CN108611340A

CN108611340A - 一种β-1,4-葡聚糖酶编码基因及其制备与应用

Info

Publication number: CN108611340A
Application number: CN201611133422.1A
Authority: CN
Inventors: 尹恒; 李悝悝; 曹海龙; 贾晓晨
Original assignee: Dalian Institute of Chemical Physics of CAS
Current assignee: Dalian Institute of Chemical Physics of CAS
Priority date: 2016-12-10
Filing date: 2016-12-10
Publication date: 2018-10-02
Anticipated expiration: 2036-12-10
Also published as: CN108611340B

Abstract

本发明公开了一种来源于多粘类芽孢杆菌(Paenibacilluspolymyxa)的内切β‑1,4‑葡聚糖酶基因及其酶的制备方法与应用，即利用基因工程的技术方法，将该内切β‑1,4‑葡聚糖酶的基因克隆到大肠杆菌表达载体上，获得可异源表达该酶的大肠杆菌重组菌株，该菌株异源表达制备的内切β‑1,4‑葡聚糖酶，能高效降解魔芋多糖(又称魔芋葡甘聚糖)。本发明提供的内切β‑1,4‑葡聚糖酶可广泛应用于农业、食品、饲料添加剂、医药及葡甘露低聚糖制备等领域。

Description

一种β-1,4-葡聚糖酶编码基因及其制备与应用

技术领域

本发明涉及一种内切β-1,4-葡聚糖酶的基因序列及其制备方法和应用。本发明提供了该内切β-1,4-葡聚糖酶的重组质粒和重组基因工程菌株及其在多糖降解方面的应用。本发明提供的内切β-1,4-葡聚糖酶可广泛应用于农业、食品、饲料添加、医药及寡糖制备等领域。

背景技术

蒟蒻(Amorphophalluskonjac)，俗称魔芋，天南星科魔芋属多年生草本植物。魔芋中主要成分为魔芋多糖(又称魔芋葡甘露聚糖)，由葡萄糖与甘露糖组成。魔芋葡甘露聚糖通过β-1,4吡喃糖苷键将β-D-葡萄糖和β-D-甘露糖按1∶1.6或1∶1.69的摩尔比连接而成，每19个糖残基上有一个乙酰基团存在，其特殊的结构使其虽具有多种生物学功能。但是其在水中为胶体，粘度大、溶解度小，在后续加工利用上带来不便；其在各种食品中添加量小，影响了其生物活性。目前我国魔芋产业多停留在魔芋初级食品开发层面，亟需高值化加工技术，对魔芋主要成分魔芋葡甘露聚糖的深加工是魔芋下游产业的主要方向。

将魔芋多糖降解成魔芋寡糖，即魔芋葡甘露寡糖(Konjacoligo-glucomannan，KOGM)，其分子量小，在水中可溶，易于吸收，将会克服魔芋多糖在加工利用中问题。与魔芋多糖相比，魔芋寡糖具有优良的性能，具有改善食品品质，保鲜食品，改善人体肠道菌群，增强免疫力，调节血糖、血脂以及肠道解毒等生物活性。生理功能试验表明，葡甘露低聚糖除了具有低热量、稳定、安全无毒等良好的理化特性外，还具有促进以双歧杆菌为代表的有益菌群的增殖,改善肠道内菌群结构；减慢肠道粘膜分泌的β-糖苷酶的扩散速度，不升高血糖，提高机体抗氧化能力等功能。

目前尚无大量工业生产魔芋葡甘低聚糖的报道，其生产尚停留在实验室研究期间，获得葡甘低聚糖的方法主要有以下几种：(1)从天然原料(魔芋)中提取，但提取工艺复杂，且产率极低；(2)通过人工化学合成的方法获得，但此法步骤繁琐，成本太高；(3)利用酸水解魔芋葡甘露聚糖的方法获得，但这样生产的低聚糖性质不稳定，副产品多，不易得到特定的低聚糖；(4)利用物理方法降解得到，但此方法要利用现代化的生产设备，实验设备要求太高，不利于大量生产；(5)利用酶解葡甘露聚糖的方法获得，酶的反应效率高，方法简单、易控制，后期分离也容易，且酶作为一种生物制剂，不会带来化学试剂产生的不利因素。所以利用酶解葡甘露聚糖的方法生产葡甘露低聚糖是一条相对简单，容易研究的生产方法。

