CN105331596B

CN105331596B - 属于GH3家族的耐热性β-木糖苷酶

Info

Publication number: CN105331596B
Application number: CN201510463482.9A
Authority: CN
Inventors: 近藤康弘; 广濑佳嗣; 山口明日香; 须田汀; 大熊二郎; 加藤友彦; 柴田大辅
Original assignee: Honda Motor Co Ltd
Current assignee: Honda Motor Co Ltd
Priority date: 2014-08-04
Filing date: 2015-07-31
Publication date: 2018-11-23
Anticipated expiration: 2035-07-31
Also published as: EP2982749B1; US9611464B2; US20160032265A1; JP2016034253A; JP6350987B2; EP2982749A1; CN105331596A

Abstract

本发明提供一种耐热性β‑木糖苷酶，其具有由下列(A)、(B)或(C)构成的β‑木糖苷酶催化区域：(A)由序列号1所示氨基酸序列构成的多肽；(B)由序列号1所示氨基酸序列中的至少一个氨基酸的缺失、取代或添加而形成的氨基酸序列所构成的、并且至少在85℃且pH6.0的条件下具有以对硝基苯基‑β‑D‑吡喃木糖苷为底物的水解活性的多肽；(C)由与序列号1所示氨基酸序列具有80％以上序列一致性的氨基酸序列构成的、并且至少在85℃且pH6.0的条件下具有以对硝基苯基‑β‑D‑吡喃木糖苷为底物的水解活性的多肽。

Description

属于GH3家族的耐热性β-木糖苷酶

技术领域

本发明涉及一种耐热性β-木糖苷酶、编码上述耐热性β-木糖苷酶的多核苷酸、用于表达上述耐热性β-木糖苷酶的表达载体、整合了上述表达载体的转化体、以及使用上述耐热性β-木糖苷酶的木质纤维素分解产物的制造方法。

本申请要求基于2014年8月4日在日本申请的特愿第2014-158650号的优先权，并在本文中引用其内容。

背景技术

除了对运输用能源供应的担忧之外，由于全球变暖和大气污染等环境上的问题，近年来，石油替代能源的开发成为非常重要的课题。植物生物质是地球上最丰富的可再生能源，作为石油替代资源而备受期待。作为植物生物质的主要成分的木质纤维素为纤维素、半纤维素(包含木聚糖、阿拉伯聚糖和甘露聚糖)等多糖类，以及木质素。这些多糖类被各种糖苷水解酶水解为葡萄糖或木糖等单糖后，用作生物燃料或化学品原料。

具有复杂结构的木质纤维素是难分解性的，难以用单一的酶分解或糖化(hydrolysis)。因此，对于多糖类中的纤维素的水解，通常需要糖苷水解酶中的内切葡聚糖酶(内切-1,4-β-D-葡聚糖酶，EC 3.2.1.4)、外切型纤维二糖水解酶(1,4-β-纤维二糖糖苷酶(cellobiosidase)或纤维二糖水解酶，EC 3.2.1.91、EC 3.2.1.176)、β-葡糖苷酶(EC3.2.1.21)这三种酶。另一方面，半纤维素的构成因植物的种类而异，例如，在阔叶树和草本植物中，木聚糖构成了主要成分。对于木聚糖的水解，需要木聚糖酶(内切-1,4-β-木聚糖酶，EC 3.2.1.8)、β-木糖苷酶(EC3.2.1.37)。β-木糖苷酶对通过木聚糖酶水解半纤维素生成的低聚糖进行水解，是涉及单糖生成工艺的水解酶之一。

在以往的以木质纤维素为资源的生物乙醇的制造中，以乙醇的高能效转化为目的，尝试了基于高固液比(30～60％的固液比)的糖化处理(hydrolysis process)。这种基于高固液比的木质纤维素的酶糖化，生物质糖化液的粘性高，难以进行木质纤维素的水解反应。因此，通过使用耐热性酶在例如80℃以上的高温下进行木质纤维素的酶解糖化处理，除了加快水解反应速度之外，降低了生物质糖化液的粘性，从而有望实现缩短糖化反应时间并降低酶量。因此，对于各种糖苷水解酶，期望开发耐热性更优异的酶。

