CN103361374A - 一种来源于土壤宏基因组文库的壳聚糖酶基因及其获取方法与用途 - Google Patents
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Abstract
本发明提供了一种来源于土壤宏基因组文库的壳聚糖酶基因，其DNA序列如SEQID NO：1所示。还提供了该基因编码得到的壳聚糖酶、包括该基因的重组质粒，还提供了含有该基因的大肠杆菌工程菌及其获取方法。该壳聚糖酶基因获取方法简单，并提供了包含该基因的大肠杆菌工程菌，该菌株能够高效表达获得壳聚糖酶，获得的壳聚糖酶经生物信息学分析表明该壳聚糖酶属于糖苷水解酶第46家族，其催化活性高、热稳定性好，最适作用温度为55℃、pH为6.0，具有较大的工业价值和经济价值。
Description
技术领域
本发明属于生物工程技术领域，特别涉及一种来源于土壤宏基因组文库的糖苷水解酶46家族的壳聚糖酶基因及其获取方法，还涉及该基因编码得到的壳聚糖酶，还涉及包括该基因的重组质粒，还涉及含有该基因的大肠杆菌工程菌及其获取方法。
背景技术
壳聚糖是甲壳素脱乙酰化后的产物，具有降低胆固醇、降血压、防治糖尿病、强化肝脏机能、治疗烧烫伤等功能。壳寡糖是壳聚糖的降解产物，除了具有增强免疫功能作用外，还具有防腐抑菌作用，因而在医药、食品、化妆品、材料、化工、农业和环保等诸多领域有广泛应用。
相对于化学法制备壳寡糖，酶法降解壳聚糖的过程更容易控制，且反应专一性强，产物安全性高，环境污染少。壳聚糖酶是专一性降解壳聚糖的糖苷水解酶，是目前酶法降解壳聚糖的重要研究内容。目前，国内外对于壳聚糖酶的筛选研究大都采用单菌落纯培养的方式从自然界中筛选产酶活性较高的微生物菌株。然而，土壤中不可培养微生物占据微生物总数的99%以上，传统的分离培养单菌落只能认识土壤里不到1%的微生物，这己成为微生物资源开发利用的一个限制性因素。
宏基因组学是通过提取某一环境中的所有微生物基因组DNA、构建基因组文库及对文库进行筛选、寻找和发现新的功能基因及活性代谢产物的一种方法。它避开了微生物分离培养的过程，极大地扩展了微生物资源的利用空间。
本发明提供一种新型的获取壳聚糖酶基因的方法，即采用基于宏基因组文库的筛选方法进行壳聚糖酶基因的获取，为壳聚糖酶基因的异源高效表达和产业化生产奠定理论基础。
发明内容
发明目的：本发明的第一目的是提供一种来源于土壤宏基因组文库的糖苷水解酶46家族的壳聚糖酶基因及其获取方法。
本发明的第二目的是提供该基因编码得到的壳聚糖酶。
本发明的第三目的是提供包括该基因的重组质粒。
本发明的第四目的是提供含有该基因的大肠杆菌工程菌及其获取方法。
技术方案：本发明提供的一种来源于土壤宏基因组文库的壳聚糖酶（Meta chiA）基因，其DNA序列如SEQ ID NO：1所示。
本发明还提供了上述壳聚糖酶（Meta chiA）基因的DNA序列的获取方法，包括以下步骤：
（1）土壤宏基因组文库的构建：提取土壤中微生物宏基因组DNA，用Fosmid载体构建插入片段为35-50kb的土壤宏基因组文库；将所获得的文库转染细菌后，涂布在含有壳聚糖的LB固体培养基上培养；
（2）亚克隆文库的筛选：挑取菌落周围有透明圈的菌株，提取质粒，用限制性内切酶EcoRI和HindIII酶切质粒后，割胶回收2-6kb DNA片段；将回收的DNA片段与相同限制性内切酶酶切的pUC19连接并导入E.coli DH5α，涂布在含有壳聚糖的LB固体培养基上培养；挑选菌落周围有透明圈的菌株，提取重组质粒并测序；
（3）壳聚糖酶基因的DNA序列的获取：根据测序结果设计带有酶切位点的引物PCR扩增出剪切信号肽的壳聚糖酶基因chiA；琼脂糖凝胶电泳分析，割胶回收目的条带并与pMD-19T simple vector连接得到pMD-19T simple vector-chiA，转化E.coli JM109，经酶切鉴定并测序。
本发明还提供了一种壳聚糖酶（Meta chiA），由SEQ ID NO：1所述的壳聚糖酶基因编码得到。
优选地，所述壳聚糖酶（Meta chiA），其氨基酸序列如SEQ ID NO：2所示。
本发明还提供了一种重组质粒，包括DNA序列为SEQ ID NO：1所示的壳聚糖酶基因。
本发明还提供了一种获得大肠杆菌工程菌的方法，包括以下步骤：
