CN101397552A - 高效重组表达的一种壳聚糖酶 - Google Patents

Abstract

本发明涉及新型的重组壳聚糖酶和其应用，以及制备该酶的方法和其中所用的核酸、载体、宿主细胞等。本发明的重组壳聚糖酶比全长壳聚糖酶短，能通过基因工程手段高效表达，表达量高于500毫克/升，并能用简化的纯化工艺分离纯化，其酶的比活力能达到700U/毫克，因此生产成本低，更适合在实际使用中推广。

Description

高效重组表达的一种壳聚糖酶

技术领域

本发明涉及分子生物学及基因工程技术，具体的说，本发明涉及一种全长壳聚糖酶的N端截短形式的壳聚糖酶，以及通过基因工程手段在大肠杆菌中以可溶形式重组表达该壳聚糖酶的方法等。

发明背景

几丁质(chitin)是一类丰富的自然资源，每年产量超过10亿吨，仅次于纤维素。几丁质不溶于常用溶剂，直接利用非常困难，通常需要用碱液将几丁质处理成脱乙酰基的产物——壳聚糖(chitosan，其脱乙酰度为65％～99％，以70％～80％最常见)，才能加以利用。壳聚糖溶于酸性溶剂并带正电荷，已经广泛应用于食品、制药、纺织、污水处理等行业。壳聚糖可进一步通过酶法降解成壳寡糖(一般由几个到十几个糖残基组成)。由于壳寡糖具有好的水溶性，而且具有多种生物活性，例如可以抑制细菌和真菌生长、具有抗肿瘤与调节免疫活性、可增强植物抗病性等，因此针对壳寡糖的生产和利用的研究近年来越来越受到重视。

在酶法降解壳聚糖的生产工艺中，最关键的就是壳聚糖酶。壳聚糖酶(chitosanase，EC 3.2.1.123)是一类可以将壳聚糖降解的酶，其水解壳聚糖中的β-1，4-糖苷键。目前已经有不少壳聚糖酶被开发出来了，如Genbank登录号ZP_00240544.1、ZP_02591206.1、YP_084010.1、ZP_02259755.1、NP_845032.1等所描述的壳聚糖酶。但是这些酶的氨基酸序列都比较长，通过基因工程表达时，表达宿主负担较大，因而使得表达水平相对较低，也相对增加了下游分离纯化出均一的酶的难度，生产成本也因此较高。

为此，本发明人经过长期艰苦实践，令人惊讶地发现了一种截短的壳聚糖酶，其在全长壳聚糖酶的N端被截短大约10％后仍旧能保持相同的酶活力。这样的壳聚糖酶不但能够保持用壳聚糖酶酶解生产壳寡糖中所应有的传统优势，例如壳寡糖的得率高、对环境污染小等，更能在用基因工程手段生产它时减轻宿主表达负担，获得更高的表达水平，较小的蛋白质也相对降低了后期酶分离纯化的难度，且酶的比活力高达700U/毫克，从而降低了这种壳聚糖酶在生产中的使用重量，使得这种成本更低的壳聚糖酶更适宜在壳寡糖生产中推广应用。另外，本发明人发现通过产期摸索，发现用金属螯合层析进行的分离纯化能大大简化后期分离的步骤，回收率大于90％，具有工艺简单而分离纯化效果好的优点，这进一步降低了本发明的壳聚糖酶生产成本。

发明内容

本发明的目的在于提供新型的重组壳聚糖酶和其应用，以及制备该酶的方法和其中所用的核酸、载体、宿主细胞等。本发明的重组壳聚糖酶比全长壳聚糖酶短，能通过基因工程手段高效表达，并能用简化的纯化工艺分离纯化，因此生产成本低，比全长壳聚糖酶更适合在实际使用中推广。