大多数耐热性糖苷水解酶可以通过如下方式获得：对生存于高温环境下的嗜热性微生物进行分离鉴定，从这些分离培养的微生物中克隆基因，确定DNA序列后，利用大肠杆菌或丝状真菌等表达而获得。例如，专利文献1公开了来源于丝状真菌的β-木糖苷酶，专利文献2公开了在30℃表现出酶活性的、来源于丝状真菌米曲霉(Aspergillus oryzae)的β-木糖苷酶。专利文献3中公开了在pH5.5以下、50℃以上表现出酶活性的、来源于酸热脂环酸芽孢杆菌(Alicyclobacillus acidocaldarius)的β-木糖苷酶。专利文献4公开了在45℃表现出酶活性的、来源于解纤维顶孢霉(Acremonium cellulolyticus)的β-木糖苷酶。另外，非专利文献1～6报道了最适温度为60℃左右的、分离自特定细菌或丝状真菌的β-木糖苷酶。

现有技术文献

专利文献

专利文献1：特表平第11-507837号公报

专利文献2：特开平第11-313683号公报

专利文献3：特表第2011-523346号公报

专利文献4：特开第2013-59272号公报

非专利文献

非专利文献1：Kormelink等，《Journal of Biotechnology(生物技术杂志)》，1993年，第27卷，第249-265页。

非专利文献2：Herrmann等，《Biochemical Journal(生化杂志)》，1997年，第321卷，第375-381页。

非专利文献3：kitamoto等，《Applied and Environmental Microbiology(应用与环境微生物学)》，1999年，第65卷，第20-24页。

非专利文献4：La Grange等，《Applied and Environmental Microbiology(应用与环境微生物学)》，2001年，第67卷，第5512-5519页。

非专利文献5：Shao等，《Applied and Environmental Microbiology(应用与环境微生物学)》，2011年，第77卷，第719-726页。

非专利文献6：Morais等，《Journal of Biological Chemistry(生物化学杂志)》，2012年，第287卷，第9213-9221页。

发明内容

本发明要解决的技术问题

本发明的目的是提供一种至少在85℃且pH6.0的条件下表现出以对硝基苯基-β-D-吡喃木糖苷(PNPX)为底物的水解活性的新耐热性β-木糖苷酶、编码上述耐热性β-木糖苷酶的多核苷酸、用于表达上述耐热性β-木糖苷酶的表达载体、整合了上述表达载体的转化体、以及使用上述耐热性β-木糖苷酶制造木质纤维素分解产物的方法。

解决技术问题的技术手段

本发明的发明人为了解决上述问题，通过从温泉高温土壤中直接提取DNA来进行难培养微生物群的大规模宏基因组测序，成功获取具有新的氨基酸序列的耐热性β-木糖苷酶，从而完成了本发明。

即，作为本发明的耐热性β-木糖苷酶、多核苷酸、表达载体、转化体、耐热性β-木糖苷酶的制造方法、糖苷水解酶混合物、以及木质纤维素分解产物的制造方法，可以列举下列[1]～[10]。

[1]一种耐热性β-木糖苷酶，其特征在于具有由下列(A)、(B)或(C)构成的β-木糖苷酶催化区域：

(A)由序列号1所示氨基酸序列构成的多肽；

(B)由序列号1所示氨基酸序列中的至少一个氨基酸的缺失、取代或添加而形成的氨基酸序列所构成的、并且至少在85℃且pH6.0的条件下具有以对硝基苯基-β-D-吡喃木糖苷为底物的水解活性的多肽；

(C)由与序列号1所示氨基酸序列具有80％以上序列一致性的氨基酸序列构成的、并且至少在85℃且pH6.0的条件下具有以对硝基苯基-β-D-吡喃木糖苷为底物的水解活性的多肽。

[2]上述[1]的耐热性β-木糖苷酶，其进一步具有β-葡糖苷酶活性。

[3]一种多核苷酸，其具有由下列(a)～(e)的碱基序列构成的编码β-木糖苷酶催化区域的区域：

(a)编码由序列号1所示氨基酸序列构成的多肽的碱基序列；

(b)编码由序列号1所示氨基酸序列中的至少一个氨基酸的缺失、取代或添加而形成的氨基酸序列所构成的、并且至少在85℃且pH6.0的条件下具有以对硝基苯基-β-D-吡喃木糖苷为底物的水解活性的多肽的碱基序列；

