CN102864132A - 一种极耐热木糖苷酶及其编码基因和应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种极耐热木糖苷酶及其编码基因和应用，该极耐热木糖苷酶的氨基酸序列如SEQNO：1所示。该木糖苷酶具有优良的耐热性能。在95℃、pH为6.0的条件下酶活性最高，比酶活达到117.6U/mg；该蛋白酶在温度为75-100℃、pH为5.0-7.5的范围内，均具有较高的酶活。该木糖苷酶的耐热性能极高，在85℃反应体系中，保温1h酶活性基本保持不变。上述特性使得本发明得到的木糖苷酶比现有木糖苷酶具有更大的优越性，适用于80℃以上高温、偏中性的pH条件下木寡糖的降解，具有潜在的工业应用价值。

Description

一种极耐热木糖苷酶及其编码基因和应用

技术领域

本发明属于基因工程技术及纤维原料水解领域，具体涉及一种极耐热木糖苷酶及其编码基因和应用。

背景技术

木聚糖是植物细胞壁半纤维素的土要成分，是除纤维素之外自然界中最为丰富的可再生资源之一。木糖就存在于半纤维素多缩戊糖中, 是亟待开发的重要可再生资源。如果将半纤维素生物降解为木糖和少量其它单糖, 可以用作基本碳源生产各种发酵产品、工业酒精及糠醛制备等。同时, 木糖的衍生物木糖醇还可作为食品添加剂，如用于口香糖、糖果及于尿病患者的甜味剂等。

木糖苷酶是木聚糖降解酶系中的较为关键的多糖水解酶，通过随机切割木寡糖的β-1,4-糖苷键，将木寡糖降解为木糖。由于木糖苷酶可以将寡糖降解为木糖，因此可作为一种高效的工业酶制剂用于木糖及木糖衍生物的生产，因此具有潜在的应用价值。

发明内容

发明目的：针对现有技术中存在的不足，本发明的目的是提供一种极耐热木糖苷酶，以使其满足使用要求。本发明的另一目的是提供一种编码上述极耐热木糖苷酶的核苷酸序列。本发明还有一目的是提供上述一种极耐热木糖苷酶的应用。

技术方案：为了实现上述发明目的，本发明采用的技术方案如下：

一种极耐热木糖苷酶，氨基酸序列如SEQ NO：1所示。

一种极耐热木糖苷酶，氨基酸序列为权利要求1所述的SEQ NO：1序列中的氨基酸经过一个或多个氨基酸残基的取代、缺失及添加形成的具有木糖苷酶活性的衍生蛋白质。

一种编码上述的极耐热木糖苷酶的基因， DNA序列如SEQ NO：2所示。

一种可表达上述的极耐热木糖苷酶的重组体系，在所述的重组体系上克隆有如SEQ NO：2所示的DNA序列；所述的重组体系包括重组质粒和重组菌。

一种扩增上述的编码极耐热木糖苷酶的基因的方法，所使用的引物对为：

Xylo-1：5’- GGAATTCCATATGGATCTTTACAAGAATCCAAATGTAC-3’；

Xylo-2：5’-CCGCTCGAGCTCGATCTTTGTATTTGTGAAGAAAAC-3’。

上述的极耐热木糖苷酶在酶解木寡糖中的应用。酶解反应温度为75-100℃，pH5.0-7.5。所述的木寡糖来源于纤维原料中的半纤维素，包括木二糖、木三糖和木四糖。

上述的重组体系在酶解木寡糖中的应用。

上述的极耐热木糖苷酶在酶解玉米秸秆的木寡糖中的应用。

有益效果：与现有技术相比，本发明所提供的木糖苷酶具有优良的耐热性能。在95℃、pH为6.0的条件下酶活性最高，比酶活达到117.6U/mg；该蛋白酶在温度为75-100℃、pH为5.0-7.5的范围内，均具有较高的酶活。该木糖苷酶的耐热性能极高，在85℃反应体系中，保温1h 酶活性基本保持不变。上述特性使得本发明得到的木糖苷酶比现有木糖苷酶具有更大的优越性，适用于80℃以上高温、偏中性的pH条件下木寡糖的降解，具有潜在的工业应用价值。