具体而言，在第一方面，本发明提供了一种重组壳聚糖酶，其特征在于，所述重组壳聚糖酶是

(a)由Seq ID NO.2所示的氨基酸序列组成的蛋白质，或者

(b)在(a)限定的氨基酸序列中经过取代、缺失或添加一个或几个氨基酸且具有壳聚糖酶活性的由(a)衍生的蛋白质。

本发明的重组壳聚糖酶相对于全长壳聚糖酶，N端被截短，尽管由于蛋白质表达后折叠过程一般是从N端开始的，N端的氨基酸序列对蛋白质构象及相应功能有较大影响，但是仍旧本发明的重组壳聚糖酶具有壳聚糖酶活性。本发明的重组壳聚糖酶可以在由Seq ID NO.2所示的氨基酸序列中取代、缺失或添加一个或几个氨基酸残基，优选是取代、缺失或添加一个至五个氨基酸残基，更优选是取代、缺失或添加一个至三个氨基酸残基。本领域技术人员知晓，通过改变已知蛋白质的编码基因序列并将其导入表达载体，可以制备出取代、缺失或添加了氨基酸残基的多肽，这些方法已经广泛记载于《分子克隆实验指南》(北京：科学出版社，2002年)等文献中。在取代的氨基酸残基中，优选取代为与原氨基酸残基侧链性质相似的其他氨基酸。侧链性质相似的氨基酸分别有疏水性氨基酸(A、I、L、M、F、P、W、Y、V)、亲水性氨基酸(R、D、N、C、E、Q、G、H、K、S、T)、脂肪族侧链的氨基酸(G、A、V、L、I、P)、含羟基侧链的氨基酸(S、T、Y)、含硫原子侧链的氨基酸(C、M)、含羧酸和酰胺侧链的氨基酸(D、N、E、Q)、含碱性基团侧链的氨基酸(R、K、H)、含芳香族侧链的氨基酸(H、F、Y、W)。在本发明的一个具体实施方式中，所述重组壳聚糖酶是由Seq ID NO.2所示的氨基酸序列组成的蛋白质。

本文中所用的术语“具有壳聚糖酶活性”指的是能够将壳聚糖降解为不含单糖的壳寡糖的酶活性。壳聚糖酶活性可以通过本领域已经存在的大量酶学实验方法来测量，如本发明实施例所提供的具体方法。优选本发明的重组壳聚糖酶的壳聚糖酶活性相对于全长壳聚糖酶的活性基本不减弱，优选活性可降低不到30％，更优选可降低不到10％，更优选不减弱，最优选活性有提高。

在第二方面，本发明提供了编码本发明第一方面所述的重组壳聚糖酶的核酸。在本文中，“多核苷酸”、“核酸”、“核酸分子”、“核苷酸序列”可以相互替换使用，均指一个含意。本发明的核酸，可以是DNA形式，也可以是RNA形式，优选DNA形式。DNA形式包括天然cDNA和人工合成的cDNA，DNA可以是编码链或模板链。通过常规技术，如PCR方法、重组技术或人工合成的方法，本领域技术人员可以获得本发明的编码重组壳聚糖酶的核苷酸序列或其片段。这些序列一旦获得，就可以将其克隆入载体，再转化或转染入相应的细胞，然后通过常规的宿主细胞进行增殖，从中分离得到大量的核酸。在本发明的一个具体实施方式中，本发明的核酸的核苷酸序列如SEQ ID No.1所示。

在第三方面，本发明提供了一种载体，其含有本发明第二方面所述的核酸。在本文中，“载体”是指本领域中常用的细菌质粒、粘粒、噬菌粒、酵母质粒、植物细胞病毒、动物病毒及其它各种病毒载体。本发明中适用的载体包括但不限于：在细菌中表达用的载体(原核表达载体)、在酵母中表达用的载体(如毕赤酵母载体、汉逊酵母载体等)、在昆虫细胞中表达的杆状病毒载体、在哺乳动物细胞中表达用的载体(痘苗病毒载体、逆转录病毒载体、腺病毒载体、腺伴病毒载体等)、在植物中表达用的植物病毒载体以及在哺乳动物乳腺中表达用的各种载体。总之，只要能在宿主细胞中稳定复制，任何质粒和载体都可使用。优选表达载体包含选择标记基因，如细菌的氨苄青霉素抗性基因、四环素抗性基因、卡那霉素抗性基因、链霉素抗性基因、氯霉素抗性基因；酵母菌的新霉素抗性基因、Zeocin抗性基因，酵母菌的缺陷选择标志，如His，Leu，Trp等；真核细胞的新霉素抗性基因、Zeocin抗性基因、二氢叶酸还原酶基因及荧光蛋白标记基因等。在一优选实施方式中，所述表达载体为大肠杆菌表达载体。本领域技术人员可利用DNA重组技术等一系列技术，构建含本发明所述编码重组壳聚糖酶的DNA序列、合适的转录和翻译调控序列、启动子及选择性标记基因等特定元件的表达载体。上述载体可用来转化、转染合适的宿主细胞，以便获得所需要的蛋白产物。本发明的载体优选是原核表达载体，更优选是适于大肠杆菌表达的载体。在本发明的一个具体实施方式中，本发明的载体是名为pET/chitosanase的质粒。