(c)编码由与序列号1所示氨基酸序列具有80％以上序列一致性的氨基酸序列构成的、并且至少在85℃且pH6.0的条件下具有以对硝基苯基-β-D-吡喃木糖苷为底物的水解活性的多肽的碱基序列；

(d)与序列号2或3所示碱基序列具有80％以上序列一致性、并且编码至少在85℃且pH6.0的条件下具有以对硝基苯基-β-D-吡喃木糖苷为底物的水解活性的多肽的碱基序列；

(e)与由序列号2或3所示碱基序列构成的多核苷酸在严格条件下进行杂交的多核苷酸的碱基序列、且编码至少在85℃且pH6.0的条件下具有以对硝基苯基-β-D-吡喃木糖苷为底物的水解活性的多肽的碱基序列。

[4]上述[3]的多核苷酸，上述多肽进一步具有β-葡糖苷酶活性。

[5]一种表达载体，其整合了上述[3]或[4]的多核苷酸，在宿主细胞中可表达具有β-木糖苷酶活性的多肽。

[6]一种转化体，其导入有上述[5]的表达载体。

[7]上述[6]的转化体，其为真核微生物。

[8]上述耐热性β-木糖苷酶的制造方法，其包括在上述[6]或[7]的转化体中生产上述耐热性β-木糖苷酶。

[9]一种糖苷水解酶混合物，其包含上述[1]或[2]的耐热性β-木糖苷酶、上述[3]或[4]的多核苷酸编码的耐热性β-木糖苷酶、或者利用上述[8]的耐热性β-木糖苷酶的制造方法制得的耐热性β-木糖苷酶及至少一种其他糖苷水解酶。

[10]一种木质纤维素分解产物的制造方法，其包括使含有纤维素、半纤维素及木质素的木质纤维素所形成的材料与上述[1]或[2]的耐热性β-木糖苷酶、上述[3]或[4]的多核苷酸编码的耐热性β-木糖苷酶、上述[6]或上述[7]中记载的转化体、利用上述[8]的耐热性β-木糖苷酶的制造方法制得的耐热性β-木糖苷酶、或者上述[9]的糖苷水解酶混合物接触，由此生产木质纤维素分解产物。

发明效果

本发明的耐热性β-木糖苷酶至少在85℃且pH6.0的条件下具有以对硝基苯基-β-D-吡喃木糖苷(下面有时缩写为PNPX)为底物的水解活性。因此，上述耐热性β-木糖苷酶适合于高温条件下的、木质纤维素所形成的材料的糖化处理。

此外，作为另一方面，上述耐热性β-木糖苷酶适合于高温条件下的、包含具有β-木糖苷键的低聚糖的材料的糖化处理。

此外，作为又一方面，上述耐热性β-木糖苷酶适合于高温条件下的、包含具有β-木糖苷键的低聚糖、或具有β-葡糖苷键的低聚糖的材料的糖化处理。

另外，上述包含具有β-木糖苷键的低聚糖的材料可通过例如对包含半纤维素的木质纤维素进行木聚糖酶的水解而得到。上述包含具有β-葡糖苷键的低聚糖的材料可通过例如对包含纤维素的木质纤维素进行纤维二糖水解酶的水解而得到。此外，本发明的多核苷酸、整合了上述多核苷酸的表达载体、导入有上述表达载体的转化体适合用于制造本发明的耐热性β-木糖苷酶。

附图说明

图1为基因克隆AR19M-346-18的β-木糖苷酶活性催化区域的氨基酸序列(序列号1)与Fervidobacterium gondwanense的GH3木糖苷酶(序列号7)的氨基酸序列的比对图。

图2为表示实施例1中的AR19M-346-18基因在大肠杆菌中表达得到的AR19M-346-18蛋白的SDS-PAGE分析结果的图。

图3为表示实施例1中的大肠杆菌所表达的AR19M-346-18蛋白对各底物的水解活性的测定结果的图。

图4为表示实施例1中的大肠杆菌所表达的AR19M-346-18蛋白在各温度下的PNPX水解活性(pH6.0)的测算结果的图。

图5为表示实施例1中的大肠杆菌所表达的AR19M-346-18蛋白在各pH的PNPX水解活性(70℃)的测算结果的图。

图6为表示实施例1中的大肠杆菌所表达的AR19M-346-18蛋白示出的、伴随热变性而引发的SYPRO Orange(宝石橙蛋白染色试剂)的荧光强度变化的图。

具体实施方式

[耐热性β-木糖苷酶]