附图说明

图1是木糖苷酶Tth xylo的SDS-PAGE蛋白电泳图；

图2是Tth xylo的最适温度结果图；

图3是Tth xylo的最适pH结果图；

图4是Tth xylo的热稳定性结果图；

图5是Tth xylo降解玉米秸秆半纤维素TLC图。

具体实施方式

下面结合具体实施例对本发明做进一步的说明。

以下实施例中所使用的材料、试剂等，若无特殊说明，均可从商业途径获得。

实施例1 嗜热陆地热泉高温神袍菌基因组DNA的提取

采用嗜热陆地热泉高温神袍菌Thermotoga thermarum DSM5069（购自德国微生物菌种保藏中心）新鲜菌体10g，悬于5mL 50mM Tris缓冲溶液中（pH8.0），混匀后在37℃放置20min，然后加入2mL 10%SDS，55℃放置5min，用等体积的酚-氯仿（24:1）抽提一次，取上清液加入2倍体积的无水乙醇，于-20℃放置30min，4℃ 13000rpm离心20min，收集沉淀。沉淀溶于0.5mL TE缓冲液（pH8.0，10mM Tris，1mM EDTA），加入10mg/mL RNase 3μL，37℃保温1h，用等体积的酚-氯仿（24:1）抽提一次，取上清加入2倍体积的无水乙醇，于-20℃放置30min，4℃ 13000rpm离心20min，收集沉淀，真空冷冻干燥，用0.5mL超纯水溶解。

实施例2 木糖苷酶基因Tth xylo的制备

可采用如下方法制备Tth xylo基因，也可以采用人工合成的方式得到。

以Thermotoga thermarum DSM5069的总DNA（实施例1制备）为模版，用下述引物对进行PCR扩增：

Xylo-1：5’- GGAATTCCATATGGATCTTTACAAGAATCCAAATGTAC-3’；

Xylo-2：5’-CCGCTCGAGCTCGATCTTTGTATTTGTGAAGAAAAC-3’；

引物合成时，Tth-1引入Nde I酶切位点，Tth-2引入Xho I酶切位点。

PCR反应体系：1μL T．thermarum 基因组DNA，1μL Tth-1，1μL Tth-2，25μL Premix ExTaq，22μL超纯水。

PCR反应条件：94℃变性5min；94℃变性30sec，52℃退火30sec，72℃延伸3min，30Cycles；72℃延伸10min；4℃保温。

PCR产物用1%琼脂糖凝胶电泳检测产量和特异性，并用PCR产物回收试剂盒进行纯化（BIOMIGA，上海）。

实施例3 重组克隆、表达载体pET-20b-Tth xylo的构建与验证

将纯化过的PCR产物（实施例2制备）、pET-20b（Novagen）用分别Nde I和Xho I双酶切，琼脂糖电泳回收酶切酶切PCR及载体大片段。割胶回收后的目的片段与载体，经浓缩加入8μL无菌水重悬，加入1μL 10×Ligase Buffer和1μL Ligase，于16℃连接过夜。用连接反应产物转化大肠杆菌pET-20b，然后涂于含100μg/mL Amp（氨苄青霉素）的培养皿，37℃培养10-12h。

从转化平板上挑取多个单菌落，采用BIOMIGA的质粒小量提取试剂盒提取质粒。对获得的质粒双酶切验证并对获得的重组质粒进行测序。测序结果显示，pET-20b载体中插入了所克隆的目的片段（核苷酸长度为2322 bp），进而得到重组克隆、表达载体pET-20b-Tth xylo，Tth xylo的核苷酸如SEQ NO：2所示，其编码的氨基酸序列如SEQ NO：1所示，将该蛋白命名为Tth xylo。