在第四方面，本发明提供了一种宿主细胞，其特征在于，所述细胞含有本发明第三方面所述的载体，或者所述细胞已用本发明第二方面所述的核酸转化或转染。宿主细胞可以是原核细胞，也可以是真核细胞，如，细菌细胞、酵母细胞、植物细胞、昆虫细胞、哺乳动物细胞等。宿主细胞在转化或转染含本发明所述编码重组壳聚糖酶的核酸序列后，即构成工程化细胞或细胞株，可用于生产所需蛋白产物。本领域技术人员能够恰当地选择适当的载体、宿主细胞，并熟知如何将载体高效地转化或转染入宿主细胞中，所用方法包括但不限于：氯化钙法、电穿孔法用于细菌细胞，电穿孔法和原生质体融合法用于酵母细胞，脂质体包裹、磷酸钙共沉淀、电融合法以及显微注射法用于哺乳动物细胞等真核细胞。本发明的宿主细胞优选是细菌细胞，更优选是大肠杆菌细胞。在本发明的一个具体实施方式中，本发明的宿主细胞是大肠杆菌菌株BL21(DE3)。

在第五方面，本发明提供了制备本发明第一方面所述的重组壳聚糖酶的方法，其包括，用本发明第四方面所述的宿主细胞表达本发明第一方面所述的重组壳聚糖酶，并分离所述的重组壳聚糖酶。该制备方法包括发酵步骤和分离纯化步骤。在发酵过程中，宿主细胞可以通过常规方法培养来表达所需要的蛋白产物，并使表达出的蛋白产物出现在在细胞内、细胞膜上或分泌到细胞周质中或细胞外。本发明优选通过诱导方式来表达重组壳聚糖酶。本发明的一个具体实施方式是通过IPTG诱导使转化的菌株表达该重组壳聚糖酶的。对于分离纯化步骤，有大量分离纯化的方法可供选择，所述方法包括但不限于：裂菌(如，超声波裂菌、渗透压裂菌)，离心，盐析，分子筛色谱，离子交换色谱，吸附色谱(如，亲和层析、金属鏊合层析)，反向色谱，高效液相色谱，毛细管电泳，制备性等电聚焦以及常规的变性、复性处理等，或以上方法的组合。本发明经过长期摸索发现，在将表达菌体裂解后，通过金属螯合层析分离纯化重组壳聚糖酶，就能一步实现分离纯化的目的，可以不再需要其他分离纯化步骤，因此大大简化了分离纯化步骤并降低了生产成本。因此，本发明优选分离纯化步骤中包括用金属螯合层析进行的分离纯化步骤，尤其优选用金属螯合层析进行分离纯化后不再使用其他分离纯化步骤。

在第六方面，本发明提供了本发明第一方面所述的重组壳聚糖酶在将壳聚糖降解制备成壳寡糖中的应用。由于本发明的重组壳聚糖酶具有表达量高、成本低廉、生产周期短、纯化简便的优点，因此适宜应用于壳寡糖的生产。

为了便于理解，以下将通过具体的附图、实施例对本发明进行详细地描述。需要特别指出的是，这些描述仅仅是示例性的描述，并不构成对本发明范围的限制。依据本说明书的论述，本发明的许多变化、改变对所属领域技术人员来说都是显而易见的。另外，本发明引用了公开文献，这些文献是为了更清楚地描述本发明，它们的全文内容均纳入本文进行参考，就好像它们的全文已经在本文中重复叙述过一样。