葡甘聚糖酶(glucomannanase)是一种能够将葡甘聚糖降解为葡甘低聚糖的酶，根据葡甘聚糖的结构，大部分的研究报道是葡甘聚糖酶的类似酶——甘露聚糖酶，而对于葡聚糖酶(纤维素酶)的研究相对较少。目前，对葡聚糖酶的研究多集中于纤维素类底物降解方面，而对半纤维素类底物(如魔芋)的研究相对较少。且已报道的葡聚糖酶对魔芋多糖的降解活性均较弱，不适于大规模应用。因此，寻找一种能够高效降解魔芋多糖的葡聚糖酶是降低葡甘露寡糖生产成本的有利途径。而由于葡聚糖酶在生物体内的含量非常少，借助基因水平进行高量表达和表征是提高葡聚糖酶产量的一种有效措施。

发明内容

本发明的第一个目的是提供一种新型的来源于多粘类芽孢杆菌(Paenibacilluspolymyxa)的内切β-1,4-葡聚糖酶Ppglu及其编码基因。

本发明的第二个目的是提供一种制备新型内切β-1,4-葡聚糖酶Ppglu的方法。

本发明的第三个目的是提供含有所述的内切β-1,4-葡聚糖酶Ppglu基因重组表达质粒和重组基因工程菌株。

本发明的第四个目的是提供一种新型内切β-1,4-葡聚糖酶Ppglu在魔芋多糖降解中的应用。

本发明所提供的内切β-1,4-葡聚糖酶Ppglu，来源于土壤中分离纯化的多粘类芽孢杆菌Paenibacilluspolymyxa，从中扩增出的内切β-1,4-葡聚糖酶Ppglu编码基因(命名为Ppglu)，具有下述核苷酸序列特征中的一种或二种以上：

1)序列表中SEQ ID NO.1的脱氧核糖核酸(DNA)序列；

2)编码序列表中SEQ ID NO.2氨基酸序列的脱氧核糖核酸(DNA)序列；

3)与SEQ ID NO.1限定的脱氧核糖核酸(DNA)序列的同源性达到80％及以上，且能编码降解葡聚糖的蛋白质的脱氧核糖核酸(DNA)序列；

4)对序列表中SEQ ID NO.1的脱氧核糖核酸(DNA)序列进行一个或几个核苷酸取代、缺失或添加而得到的编码具有内切β-1,4-葡聚糖酶活性的核苷酸序列。

本发明还提供了内切β-1,4-葡聚糖酶Ppglu的氨基酸序列，具有如下特征中的一种或二种以上：

1)序列表中的SEQ ID NO.2从氨基端开始的第1-374位氨基酸残基序列，其中1-366位为具有内切β-1,4-葡聚糖酶Ppglu活性的氨基酸序列，367-374位为酶切位点及His-Tag的氨基酸序列；

2)将序列表中的SEQ ID NO.2从氨基端开始的第1-374或1-366位氨基酸残基进行一个或两个以上氨基酸取代、缺失或添加而形成具有内切β-1,4-葡聚糖酶活性不变的氨基酸序列。

本发明的内切β-1,4-葡聚糖酶Ppglu的氨基酸序列及其核苷酸编码序列也可以根据预测的β-1,4-葡聚糖酶Ppglu的氨基酸序列及其核苷酸编码序列人工合成获得。

制备重组酶Ppglu的方法，是将内切β-1,4-葡聚糖酶基因克隆入重组表达载体，导入宿主细胞，获得重组表达的内切β-1,4-葡聚糖酶。

上述内切β-1,4-葡聚糖酶基因，其核苷酸序列具有如下特征中的一种或二种以上：

1)具有序列表中SEQ ID NO.1的脱氧核糖核酸(DNA)序列；

2)编码SEQ ID NO.2氨基酸序列的脱氧核糖核酸(DNA)序列；

3)对序列表中SEQ ID NO.1的脱氧核糖核酸(DNA)序列进行一个或两个以上核苷酸取代、缺失或添加而得到的编码具有内切β-1,4-葡聚糖酶活性的核苷酸序列；