实施例 4 重组木糖苷酶Tth xylo的表达与纯化

将重组克隆、表达载体pET-20b-Tth xylo（实施例3制备）电转至宿主菌E. coli BL21(DE3)（Novagen），获得含有重组质粒的重组菌。将单菌落的重组菌接种于5mL含有100μg/ml氨苄青霉素的Luria-Bertani broth (LB)培养基，在37℃温度下，200rpm震荡培养8-12h。将上述4mL菌液接种于含400mL培养基的1000 mL摇瓶中，37℃温度下，200rpm震荡培养，当吸光度达到0.6-0.8时，加人200μL的1M IPTG，并在30℃温度下，120rpm诱导表达10-12h。用高速冷冻离心机将培养液在4℃下一下以13000rpm离心15min，收集菌体。用50mL超纯水洗涤并在4℃下一下以13000rpm离心15min，回收菌体，接着用20mL 1×Binding Buffer 重悬（0.5M NaCl，20mM Tris-HCl，5mM imidazole，pH7.9），在冰水浴中，用超声波破碎机破碎细菌细胞，并在4℃下13000rpm 离心15min，得到含木糖苷酶Tth xylo的粗提液。

粗提液先经70℃加热处理30min的热处理，除去不耐热的杂蛋白，再用Ni-NTA亲和层析柱进行纯化（方法见His-Bind Kits，Novagen）。纯化酶纯度的鉴定和分子量的测定采用SDS-PAGE方法进行，结果见图1，1即为化过后的Tth xylo蛋白，分子量约为85 kDa，与理论值相近。

实施例5 重组木糖苷酶Tth xylo的酶学性质分析

酶活定义为：1 min内催化4-硝基苯基-β-D-吡喃木糖苷（pNPX）产生1μmol对硝基苯酚（pNP）所需的酶量。

（1）最适温度

用pH值为6.0的0.1M咪唑-邻笨二甲酸氢钾缓冲液稀释实施4制得的纯酶液，用稀释后的酶液进行酶活测定。酶活测定反应体系为200μL，20mM的4-硝基苯基-β-D-吡喃木糖苷（pNPX）10μL，180μL 0.1M咪唑-邻笨二甲酸氢钾缓冲液和10μL稀释酶液组成；反应体系的pH为6.0。将反应体系在60-100℃温育20min后，加入600μL 1M Na₂CO₃试剂终止反应，测定410nm的吸光值。实验设3次重复，取平均值作图，结果如图2所示，研究结果表明在95℃时，木糖苷酶具有最高的酶活性，为117.6 U/mg；将此温度下的酶活反应体系的吸光值最为相对活性100%，其它温度下酶活反应体系的吸光值与此最高酶活性体系的吸光值作为相对活性。其中，在温度75-100℃的反应体系中酶活性较高。

（2）最适pH

酶活测定反应体系为200μL，20mM的4-硝基苯基-β-D-吡喃木糖苷（pNPX）10μL，180μL pH4.0-pH8.5 的0.1M咪唑-邻笨二甲酸氢钾缓冲液和10μL稀释酶液（同上）组成。将反应体系在95℃温育20 min后，加入600μL 1M Na₂CO₃试剂终止反应，测定410nm的吸光值，实验设3次重复实验，取平均值。结果如图3所示，研究结果表明，在pH为6.0时，木糖苷酶具有最高的酶活性，为117.6 U/mg；将此pH值下的酶活反应体系的作为相对活性100%，其它pH值下酶活反应体系的吸光值与此最高酶活性体系的吸光值的比值作为相对活性。在pH5.0-7.5的条件下，酶活较高。

（3）重组酶热稳定性

用pH值为6.0的0.1M咪唑-邻笨二甲酸氢钾缓冲液稀释实施例4制得的纯酶液，用稀释后的酶液进行酶活测定。将稀释酶液在75℃、80℃、85℃、90℃和95℃分别水浴30 min、60 min、90 min和120 min，测定酶的残存酶活。酶活测定反应体系中pH为6.0，测定温度为95℃。实验设3次重复，取平均值。结果如图4所示，研究结果显示，85℃处理1 h未见酶活下降，可见该木聚糖在85℃条件下热稳定非常好，该酶在75℃温育2 h酶活未见下降。