（1）含编码壳聚糖酶基因的表达质粒的构建：将权利要求2制得的pMD-19T simplevector-chiA与pET-28a质粒均用BamHI和HindIII进行双酶切，割胶回收的酶切产物在T4DNA连接酶的作用下进行连接，得到重组质粒pET28a-chiA，并对重组质粒进行序列测定；
（2）大肠杆菌工程菌E.coli Rosetta-gami/chiA的构建：将重组质粒pET28a-chiA转化到E.coli Rosetta-gami中，IPTG诱导6-10h，即得。
有益效果：本发明提供的壳聚糖酶基因获取方法简单，并提供了包含该基因的大肠杆菌工程菌，该菌株能够高效表达获得壳聚糖酶，获得的壳聚糖酶经生物信息学分析表明该壳聚糖酶属于糖苷水解酶第46家族，其催化活性高、热稳定性好，最适作用温度为55℃、pH为6.0，具有较大的工业价值和经济价值。
附图说明
图1为是Fosmid-Chi1在壳聚糖平板上的生长情况；其中，1为不加IPTG诱导的重组子的细胞破碎上清液；2为加入IPTG诱导的重组子的细胞破碎上清液；M为蛋白Marker。
图2为Meta ChiA诱导表达的SDS-PAGE图谱。
图3为琼脂糖凝胶电泳图。
图4为琼脂糖凝胶电泳图。
具体实施方式
根据下述实施例，可以更好地理解本发明。然而，本领域的技术人员容易理解，实施例所描述的具体的物料配比、工艺条件及其结果仅用于说明本发明，而不应当也不会限制权利要求书中所详细描述的本发明。
本发明中，含壳聚糖的基础培养基的组成为：胶体壳聚糖1g/L，蛋白胨10g/L，酵母粉5g/L，氯化钠10g/L，琼脂粉15g/L，氯霉素12.5mg/L。
本发明的一些分析方法：
对测序结果进行分析，其中DNA序列分析开放阅读框架（ORF）分析是使用美国国家生物信息中心提供的ORF Finder功能（http://www.ncbi.nlm.nih.gov/gorf/gorf.html）。DNA同源性分析是使用美国国家生物信息中心提供的世界范围的Blast引擎（http://www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST/）与各DNA数据库中进行比对。
对氨基酸序列分析，其中分析目的蛋白氨基酸序列同源性分析是使用美国国家生物信息中心提供的世界范围的Blast引擎（http://www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST）与各氨基酸序列数据库中的氨基酸序列进行比对。目的蛋白氨基酸序列保守结构域的分析是通过美国国家生物信息中心（http://www.ncbi.nlm.nih.gov/Structure/cdd/wrpsb.cgi）。不同蛋白之间的氨基酸序列比对分析使用软件DNAMAN。
实施例1壳聚糖酶（Meta chiA）基因的DNA序列的获取
壳聚糖酶（Meta chiA）基因的DNA序列的获取，包括以下步骤：
取1g采集的土壤样品，应用Epicentre公司的Meta-G-NomeTM DNA Isolation Kit，严格按照说明书操作，提取土壤DNA。
取适量DNA，按照Epicentre公司的CopyControlTM HTP Fosmid Library Production Kit的使用说明，对该DNA片段进行末端补平，低熔点琼脂糖凝胶电泳后（图3），切割分离含30-60kb碱基之间的DNA条带，溶胶法回收该DNA，连接，包装，转导入EPI300宿主细胞，涂布含12.5mg/L氯霉素的平板上，37℃培养24h；洗下平板上的菌落文库。
将菌落文库中菌液按照适当的稀释倍数涂布在含壳聚糖的基础培养基上，置于37℃恒温培养箱培养24h，观察菌落周围培养基变化，挑取菌落周围出现透明圈的菌株，命名为Fosmid-Chi1，结果见图1所示。确定为表达壳聚糖酶活性的克隆后，进而构建亚克隆文库筛选。
提取Fosmid-Chi1质粒DNA，用限制性内切酶EcoR I和HindIII打断质粒DNA后，割胶回收2～6kb DNA片段，连接用相同限制性内切酶酶切的pUC19，导入E.coli DH5α，涂布含有壳聚糖的LB固体培养基，观察菌落周围培养基变化，挑取菌落周围出现透明圈的菌株，提取质粒后送测序。将测序结果在NCBI上对开放阅读框架（Open ReadingFrame）进行分析，进而推导出Meta ChiA的氨基酸序列。
重新设计带有酶切位点的引物P1和P2，将Meta chiA PCR扩增出来。用1%琼脂糖凝胶电泳分析（图4），割胶回收目的条带并与pMD-19T simple vector连接得到pMD-19T simple vector-chiA，转化E.coli JM109，经酶切鉴定正确后送上海生工测序，得到Meta chiA序列，见SEQ ID NO：2所示。其中，