附图说明

图1：构建本发明的壳聚糖酶表达载体流程图。

图2：本发明示例的壳聚糖酶的编码核苷酸序列及其编码的氨基酸序列。

图3：重组表达本发明的壳聚糖酶并进行纯化的流程图。

图4：金属螯合层析纯化前、后壳聚糖酶样品用十二烷基磺酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)鉴定图谱。

图5：本发明示例的重组壳聚糖酶的酶活力测定所用的标准曲线，其中纵坐标表示吸光度的差值。

图6：用硅胶薄层层析分析本发明的重组壳聚糖酶水解生产的壳寡糖。

具体实施方式

以下本文将通过具体的实施例来描述发明。如未特别指明之处，可根据本领域技术人员所熟悉的《分子可隆实验指南》(第三版)(Cold Spring Harborlaboratory Press)、《细胞实验指南》(科学出版社，北京，中国，2001年)等实验手册以及本文所引用的参考文献中所列的方法来实施。

实施例1

壳聚糖酶表达载体的构建

从革兰氏阳性杆菌菌株Bacillus A520(可购自浙江丰安生物制药有限公司)中提取基因组DNA并以该基因组DNA为模板，用寡核苷酸P1和P2为引物，通过PCR扩增出编码该截短的壳聚糖酶的DNA片段。

具体而言，所用引物P1的核苷酸序列为：5’-GCT GCT GCA AAG GAA ATGAAA-3’；所用引物P2的核苷酸序列为：5’-TTAATT ATC GTA TCC TTC ATA AATT-3’。PCR循环参数为：94℃，30秒；50℃，50秒；72℃，120秒，共30个循环。最后一步于72℃保温15分钟。扩增产物用琼脂糖凝胶鉴定，与T载体(购自Promega公司)连接。连接产物转化大肠杆菌DH12S菌株(可购自Invitrogen公司)。挑取数个转化的克隆抽提质粒，通过限制性内切酶酶切鉴定目的基因是否正确插入。选取有目的基因插入的质粒进行DNA序列测定，选取测序所得的DNA序列如图2所示的正确的质粒，以该质粒为模板，以寡核苷酸P3和P4为引物，通过第二轮PCR扩增出两端带有合适酶切位点的壳聚糖酶基因。其中，引物P3的核苷酸序列为：5’-AAAAAAA CAT ATG GCT GCT GCAAAGGAA ATG AAA-3’；引物P4的核苷酸序列为：5，-GGCCGCGAATTCACTAGTG-3’。PCR循环同上所述。扩增出的DNA片段用限制性内切酶NdeI和EcoRI酶切，然后连接到预先用NdeI和EcoRI酶切的pET载体(可购自Invitrogen公司)中。连接产物转化大肠杆菌DH12S菌株(可购自Invitrogen公司)。经限制性内切酶酶切鉴定和DNA序列测定后，将正确的壳聚糖酶表达载体命名为pET/chitosanase。以上所述克隆工作流程如图1所示，然后如图3所示进行表达、纯化。

实施例2

重组壳聚糖酶的诱导表达

用实施例1构建的pET/chitosanase质粒转化大肠杆菌表达菌株BL21(DE3)(可购自Invitrogen公司)，转化克隆生长在含有胺苄青霉素(100μg/ml)的固体LB培养基上。挑取单克隆接种于50ml液体LB培养基中(含有100μg/ml的胺苄青霉素)，于37℃震荡培养过夜(转速250rpm)。将15ml上述菌液接种于500ml液体LB培养基中(含有100μg/ml的胺苄青霉素)，于37℃震荡(转速250rpm)培养至菌液在600nm的吸光度为0.6-1.0，然后加入IPTG至终浓度为1mmol/l。菌液于37℃继续震荡(转速160rpm)培养约18小时。高密度摇瓶培养时，大肠杆菌于500ml液体LB培养基中(含有100μg/ml的胺苄青霉素)在37℃震荡(转速250rpm)培养至菌液在600nm的吸光度约为2，加入50ml浓缩培养基，并继续培养至菌液在600nm的吸光度为3-4。然后加入IPTG至终浓度为1mmol/l，同时加入40ml的浓缩培养基。菌液于37℃继续震荡(转速160rpm)培养约18小时。根据如图4所示的SDS-PAGE鉴定结果，高密度培养时壳聚糖酶的表达量高于500毫克/升。其中，液体LB培养基的配方为：称取胰化蛋白胨10克、酵母提取物5克、NaCl 10克，加入蒸馏水1升，搅拌溶解，于121℃高温灭菌20分钟；固体LB培养基的配方为：每100毫升上述液体LB培养基中加入琼脂粉1.4克，于121℃高温灭菌20分钟；浓缩培养基的配方为：称取胰化蛋白胨100g、酵母提取物500g、NaCl10g，加入蒸馏水1升，搅拌溶解，于121℃高温灭菌20分钟。