实施例6 重组木糖苷酶Tth xylo的应用研究

重组木糖苷酶Tth xylo对木寡糖的降解研究，具体步骤如下所述：

（1）用pH6.0的上述缓冲液配制1%木二糖、木三糖及木四糖各1mL，混匀后形成1%的混合液。吸取100μL混合液，加入上述的缓冲溶液90μL与含10μL的纯化酶于100μL的反应体系中，75℃水浴震荡0.5h、1h、2h和3h。

（2）分别收集上述1h、2h、3h和4h水解液于-20℃的冰箱中保存。

（3）配置上述水解液适宜的TLC的展层剂和显色剂，展层剂中正丁醇：乙酸：水=2：1：1，显色剂为将1g的3,5-二羟基甲苯加入到100mL的硫酸/甲醇溶液（2：8）中配制而成。

（4）用毛细吸管蘸取少量的1%的木1-木4糖的混合液及上述样品，分别点至宽度为10cm、长度为20cm的玻璃硅胶板上，点完样后用吹分机吹干并将硅胶板放置于上述展层剂的层析缸中。

（5）3h后取出玻璃板先风干，再放置于100℃的干燥箱中烘干，在通风橱中用喷壶将硅胶板均匀喷洒，接着在再放置于100℃的干燥箱中烘干。

结果如图5所示，M为木1-木4的标准样品，1、2、3和4分别为0.5h、1h、2h和3h的水解液。研究结果表明，重组木糖苷酶Tth xylo可以快速有效地将木二糖、木三糖及木四糖降解为木糖。因此，此木糖苷酶Tth xylo适用于玉米秸秆等原料的木糖生产。

SEQUENCE LISTING

 

<110>  南京林业大学

 

<120>  一种极耐热木糖苷酶及其编码基因和应用

 

<130>  100

 

<160>  4    

 

<170>  PatentIn version 3.3

 

<210>  1

<211>  774

<212>  PRT

<213>  Thermotoga thermarum

 

<400>  1

 

Met Asp Leu Tyr Lys Asn Pro Asn Val Pro Ala Lys Val Arg Ala Lys

1               5                   10                  15     

 

 

Asp Leu Leu Ser Lys Met Thr Leu Glu Glu Lys Ile Ala Gln Leu Gly

            20                  25                  30         

 

 

Ser Val Trp Ser Tyr Glu Leu Leu Thr Glu Asp Gly Lys Phe Ser Val

        35                  40                  45             

 

 

Glu Lys Ala Lys Glu Ile Leu Lys His Gly Ile Gly Gln Ile Thr Arg

    50                  55                  60                 

 

 

Pro Gly Gly Ala Thr Asn Phe Glu Pro Pro Glu Val Ala Lys Leu Val

65                  70                  75                  80 

 

 

Asn Glu Ile Gln Lys Phe Leu Val Glu Asn Thr Arg Leu Gly Ile Pro

                85                  90                  95     

 

 

Ala Ile Met His Glu Glu Cys Leu Ala Gly Tyr Met Gly Leu Gly Ala

            100                 105                 110        

 

 

Thr Ile Phe Pro Gln Pro Ile Gly Met Ala Ser Thr Trp Asp Pro Glu

        115                 120                 125            

 

 

Leu Val Glu Lys Ile Thr Ser Ala Ile Arg Glu Asp Leu Arg Lys Leu

    130                 135                 140                

 

 

Gly Ile Thr Gln Gly Leu Ala Pro Val Leu Asp Val Ala Arg Asp Pro

145                 150                 155                 160

 

 

Arg Trp Gly Arg Thr Glu Glu Thr Phe Gly Glu Ser Pro Tyr Leu Val

                165                 170                 175    

 

 

Ala Lys Met Gly Val Ala Tyr Val Lys Gly Leu Gln Gly Ser Asp Ile

            180                 185                 190        

 

 

Thr Lys Gly Val Val Ala Thr Gly Lys His Phe Ala Gly Tyr Ser Ala

        195                 200                 205            

 

 

Ser Glu Gly Gly Lys Asn Trp Ala Pro Thr Asn Ile Pro Pro Arg Glu

    210                 215                 220                

 

