魔芋寡糖，即魔芋葡甘露寡糖(Konjacoligo-glucomannan，KOGM)，其分子量小，在水中可溶，易于吸收，将会克服魔芋多糖在加工利用中问题。与魔芋多糖相比，魔芋寡糖具有优良的性能，具有改善食品品质，保鲜食品，改善人体肠道菌群，增强免疫力，调节血糖、血脂以及肠道解毒等生物活性。生理功能试验表明，葡甘露低聚糖除了具有低热量、稳定、安全无毒等良好的理化特性外，还具有促进以双歧杆菌为代表的有益菌群的增殖,改善肠道内菌群结构；减慢肠道粘膜分泌的β-糖苷酶的扩散速度，不升高血糖，提高机体抗氧化能力等功能。

目前尚无大量工业生产魔芋葡甘低聚糖的报道，其生产尚停留在实验室研究期间，获得葡甘低聚糖的方法主要有以下几种：(1)从天然原料(魔芋)中提取，但提取工艺复杂，且产率极低；(2)通过人工化学合成的方法获得，但此法步骤繁琐，成本太高；(3)利用酸水解魔芋葡甘露聚糖的方法获得，但这样生产的低聚糖性质不稳定，副产品多，不易得到特定的低聚糖；(4)利用物理方法降解得到，但此方法要利用现代化的生产设备，实验设备要求太高，不利于大量生产；(5)利用酶解葡甘露聚糖的方法获得，酶的反应效率高，方法简单、易控制，后期分离也容易，且酶作为一种生物制剂，不会带来化学试剂产生的不利因素。所以利用酶解葡甘露聚糖的方法生产葡甘露低聚糖是一条相对简单，容易研究的生产方法。

葡甘聚糖酶(glucomannanase)是一种能够将葡甘聚糖降解为葡甘低聚糖的酶，根据葡甘聚糖的结构，大部分的研究报道是葡甘聚糖酶的类似酶——甘露聚糖酶，而对于纤维素酶(葡聚糖酶)的研究相对较少。目前，对纤维素酶的研究多集中于纤维素类底物降解方面，而对半纤维素类底物(如魔芋)的研究相对较少。且已报道的纤维素酶对魔芋多糖的降解活性均较弱，不适于大规模应用。因此，寻找一种能够高效降解魔芋多糖的纤维素酶是降低葡甘露寡糖生产成本的有利途径。而由于纤维素酶在生物体内的含量非常少，借助基因水平进行高量表达和表征是提高纤维素酶产量的一种有效措施。

发明内容

本发明的第一个目的是提供一种新型的来源于多粘类芽孢杆菌(Paenibacilluspolymyxa)的内切纤维素酶Ppcell及其编码基因。

本发明的第二个目的是提供一种制备新型内切纤维素酶Ppcell的方法。

本发明的第三个目的是提供含有所述的内切纤维素酶Ppcell基因重组表达质粒和重组基因工程菌株。

本发明的第四个目的是提供一种新型内切纤维素酶Ppcell在魔芋多糖降解中的应用。

本发明所提供的内切纤维素酶Ppcell，来源于土壤中分离纯化的多粘类芽孢杆菌Paenibacilluspolymyxa，从中扩增出的内切纤维素酶Ppcell编码基因(命名为Ppcell)，具有下述核苷酸序列特征中的一种或二种以上：

1)序列表中SEQ ID NO.1的脱氧核糖核酸(DNA)序列；

2)编码序列表中SEQ ID NO.2氨基酸序列的脱氧核糖核酸(DNA)序列；

3)与SEQ ID NO.1限定的脱氧核糖核酸(DNA)序列的同源性达到80％及以上，且能编码降解葡聚糖的蛋白质的脱氧核糖核酸(DNA)序列；

4)对序列表中SEQ ID NO.1的脱氧核糖核酸(DNA)序列进行一个或几个核苷酸取代、缺失或添加而得到的编码具有内切纤维素酶活性的核苷酸序列。

本发明还提供了内切纤维素酶Ppcell的氨基酸序列，具有如下特征中的一种或二种以上：

1)序列表中的SEQ ID NO.2从氨基端开始的第1-553位氨基酸残基序列，其中1-545位为具有内切纤维素酶Ppcell活性的氨基酸序列，546-553位为酶切位点及His-Tag的氨基酸序列；