实施例3

重组壳聚糖酶的纯化

将500毫升实施例2高密度诱导表达的菌液离心(5000g，10min)，去上清，菌体用50毫升裂解缓冲液(含0.5mol/l的20mmol/l磷酸钠溶液，pH7.5)洗涤菌体。再次离心(5000g，10min)，菌体用30毫升上述裂解缓冲液重悬。重悬菌液在冰上用超声波破碎(功率200瓦，超声5秒，间歇2秒，总超声时间为20分钟)。破碎菌液离心(8000g，10min)，取上清，其中含有重组壳聚糖酶。将上清分3次上到用裂解缓冲液预平衡的金属螯合(Ni²⁺)层析柱(可购自Pharmacia公司)上(直径1.5厘米，柱高6厘米)，流速1毫升每分钟。然后用含20mmol/l咪唑的裂解缓冲液淋洗，最后用含100mmol/l咪唑的裂解缓冲液洗脱壳聚糖酶，收集洗脱峰。根据SDS-PAGE鉴定结果(其结果如图4所示)，金属螯合层析回收的重组壳聚糖酶的回收率大于90％。

实施例4

重组壳聚糖酶的酶活力测定

酶活力测定的底物为：0.5克每升的壳聚糖溶液(壳聚糖购自国药集团，脱乙酰度大于等于90％)，溶解在0.1mol/l的NaAc-HAc(pH4.5)缓冲液中。取0.6毫升上述底物溶液于50℃预热10分钟，然后加入定量的壳聚糖酶(加入体积5-10微升，酶溶液可做适当稀释后加入)，酶解反应于50℃保温15分钟。随后向酶反应体系中加入0.5g/l的铁氰化钾溶液0.8毫升(溶于0.5mol/lNa₂CO₃溶液中)并立即于沸水中保温5分钟。将上述煮沸后的溶液离心(12000g，5min)除去壳聚糖絮状沉淀，然后用分光光度计测定上清液在420nm的光吸收。通过与氨基葡萄糖标准曲线对照，可计算出酶解反应产生的还原糖的量。一个酶活力单位(U)定义为在上述活力测定条件下每分钟产生1μmole还原糖所需的酶的量。重组表达的壳聚糖酶的比活力为700U/mg。

其中根据如下方法进行氨基葡萄糖标准曲线的绘制：

称取133毫克D-氨基葡萄糖盐酸盐(分子量216)用200毫升0.1mol/l的NaAc-HAc(pH 4.5)缓冲液溶解，该溶液中D-氨基葡萄糖盐酸盐的浓度为0.66g/l，折算为壳聚糖残基(每个壳聚糖残基的分子量为162)的浓度为0.5g/l。分别取上述D-氨基葡萄糖盐酸盐溶液0，20，30，40，50，60微升于相应的eppendorf管中(每管对应壳聚糖残基的量分别为0，10，15，20，15，30微克)，然后向每管加入0.1mol/l的NaAc-HAc(pH4.5)缓冲液，使每管的总体积均为600微升。向上述每管中均加入800微升0.5g/l的铁氰化钾溶液，混匀并于沸水中保温5分钟。上述每一个点均做两个平行管。然后用分光光度计测定每管液体在420nm的光吸收。上述每管测出的光吸收值均减去未加入D-氨基葡萄糖管的光吸收值，算出每管的光吸收差值。以每管中加入糖残基的量(微克数)为横坐标，以每管的光吸收差值为纵坐标，绘制标准曲线(如图5所示)。