 

Leu Arg Glu Val Phe Leu Tyr Pro Phe Glu Ala Ala Val Lys Glu Ala

225                 230                 235                 240

 

 

Gly Leu Leu Ser Ile Met Asn Ser Tyr Ser Glu Ile Asp Gly Ile Pro

                245                 250                 255    

 

 

Cys Ala Ser Asn Arg Glu Leu Leu Thr Asp Ile Leu Arg Arg Thr Trp

            260                 265                 270        

 

 

Gly Phe Glu Gly Ile Val Val Ser Asp Tyr Phe Ala Val Asp Met Leu

        275                 280                 285            

 

 

Ala Ala Tyr His Arg Met Ala Lys Asn Lys Ala Glu Ala Ala Lys Tyr

    290                 295                 300                

 

 

Ala Leu Glu Ala Gly Ile Asp Ile Glu Leu Pro Lys Thr Asp Cys Tyr

305                 310                 315                 320

 

 

Leu His Leu Lys Ser Leu Val Glu Asn Gly Ile Ile Ser Glu Lys Leu

                325                 330                 335    

 

 

Leu Asp Glu Ala Val Leu Arg Val Leu Thr Leu Lys Phe Leu Leu Gly

            340                 345                 350        

 

 

Leu Phe Glu Asn Pro Tyr Ala Glu Gly Gly Ser Leu Asn Asp His Asn

        355                 360                 365            

 

 

Asp Ile Ala Leu Glu Ala Ser Arg Lys Ser Ile Val Leu Leu Lys Asn

    370                 375                 380                

 

 

Asn Gly Ile Leu Pro Leu Lys Asn Asp Val Lys Ile Ala Leu Val Gly

385                 390                 395                 400

 

 

Pro Thr Ala Asn Asp Val Arg Asn Leu Leu Gly Asp Tyr Ser Tyr Leu

                405                 410                 415    

 

 

Val His Ile Lys Thr Leu Leu Glu Asn Val Asn Ala Thr Thr Phe Asn

            420                 425                 430        

 

 

Ala Pro Lys Phe Asn Leu Lys Lys Val Glu Glu Leu Val Glu Ala His

        435                 440                 445            

 

 

Leu Lys Lys Ile Pro Ser Ile Leu Ala Glu Phe Ala Lys Arg Ala Lys

    450                 455                 460                

 

 

Glu Ile Tyr Tyr Ala Lys Gly Cys Asp Ile Thr Asp Pro Ser Arg Glu

465                 470                 475                 480

 

 

Gly Phe Ala Glu Ala Leu Glu Ala Ala Lys Lys Ala Asp Val Val Val

                485                 490                 495    

 

 

Ala Val Val Gly Asp Arg Ser Gly Leu Thr Ile Glu Cys Thr Ser Gly

            500                 505                 510        

 

 

Glu Ser Arg Asp Met Ala Asn Leu Lys Leu Pro Gly Val Gln Glu Glu

        515                 520                 525            

 

 

Phe Ile Leu Glu Leu Thr Lys Val Gly Lys Pro Ile Val Val Val Leu

    530                 535                 540                

 

 

Val Thr Gly Arg Pro Tyr Ser Leu Lys Ala Phe Val Asn Lys Val Asn

545                 550                 555                 560

 

 

Ala Ile Val Gln Leu Trp Leu Pro Gly Glu Thr Gly Ala Gln Ala Leu

                565                 570                 575    

 

 

Ala Glu Val Ile Phe Gly Gln Val Asn Pro Ser Gly Lys Leu Pro Ile

            580                 585                 590        

 

 

Ser Phe Pro Ala Ser Ala Gly Gln Ile Pro Val Phe His Tyr Val Lys

        595                 600                 605            

 

 

Pro Ser Gly Gly Arg Ser Cys Trp His Gly Asn Tyr Val Asp Glu Asp

    610                 615                 620                

 

 

Val Lys Pro Leu Phe Pro Phe Gly His Gly Leu Ser Tyr Thr Thr Phe

625                 630                 635                 640

 

