CN108611337A

CN108611337A - 一种重组壳聚糖酶及其生产方法与应用

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Publication number: CN108611337A
Application number: CN201810439371.8A
Authority: CN
Inventors: 赵黎明; 秦臻; 罗洒; 邱勇隽
Original assignee: East China University of Science and Technology
Current assignee: East China University of Science and Technology
Priority date: 2018-05-09
Filing date: 2018-05-09
Publication date: 2018-10-02
Anticipated expiration: 2038-05-09
Also published as: CN108611337B

Abstract

本发明涉及一种重组壳聚糖酶及其生产方法与应用，具体涉及重组壳聚糖酶、编码基因及其生产方法和应用。本发明所涉及的重组壳聚糖酶是由SEQ ID：1所示的氨基酸序列所组成的蛋白质，所述重组壳聚糖酶的编码基因是SEQ ID：2所示的DNA分子。本发明所公开的壳聚糖酶具有优良的酶学性质：在pH 5.5‑6.0和45‑60℃条件下酶活性较高，比酶活达到1203U/mg。该酶能够有效降解壳聚糖制备聚合度2‑10的壳寡糖，在酶法制备壳寡糖中具有重要的工业应用价值以及经济价值。

Description

一种重组壳聚糖酶及其生产方法与应用

技术领域

本发明属于食品生物技术领域，尤其是涉及一种重组壳聚糖酶及其生产方法与应用，包括重组壳聚糖酶、编码基因及其生产方法和应用。

背景技术

壳聚糖是甲壳素部分或完全脱乙酰基的衍生物，主要由D-氨基葡萄糖通过β-1,4-糖苷键连接形成。壳聚糖的水解产物壳寡糖在提高巨噬细胞吞噬能力、抑制肿瘤细胞生长、降低胆固醇、抗氧化和植物免疫诱抗等方面具有较强活性，在功能食品、抗肿瘤药物、免疫增强剂及农作物生物制剂领域具有独特而重要的应用。壳聚糖酶(Chitosanase，E C3.2.1.132)是一种能够专一性催化水解壳聚糖中的β-1,4-糖苷键生成壳寡糖的糖苷水解酶。国内外研究者对于壳聚糖酶均展开了大量探索性研究，已报道的壳聚糖酶主要来源于细菌、真菌、部分植物及宏基因组。由于微生物来源的壳聚糖酶具有生产周期快、酶活力稳定、生产容易放大等优点，目前已成为壳聚糖酶研究的最重要来源。一些微生物来源的壳聚糖酶能够高效水解壳聚糖制备壳寡糖，具有良好应用前景。如：Microbacterium sp.来源的壳聚糖酶水解壳聚糖的产物主要为DP 2-6的壳寡糖(Biotechnol.Lett.,2006,28:1393–1399)；Bacillus subtilis 168来源的壳聚糖酶水解壳聚糖的产物为DP 2-6的壳寡糖(Bioresour.Technol.,2013,127:407–414)；Aspergillus sp.来源壳聚糖酶具有良好的热稳定性及pH稳定性，能够水解壳聚糖生成DP2-7的壳寡糖(Int.J.Biol.Macromol.,2015,81:362–369)。

尽管酶法制备壳寡糖存在许多优势，但现有的壳聚糖酶普遍存在活力较低、应用性能较差、产物聚合度不可控、使用成本高等问题，满足工业生产需求的新型壳聚糖酶仍然有待进一步研究挖掘。目前，专利公开的壳聚糖酶主要来源于芽孢杆菌、曲霉属菌株、青霉菌(公开号：CN106754829A；CN107236721A；CN103215192A；CN102250858A)，其中活性较高的重组壳聚糖酶的酶活为700U/mg(公开号：CN101397552)，但是其酶活仍然有待进一步提高。