所述的重组表达内切β-1,4-葡聚糖酶Ppglu的表达载体可以是大肠杆菌表达载体、酵母表达载体、枯草杆菌表达载体、乳酸菌表达载体、链霉菌表达载体、噬菌体载体、丝状真菌表达载体、植物表达载体、昆虫表达载体、或哺乳动物细胞表达载体等。

用于重组表达内切β-1,4-葡聚糖酶Ppglu的重组菌或转基因细胞系，可以是大肠杆菌宿主细胞(如Escherichia coli BL21、Escherichia coli JM109、Escherichia coliDH5α等)、酵母菌宿主细胞(如Saccharomyces cerevisiae、Pichiapastoris、Kluyveromyceslactis等)、枯草杆菌宿主细胞(如Bacillus subtilis R25、Bacillussubtilis9920等)、乳酸菌宿主细胞(如Lactic acid bacteria COCC101等)、放线菌宿主细胞(如Streptomyces spp.等)、丝状真菌宿主细胞(如Trichodermaviride、Trichodermareesei、Aspergillusniger、Aspergillusnidulans等)、昆虫细胞(如Bombyxmori、Antharaea eucalypti等)或哺乳动物细胞(如中国仓鼠卵巢细胞CHO、幼小仓鼠肾脏细胞BHK、中国仓鼠肺细胞CHL等)。

本发明的内切β-1,4-葡聚糖酶Ppglu的基因序列是通过降落PCR技术从多粘类芽孢杆菌(Paenibacilluspolymyxa)中克隆得到。该基因编码区长1125bp，属于糖苷水解酶GH(glycoside hydrolase)1家族。

本发明提供的内切β-1,4-葡聚糖酶在降解魔芋多糖中可以应用，包括以下应用中的一种或二种：

1)在断裂魔芋多糖的糖苷键，获得单糖或葡甘露寡糖中的应用；

2)在断裂葡聚糖的糖苷键，获得单糖或葡寡糖中的应用；

3)在断裂纤维素的糖苷键，获得单糖或纤维寡糖中的应用；

4)与其他葡甘聚糖酶混合后，在协同断裂葡甘聚糖糖苷键方面应用。

本发明从大肠杆菌重组表达获得的内切β-1,4-葡聚糖酶Ppglu，可以高效降解魔芋多糖，以魔芋多糖为底物时，在75℃、pH5.0的条件下具有最佳酶活性，比活为544U/mg。解决了现有β-1,4-葡寡糖生产成本高的难题，具有重要的实用价值，可应用于大规模的工业化生产。

本发明的内切β-1,4-葡聚糖酶Ppglu可广泛应用农业、食品、饲料添加、医药及葡甘露寡糖的制备等领域。

附图说明

图1：内切β-1,4-葡聚糖酶基因Ppglu琼脂糖凝胶电泳检测。

图2：内切β-1,4-葡聚糖酶Ppglu表达及纯化的SDS-PAGE图。各泳道加入的样品分别是：泳道1-Ppglu上清，泳道2-Ppglu上柱后三次流穿，泳道3-20mM咪唑洗脱液，泳道4-60mM咪唑洗脱液，泳道5-蛋白分子量标准，泳道6-250mM咪唑洗脱液。