2)将序列表中的SEQ ID NO.2从氨基端开始的第1-553或1-545位氨基酸残基进行一个或两个以上氨基酸取代、缺失或添加而形成具有内切纤维素酶活性不变的氨基酸序列。

本发明的内切纤维素酶Ppcell的氨基酸序列及其核苷酸编码序列也可以根据预测的纤维素酶Ppcell的氨基酸序列及其核苷酸编码序列人工合成获得。

制备重组酶Ppcell的方法，是将内切纤维素酶基因克隆入重组表达载体，导入宿主细胞，获得重组表达的内切纤维素酶。

上述内切纤维素酶基因，其核苷酸序列具有如下特征中的一种或二种以上：

1)具有序列表中SEQ ID NO.1的脱氧核糖核酸(DNA)序列；

2)编码SEQ ID NO.2氨基酸序列的脱氧核糖核酸(DNA)序列；

3)对序列表中SEQ ID NO.1的脱氧核糖核酸(DNA)序列进行一个或两个以上核苷酸取代、缺失或添加而得到的编码具有内切纤维素酶活性的核苷酸序列；

所述的重组表达内切纤维素酶Ppcell的表达载体可以是大肠杆菌表达载体、酵母表达载体、枯草杆菌表达载体、乳酸菌表达载体、链霉菌表达载体、噬菌体载体、丝状真菌表达载体、植物表达载体、昆虫表达载体、或哺乳动物细胞表达载体等。

用于重组表达内切纤维素酶Ppcell的重组菌或转基因细胞系，可以是大肠杆菌宿主细胞(如Escherichia coli BL21、Escherichia coli JM109、Escherichia coli DH5α等)、酵母菌宿主细胞(如Saccharomyces cerevisiae、Pichiapastoris、Kluyveromyceslactis等)、枯草杆菌宿主细胞(如Bacillus subtilis R25、Bacillussubtilis9920等)、乳酸菌宿主细胞(如Lactic acid bacteria COCC101等)、放线菌宿主细胞(如Streptomyces spp.等)、丝状真菌宿主细胞(如Trichodermaviride、Trichodermareesei、Aspergillusniger、Aspergillusnidulans等)、昆虫细胞(如Bombyxmori、Antharaea eucalypti等)或哺乳动物细胞(如中国仓鼠卵巢细胞CHO、幼小仓鼠肾脏细胞BHK、中国仓鼠肺细胞CHL等)。

本发明的内切纤维素酶Ppcell的基因序列是通过PCR技术从多粘类芽孢杆菌(Paenibacilluspolymyxa)中克隆得到。该基因编码区长1662bp，属于糖苷水解酶GH(glycoside hydrolase)1家族。

本发明提供的内切纤维素酶在降解魔芋多糖中可以应用，包括以下应用中的一种或二种：

1)在断裂魔芋多糖的糖苷键，获得单糖或葡甘露寡糖中的应用；

2)在断裂甘露聚糖的糖苷键，获得单糖或甘露寡糖中的应用；

3)与其他葡甘露聚糖酶混合后，在协同断裂葡甘露聚糖糖苷键方面应用。

本发明从大肠杆菌重组表达获得的内切纤维素酶Ppcell，可以高效降解魔芋多糖，以魔芋多糖为底物时，在45℃、pH5.0的条件下具有最佳酶活性，比活为150U/mg。解决了现有β-1,4-葡寡糖生产成本高的难题，具有重要的实用价值，可应用于大规模的工业化生产。

本发明的内切纤维素酶Ppcell可广泛应用于农业、食品、饲料添加、医药及葡甘露寡糖的制备等领域。

附图说明

图1：内切纤维素酶基因Ppcell琼脂糖凝胶电泳检测。

图2：内切纤维素酶Ppcell表达及纯化的SDS-PAGE图。各泳道加入的样品分别是：泳道1-蛋白分子量标准，泳道2-250mM咪唑洗脱流穿液，泳道3-60mM咪唑洗脱流穿液，泳道4-40mM咪唑洗脱流穿液，泳道5-20mM咪唑洗脱流穿液，泳道6-Ppcell上柱三次流穿液。