发明内容

本发明的目的就是为了克服上述现有技术存在的缺陷而提供一种重组壳聚糖酶及其生产方法与应用。

本发明的目的可以通过以下技术方案来实现：

本发明提供一种重组壳聚糖酶，所述重组壳聚糖酶是如下a)或b)的蛋白质：

a)由SEQ ID NO：1所示的氨基酸序列组成的蛋白质，

b)由SEQ ID NO：1所示的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加得到的且具有相同功能的蛋白质。

本发明还提供编码所述重组壳聚糖酶的基因。

进一步的，编码重组壳聚糖酶的基因是SEQ ID NO：2所示的DNA分子。

本发明提供上述含有编码重组壳聚糖酶的基因的重组载体、表达盒、转基因细胞或重组菌。

本发明提供一种重组质粒，是将壳聚糖酶基因Csn46A连接至大肠杆菌表达载体pET28a构建而成。

本发明提供一种重组菌株，所述重组菌株是以大肠杆菌BL21(DE3)为宿主构建的，是将上述重组质粒转入大肠杆菌BL21(DE3)中获得的，所述重组菌株表达碱基序列如SEQID NO：2所示的DNA，得到重组壳聚糖酶。

本发明提供所述重组壳聚糖酶的制备方法，该方法为：将SEQ ID NO：2所示的DNA分子导入宿主菌中得到的重组菌，所述宿主菌为大肠杆菌BL21(DE3)，诱导培养所述重组菌，得到重组壳聚糖酶。

本发明提供所述壳聚糖酶在水解壳聚糖中的应用。

进一步的，所述壳聚糖包括商品化壳聚糖以及脱乙酰度为20-100％的脱乙酰几丁质。

本发明提供所述壳聚糖酶在制备壳寡糖或几丁寡糖中的应用。

进一步的，所述壳寡糖或几丁寡糖聚合度为2-20，平均分子量为400-4000Da，脱乙酰度为20-100％。

本发明提供一种生产壳寡糖的方法，用所述壳聚糖酶单独水解壳聚糖制备壳寡糖；或者采用所述壳聚糖酶与其他壳聚糖酶、几丁质酶或非特异性酶复配使用，协同降解壳聚糖或部分脱乙酰几丁质制备壳寡糖。

进一步地，所述水解的条件为：壳聚糖质量分数为0.1-3％，反应pH 5.0-6.0，反应温度40-50℃，水解30-100min。

本发明提供了一种壳聚糖酶，重组酶活高达1203U/mg，具有较好的热稳定性和pH稳定性，在壳寡糖制备领域具有很大应用潜力。

与现有技术相比，本发明所述壳聚糖酶能够专一性降解壳聚糖生成聚合度2-10的一系列壳聚糖，具有不水解产生单糖、酶活性高和反应条件温和等优点，在酶法制备食品、农业用壳寡糖方面具有很好的工业应用前景。

附图说明

图1显示了大肠杆菌重组Csn46A经Ni-IDA亲和层析纯化的纯化图。

其中，泳道M代表低分子量标准蛋白，泳道1代表菌体破壁后的上清液，泳道2代表经Ni-IDA亲和层析纯化后的蛋白。

图2显示了温度变化对Csn46A酶活力的影响。

所用缓冲液为：醋酸-醋酸钠缓冲液(pH 6.0)。

图3显示了温度变化对Csn46A酶活稳定性的影响。

所用缓冲液为：醋酸-醋酸钠缓冲液(pH 6.0)。

图4显示了pH变化对Csn46A酶活力的影响。

所用缓冲液为：醋酸-醋酸钠缓冲液(pH 4.5-6.5)、柠檬酸-磷酸氢二钠(pH5.5-7.0)、磷酸二氢钠-磷酸氢二钠(pH 7.0-8.0)。

图5显示了pH变化对Csn46A酶活稳定性的影响。

所用缓冲液为：柠檬酸-磷酸氢二钠(pH 3.0-5.0)、醋酸-醋酸钠缓冲液(pH4.0-6.0)、MES(pH 5.0-6.0)、磷酸二氢钠-磷酸氢二钠(pH 6.0-8.0)、甘氨酸-氢氧化钠(pH8.0-11.0)。