图3：pH值对内切β-1,4-葡聚糖酶Ppglu的影响曲线。

图4：温度对内切β-1,4-葡聚糖酶Ppglu的影响曲线。

图5：内切β-1,4-葡聚糖酶Ppglu对魔芋多糖降解产物的MALDI-TOF-MS图谱。

具体实施方式

序列表

SEQ ID No.1的信息

(a)序列特征

长度：1126核苷酸

类型：核苷酸

链型：单链

(b)分子类型：DNA

序列描述：SEQ ID NO.1

ATGGCCAGTGTGAAAGGATATTATCACACCCAAGGAAACAAGATTGTAGATGAATCCGGGAAAGAGGCCGCATTTAACGGTCTGAACTGGTTCGGTCTGGAAACCCCTAATTACACCTTGCATGGACTGTGGAGCCGCTCAATGGACGACATGCTGGATCAGGTGAAAAAGGAAGGCTATAATCTCATCCGTCTGCCTTACAGCAACCAGTTATTTGATTCCAGCTCCCGTGCTGACAGTATTGATTACTACAAAAATCCTGATCTGGTCGGATTGACTCCGATTCAAATTATGGACAAGCTGATCGAAAAAGCTGGACAACGCGGTATTCAGATTATCCTTGACCGTCACCGCCCAGGCTCAGGTGGACAATCCGAGCTATGGTATACCTCTCAGTACCCTGAGTCCCGCTGGATCAGCGACTGGAAGATGTTAGCTGAACGTTATAAAAACAATCCTACCGTCATCGGTGCAGATTTACACAACGAGCCACACGGTCAGGCAAGCTGGGGAACAGGCGATGTCTCCACAGACTGGCGTCTCGCGGCGCAGCGTGCAGGGAATGCCATTCTGTCCGTGAATCCAAATTGGCTGATTCTCGTAGAAGGTGTGGACCATAATGTACAAGGCAACAACAGCCAATATTGGTGGGGCGGCAACCTGACAGGTGTGGCCAATTATCCTGTCGTACTGGACGTGCCGAACCGTGTCGTATATTCACCACATGACTATGGTCCTGGTGTGTCTTCGCAGCCATGGTTCAACGACTCGACCTTCCCGTCCAACCTGCCAGCAATCTGGGATCAAACCTGGGGCTACATCAGTAAGCAAAACATAGCTCCAGTGCTGG.TTGGTGAATTCGGCGGTCGCAATGTCGATTCGTCTTCCCCTGAGGGTAAATGGCAAAATGCACTCGTAGACTATATTGGTGCCAACAACCTGTACTTTACGTATTGGTCCCTGAATCCGAATAGCGGCGACACAGGCGGTCTGCTGCTGGATGACTGGGTTACCTGGAATCGTCCAAAGCAGGATATGCTGAGCCGGATTATGAAGCCTGTCGTTTTCGTAGTGGAGCAAGTTAAAGCAGCCGCCGAACTCGAGCACCACCACCACCACCACTGA

SEQ ID No.2的信息

(a)序列特征

长度：374氨基酸

类型：氨基酸

链型：单链

(b)分子类型：蛋白

序列描述：SEQ ID NO.2

MASVKGYYHTQGNKIVDESGKEAAFNGLNWFGLETPNYTLHGLWSRSMDDMLDQVKKEGYNLIRLPYSNQLFDSSSRADSIDYYKNPDLVGLTPIQIMDKLIEKAGQRGIQIILDRHRPGSGGQSELWYTSQYPESRWISDWKMLAERYKNNPTVIGADLHNEPHGQASWGTGDVSTDWRLAAQRAGNAILSVNPNWLILVEGVDHNVQGNNSQYWWGGNLTGVANYPVVLDVPNRVVYSPHDYGPGVSSQPWFNDSTFPSNLPAIWDQTWGYISKQNIAPVLVGEFGGRNVDSSSPEGKWQNALVDYIGANNLYFTYWSLNPNSGDTGGLLLDDWVTWNRPKQDMLSRIMKPVVFVVEQVKAAAELEHHHHHH

实施例1内切β-1,4-葡聚糖酶全长基因克隆

参照基因组DNA纯化试剂盒(Thermo，LOT 00105781)操作步骤提取多粘类芽孢杆菌的基因组DNA。对The National Center for Biotechnology Information(NCBI)数据库中内切β-1,4-葡聚糖酶基因序列进行多序列比对分析后，设计简并引物Ppglu-F:5’-CGGACGCATATGGCCAGYGTGAAAGGATATTATC-3’；Ppglu-R:5’-GATGATCTCGAGTTCGGCKSYTGCTTYMRCTTGC-3’，以提取的多粘类芽孢杆菌的基因组DNA为模板，扩增编码内切β-1,4-葡聚糖酶成熟蛋白的基因序列(不包括信号肽基因)。PCR反应条件为：94℃3min，1个循环；94℃30s，68℃30s(每个循环降0.5℃)，72℃1min30s，30个循环；72℃5min，1个循环。PCR产物进行琼脂糖凝胶电泳分析后(见图1)，对目的基因进行清洁回收，经双酶切的方法连接到原核表达载体pET21a上后测序。