图3：pH值对内切纤维素酶Ppcell的影响曲线。

图4：温度对内切纤维素酶Ppcell的影响曲线。

图5：内切纤维素酶Ppcell对魔芋多糖降解产物的MALDI-TOF-MS图谱。

具体实施方式

序列表

SEQ ID No.1的信息

(a)序列特征

长度：1662核苷酸

类型：核苷酸

链型：单链

(b)分子类型：DNA

序列描述：SEQ ID NO.1

ATGGCTGAATCTGACGAACAAGCACAGCCAGCTGCTGCCACAAGCAATATGCAGTCATACGTGGAAGCCATGCAGCCTGGATGGAATTTAGGAAATTCGCTGGATGCTGTCGGGGCGGATGAAACCGCCTGGGGCAATCCGCGCATTACCCAAGCTTTGATCCAGCAAATTGCTGCCCAAGGGTACAAAAGTATTCGGATTCCCGTCACCTGGGATAAGCATATTGGAGCCGCACCCCATTATACCGTTGAATCTGCTTACATGAACCGTGTGGAAGAGGTTGTTCGCTGGGCACTGGATGCCAATCTGTATGTCATGATTAATGTCCATCATGATTCATGGACGTGGGTAAGCAGTATGGAGCCCAAGCATGATGAAGTGTTAGCTCGCTATAACGCATTATGGACACAAATTGCCGACCGCTTTAAAAATCAGCCCAACAAGTTGATGTTTGAAAGTATTAACGAGCCCCGCTTTTCTGAAGGGGGAACCACGGATGAAGCGAAAATGAATCAGATGCTTCATGAGCTAAATGTATCCTTCCACAAAATCGTTCGCGCCTCCGGTGGTAAGAATGCCACTCGTCCCCTTGTCCTATCCGGTCTGGATGCTGCACCTGCCCAAGCCAAGATCAGCCAACTTGCCAACACGATTACTGGGCTGAACGATCCTAATCTGATTGCGACTGTTCACTATTATGGCTTTTGGCCTTTCAGTGTGAACATTGCCGGGAATACAACTTTTGATAAAGCTGCCCAAGACGATATTATTCAAACCTTTGATAATGTCTATAACACCTTTGTAGCCAAGGGAATCCCGGTTATTGTCGGTGAATATGGCCTGCTCGGTTTTGATAAACATACAGGTGTTATTGAACAGGGAGAAAAGCTGAAGTTTTTTGAATTTTTGACTTATTACATGAAAGTGAAGAAAGTAACAGGCATGCTCTGGGATAACGGCCAGCATTTGAATCGGAGCACTTACAAGTGGTCTGATCCTGAACTCTTTAATGTCATTAAGGCCAGCCTGAAAGGACGTTCCTCCAATGCAGCTAGTGATCTCATTCACTTGAAGAAAGGCTCTTCTATTCAGGATACCAAGATCACTCTAAACCTGAACGGCAACCAGTTGAAATCGCTCAATGCCAACAGCAAGCAGCTGAAACAGGGCACCGACTATACGCTGAGTGGAGATACATTAACCTTCAAAGCCAGCTTGCTCACCAGCCTAATTACTTCCGGTAAATATGGTGAGAATGCCGTCATTACCGCCAAGTTTAATAGGGGGGCAGATTGGAATTTTAAAGTCGTCGTGTATGATACGCCGAAATTAAGTGCTGTCGAAGGGACTACACAAGCCTTTACCATTCCAACAGACTTCCGTGGTAGCCTGCTTGCGACGATGGAAGCCGTGTATACGAATGGAGGCAATGCCGGTCCACAGGATTGGACACCTTATAAAGAGTTTGGCAATACTTTTGCCCCTTCCTATGATACGAATGGCATCAAGCTGCTGCCTGAATTTTTCAACAGTGTGAAGGATGGTGAAGTCACGTTGAAGTTCCACTTCTGGAGCGGCGATGTAGTGACATACAAAATCACCAAGAACGGAACCCGCGTGACGGGCACGACATCTCTCGAGCACCACCACCACCACCACTGA

