CN107603967B - 一种壳聚糖酶csn4及其编码基因和应用 - Google Patents
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Abstract
本发明提供一种壳聚糖酶CSN4及其编码基因和应用，壳聚糖酶CSN4的氨基酸序列如SEQ ID NO:1；所述壳聚糖酶CSN4的基因csn4，其核苷酸序列如SEQ ID NO:2。所述壳聚糖酶CSN4用于降解壳聚糖产生低聚合度壳寡糖，其反应条件温和，能源消耗少，无污染物产生，在酶法制备壳寡糖中具有很好的工业应用前景，具有重要的经济价值。
Description
技术领域
本发明属于生物工程技术领域，具体涉及一种壳聚糖酶CSN4及其编码基因和应用。
背景技术
壳聚糖(Chitosan)是由自然界中广泛存在的甲壳素经过脱乙酰作用得到的，大量的研究表明壳聚糖在食品、化工、医药及农业等领域都有广泛的应用前景。但由于壳聚糖的溶解性问题，严重阻碍了其资源的有效利用。因此，将壳聚糖降解为寡糖后再对其加以利用是目前该领域研究的热点之一。壳寡糖(Chitooligosaccharide)是一类低聚合度(一般为2-10)、可溶于水的氨基糖类化合物，也是目前仅知的碱性寡糖。已有研究证明壳寡糖具有独特生理活性和功能性，容易被人体吸收，具有杀菌、抗肿瘤、调节人体免疫功能等功效，是优良的功能性保健食品；另外在化妆品方面，由于壳寡糖具有保湿吸湿，且纯天然、无毒性的特点，如今已被越来越多地应用于高档化妆品中。因此，壳寡糖的制备是壳聚糖高值化利用的关键环节，建立高效、环保、易于后期纯化的壳寡糖制备方法具有重要科学意义和应用前景。
目前，降解壳聚糖制备壳寡糖的方法主要有酶降解法、物理和化学降解法。酶降解法因专一性强、反应条件温和、过程易控制、产物相对均一及环境污染少等优势而广受关注。壳聚糖酶(EC 3.2.1.132)可以催化水解壳聚糖的β-1,4-糖苷键，是专一性水解壳聚糖的酶，广泛分布于细菌、真菌、病毒以及植物等生物群中，在降解壳聚糖多聚物、制备壳寡糖中发挥着重要作用。但是由于原始菌株产壳聚糖酶的能力普遍较弱，且专一性强的壳聚糖酶存在发酵水平低、种类单一、应用性能较差、使用成本高等诸多问题，导致商品壳聚糖酶的价格始终居高不下，另外商品壳聚糖酶在热稳定性等方面还不足以满足大规模工业化生产的要求。
随着对新型生物催化剂需求的日益增长，促使人们不断研究新的方法来获取生物催化剂。各种环境中的可培养微生物是新酶和生物活性分子的重要来源，但在微生物多样化的地球中，采用可培养技术能获得的微生物不足1％，从而限制了微生物资源的发掘与利用。与之相反，占大多数的不可培养微生物(>99％)，代表着生物技术开发应用的巨大基因库。宏基因组学，作为一种不依赖于培养的技术，巧妙地避开了分离培养过程。通过提取特定环境中的微生物基因组DNA、构建基因组文库，从文库中筛选、寻找、发现新的功能基因。被认为是用于获取和研究微生物的最好方法之一，已成为基于遗传工程方法选育菌株的一个新的方向与研究热点。宏基因组学的方法已被成功用于多种工业酶类的开发，但鲜有用于壳聚糖酶菌株选育的报道。因此，利用宏基因组学的方法开发挖掘新型壳聚糖酶资源具有广阔的发展前景。
发明内容
本发明要解决的技术问题在于提供一种壳聚糖酶CSN4及其编码基因和应用，所述壳聚糖酶基因csn4来源于深海淤泥宏基因组。
本发明是通过如下技术方案来实现的：
一种壳聚糖酶CSN4，其氨基酸序列如SEQ ID NO:1所示。
本发明还提供编码所述壳聚糖酶CSN4的基因csn4，其核苷酸序列如SEQ ID No:2所示。
本发明的另一个目的在于提供一种重组质粒csn4/pET-28a，所述重组质粒csn4/pET-28a含有上述壳聚糖酶CSN4的基因csn4。
本发明还提供含有所述重组质粒csn4/pET-28a的基因工程菌株。
进一步，本发明提供的重组质粒csn4/pET-28a包含表达载体和所述的壳聚糖酶CSN4的基因csn4，表达载体优选为pET28a。