实施例2内切β-1,4-葡聚糖酶基因序列分析

测序结果采用GenBank数据库中的Basic Local Alignment Search Tool(BLAST)分析，DNAMAN软件进行多序列比对，Vector NTI分析序列信息。

获得的内切β-1,4-葡聚糖酶基因(命名为Ppglu)编码区长1125bp，其核苷酸序列如SEQ ID NO 1所示。Ppglu编码374个氨基酸和一个终止密码子，其氨基酸序列如SEQ IDNO 2所示，蛋白质理论分子量为42.18kDa，预测等电点为5.58。Ppglu编码的氨基酸主要包含一个纤维素酶结构域，其结构域特征与GH1家族成员更为相似，被归类为GH1家族。

实施例3Ppglu基因在大肠杆菌中的重组表达及纯化

为了便于基因的重组表达，在设计的上下游引物中分别引入NdeI和XhoI酶切位点。将PCR清洁产物Ppglu和表达载体pET21a分别用NdeI和XhoI进行双酶切，酶切产物经清洁回收后，用T₄DNA连接酶连接(连接体系：(5μLT₄DNA Ligase 0.5μL，10×T₄DNA LigaseBuffer 0.5μL，pET21a 2μL，PCR产物2μL)，连接条件：室温过夜连接。)。取5μL连接产物转化E.coli TOP10感受态细胞，涂布在含100μg/mL氨苄青霉素的固体Luria-Bertani培养基上，37℃培养12-16h。挑取单克隆，使用简并引物进行菌落PCR验证，将扩增正确的单克隆接入含有100μg/mL氨苄青霉素的液体Luria-Bertani培养基中培养，提取质粒；使用内切酶NdeI和XhoI对提取的质粒进行双酶切，结果正确的重组质粒送华大基因测序。测序结果表明，在pET21a的NdeI和XhoI酶切位点之间插入了SEQ ID NO 1所示的Ppglu基因，且插入方向正确，证明重组质粒构建成功，将该重组质粒命名为pET21a-Ppglu。

将pET21a-Ppglu转化E.coli BL21(DE3)，对其进行诱导表达及纯化。用聚丙烯酰胺凝胶电泳检测内切β-1,4-葡聚糖酶Ppglu的表达及纯化情况，结果如图2所示，纯化后的内切β-1,4-葡聚糖酶Ppglu在电泳胶上呈单一条带，且位置与预测的分子量相吻合。

实施例4内切β-1,4-葡聚糖酶Ppglu的活性测定及酶学性质分析

(1)内切β-1,4-葡聚糖酶Ppglu的活力测定

以450μL 0.5％(w/v)的魔芋多糖为底物，加入50μL重组酶Ppglu，反应10min，采用3,5-二硝基水杨酸(DNS)法测定其活性。酶活力单位定义为:每分钟释放1μmol还原糖(以甘露糖计)所需的酶量为一个酶活力单位(U)。蛋白浓度使用碧云天BCA蛋白浓度测定试剂盒进行测定。

(2)pH对重组酶Ppglu的影响

在75℃的条件下，分别以450μL 0.5％(w/v)，pH3.0-10.0(pH3.0Gly-HCl，pH4.0-5.0HAc-NaAc，pH6.0-7.0Na₂HPO₄-NaH₂PO₄，pH8.0Tris-HCl，pH9.0-10.0Gly-NaOH)的魔芋多糖为底物，加入50μL重组酶Ppglu，反应10min，采用3,5-二硝基水杨酸(DNS)法测定其活性。以灭活的酶作为对照，以活性最高的值为100％，测定在各个反应pH下酶的相对活性。根据酶在不同pH下的相对活性绘制曲线，确定酶的最适反应pH。结果如图3所示，Ppglu的最适反应pH为5.0，随着pH的升高或降低，Ppglu的活性均降低。