P1为GGATCCGCGGGACTGAATAAAGATCAAAA；
P2为AAGCTTTTATTTGATTACAAAATTACCG。
实施例2含有DNA序列为SEQ ID NO：1所示的壳聚糖酶基因的大肠杆菌工程菌的制备
实施例1制得的pMD-19T simple vector-chiA与pET-28a质粒均用BamHI、HindIII进行双酶切，割胶回收的酶切产物在T4DNA连接酶的作用下进行连接，得到重组质粒pET28a-chiA，并对重组质粒进行序列测定。
按照分子克隆手册，将重组质粒pET28a-chiA转化到E.coli Rosetta-gami中，IPTG（终浓度为0.5mM）诱导6-10h，得到大肠杆菌重组子E.coli Rosetta-gami//chiA。
实施例3测定实施例2的大肠杆菌工程菌的壳聚糖酶活性
将大肠杆菌工程菌超声破碎后，其上清液采用Ni2+金属螯合层析进行分离纯化，纯化后经SDS-PAGE检测为单一条带，并显示重组Meta ChiA的分子量为27kDa，见图2。
用DNS法测定壳聚糖酶活性，具体操作为：
于2ml EP管中，各加入用pH6.0、醋酸-醋酸钠缓冲液配制的质量浓度为1%的胶体壳聚糖溶液0.8ml，50℃预热10min，在一个EP管中加入0.1ml适当稀释的酶液，50℃准确反应10min，立刻加入0.1ml1mol/L的NaOH，摇匀后10,000rpm离心1min，吸取0.5ml上清加入10ml具塞试管中，再加入0.5ml DNS试剂，煮沸5min，冷却后加入去离子水4ml，摇匀；空白组先将酶液煮沸10min使其失活后按照实验组相同处理。
540nm处以空白组为对照测定实验组吸光值，并从氨基葡萄糖标准曲线上查出相应的还原糖（以氨基葡萄糖计）含量并折算成酶活性单位。其中，酶活性单位定义：在本测定条件下，以每分钟产生1μmol还原糖所需的酶量定义为1个酶活单位（U）。
结果显示，该重组Meta ChiA在pH6.0、55℃条件下，粗酶的比酶活达到131U/mg。
Claims (6)
1.一种来源于土壤宏基因组文库的壳聚糖酶基因，其DNA序列如SEQ ID NO：1所示。
2.权利要求1所述的壳聚糖酶基因的DNA序列的获取方法，其特征在于：包括以下步骤：
（1）土壤宏基因组文库的构建：提取土壤中微生物宏基因组DNA，用Fosmid载体构建插入片段为35-50kb的土壤宏基因组文库；将所获得的文库转染细菌后，涂布在含有壳聚糖的LB固体培养基上培养；
（2）亚克隆文库的筛选：挑取菌落周围有透明圈的菌株，提取质粒，用限制性内切酶EcoRI和HindIII酶切质粒后，割胶回收2-6kb DNA片段；将回收的DNA片段与相同限制性内切酶酶切的pUC19连接并导入E.coli DH5α，涂布在含有壳聚糖的LB固体培养基上培养；挑选菌落周围有透明圈的菌株，提取重组质粒并测序；
（3）壳聚糖酶基因的DNA序列的获取：根据测序结果设计带有酶切位点的引物PCR扩增出剪切信号肽的壳聚糖酶基因chiA；琼脂糖凝胶电泳分析，割胶回收目的条带并与pMD-19T simple vector连接得到pMD-19T simple vector-chiA，转化E.coli JM109，经酶切鉴定并测序。
3.一种壳聚糖酶，由SEQ ID NO：1所述的壳聚糖酶基因编码得到。
4.根据权利要求3所述的一种壳聚糖酶，其氨基酸序列如SEQ ID NO：2所示。
5.一种重组质粒，包括DNA序列为SEQ ID NO：1所示的壳聚糖酶基因。
6.一种获得大肠杆菌工程菌的方法，其特征在于：包括以下步骤：
（1）含编码壳聚糖酶基因的表达质粒的构建：将权利要求2制得的pMD-19T simplevector-chiA与pET-28a质粒均用BamHI和HindIII进行双酶切，割胶回收的酶切产物在T4DNA连接酶的作用下进行连接，得到重组质粒pET28a-chiA，并对重组质粒进行序列测定；
（2）大肠杆菌工程菌E.coli Rosetta-gami/chiA的构建：将重组质粒pET28a-chiA转化到E.coli Rosetta-gami中，IPTG诱导6-10h，即得。
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