进一步，本发明提供的基因工程菌株由所述的重组质粒csn4/pET-28a转化大肠杆菌E.coli BL21(DE3)获得。
本发明还提供上述壳聚糖酶CSN4用于催化壳聚糖生产壳寡糖的应用。
本发明还提供上述基因工程菌株用于催化壳聚糖生产壳寡糖的应用。
本发明与现有技术相比的有益效果：
本发明从深海淤泥中提取了壳聚糖酶基因csn4，其编码的壳聚糖酶CSN4的氨基酸序列与GenBank中Geobacteraceae bacterium来源的肽聚糖结合蛋白具有最高的相似性，为60％，属于糖苷水解酶46家族。本发明同时构建了该壳聚糖酶CSN4的基因csn4的重组质粒csn4/pET-28a及基因工程菌株，所产生的壳聚糖酶CSN4具有优良的酶学特性：最适温度为35℃，在25-40℃具有较高活性；最适pH为3.5，在pH 2.5-4.0的条件下酶活较高，是一个酸性壳聚糖酶。其反应条件温和，在酶法制备壳寡糖中具有很好的工业应用前景。
附图说明
图1：本发明的壳聚糖酶CSN4经Ni-IDA亲和层析纯化的纯酶SDS-PAGE电泳图，M为Marker。
图2：温度变化对本发明的壳聚糖酶CSN4酶活力的影响。
图3：pH变化对本发明的壳聚糖酶CSN4酶活力的影响。
具体实施方式
下面结合实施例对本发明做进一步说明。应理解，以下实施例仅用于说明本发明而非用于限制本发明的范围。基于本发明中的实施例，本领域的技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的其他实施例，也属于本发明的保护范围。
本发明提供了一种壳聚糖酶CSN4，编码该壳聚糖酶CSN4的基因csn4及其应用、含有该基因的重组质粒csn4/pET-28a、含有该重组质粒的基因工程菌株以及该基因工程菌株的应用。
实施例1、来源于深海淤泥壳聚糖酶CSN4的基因csn4获取
本发明的壳聚糖酶CSN4的基因csn4获取方法包括如下步骤：
(1)、构建深海淤泥宏基因组文库
取10g采集的深海淤泥样品，应用Epicentre公司的Meta-G-NomeTM DNA IsolationKit，严格按照说明书操作，提取并纯化样品DNA。
取适量纯化的DNA，与Epicentre公司的CopyControlTM Fosmid LibraryProduction Kit with pCC1FOSTM Vector载体连接，并将连接液包装后转导入EPI300TM-T1R E.coli宿主菌中。然后涂布在含12.5mg/L氯霉素的平板上，37℃过夜培养；用无菌LB洗下平板上的菌落，加甘油(20％，v/v)保存于-80℃。
(2)筛选壳聚糖酶的阳性克隆
将保存的菌液按照适当的稀释倍数涂布在含壳聚糖(0.1％)的LB-氯霉素筛选平板上，37℃培养24-48h后，观察菌落周围培养基变化，挑选能形成清晰透明圈且水解活性较高的菌株，命名为1-csn4。
(3)构建亚克隆文库及筛选
将筛选到的阳性克隆1-csn4培养后，采用碱裂法提取质粒，用内切酶Sau3A I将质粒片段化，琼脂糖电泳分离，切胶回收2-5kb的DNA片段，与用BamH I酶切的质粒pBluescript II SK(+)连接并转化至E.coli DH5α中，构建亚克隆文库，筛选方法同如上所述，挑选周围出现透明圈的菌株，并经划线重复确认，获得阳性亚克隆菌株2-csn4。
(4)基因测序及壳聚糖酶CSN4的基因序列分析
将筛选得到的阳性亚克隆提取质粒后进行测序。测序结果基于NCBI/ORF Finder进行在线分析，得到一个长为687bp的完整开放阅读框(Open Reading Frame)，命名为csn4，其碱基序列如SEQ ID NO:2所示。编码蛋白长度为228个氨基酸残基，其氨基酸序列如SEQ ID NO:1所示。将该氨基酸序列在GenBank中进行同源搜索，与之相似性最高为60％的是一个来源于Geobacteraceae bacterium的肽聚糖结合蛋白。
系统发育分析结果表明，壳聚糖酶CSN4属于糖苷水解酶46家族。根据氨基酸序列推测，壳聚糖酶CSN4的催化中心由谷氨酸(E19)和天冬氨酸(D35)组成。综上所述，壳聚糖酶CSN4为糖苷水解酶46家族中的一名新成员。