(3)温度对重组酶Ppglu的影响

在pH5.0的条件下，以450μL0.5％(w/v)魔芋多糖为底物，分别在4-85℃下加入50μL重组酶Ppglu，反应10min，采用3,5-二硝基水杨酸(DNS)法测定其活性。以灭活的酶为对照，以反应最高酶活力为100％计算相对酶活，根据酶在不同温度下的相对活性绘制曲线。结果如图4所示，Ppglu的最适反应温度为75℃。

在最适温度和最适pH条件下，按标准方法测得Ppglu的比活为544U/mg。(4)重组酶Ppglu的底物特异性

选取魔芋葡甘露聚糖、刺槐豆胶、瓜尔豆胶、田菁胶、刺云豆胶、葫芦巴胶、黄原胶、卡拉胶、羧甲基纤维素、磷酸溶胀纤维素、微晶纤维素11种底物考察重组酶Ppglu的底物特异性。将50μL重组酶Ppglu分别加入到450μL 0.5％(w/v)的不同底物中，反应10min，采用3,5-二硝基水杨酸(DNS)法测定重组酶Ppglu对各底物的降解活性，以降解魔芋葡甘露聚糖的比活力为100％。结果显示：重组酶Ppglu仅对魔芋葡甘露聚糖表现出降解活性，但对其它几种底物均未表现出降解活性，说明Ppglu为一种专一的葡甘聚糖降解酶。

实施例5重组酶Ppglu降解魔芋葡甘露聚糖产物分析

将0.5％(w/v)魔芋多糖与重组酶Ppglu按9:1(体积比)的比例混合后，在75℃条件下反应2h，通过Sevage法除蛋白后，对其产物进行基质辅助激光解析电离飞行时间质谱(MALDI-TOF-MS)分析。如图5所示，Ppglu对魔芋多糖的降解可以生成多种聚合度的低聚糖，DP＝2-11。因此，Ppglu可用于葡甘露低聚糖的制备以及与魔芋多糖降解相关方面的研究，包括农业、食品、饲料添加、医药及葡甘露低聚糖制备等领域。

SEQUENCE LISTING

<110> 中国科学院大连化学物理研究所

<120> 一种β-1,4-葡聚糖酶编码基因及其制备与应用

<130>

<160> 2

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 1125

<212> DNA

<213> 多粘类芽孢杆菌Paenibacilluspolymyxa

<220>

<221> DNA

<222> (1)..(1125)