SEQ ID No.2的信息

(a)序列特征

长度：553氨基酸

类型：氨基酸

链型：单链

(b)分子类型：蛋白

序列描述：SEQ ID NO.2

MAESDEQAQPAAATSNMQSYVEAMQPGWNLGNSLDAVGADETAWGNPRITQALIQQIAAQGYKSIRIPVTWDKHIGAAPHYTVESAYMNRVEEVVRWALDANLYVMINVHHDSWTWVSSMEPKHDEVLARYNALWTQIADRFKNQPNKLMFESINEPRFSEGGTTDEAKMNQMLHELNVSFHKIVRASGGKNATRPLVLSGLDAAPAQAKISQLANTITGLNDPNLIATVHYYGFWPFSVNIAGNTTFDKAAQDDIIQTFDNVYNTFVAKGIPVIVGEYGLLGFDKHTGVIEQGEKLKFFEFLTYYMKVKKVTGMLWDNGQHLNRSTYKWSDPELFNVIKASLKGRSSNAASDLIHLKKGSSIQDTKITLNLNGNQLKSLNANSKQLKQGTDYTLSGDTLTFKASLLTSLITSGKYGENAVITAKFNRGADWNFKVVVYDTPKLSAVEGTTQAFTIPTDFRGSLLATMEAVYTNGGNAGPQDWTPYKEFGNTFAPSYDTNGIKLLPEFFNSVKDGEVTLKFHFWSGDVVTYKITKNGTRVTGTTSLEHHHHHH

实施例1内切纤维素酶全长基因克隆

参照基因组DNA纯化试剂盒(Thermo，LOT 00105781)操作步骤提取多粘类芽孢杆菌的基因组DNA。对The National Center for BiotechnologyInformation(NCBI)数据库中内切纤维素酶基因序列进行多序列比对分析后，设计简并引物Ppcell-F:5’-CGGACGCATATGGAATCARCTMMCTTGGTCAC-3’；Ppcell-R:5’-GACGAGCTCGAGCTCCGCTTYATTYTTGGABRAAGTA-3’，以提取的多粘类芽孢杆菌的基因组DNA为模板，扩增编码内切纤维素酶成熟蛋白的基因序列(不包括信号肽基因)。PCR反应条件为：94℃3min，1个循环；94℃30s，55℃30s，72℃1min30s，30个循环；72℃5min，1个循环。PCR产物进行琼脂糖凝胶电泳分析后(见图1)，对目的基因进行切胶回收，经双酶切的方法连接到原核表达载体pET21a上后测序。

实施例2内切纤维素酶基因序列分析

测序结果采用GenBank数据库中的Basic Local Alignment Search Tool(BLAST)分析，DNAMAN软件进行多序列比对，Vector NTI分析序列信息。

获得的内切纤维素酶基因(命名为Ppcell)编码区长1662bp，其核苷酸序列如SEQID NO 1所示。Ppcell编码553个氨基酸和一个终止密码子，其氨基酸序列如SEQ ID NO 2所示，蛋白质理论分子量为61.45kDa，预测等电点为6.55。Ppcell编码的氨基酸包含一个GH1家族结构域和一个碳水化合物结合模块CBM(Carbohydrate Binding Module)X2结构域，其GH1结构域又与GH6家族的纤维素酶结构域相重合，由此表明Ppcell为一种双结构域功能酶。