众所周知，包含丝状真菌、细菌和古细菌的大多微生物是具有难培养性的，在土壤等微生物环境中生存的菌约99％为未知的菌。特别公认在高温环境中生存的微生物的培养是极其困难的，目前的微生物培养技术只不过是分离培养出0.1％以下土壤中生存的微生物。此高温土壤微生物的难培养性成为耐热性酶的开发无进展的一个原因。

近年来，通过开发可大量序列解码千兆碱基对的新一代千兆测序仪(giga-sequencer)，可完整解码土壤等中所含有的微生物群的基因组。提出了利用该分析技术的宏基因组分析法，从而使难培养性微生物的基因组解码得到了飞速发展，上述宏基因组分析法即制备来自于土壤等环境样本的微生物菌落的基因组DNA，对基因组结构不均匀且多杂的菌群直接进行基因组的全面解码，通过并行计算机进行解码数据的拼接，再度构成微生物群基因组序列。

本发明的发明人如下述实施例1所示，从所采集的高温温泉土壤(例如可列举58～78℃的含有土壤、泥、生物垫(biomat)、生物膜等的温泉水等)提取微生物菌落的基因组DNA(宏基因组DNA)，进行宏基因组DNA的鸟枪法测序和注释，获得405个编码与已知β-葡糖苷酶或β-木糖苷酶类似的氨基酸序列(例如具有20％以上序列一致性、且期望值(E-Value)不足1e^-20的氨基酸序列)的开放阅读框(ORF)。在这些ORF中，对于167个能够确定β-葡糖苷酶催化区域(催化结构域)或β-木糖苷酶催化区域的全长ORF，根据ORF的碱基序列信息设计引物，通过PCR法，从高温温泉土壤宏基因组DNA克隆得到候选基因。将PCR克隆得到的DNA整合到大肠杆菌中，表达上述碱基序列编码的蛋白质，通过PNPX分解活性检测来进行功能筛选。最终，从这些ORF中得到具有PNPX分解活性的耐热性β-木糖苷酶(下面有时称为“AR19M-346-18”)。分别将AR19M-346-18的氨基酸序列示于序列号1，将编码AR19M-346-18的氨基酸序列的碱基序列示于序列号3。

如后述实施例1所示，AR19M-346-18对PNPX表现出高水解活性，对于对硝基苯基-β-D-吡喃木糖苷(下面有时缩写为PNPG)也表现出水解活性。另一方面，对于磷酸溶胀Avicel(Phosphoric acid swollen Avicel，PSA)、羧甲基纤维素(CMC)、由β-1,3键和β-1,6键葡聚糖形成的海带多糖(Laminarin)、由β-1,3键和β-1,4键葡聚糖形成的地衣多糖(Lichenan)、微晶纤维素Avicel，AR19M-346-18几乎没有表现出分解活性。此底物特异性表明AR19M-346-18为至少具有β-木糖苷酶活性的糖苷水解酶。

另外，在本说明书中，“β-木糖苷酶活性”是指以PNPX为底物的水解活性。

此外，在本说明书中，“β-葡糖苷酶活性”是指以PNPG为底物的水解活性。

此外，在本说明书中，“具有活性”是指至少对一种底物起作用，与阴性对照(Negative control)相比，被水解的底物的还原性末端的数量或者在显色反应中存在显著差异。因此，“具有β-木糖苷酶活性”是指至少对PNPX起作用，与阴性对照相比，被水解的底物的还原性末端的数量或者在显色反应中存在显著差异。“具有β-葡糖苷酶活性”是指至少对PNPG起作用，与阴性对照相比，被水解的底物的还原性末端的数量或者在显色反应中存在显著差异。

在公知的氨基酸序列数据库中对AR19M-346-18的氨基酸序列进行检索时，序列一致性最高的氨基酸序列为属于Fervidobacterium gondwanense的GH3家族的β-木糖苷酶(Genbank登记号：AFY97406.1)(序列号7)，其序列一致性(相似性)为76％。由底物特异性和与已知的蛋白质的氨基酸序列的序列一致性得知，AR19M-346-18为属于GH3家族的新β-木糖苷酶。