图6显示了Csn46A对壳聚糖的水解特性。

图7显示了通过控制水解条件所得壳聚糖产品的聚合度分布。

具体实施方式

本发明提供重组壳聚糖酶是由SEQ ID NO：1所示的氨基酸序列组成的蛋白质。

本发明提供上述重组壳聚糖酶的编码基因，所述重组壳聚糖酶的编码基因是SEQID NO：2所示的DNA分子。

本发明提供一种制备重组壳聚糖酶的方法，是将上述壳聚糖酶基因Csn46A连接至大肠杆菌BL21(DE3)表达载体pET28a，并转化至大肠杆菌BL21(DE3)中诱导表达得到重组壳聚糖酶。

本发明提供应用所述重组菌株发酵生产重组壳聚糖酶的方法，是由上述重组菌株进行发酵培养，经异丙基-β-D-硫代半乳糖苷(IPTG)诱导表达得到重组壳聚糖酶。

本发明提供应用所述重组菌株制备重组壳聚糖酶经过如下步骤：

1)种子液培养：将重组菌株接种于LB培养基中，在37℃、200rpm条件下培养24h，得到种子液。

2)扩大培养：将种子液接种到LB培养基中，在37℃、200rpm条件下培养4h，得到扩大培养液。

3)IPTG诱导培养：在扩大培养基中加入IPTG，用量为1mmol/mL，在30℃、200rpm条件下诱导12h。

4)离心和纯化：将所述发酵液依次进行离心和纯化。

重组壳聚糖酶的离心、纯化包括以下步骤：

(1)将发酵培养后得到的发酵液在10000rpm条件下离心2min，收集沉淀。

(2)在步骤(1)中沉淀中加入15-20mL缓冲液(20mM Tris-Hcl,pH 8.0,100mMNaCl)重悬，用超声细胞粉碎仪破碎细胞，在10000rpm条件下离心2min，取上清液，所述上清液为含有重组壳聚糖酶的溶液。

(3)将步骤(2)中含有重组壳聚糖酶的溶液进行Ni-IDA亲和层析柱纯化，得到纯化后的重组壳聚糖酶。

下面结合附图和具体实施例对本发明进行详细说明。

实施例1、Csn46A基因及蛋白的获得

以腐败降解的虾蟹壳废弃物为样品，将其接种入壳聚糖为单一碳源的富集培养基(壳聚糖50g，酵母提取物5g，CaCl₂ 0.3g，MgSO₄.7H₂O 0.3g，FeSO₄ 0.3g，KH₂PO₄ 0.6g，吐温80 2.5g，定容到1L，pH 5.5)中，培养条件：温度37℃，时间72h，转速150rpm，用于富集可降解壳聚糖的环境微生物。离心收集混合液中所有沉淀组分，提取上述样品总DNA。根据糖苷水解酶46家族壳聚糖酶相关基因序列的保守区域，设计简并引物，以上述样品总DNA为模板进行PCR扩增，对获得的片段进行测序，应用TAIL-PCR技术扩增潜在的壳聚糖酶基因全长。对全长基因测序表明DNA片段含有SEQ ID NO.2所示的DNA分子，编码SEQ ID NO.1所示的壳聚糖酶蛋白质，将其命名为Csn46A。

以上述序列作为模板，以人工合成的上游引物Csn46A-up(5’-ATTCTAGCTAGCATGATGGUCGACACGAAGGACG-3’，下划线示NheⅠ酶切位点)和下游引物Csn46A-down(5’-ATTCCGCTCGAG TTATTGAATAGTATAATTAC-3’，下划线示XhoⅠ酶切位点)，进行PCR扩增，得到目的DNA片段。