实施例3Ppcell基因在大肠杆菌中的重组表达及纯化

为了便于基因的重组表达，在设计的上下游引物中分别引入NdeI和XhoI酶切位点。将PCR清洁产物Ppcell和表达载体pET21a分别用NdeI和XhoI进行双酶切，酶切产物经清洁回收后，用T₄DNA连接酶连接(连接体系：(5μLT₄DNA Ligase 0.5μL，10×T₄DNA LigaseBuffer 0.5μL，pET21a 2μL，PCR产物2μL)，连接条件：室温过夜连接。)。取5μL连接产物转化E.coli TOP10感受态细胞，涂布在含100μg/mL氨苄青霉素的固体Luria-Bertani培养基上，37℃培养12-16h。挑取单克隆，使用简并引物进行菌落PCR验证，将扩增正确的单克隆接入含有100μg/mL氨苄青霉素的液体Luria-Bertani培养基中培养，提取质粒；使用内切酶NdeI和XhoI对提取的质粒进行双酶切，结果正确的重组质粒送华大基因测序。测序结果表明，在pET21a的NdeI和XhoI酶切位点之间插入了SEQ ID NO 1所示的Ppcell基因，且插入方向正确，证明重组质粒构建成功，将该重组质粒命名为pET21a-Ppcell。

将pET21a-Ppcell转化E.coli BL21(DE3)，对其进行诱导表达及纯化。用聚丙烯酰胺凝胶电泳检测内切纤维素酶Ppcell的表达及纯化情况，结果如图2所示，纯化后的内切纤维素酶Ppcell在电泳胶上呈单一条带，且位置与预测的分子量相吻合。

实施例4内切纤维素酶Ppcell的活性测定及酶学性质分析

(1)内切纤维素酶Ppcell的活力测定

以450μL 0.5％(w/v)的魔芋多糖为底物，加入50μL重组酶Ppcell，反应10min，采用3,5-二硝基水杨酸(DNS)法测定其活性。酶活力单位定义为:每分钟释放1μmol还原糖(以葡萄糖计)所需的酶量为一个酶活力单位(U)。蛋白浓度使用碧云天BCA蛋白浓度测定试剂盒进行测定。

(2)pH对重组酶Ppcell的影响

在45℃的条件下，分别以240μL 0.5％(w/v)，pH3.0-10.0(pH3.0Gly-HCl，pH4.0-5.0HAc-NaAc，pH6.0-8.0Na₂HPO₄-NaH₂PO₄，pH8.0-9.0Tris-HCl，pH9.0-10.0Gly-NaOH)的魔芋多糖为底物，加入10μL重组酶Ppcell，反应5min，采用3,5-二硝基水杨酸(DNS)法测定其活性。以灭活的酶作为对照，以活性最高的值为100％，测定在各个反应pH下酶的相对活性。根据酶在不同pH下的相对活性绘制曲线，确定酶的最适反应pH。结果如图3所示，Ppcell的最适反应pH为5.0，随着pH的升高或降低，Ppcell的活性均降低。

(3)温度对重组酶Ppcell的影响

在pH5.0的条件下，以240μL0.5％(w/v)魔芋多糖为底物，分别在25-85℃下加入10μL重组酶Ppcell，反应5min，采用3,5-二硝基水杨酸(DNS)法测定其活性。以灭活的酶为对照，以反应最高酶活力为100％计算相对酶活，根据酶在不同温度下的相对活性绘制曲线。结果如图4所示，Ppcell的最适反应温度为45℃。

在最适温度和最适pH条件下，按标准方法测得Ppcell的比活为150U/mg。

(4)重组酶Ppcell的底物特异性

选取魔芋葡甘露聚糖、刺槐豆胶、瓜尔豆胶、田菁胶、刺云豆胶、葫芦巴胶、黄原胶、卡拉胶8种底物考察重组酶Ppcell的底物特异性。将50μL重组酶Ppcell分别加入到450μL0.5％(w/v)的不同底物中，反应10min，采用3,5-二硝基水杨酸(DNS)法测定重组酶Ppcell对各底物的降解活性，以降解魔芋葡甘露聚糖的比活力为100％。结果显示：重组酶Ppcell仅对魔芋葡甘露聚糖表现出降解活性，但对其它几种底物均未表现出降解活性，说明Ppcell为一种专一的葡甘聚糖降解酶。

实施例5重组酶Ppcell降解魔芋葡甘露聚糖产物分析

将0.5％(w/v)魔芋多糖与重组酶Ppcell按9:1(体积比)的比例混合后，在25℃条件下反应1h，通过Sevage法除蛋白后，对其产物进行基质辅助激光解析电离飞行时间质谱(MALDI-TOF-MS)分析。如图5所示，Ppcell对魔芋多糖的降解可以生成多种聚合度的低聚糖，DP＝3-15。因此，Ppcell可用于葡甘露低聚糖的制备以及与魔芋多糖降解相关方面的研究，包括农业、食品、饲料添加、医药及葡甘露低聚糖制备等领域。