AR19M-346-18至少在85℃、pH6.0的条件下具有以PNPX为底物的水解活性(即β-木糖苷酶活性)。实际上，如下述实施例1<10>所示，AR19M-346-18在50～95℃的温度范围内表现出β-木糖苷酶活性，在70～90℃的温度范围内表现出强β-木糖苷酶活性。更具体而言，AR19M-346-18的β-木糖苷酶活性在50～85℃的范围内随着温度的升高而升高，超过90℃时有急剧下降的倾向。

通常，任何具有生理活性的蛋白质都能在不损害其生理活性的前提下，进行1个或2个以上氨基酸的缺失、取代或添加。即，对于AR19M-346-18，也可以在不丧失以β-木糖苷酶活性为首的糖苷水解酶活性的前提下，进行1个或2个以上氨基酸的缺失、取代或添加。

即，本发明的耐热性β-木糖苷酶为具有由下列(A)～(C)中任一多肽构成的β-木糖苷酶催化区域的耐热性糖苷水解酶。

(A)由序列号1所示氨基酸序列构成的多肽(即AR19M-346-18)；

(B)由序列号1所示氨基酸序列中的至少一个氨基酸的缺失、取代或添加而形成的氨基酸序列所构成的、并且至少在85℃且pH6.0的条件下具有以PNPX为底物的水解活性的多肽；或者

(C)由与序列号1所示氨基酸序列具有80％以上序列一致性的氨基酸序列构成的、并且至少在85℃且pH6.0的条件下具有以PNPX为底物的水解活性的多肽。

在本说明书中，“多肽中的氨基酸的缺失”是指失去(即去除)构成多肽的一部分氨基酸。

在本说明书中，“多肽中的氨基酸的取代”是指将构成多肽的氨基酸替换为其他氨基酸。

在本说明书中，“多肽中的氨基酸的添加”是指在多肽中插入新的氨基酸。

在上述(B)的多肽中，对于序列号1所示氨基酸序列，缺失、取代或添加氨基酸的个数优选为1～20个，更加优选为1～10个，进一步优选为1～5个。

在上述(C)的多肽中，与序列号1所示氨基酸序列的序列一致性只要是80％以上且不足100％即可，没有特别的限制，但优选为85％以上且不足100％，更加优选为90％以上且不足100％，进一步优选为95％以上且不足100％，更进一步优选为98％以上且不足100％。

另外，氨基酸序列之间的序列一致性(相似性)是以使对应氨基酸有最多一致的方式，在相当于插入及缺失的部分加入空位(gap)的同时，使两个氨基酸序列并列得到比对，再以一致的氨基酸相对于除去所得比对中的空位的氨基酸序列整体的比例求得。氨基酸序列之间的序列一致性可以使用上述技术领域中公知的各种相似性检索软件来求得。本发明的氨基酸序列的序列一致性的值是以利用公知的相似性检索软件BLASTP得到的比对为基础算得的。

作为上述(B)和(C)的多肽，可以是人工设计的，也可以是AR19M-346-18等的同源物或其部分蛋白质。

上述(A)～(C)的多肽分别可以根据氨基酸序列进行化学合成，也可以由使用了下述本发明的多核苷酸的蛋白质表达系统来生产。此外，上述(B)和(C)的多肽也可以分别根据由序列号1所示氨基酸序列构成的多肽，利用导入氨基酸突变的基因重组技术来进行人工合成。

上述(A)～(C)的多肽至少在85℃、pH6.0的条件下具有以PNPX为底物的水解活性(β-木糖苷酶活性)。因此，通过具有上述(A)～(C)中任一多肽作为β-木糖苷酶催化区域，能够得到耐热性β-木糖苷酶。