PCR扩增条件为：94℃预变性5min；94℃变性30s，54℃退火30s，72℃延伸60s，循环35次；最后72℃后延伸5min。

PCR产物经过1％琼脂糖凝胶电泳回收，以NheⅠ和XhoⅠ双酶切。将该双酶切后的产物与经相同双酶切过的原核表达载体pET-28a(+)(美国Novagen公司，产品编号：69864-3)片段以T4DNA连接酶进行连接，得到重组质粒，并将其转化至宿主大肠杆菌DH5α。挑选菌落PCR(PCR所用的引物和扩增条件与本段前述PCR的相同)验证为阳性的转化子测序。

测序结果表明：重组质粒为在载体pET-28a(+)的NheⅠ和XhoⅠ位点间插入了SEQ IDNO:2所示的DNA片段，阳性转化子即为含有上述重组质粒的大肠杆菌DH5α。

实施例2、重组壳聚糖酶(Csn46A)的表达和纯化

将实施例1中的重组质粒转化表达至宿主大肠杆菌BL21(DE3)，得到重组菌，并将其接种至1L LB液体培养基(含50μg/mL卡那霉素)，在37℃，200rpm条件下培养至OD₆₀₀在0.6-0.8之间，加入IPTG(异丙基-β-D-硫代半乳糖苷)至终浓度为1mM，30℃诱导过夜。离心收集菌体后，将菌体按照1:10(v/v)的比例，用缓冲液A(20mM Tris-Hcl冲液，0.5M NaCl，20mM咪唑,pH 8.0)重悬浮，然后于冰水浴中超声破碎(200W，超声3s，间歇4s，120次)，再离心收集上清液即为粗酶液，粗酶液中含有重组蛋白Csn46A，即重组壳聚糖酶(Csn46A)。

基于pET28-a(+)质粒中有编码His-Tag标签蛋白的序列，使用琼脂糖Ni-IDA亲和柱纯化重组蛋白Csn46A(即在序列表SEQ ID NO:1所示氨基酸序列的N端连接了His-Tag标签序列(HHHHHH)的重组蛋白)。具体纯化步骤如下：

将粗酶液上样于Ni-IDA柱进行纯化。纯化的具体步骤为(流速为1mL min^-1)：先用缓冲液A(20mM Tris-Hcl冲液，0.5M NaCl，20mM咪唑，pH 8.0)洗脱至OD₂₈₀小于0.05，然后用缓冲液B(20mM Tris-Hcl冲液，0.5M NaCl，40mM咪唑，pH 8.0)洗脱至OD₂₈₀小于0.05，最后用缓冲液C(20mM Tris-Hcl冲液，0.5M NaCl，200mM咪唑，pH 8.0)洗脱。收集缓冲液C洗脱部分，得到纯化的重组壳聚糖酶(Csn46A)的溶液。

经SDS-PAGE检测蛋白纯度(图1)。结果显示重组蛋白Csn46A经Ni-IDA亲和柱一步纯化可得电泳纯蛋白，分子量大小约为30kDa。

实施例3、重组壳聚糖酶(Csn46A)性质检测及酶学性质

1、Csn46A的酶活力检测

壳聚糖酶的酶活力的测定方法具体如下：在1.5mL离心管中先后加入350μL壳聚糖底物(1.0％,W/V；pH6.0，200mM醋酸-醋酸钠缓冲液)及50μL适当稀释的酶液，50℃反应10min，随后采用DNS法测定反应液中的还原糖含量。酶活力单位(1U)定义为：在上述反应条件下，每分钟生成1μmol的氨基葡萄糖所需要的酶量。其中，壳聚糖底物制备方法：将1.0g壳聚糖用适量100mM醋酸溶液溶解。随后用100mM醋酸钠溶液调节pH至6.0。经过这一处理，壳聚糖即形成均一、透明的溶液。