(5)壳聚糖酶CSN4基因的克隆
根据序列分析结果，设计扩增壳聚糖酶CSN4全基因的引物：
CSN4BF：5'CGCGGATCCATGCAGCTAACTG 3'(下划线部分为BamH I酶切位点)；
CSN4HR：5'CCCAAGCTTCTAGTCGCCGTGGA 3'(下划线部分为Hind III酶切位点)。
以阳性亚克隆菌株2-csn4中提取的质粒为模板，进行PCR扩增。PCR产物纯化后，用BamH I和Hind III进行双酶切，酶切产物经纯化后与经相同双酶切过的原核表达载体pET-28a(+)连接，得到重组质粒csn4/pET-28a，然后将其转入大肠杆菌E.coli DH5α中，挑取转化子进行测序验证。
测序结果显示重组质粒插入的片段序列与SEQ ID NO:2所述核酸序列完全一致。
实施例2、重组壳聚糖酶CSN4的表达及纯化
按常规方法将实施例1中的重组质粒csn4/pET-28a转化至大肠杆菌E.coli BL21(DE3)，获得生产壳聚糖酶CSN4的基因工程菌株。
将上述基因工程菌株接入LB培养基中，于37℃培养至对数生长期后，加入IPTG至终浓度为0.1mmol/L，20℃继续培养20小时。离心收集菌体，并用生理盐水洗涤，加入NPI-0缓冲液(50mM Na2HPO4，0.3M NaCl，pH8.0)悬浮。然后在冰水浴中进行超声破碎(功率200～400W，工作3s，间隙5s，超声20min)，离心收集上清，此即为壳聚糖酶CSN4的粗酶液。粗酶液中含有重组蛋白，即壳聚糖酶CSN4。
采用Ni-IDA亲和柱纯化重组壳聚糖酶CSN4，经不同浓度的咪唑溶液梯度洗脱，并将洗脱液超滤脱盐浓缩，得到纯化的重组壳聚糖酶CSN4。经SDS-PAGE电泳检测蛋白纯度，结果如图1所示，根据图1结果，重组壳聚糖酶CSN4表达量较高，在约26kDa处看到清晰条带，与预期的壳聚糖酶大小吻合。
实施例3、重组壳聚糖酶CSN4的酶学性质检测
将实施例2中制备得到的壳聚糖酶CSN4纯酶用柠檬酸缓冲液稀释(100mM，pH3.5)，然后分别在25-55℃下进行反应，反应条件为：取10μL纯酶加入至990μL 100mM，pH3.5的柠檬酸缓冲液中，在不同的温度下温浴10min后，分别加入100μL 1％壳聚糖反应20min，然后用DNS法测定反应液中的还原糖含量。以酶活力的最高值作为100％，结果如图2所示。结果显示重组壳聚糖酶CSN4的最适温度为35℃，在25-40℃具有较高活性。
将实施例2中制备得到的壳聚糖酶CSN4纯酶分别用100mM，pH为2.5-5.0的柠檬酸缓冲液稀释，然后在30℃进行反应，反应条件为：取10μL纯壳聚糖酶CSN4加入至990μL不同pH值的柠檬酸缓冲液(pH2.5-5.0)中孵育10min后，然后分别加入100μL 1％壳聚糖在30℃条件下反应20min，检测方法如上所述。以酶活力的最高值作为100％，结果如图3所示。结果表明重组壳聚糖酶CSN4的最适pH为3.5，在pH2.5-4.0的条件下酶活较高，该酶是一个酸性壳聚糖酶。
Claims (7)
1.一种壳聚糖酶CSN4，其特征在于其氨基酸序列如SEQ ID NO:1所示。
2.编码权利要求1所述壳聚糖酶CSN4的基因csn4，其核苷酸序列如SEQ ID No:2所示。
3.一种重组质粒csn4/pET-28a，所述重组质粒csn4/pET-28a含有权利要求2所述壳聚糖酶CSN4的基因csn4。
4.含有权利要求3所述重组质粒csn4/pET-28a的基因工程菌株。
5.权利要求4所述的基因工程菌株，其特征在于它是由权利要求3所述的重组质粒csn4/pET-28a转化大肠杆菌E. coli BL21(DE3)获得。
6.权利要求1所述壳聚糖酶CSN4用于催化壳聚糖生产壳寡糖的应用。
7.权利要求4所述基因工程菌株用于催化壳聚糖生产壳寡糖的应用。
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