本发明的耐热性β-木糖苷酶以PNPX为底物。上述耐热性β-木糖苷酶还可以进一步以PNPX之外的其他β-葡聚糖或低聚糖为底物。作为可充当本发明的耐热性β-木糖苷酶的底物的其他物质，例如可列举：PNPG、对硝基苯基-α-L-呋喃阿拉伯糖苷、对硝基苯基-α-L-吡喃阿拉伯糖苷、对硝基苯基-β-L-吡喃阿拉伯糖苷、对硝基苯基-β-D-吡喃甘露糖苷、对硝基苯基-α-D-吡喃半乳糖苷、对硝基苯基-β-D-吡喃半乳糖苷；地衣多糖等由β-1,3键和β-1,4键形成的葡聚糖；木聚糖；Avicel、微晶性细菌纤维素(Bacterial microcrystallinecellulose，BMCC)、滤纸等结晶纤维素、非结晶纤维素的磷酸溶胀Avicel(phosphoric acidswollen Avicel,PSA)、CMC等由β-1,4键形成的葡聚糖；纤维二糖等由β-1,4键形成的低聚糖；海带多糖等由β-1,3键和β-1,6键形成的葡聚糖；由β-1,3键形成的葡聚糖；由β-1,6键形成的葡聚糖；龙胆二糖等由β-1,6键形成的低聚糖。作为本发明的耐热性β-木糖苷酶，除了PNPX之外，优选以选自由PNPG、对硝基苯基-α-L-呋喃阿拉伯糖苷、对硝基苯基-α-L-吡喃阿拉伯糖苷、对硝基苯基-β-L-吡喃阿拉伯糖苷、对硝基苯基-β-D-吡喃甘露糖苷、对硝基苯基-α-D-吡喃半乳糖苷、以及对硝基苯基-β-D-吡喃半乳糖苷构成的组的至少一种为底物的耐热性β-木糖苷酶，更加优选以PNPG为底物的耐热性β-木糖苷酶。

本发明的耐热性β-木糖苷酶至少在pH6.0的条件下，优选在70～90℃的温度范围内表现出以PNPX为底物的水解活性(β-木糖苷酶)，更加优选在60～95℃的温度范围内表现出以PNPX为底物的水解活性，进一步优选在50～95℃的温度范围内表现出以PNPX为底物的水解活性。本发明的耐热性β-木糖苷酶的最适温度优选在70～90℃的范围内，更加优选在80～90℃的范围内。

本发明的耐热性β-木糖苷酶的最适pH虽然依赖于反应温度而变化，但是在pH5.0～7.0的范围内。作为本发明的耐热性β-木糖苷酶，优选至少在pH4.5～8.0的范围内表现出β-木糖苷酶活性，更加优选在pH4.0～8.0的范围内表现出β-木糖苷酶活性。

本发明的耐热性β-木糖苷酶还可以进一步具有β-木糖苷酶活性之外的糖苷水解活性。作为其他糖苷水解活性，可列举内切葡聚糖酶活性、木聚糖酶活性、β-葡糖苷酶活性或纤维二糖水解酶活性等。

本发明的耐热性β-木糖苷酶可以是仅由上述(A)～(C)的多肽中的任一多肽构成的β-木糖苷酶催化区域所构成的酶，也可以进一步含有其他区域。作为其他区域，可列举公知的β-木糖苷酶所具有的酶催化区域之外的区域。例如，在本发明的耐热性β-木糖苷酶中，相对于公知的β-木糖苷酶，还包含通过酶催化区域被上述(A)～(C)的多肽取代而得到的酶。

本发明的耐热性β-木糖苷酶含有β-木糖苷酶催化区域之外的区域时，还优选含有纤连蛋白III型样结构域。

纤连蛋白III型样结构域可以在β-木糖苷酶催化区域的上游(N末端一侧)，也可以在其下游(C末端一侧)。此外，纤连蛋白III型样结构域和β-木糖苷酶催化区域可以直接结合，也可以通过适当长度的连接区域进行结合。作为本发明的耐热性β-木糖苷酶，优选在β-木糖苷酶催化区域的上游或下游通过连接区域存在纤连蛋白III型样结构域，更加优选在β-木糖苷酶催化区域的下游通过连接区域存在纤连蛋白III型样结构域。

本发明的耐热性β-木糖苷酶另外还可以在N末端或C末端具有可转移并定位于细胞内特定区域的信号肽、或者向细胞外分泌的信号肽。作为这种信号肽，例如可列举质外体转移信号肽、内质网驻留信号肽、核转运信号肽、或者分泌信号肽等。作为内质网驻留信号肽，例如可列举由HDEL的氨基酸序列构成的信号肽等。本发明的耐热性β-木糖苷酶在其N末端或C末端具有信号肽时，可使在转化体中表达的耐热性β-木糖苷酶分泌到细胞外，或定位于细胞中的内质网等中。