SEQUENCE LISTING

<110> 中国科学院大连化学物理研究所

<120> 一种内切纤维素酶编码基因及其制备与应用

<130>

<160> 4

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 1662

<212> DNA

<213> 多粘类芽孢杆菌Paenibacilluspolymyxa

<220>

<221> DNA

<222> (1)..(1662)

<400> 1

atggctgaat ctgacgaaca agcacagcca gctgctgcca caagcaatat gcagtcatac 60

gtggaagcca tgcagcctgg atggaattta ggaaattcgc tggatgctgt cggggcggat 120

gaaaccgcct ggggcaatcc gcgcattacc caagctttga tccagcaaat tgctgcccaa 180

gggtacaaaa gtattcggat tcccgtcacc tgggataagc atattggagc cgcaccccat 240

tataccgttg aatctgctta catgaaccgt gtggaagagg ttgttcgctg ggcactggat 300

gccaatctgt atgtcatgat taatgtccat catgattcat ggacgtgggt aagcagtatg 360

gagcccaagc atgatgaagt gttagctcgc tataacgcat tatggacaca aattgccgac 420

cgctttaaaa atcagcccaa caagttgatg tttgaaagta ttaacgagcc ccgcttttct 480

gaagggggaa ccacggatga agcgaaaatg aatcagatgc ttcatgagct aaatgtatcc 540

ttccacaaaa tcgttcgcgc ctccggtggt aagaatgcca ctcgtcccct tgtcctatcc 600

ggtctggatg ctgcacctgc ccaagccaag atcagccaac ttgccaacac gattactggg 660

ctgaacgatc ctaatctgat tgcgactgtt cactattatg gcttttggcc tttcagtgtg 720

aacattgccg ggaatacaac ttttgataaa gctgcccaag acgatattat tcaaaccttt 780

gataatgtct ataacacctt tgtagccaag ggaatcccgg ttattgtcgg tgaatatggc 840

ctgctcggtt ttgataaaca tacaggtgtt attgaacagg gagaaaagct gaagtttttt 900

gaatttttga cttattacat gaaagtgaag aaagtaacag gcatgctctg ggataacggc 960

cagcatttga atcggagcac ttacaagtgg tctgatcctg aactctttaa tgtcattaag 1020

gccagcctga aaggacgttc ctccaatgca gctagtgatc tcattcactt gaagaaaggc 1080

tcttctattc aggataccaa gatcactcta aacctgaacg gcaaccagtt gaaatcgctc 1140

aatgccaaca gcaagcagct gaaacagggc accgactata cgctgagtgg agatacatta 1200

accttcaaag ccagcttgct caccagccta attacttccg gtaaatatgg tgagaatgcc 1260

gtcattaccg ccaagtttaa taggggggca gattggaatt ttaaagtcgt cgtgtatgat 1320

acgccgaaat taagtgctgt cgaagggact acacaagcct ttaccattcc aacagacttc 1380

cgtggtagcc tgcttgcgac gatggaagcc gtgtatacga atggaggcaa tgccggtcca 1440

caggattgga caccttataa agagtttggc aatacttttg ccccttccta tgatacgaat 1500

ggcatcaagc tgctgcctga atttttcaac agtgtgaagg atggtgaagt cacgttgaag 1560

ttccacttct ggagcggcga tgtagtgaca tacaaaatca ccaagaacgg aacccgcgtg 1620

acgggcacga catctctcga gcaccaccac caccaccact ga 1662

<210> 2

<211> 553

<212> PRT

<213> 多粘类芽孢杆菌Paenibacilluspolymyxa

<220>

<221> PRT

<222> (1)..(553)