<400> 1

atggccagtg tgaaaggata ttatcacacc caaggaaaca agattgtaga tgaatccggg 60

aaagaggccg catttaacgg tctgaactgg ttcggtctgg aaacccctaa ttacaccttg 120

catggactgt ggagccgctc aatggacgac atgctggatc aggtgaaaaa ggaaggctat 180

aatctcatcc gtctgcctta cagcaaccag ttatttgatt ccagctcccg tgctgacagt 240

attgattact acaaaaatcc tgatctggtc ggattgactc cgattcaaat tatggacaag 300

ctgatcgaaa aagctggaca acgcggtatt cagattatcc ttgaccgtca ccgcccaggc 360

tcaggtggac aatccgagct atggtatacc tctcagtacc ctgagtcccg ctggatcagc 420

gactggaaga tgttagctga acgttataaa aacaatccta ccgtcatcgg tgcagattta 480

cacaacgagc cacacggtca ggcaagctgg ggaacaggcg atgtctccac agactggcgt 540

ctcgcggcgc agcgtgcagg gaatgccatt ctgtccgtga atccaaattg gctgattctc 600

gtagaaggtg tggaccataa tgtacaaggc aacaacagcc aatattggtg gggcggcaac 660

ctgacaggtg tggccaatta tcctgtcgta ctggacgtgc cgaaccgtgt cgtatattca 720

ccacatgact atggtcctgg tgtgtcttcg cagccatggt tcaacgactc gaccttcccg 780

tccaacctgc cagcaatctg ggatcaaacc tggggctaca tcagtaagca aaacatagct 840

ccagtgctgg ttggtgaatt cggcggtcgc aatgtcgatt cgtcttcccc tgagggtaaa 900

tggcaaaatg cactcgtaga ctatattggt gccaacaacc tgtactttac gtattggtcc 960

ctgaatccga atagcggcga cacaggcggt ctgctgctgg atgactgggt tacctggaat 1020

cgtccaaagc aggatatgct gagccggatt atgaagcctg tcgttttcgt agtggagcaa 1080

gttaaagcag ccgccgaact cgagcaccac caccaccacc actga 1125

<210> 2

<211> 374

<212> PRT

<213> 多粘类芽孢杆菌（Paenibacilluspolymyxa）

<220>

<221> PRT

<222> (1)..(374)

<400> 2

Met Ala Ser Val Lys Gly Tyr Tyr His Thr Gln Gly Asn Lys Ile Val

1 5 10 15

Asp Glu Ser Gly Lys Glu Ala Ala Phe Asn Gly Leu Asn Trp Phe Gly

20 25 30

Leu Glu Thr Pro Asn Tyr Thr Leu His Gly Leu Trp Ser Arg Ser Met

35 40 45

Asp Asp Met Leu Asp Gln Val Lys Lys Glu Gly Tyr Asn Leu Ile Arg

50 55 60

Leu Pro Tyr Ser Asn Gln Leu Phe Asp Ser Ser Ser Arg Ala Asp Ser

65 70 75 80

Ile Asp Tyr Tyr Lys Asn Pro Asp Leu Val Gly Leu Thr Pro Ile Gln

85 90 95

Ile Met Asp Lys Leu Ile Glu Lys Ala Gly Gln Arg Gly Ile Gln Ile

100 105 110

Ile Leu Asp Arg His Arg Pro Gly Ser Gly Gly Gln Ser Glu Leu Trp

115 120 125

Tyr Thr Ser Gln Tyr Pro Glu Ser Arg Trp Ile Ser Asp Trp Lys Met

130 135 140

Leu Ala Glu Arg Tyr Lys Asn Asn Pro Thr Val Ile Gly Ala Asp Leu

145 150 155 160

His Asn Glu Pro His Gly Gln Ala Ser Trp Gly Thr Gly Asp Val Ser

165 170 175

Thr Asp Trp Arg Leu Ala Ala Gln Arg Ala Gly Asn Ala Ile Leu Ser

180 185 190

Val Asn Pro Asn Trp Leu Ile Leu Val Glu Gly Val Asp His Asn Val

195 200 205

Gln Gly Asn Asn Ser Gln Tyr Trp Trp Gly Gly Asn Leu Thr Gly Val

210 215 220

Ala Asn Tyr Pro Val Val Leu Asp Val Pro Asn Arg Val Val Tyr Ser

225 230 235 240

Pro His Asp Tyr Gly Pro Gly Val Ser Ser Gln Pro Trp Phe Asn Asp

245 250 255

Ser Thr Phe Pro Ser Asn Leu Pro Ala Ile Trp Asp Gln Thr Trp Gly

260 265 270

Tyr Ile Ser Lys Gln Asn Ile Ala Pro Val Leu Val Gly Glu Phe Gly

275 280 285

Gly Arg Asn Val Asp Ser Ser Ser Pro Glu Gly Lys Trp Gln Asn Ala

290 295 300

Leu Val Asp Tyr Ile Gly Ala Asn Asn Leu Tyr Phe Thr Tyr Trp Ser

305 310 315 320

Leu Asn Pro Asn Ser Gly Asp Thr Gly Gly Leu Leu Leu Asp Asp Trp

325 330 335

Val Thr Trp Asn Arg Pro Lys Gln Asp Met Leu Ser Arg Ile Met Lys

340 345 350

Pro Val Val Phe Val Val Glu Gln Val Lys Ala Ala Ala Glu Leu Glu

355 360 365

His His His His His His

370

<210> 3

<211> 34

<212> DNA

<213> 人工合成

<220>

<221> DNA

<222> (1)..(32)