2、Csn46A的最适反应温度测定

将步骤一制备得到的纯化的重组壳聚糖酶溶液在100mM的醋酸-醋酸钠缓冲液(pH6.0)中适当稀释，然后分别在不同温度下：30℃、40℃、45℃、50℃、55℃、60℃、70℃按照步骤1中的方法测定壳聚糖酶的酶活力，以酶活力的最高值作为100％，结果如图2所示。图2显示重组壳聚糖酶(Csn46A)的最适温度为50℃，在45℃-60℃均具有较高活性。

3、Csn46A的温度稳定性测定

将步骤一制备得到的纯化的重组壳聚糖酶溶液在100mM的醋酸-醋酸钠缓冲液(pH6.0)中适当稀释，然后分别在不同温度下：30℃、40℃、45℃、50℃、55℃、60℃、70℃，保温30min，随后在冰水浴中冷却30min，最后在50℃和pH 6.0条件下按照步骤1中的方法测定壳聚糖酶的酶活力，以未经热处理的酶液作为对照，分别计算不同热处理后酶液的残余酶活力。以残余酶活力占对照酶活力的百分比计算相对酶活力。结果如图3所示。图3显示重组壳聚糖酶(Csn46A)在40℃以下较为稳定，酶活力能保持80％以上。

4、Csn46A的最适pH测定

将步骤一制备得到的纯化的重组壳聚糖酶溶液在100mM的醋酸-醋酸钠缓冲液(pH6.0)中适当稀释，在两个缓冲范围内测定，即乙酸-乙酸钠(4.5-6)和柠檬酸-Na₂HPO₄(5.5-7)。用以上两种缓冲液配制1％的壳聚糖底物，然后在50℃条件下测定壳聚糖酶的酶活力，以酶活力最高点作为100％。结果如图4所示。图4显示重组壳聚糖酶(Csn46A)的最适pH为6.0，在pH 5.5-6.0均具有较高活性。

5、Csn46A的pH稳定性测定

将纯化得到的重组壳聚糖酶溶液用以下几种缓冲液稀释适当倍数：0.2M柠檬酸-Na₂HPO₄(3.0-5.0)、乙酸-乙酸钠(4.0-6.0)、MES(5.0-6.0)、磷酸二氢钠-磷酸氢二钠(6.0-8.0)、Gly-NaOH(8.0-10.0)。将不同pH酶液置于室温分别处理30min后，最后在50℃和pH6.0条件下按照步骤1中的方法测定壳聚糖酶的酶活力，以未经处理的酶液作为对照，分别计算不同pH处理后酶液的残余酶活力。以残余酶活力占对照酶活力的百分比计算相对酶活力。结果如图5所示。图5显示重组壳聚糖酶(Csn46A)在pH 4.0-9.5较为稳定，酶活力能保持95％以上。

综上，该壳聚糖酶的最适反应条件为温度50℃，pH 6.0，在酶的最适反应条件下，纯化后的重组壳聚糖酶(Csn46A)的比酶活为1203U/mg。

实施例3、重组壳聚糖酶(Csn46A)在酶法制备壳寡糖中的应用

(1)酶解壳聚糖条件

重组壳聚糖酶(Csn46A)水解壳聚糖反应条件参照酶的最适反应条件：Ph 6.0，50℃，底物质量分数1％(食品级壳聚糖，脱乙酰度95％)，加酶量0.5U/mL，水解时间2h。水解液体积1L，搅拌转速80-120rpm/min。分别于0，2，5，10，15，30，60，120min取样，95℃保温5min灭酶终止反应。

(2)水解产物检测

2.1薄层层析法(thin layer chromatography，TLC)

采用Kieselgel 60硅胶板(Merck)分析水解产物，展层液为异丙醇：水：氨水：(15:1:7.5，v/v/v)。样品点样1μL于硅胶板点样点，将硅胶板用展层剂展开，吹干后在其表面均匀用显色剂(大茴香醛25mL溶于450mL乙醇中，缓慢加入25mL浓硫酸，最后加入5mL乙酸，混匀)浸湿，然后在130℃烘箱中烘烤5min显色。