<400> 2

Met Ala Glu Ser Asp Glu Gln Ala Gln Pro Ala Ala Ala Thr Ser Asn

1 5 10 15

Met Gln Ser Tyr Val Glu Ala Met Gln Pro Gly Trp Asn Leu Gly Asn

20 25 30

Ser Leu Asp Ala Val Gly Ala Asp Glu Thr Ala Trp Gly Asn Pro Arg

35 40 45

Ile Thr Gln Ala Leu Ile Gln Gln Ile Ala Ala Gln Gly Tyr Lys Ser

50 55 60

Ile Arg Ile Pro Val Thr Trp Asp Lys His Ile Gly Ala Ala Pro His

65 70 75 80

Tyr Thr Val Glu Ser Ala Tyr Met Asn Arg Val Glu Glu Val Val Arg

85 90 95

Trp Ala Leu Asp Ala Asn Leu Tyr Val Met Ile Asn Val His His Asp

100 105 110

Ser Trp Thr Trp Val Ser Ser Met Glu Pro Lys His Asp Glu Val Leu

115 120 125

Ala Arg Tyr Asn Ala Leu Trp Thr Gln Ile Ala Asp Arg Phe Lys Asn

130 135 140

Gln Pro Asn Lys Leu Met Phe Glu Ser Ile Asn Glu Pro Arg Phe Ser

145 150 155 160

Glu Gly Gly Thr Thr Asp Glu Ala Lys Met Asn Gln Met Leu His Glu

165 170 175

Leu Asn Val Ser Phe His Lys Ile Val Arg Ala Ser Gly Gly Lys Asn

180 185 190

Ala Thr Arg Pro Leu Val Leu Ser Gly Leu Asp Ala Ala Pro Ala Gln

195 200 205

Ala Lys Ile Ser Gln Leu Ala Asn Thr Ile Thr Gly Leu Asn Asp Pro

210 215 220

Asn Leu Ile Ala Thr Val His Tyr Tyr Gly Phe Trp Pro Phe Ser Val

225 230 235 240

Asn Ile Ala Gly Asn Thr Thr Phe Asp Lys Ala Ala Gln Asp Asp Ile

245 250 255

Ile Gln Thr Phe Asp Asn Val Tyr Asn Thr Phe Val Ala Lys Gly Ile

260 265 270

Pro Val Ile Val Gly Glu Tyr Gly Leu Leu Gly Phe Asp Lys His Thr

275 280 285

Gly Val Ile Glu Gln Gly Glu Lys Leu Lys Phe Phe Glu Phe Leu Thr

290 295 300

Tyr Tyr Met Lys Val Lys Lys Val Thr Gly Met Leu Trp Asp Asn Gly

305 310 315 320

Gln His Leu Asn Arg Ser Thr Tyr Lys Trp Ser Asp Pro Glu Leu Phe

325 330 335

Asn Val Ile Lys Ala Ser Leu Lys Gly Arg Ser Ser Asn Ala Ala Ser

340 345 350

Asp Leu Ile His Leu Lys Lys Gly Ser Ser Ile Gln Asp Thr Lys Ile

355 360 365

Thr Leu Asn Leu Asn Gly Asn Gln Leu Lys Ser Leu Asn Ala Asn Ser

370 375 380

Lys Gln Leu Lys Gln Gly Thr Asp Tyr Thr Leu Ser Gly Asp Thr Leu

385 390 395 400

Thr Phe Lys Ala Ser Leu Leu Thr Ser Leu Ile Thr Ser Gly Lys Tyr

405 410 415

Gly Glu Asn Ala Val Ile Thr Ala Lys Phe Asn Arg Gly Ala Asp Trp

420 425 430

Asn Phe Lys Val Val Val Tyr Asp Thr Pro Lys Leu Ser Ala Val Glu

435 440 445

Gly Thr Thr Gln Ala Phe Thr Ile Pro Thr Asp Phe Arg Gly Ser Leu

450 455 460

Leu Ala Thr Met Glu Ala Val Tyr Thr Asn Gly Gly Asn Ala Gly Pro

465 470 475 480

Gln Asp Trp Thr Pro Tyr Lys Glu Phe Gly Asn Thr Phe Ala Pro Ser

485 490 495

Tyr Asp Thr Asn Gly Ile Lys Leu Leu Pro Glu Phe Phe Asn Ser Val

500 505 510

Lys Asp Gly Glu Val Thr Leu Lys Phe His Phe Trp Ser Gly Asp Val

515 520 525

Val Thr Tyr Lys Ile Thr Lys Asn Gly Thr Arg Val Thr Gly Thr Thr

530 535 540

Ser Leu Glu His His His His His His

545 550

<210> 3

<211> 32

<212> DNA

<213> 人工合成

<220>

<221> DNA

<222> (1)..(32)