实施例5

重组壳聚糖酶水解壳聚糖生产壳寡糖

称取10克壳聚糖粉末，加入95毫升水，搅拌使壳聚糖粉末悬于水中。加入70酶活力单位的上述实施例所得的重组壳聚糖酶，混匀。向上述壳聚糖悬液中加入冰醋酸5毫升，迅速搅拌，形成粘稠固体。将该粘稠固体于50℃保温，于不同时间取样1毫升立即冻存于-20℃待进一步分析。随酶解的进行，上述粘稠固体逐渐转化为液体，粘度不断下降。然后通过硅胶薄层层析分析壳聚糖水解产物：将不同时间取样的壳聚糖水解产物分别点到硅胶薄板上，每个点0.5-1微升。将硅胶板在层析缸中用展开剂(100毫升正丙醇+50毫升30％(w/v)氨水)展开，层析时间2-3小时。层析后将薄板在热板(90℃)上彻底烘干。然后用小喷雾器将0.1％茚三酮溶液(溶于正丙醇饱和水中)均匀喷洒在薄板上，至薄板微湿。然后将薄板在热板(90℃)上烘烤至红色斑点显现，其结果如图6所示。

另外根据如下方法进行壳寡糖平均链长的测定：

将不同时间取样的壳聚糖水解产物分别取少量(5-10微升，对原液可以进行适当稀释)加入到600微升0.1mol/l的NaAc-HAc(pH4.5)缓冲液中。然后向上述每管中均加入800微升0.5g/l的铁氰化钾溶液，混匀并于沸水中保温5分钟。离心(10000g，3min)除去壳聚糖沉淀，上清用分光光度计测定420nm的光吸收。根据每管的光吸收值，通过D-氨基葡萄糖标准曲线计算出每管中还原糖残基的量。用每管中总糖残基的量(微克)除以每管中还原糖残基的量(微克)即等于该管中壳寡糖的平均链长，其结果如表1所列。

表1：壳聚糖酶酶解时间与所得壳寡糖平均链长

 

水解时间(小时)	2	3	4	6	7	10	24
								壳寡糖平均链长	13.3	9.2	7.3	5.1	4.4	3.8	3.1

序列表

<110>  (浙江丰安生物制药有限公司)

<120>  高效重组表达的一种壳聚糖酶

<160>  2

<170>  PatentIn version 3.3

<210>  1

<211>  1248

<212>  DNA

<213>  未知

<400>  1

<210>  2

<211>  415

<212>  PRT

<213>  未知

<400>  2

Claims (10)

1.一种重组壳聚糖酶，其特征在于，所述重组壳聚糖酶是

(a)由Seq ID NO.2所示的氨基酸序列组成的蛋白质，或者

(b)在(a)限定的氨基酸序列中经过取代、缺失或添加一个或几个氨基酸且具有壳聚糖酶活性的由(a)衍生的蛋白质。

2.权利要求1所述的重组壳聚糖酶，其是由Seq ID NO.2所示的氨基酸序列组成的蛋白质。

3.编码权利要求1或2所述的重组壳聚糖酶的核酸。

4.权利要求3所述的核酸，其序列如Seq ID NO.1所示。

5.一种载体，其含有权利要求3或4所述的核酸。

6.一种宿主细胞，其特征在于，所述细胞含有权利要求5所述的载体，或者所述细胞已用权利要求3或4所述的核酸转化或转染。

7.权利要求6所述的宿主细胞，其是大肠杆菌。

8.制备权利要求1或2所述的重组壳聚糖酶的方法，其包括，用权利要求6所述的宿主细胞表达权利要求1或2所述的重组壳聚糖酶，并分离所述的重组壳聚糖酶。

9.权利要求8所述的方法，其中所述分离包括用金属螯合层析进行的分离纯化步骤。

10.权利要求1或2所述的重组壳聚糖酶在将壳聚糖降解制备成壳寡糖中的应用。

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