2.2高效液相色谱法(High Performance Liquid Chromatography，HPLC)

采用蒸发光散射检测器，检测器温度为40℃，柱温30℃；色谱柱型号为ShodexNH2P-50 4E(4.6×250mm)；流动相A相为水相，B相为乙腈；洗脱条件为0～15min 75％B，15～30min 75％-50％B，30～35min 50％-75％B，35～40min 75％B；流速：1.0ml/min；进样量为10μL。

实验结果显示，Csn46A能够水解壳聚糖生成一系列的低聚糖。反应初期反应液中生成大量的壳二糖-壳六糖，经过两小时的水解，底物中的壳聚糖几乎被完全水解为壳二糖和壳三糖(图6)。利用Csn46A的这一反应特点，可以通过调控加酶量、控制酶解时间，制备不同聚合度分布的壳寡糖产品。实施例通过减少加酶量(0.2-0.3U/mL)，并在反应1-1.5小时后终止酶反应可得聚合度2-10的壳寡糖产品(图7)。

(3)壳寡糖产品精制

1、工艺一

将上述制备的壳寡糖水解液泵入离子交换柱，采用阴阳离子交换树脂(大孔弱碱性苯乙烯系阴离子交换树脂(D301型)；强酸性苯乙烯系阳离子交换树脂(001×7型))脱去料液中的盐离子。将脱离子后的料液旋转蒸发(50-60℃)浓缩至糖液固形物含量30-60％，喷雾干燥得到壳寡糖粉末。

2、工艺二

将上述制备的壳寡糖水解液经膜过滤系统(纳滤膜：截留量150Da；操作压力0.4-0.8MP)浓缩，将料液浓缩至糖液固形物含量20-30％，期间脱去料液中的大部分离子，得到壳寡糖糖浆。最后将壳寡糖糖浆喷雾干燥得到壳寡糖粉末。

上述的对实施例的描述是为便于该技术领域的普通技术人员能理解和使用发明。熟悉本领域技术的人员显然可以容易地对这些实施例做出各种修改，并把在此说明的一般原理应用到其他实施例中而不必经过创造性的劳动。因此，本发明不限于上述实施例，本领域技术人员根据本发明的揭示，不脱离本发明范畴所做出的改进和修改都应该在本发明的保护范围之内。