<400> 3

cggacgcata tggaatcarc tmmcttggtc ac 32

<210> 4

<211> 37

<212> DNA

<213> 人工合成

<220>

<221> DNA

<222> (1)..(37)

<400> 4

gacgagctcg agctccgctt yattyttgga braagta 37

Claims

1.一种内切纤维素酶基因，其核苷酸序列具有如下特征中的一种或二种以上：

1)具有序列表中SEQ ID NO.1的脱氧核糖核酸(DNA)序列；

2)编码SEQ ID NO.2氨基酸序列的脱氧核糖核酸(DNA)序列；

4)与SEQ ID NO.1限定的脱氧核糖核酸(DNA)序列的同源性达到80％及以上，且能编码降解葡甘聚糖的蛋白质的脱氧核糖核酸(DNA)序列。

2.一种权利要求1所述的内切纤维素酶基因编码的内切纤维素酶，其特征在于：其氨基酸序列具有如下特征中的一种或二种：

1)序列表中SEQ ID NO.2从氨基端开始的第1-553位氨基酸残基序列；

2)对序列表中SEQ ID NO.2所示的氨基酸序列进行一个或两个以上氨基酸取代、缺失或添加而形成的具有内切纤维素酶活性的氨基酸序列。

3.一种权利要求2所述的内切纤维素酶的制备方法，其特征在于：将内切纤维素酶基因克隆入重组表达载体，导入宿主细胞，获得重组表达的内切纤维素酶；

1)具有序列表中SEQ ID NO.1的脱氧核糖核酸(DNA)序列；

2)编码SEQ ID NO.2氨基酸序列的脱氧核糖核酸(DNA)序列；

4)所述的重组表达内切纤维素酶的表达载体，是指大肠杆菌表达载体、酵母表达载体、枯草杆菌表达载体、乳酸菌表达载体、链霉菌表达载体、噬菌体载体、丝状真菌表达载体、植物表达载体、昆虫表达载体、或哺乳动物细胞表达载体中的一种或二种以上。

4.按照权利要求3所述的方法，其特征在于：所述宿主细胞，即用于重组表达内切纤维素酶的重组菌或转基因细胞系，是指大肠杆菌宿主细胞(如Escherichia coli BL21、Escherichia coli JM109、Escherichia coli DH5α等)、酵母菌宿主细胞(如Saccharomyces cerevisiae、Pichiapastoris、Kluyveromyceslactis等)、枯草杆菌宿主细胞(如Bacillus subtilis R25、Bacillus subtilis9920等)、乳酸菌宿主细胞(如Lacticacid bacteria COCC101等)、放线菌宿主细胞(如Streptomyces spp.等)、丝状真菌宿主细胞(如Trichodermaviride、Trichodermareesei、Aspergillusniger、Aspergillusnidulans等)、昆虫细胞(如Bombyxmori、Antharaea eucalypti等)，哺乳动物细胞(如中国仓鼠卵巢细胞CHO、幼小仓鼠肾脏细胞BHK、中国仓鼠肺细胞CHL等)中的一种。

5.一种权利要求2所述的内切纤维素酶在降解魔芋葡甘聚糖中的应用。

6.按照权利要求5所述的应用，其特征在于：包括以下应用中的一种或二种以上：

2)在断裂葡聚糖的糖苷键，获得单糖或葡寡糖中的应用；

3)在断裂纤维素的糖苷键，获得单糖或纤维寡糖中的应用；

4)与其他葡聚糖酶混合后，在协同断裂葡聚糖糖苷键方面的应用；

5)与其他纤维素酶混合后，在协同断裂纤维素糖苷键方面的应用；

6)与其他葡甘聚糖酶混合后，在协同断裂葡甘聚糖糖苷键方面的应用。