 

Ser Tyr Thr Asn Leu Arg Ile Glu Gln Gln Glu Ile Pro Ile Ala Gly

                645                 650                 655    

 

 

Ser Val Lys Leu Lys Val Asp Val Gln Asn Thr Gly Glu Ile Tyr Gly

            660                 665                 670        

 

 

Glu Glu Val Val Gln Leu Tyr Ile Ser Arg Glu His Ala Ser Val Thr

        675                 680                 685            

 

 

Arg Pro Val Lys Glu Leu Lys Gly Phe Ala Arg Val Lys Leu Gln Pro

    690                 695                 700                

 

 

Lys Glu Thr Lys Thr Val Val Phe Glu Ile His Thr Asp Val Leu Ala

705                 710                 715                 720

 

 

Tyr Tyr Asp Arg Asp Met Lys Leu Val Val Glu Pro Gly Glu Tyr Lys

                725                 730                 735    

 

 

Val Leu Ile Gly Ser Ser Ala Glu Asp Ile Arg Cys Gln Gly Asn Phe

            740                 745                 750        

 

 

Lys Val Val Gly Glu Lys Arg Leu Val Gln Asp Asn Arg Val Phe Phe

        755                 760                 765            

 

 

Thr Asn Thr Lys Ile Glu

    770                

 

 

<210>  2

<211>  2322

<212>  DNA

<213>  Thermotoga thermarum

 

<400>  2

atggatcttt acaagaatcc aaatgtacca gcaaaggtaa gggcaaaaga tcttctgtca     60

 

aagatgacct tggaagaaaa aatagcccaa cttggttcgg tatggagtta cgagttgctc    120

 

acagaagatg gaaaattttc agtagaaaaa gcgaaagaaa ttctaaagca tggtatagga    180

 

cagatcacac gtcctggtgg cgcaacgaat tttgagcctc ccgaagtggc aaaattggta    240

 

aatgaaattc aaaaattttt ggttgagaac acgcgtttgg gaataccagc gataatgcac    300

 

gaagagtgcc ttgcaggata catgggactt ggagcaacaa tctttccaca accaattgga    360

 

atggccagca catgggatcc agaattggtt gaaaaaatca catcagctat aagggaagat    420

 

ctaagaaaac ttggtatcac tcaaggtctt gccccagtac ttgatgttgc cagagatcca    480

 

agatggggta gaactgaaga aacgtttggt gaatctccat accttgttgc aaaaatgggt    540

 

gtggcatacg taaagggatt gcaaggaagt gatatcacaa aaggtgtggt agcaacaggg    600

 

aaacactttg ctggttacag tgcttcggaa ggtggtaaga actgggcacc aaccaacata    660

 

cctccaaggg agttaagaga agtttttctc tatccgttcg aggcagctgt taaagaggca    720

 

ggtttgttat ctataatgaa ttcctatagt gaaatagatg ggattccatg tgccagcaat    780

 

agagaacttc tgactgatat tttaagaaga acgtggggat ttgaaggaat agttgtttca    840

 

gactattttg ctgtggatat gttggccgct tatcatagga tggcaaagaa taaagccgaa    900

 

gctgcaaaat atgcgttaga agcaggcata gatattgagc ttccaaaaac agactgttat    960

 

ctacatttga aatccctggt tgaaaatggc atcatctcag aaaaactgtt ggatgaagca   1020

 

gttcttaggg tattaacttt gaaattccta ttgggactgt tcgaaaatcc atacgcagaa   1080

 

ggtggtagtc tcaacgatca taatgatata gctttggaag cttcaagaaa gtcaatagtt   1140

 

cttttaaaaa acaatggaat attgccgtta aaaaacgatg ttaagatagc gctagttgga   1200

 

ccaaccgcaa atgatgtgag aaatttactt ggagattact cttacctagt acatataaag   1260

 

acacttcttg aaaatgtcaa cgctaccact ttcaacgcgc caaagtttaa cttgaaaaaa   1320

 

gtggaagaac ttgttgaagc tcacttgaag aaaattccaa gcatacttgc agagtttgca   1380

 