<400> 3

cggacgcata tggccagygt gaaaggatat tatc 34

<210> 4

<211> 34

<212> DNA

<213> 人工合成

<220>

<221> DNA

<222> (1)..(37)

<400> 4

gatgatctcg agttcggcks ytgcttymrc ttgc 34

Claims

1.一种内切β-1,4-葡聚糖酶基因，其核苷酸序列具有如下特征中的一种或二种以上：

1)具有序列表中SEQ ID NO.1的脱氧核糖核酸(DNA)序列；

2)编码SEQ ID NO.2氨基酸序列的脱氧核糖核酸(DNA)序列；

4)与SEQ ID NO.1限定的脱氧核糖核酸(DNA)序列的同源性达到80％及以上，且能编码降解葡甘露聚糖的蛋白质的脱氧核糖核酸(DNA)序列。

2.一种权利要求1所述的内切β-1,4-葡聚糖酶基因编码的内切β-1,4-葡聚糖酶，其特征在于：其氨基酸序列具有如下特征中的一种或二种：

1)序列表中SEQ ID NO.2从氨基端开始的第1-374位氨基酸残基序列；

2)对序列表中SEQ ID NO.2所示的氨基酸序列进行一个或两个以上氨基酸取代、缺失或添加而形成的具有内切β-1,4-葡聚糖酶活性的氨基酸序列。

3.一种权利要求2所述的内切β-1,4-葡聚糖酶的制备方法，其特征在于：将内切β-1,4-葡聚糖酶基因克隆入重组表达载体，导入宿主细胞，获得重组表达的内切β-1,4-葡聚糖酶；

1)具有序列表中SEQ ID NO.1的脱氧核糖核酸(DNA)序列；

2)编码SEQ ID NO.2氨基酸序列的脱氧核糖核酸(DNA)序列；

4)所述的重组表达内切β-1,4-葡聚糖酶的表达载体，是指大肠杆菌表达载体、酵母表达载体、枯草杆菌表达载体、乳酸菌表达载体、链霉菌表达载体、噬菌体载体、丝状真菌表达载体、植物表达载体、昆虫表达载体、或哺乳动物细胞表达载体中的一种或二种以上。

4.按照权利要求3所述的方法，其特征在于：所述宿主细胞，即用于重组表达内切β-1,4-葡聚糖酶的重组菌或转基因细胞系，是指大肠杆菌宿主细胞(如Escherichia coliBL21、Escherichia coli JM109、Escherichia coli DH5α等)、酵母菌宿主细胞(如Saccharomyces cerevisiae、Pichiapastoris、Kluyveromyceslactis等)、枯草杆菌宿主细胞(如Bacillus subtilis R25、Bacillus subtilis9920等)、乳酸菌宿主细胞(如Lacticacid bacteria COCC101等)、放线菌宿主细胞(如Streptomyces spp.等)、丝状真菌宿主细胞(如Trichodermaviride、Trichodermareesei、Aspergillusniger、Aspergillusnidulans等)、昆虫细胞(如Bombyxmori、Antharaea eucalypti等)，哺乳动物细胞(如中国仓鼠卵巢细胞CHO、幼小仓鼠肾脏细胞BHK、中国仓鼠肺细胞CHL等)中的一种。

5.一种权利要求2所述的内切β-1,4-葡聚糖酶在降解魔芋多糖中的应用。

6.按照权利要求5所述的应用，其特征在于：包括以下应用中的一种或二种以上：

2)在断裂葡聚糖的糖苷键，获得单糖或葡寡糖中的应用；

3)在断裂纤维素的糖苷键，获得单糖或纤维寡糖中的应用；

4)与其他葡聚糖酶混合后，在协同断裂葡聚糖糖苷键方面的应用；

5)与其他纤维素酶混合后，在协同断裂纤维素糖苷键方面的应用；

6)与其他葡甘聚糖酶混合后，在协同断裂葡甘聚糖糖苷键方面的应用。