序列表

<110> 华东理工大学

<120> 一种重组壳聚糖酶及其生产方法与应用

<160> 2

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 250

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 1

Met Met Leu Asp Thr Lys Asn Gly Gly Ala Leu Asn Lys Asp Gln Lys

1 5 10 15

Arg Arg Ala Glu Gln Leu Thr Ala Ile Phe Glu Asn Gly Lys Thr Glu

20 25 30

Ile Gln Tyr Gly Tyr Val Glu Glu Leu Asp Asp Gly Arg Gly Tyr Thr

35 40 45

Cys Gly Arg Ala Gly Phe Thr Thr Ala Thr Gly Asp Ala Leu Glu Val

50 55 60

Val Glu Val Tyr Thr Lys Ala Val Pro Asn Asn Lys Leu Lys Lys Tyr

65 70 75 80

Leu Pro Glu Leu Arg Arg Leu Ala Lys Asp Glu Ser Asp Asp Thr Ser

85 90 95

Asn Leu Lys Gly Phe Ala Ser Ala Trp Arg Ser Leu Gly Asn Asp Lys

100 105 110

Ala Phe Arg Ala Ala Gln Asp Glu Val Asn Asp Arg Leu Tyr Tyr Gln

115 120 125

Pro Ala Met Lys Arg Ser Asp Gln Ala Gly Leu Lys Thr Ala Leu Ala

130 135 140

Lys Ala Val Met Tyr Asp Thr Val Ile Gln His Gly Asp Gly Asp Asp

145 150 155 160

Pro Asp Ser Phe Tyr Ala Leu Ile Lys Arg Thr Asn Lys Lys Met Gly

165 170 175

Gly Ser Pro Lys Asp Gly Thr Asp Glu Lys Lys Trp Leu Asn Lys Phe

180 185 190

Leu Asp Val Arg Tyr Asp Asp Leu Met Asn Pro Ser Asp Glu Asp Thr

195 200 205

Gln Asp Glu Trp Arg Glu Ser Val Ala Arg Val Asp Val Phe Arg Asp

210 215 220

Ile Val Lys Ala Lys Asn Tyr Asn Leu Asp Gly Pro Ile His Val Arg

225 230 235 240

Ser Ser Glu Tyr Gly Asn Tyr Thr Ile Gln

245 250

<210> 2

<211> 753

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 2

atgatggtcg acacgaagga cgggggggcc ctgaataagg atcagaagcg ccgggcggaa 60

cagctgaccg ccatctttga aaacggaaag acggaaattc aatacggata tgttgaagag 120

ttggatgacg gaagaggtta cacttgcggg cgggccggtt ttacaacggc taccggggat 180

gcgctggaag tagtggaagt atacacgaaa gcggtcccga ataacaaatt gaaaaagtat 240

ttgcctgaat tgcgccgtct tgcgaaggac gaaagcgatg acacaagcaa tctgaaagga 300

ttcgcttctg cctggcgttc gcttggcaat gataaggctt tccgagctgc ccaggatgaa 360

gtaaatgacc gcttatatta tcagccggcg atgaaacgtt cagatcaagc cggattgaaa 420

acggcactgg caaaagcagt gatgtacgat acagtgattc agcatggcga cggcgatgat 480

ccagactcct tttatgccct gattaaacgc acgaacaaaa aaatgggcgg gtcaccgaaa 540

gacgggacag acgagaaaaa atggctgaat aaatttttgg atgtgcgcta tgacgatctg 600

atgaatccgt cagatgagga tacccaggat gaatggagag aatcagtagc ccgtgtcgac 660

gttttccgtg atatcgtaaa agcgaagaac tataatttag acgggccgat tcatgtccgg 720

tcaagcgaat acggtaatta tactattcaa taa 753

Claims

1.一种重组壳聚糖酶，其特征在于：所述重组壳聚糖酶是如下a)或b)的蛋白质：

a)由SEQ ID NO：1所示的氨基酸序列组成的蛋白质，

2.编码权利要求1所述重组壳聚糖酶的基因。

3.如权利要求2所述基因，其特征在于：所述基因是SEQ ID NO：2所示的DNA分子。

4.含有权利要求2或3所述基因的重组载体、表达盒、转基因细胞或重组菌。

5.权利要求1所述重组壳聚糖酶的制备方法，其特征在于：该方法为：将SEQ ID NO：2所示的DNA分子导入宿主菌中得到的重组菌，诱导培养所述重组菌，得到重组壳聚糖酶。

6.权利要求1所述壳聚糖酶在水解壳聚糖中的应用，其特征在于：所述壳聚糖包括商品化壳聚糖以及脱乙酰度为20-100％的脱乙酰几丁质。

7.权利要求1所述壳聚糖酶在制备壳寡糖或几丁寡糖中的应用。

8.根据权利要求7所述的应用，其特征在于：所述壳寡糖或几丁寡糖聚合度为2-20，平均分子量为400-4000Da，脱乙酰度为20-100％。

9.一种生产壳寡糖的方法，其特征在于：用权利要求1所述的壳聚糖酶单独水解壳聚糖制备壳寡糖；或者采用权利要求1所述的壳聚糖酶与其他壳聚糖酶、几丁质酶或非特异性酶复配使用，协同降解壳聚糖或部分脱乙酰几丁质制备壳寡糖。

10.根据权利要求9所述的方法，其特征在于：所述水解的条件为：壳聚糖质量分数为0.1-3％，反应pH 5.0-6.0，反应温度40-50℃，水解30-100min。