aaaagagcta aagagatcta ttacgcaaag ggatgtgaca tcactgatcc atcaagagag   1440

 

ggatttgcag aagccttaga agcagcgaaa aaagccgatg ttgtggttgc ggtggttggc   1500

 

gatcgctcag gtttaacgat tgaatgcaca agtggtgaat ccagggatat ggccaacttg   1560

 

aagctgccag gggttcaaga agagttcatt ttggagctga caaaagttgg caaacccatt   1620

 

gttgttgttt tggtcacagg aagaccatac tctctgaaag cttttgtgaa caaagtaaac   1680

 

gcaatcgttc agctttggct gcccggtgag acaggtgcac aagcccttgc ggaggtaata   1740

 

tttggtcaag ttaacccaag cggtaaactt ccgataagct tccctgcgag tgcaggtcaa   1800

 

atacctgtgt ttcactatgt caaaccatcc ggaggacggt cctgctggca tggaaactac   1860

 

gtcgatgagg acgttaaacc tttgttcccg tttggtcacg ggctttctta cacaacattt   1920

 

tcatatacaa acttaaggat tgaacaacaa gaaattccaa tcgctggttc ggtaaaactc   1980

 

aaagtagatg ttcaaaatac aggggaaatc tacggcgaag aagttgtaca actttacatt   2040

 

tcaagagagc atgcaagtgt tacaaggcct gtgaaggaac taaagggatt tgcaagggta   2100

 

aaattacaac caaaggaaac aaaaacggtt gtttttgaaa ttcacacaga tgtgcttgct   2160

 

tactacgata gagatatgaa acttgttgta gaacctggtg aatacaaggt tctaattgga   2220

 

agttctgcag aggatatcag atgtcaagga aacttcaaag tcgttggaga aaaaagattg   2280

 

gttcaagaca acagagtttt cttcacaaat acaaagatcg ag                      2322

 

 

<210>  3

<211>  38

<212>  DNA

<213>  Artificial

 

<220>

<223>  Xylo-1引物序列

 

<400>  3

ggaattccat atggatcttt acaagaatcc aaatgtac                             38

 

 

<210>  4

<211>  36

<212>  DNA

<213>  Artificial

 

<220>

<223>  Xylo-2引物序列

 

<400>  4

ccgctcgagc tcgatctttg tatttgtgaa gaaaac                               36

Claims (10)

1.一种极耐热木糖苷酶，其特征在于：氨基酸序列如SEQ NO：1所示。

2.一种极耐热木糖苷酶，其特征在于：氨基酸序列为权利要求1所述的SEQ NO：1序列中的氨基酸经过一个或多个氨基酸残基的取代、缺失及添加形成的具有木糖苷酶活性的衍生蛋白质。

3.一种编码权利要求1所述的极耐热木糖苷酶的基因，其特征在于：DNA序列如SEQ NO：2所示。

4.一种可表达权利要求1所述的极耐热木糖苷酶的重组体系，其特征在于：在所述的重组体系上克隆有如SEQ NO：2所示的DNA序列；所述的重组体系包括重组质粒和重组菌。

5.一种扩增权利要求3所述的编码极耐热木糖苷酶的基因的方法，其特征在于：所使用的引物对为：

Xylo-1：5’- GGAATTCCATATGGATCTTTACAAGAATCCAAATGTAC-3’；

Xylo-2：5’-CCGCTCGAGCTCGATCTTTGTATTTGTGAAGAAAAC-3’。

6.权利要求1或2所述的极耐热木糖苷酶在酶解木寡糖中的应用。

7.根据权利要求6所述的应用，其特征在于：酶解反应温度为75-100℃，pH5.0-7.5。

8.根据权利要求6所述的应用，其特征在于：所述的木寡糖来源于纤维原料中的半纤维素，包括木二糖、木三糖和木四糖。

9.权利要求4所述的重组体系在酶解木寡糖中的应用。

10.权利要求1所述的极耐热木糖苷酶在酶解玉米秸秆的木寡糖中的应用。

Images