此外，本发明的耐热性β-木糖苷酶，除此之外，由于在利用表达系统生产时可简单纯化，例如也可以在上述耐热性β-木糖苷酶的N末端或C末端添加各种标记。作为上述标记，例如可使用His标记、HA(血凝素)标记、Myc标记及Flag标记等在重组蛋白的表达纯化中广泛使用的标记。

[编码耐热性β-木糖苷酶的多核苷酸]

本发明的多核苷酸编码本发明的耐热性β-木糖苷酶。上述耐热性β-木糖苷酶可以通过将整合了上述多核苷酸的表达载体导入宿主中，利用上述宿主的表达系统来生产。

具体而言，本发明的多核苷酸为具有由下列(a)～(e)中任一碱基序列构成的编码β-木糖苷酶催化区域的区域的多核苷酸。

(a)编码由序列号1所示氨基酸序列构成的多肽的碱基序列；

(b)编码由序列号1所示氨基酸序列中的至少一个氨基酸的缺失、取代或添加而形成的氨基酸序列所构成的、并且至少在85℃且pH6.0的条件下具有以PNPX为底物的水解活性的多肽的碱基序列；

(c)编码由与序列号1所示氨基酸序列具有80％以上序列一致性的氨基酸序列构成的、并且至少在85℃且pH6.0的条件下具有以PNPX为底物的水解活性的多肽的碱基序列；

(d)与序列号2或3所示碱基序列具有80％以上序列一致性、并且编码至少在85℃且pH6.0的条件下具有以PNPX为底物的水解活性的多肽的碱基序列；

(e)与由序列号2或3所示碱基序列构成的多核苷酸在严格条件下进行杂交的多核苷酸的碱基序列、且编码至少在85℃且pH6.0的条件下具有以PNPX为底物的水解活性的多肽的碱基序列。

另外，在本说明书中，“多核苷酸中的碱基的缺失”是指失去(即去除)构成多核苷酸的一部分核苷酸。

在本说明书中，“多核苷酸中的碱基的取代”是指将构成多核苷酸的碱基替换为其他碱基。

在本说明书中，“多核苷酸中的碱基的添加”是指在多核苷酸中插入新的碱基。

本说明书中，“严格条件”例如可列举《分子克隆-实验室手册第三版》(Sambrook等，冷泉港实验室出版社)中记载的方法。例如可列举，通过在由6×SSC(20×SSC的组成：3M氯化钠、0.3M柠檬酸溶液，pH7.0)、5×邓哈特溶液(Denhardt's solution)(100×邓哈特溶液的组成：2质量％的牛血清白蛋白、2质量％的Ficoll、2质量％的聚乙烯吡咯烷酮)、0.5质量％的SDS、0.1mg/mL的鲑鱼精子DNA及50％的甲酰胺组成的杂交缓冲液中，在42～70℃进行数小时到一晚的温育而使杂交进行的条件。另外，作为用于温育后的清洗时的清洗缓冲液，优选为含有0.1质量％SDS的1×SSC溶液，更加优选为含有0.1质量％SDS的0.1×SSC溶液。

在上述(a)～(e)的碱基序列中，简并密码子优选宿主中使用频率高的密码子。例如，作为上述(a)的碱基序列，可以是序列号2所示碱基序列，也可以是序列号3所示碱基序列，也可以是在不改变所编码的氨基酸序列的前提下，将序列号2或3所示碱基序列变更为宿主中使用频率高的密码子的碱基序列。密码子的变更可以通过公知的基因序列突变技术或人工基因合成来进行。

由序列号2或3所示碱基序列构成的多核苷酸可以根据碱基序列信息进行化学合成，也可以是利用基因重组技术从自然界取得的编码AR19M-346-18的基因(有时被称为“AR19M-346-18基因”)的全长或含有β-木糖苷酶催化区域的部分区域(例如，编码由序列号1中的第23位的苏氨酸至第347位的缬氨酸的325个氨基酸所构成的部分区域的区域，或编码由序列号1中的第379位的异亮氨酸至第638位的苏氨酸的260个氨基酸所构成的部分区域的区域，或编码由序列号1中的第23位的苏氨酸至第638位的苏氨酸的616个氨基酸所构成的部分区域的区域)。AR19M-346-18基因的全长或其部分区域可以通过例如从自然界获取含有微生物的样本，以从上述样本回收的基因组DNA为模板，使用基于序列号2或3所示碱基序列用常规方法设计的正向引物和反向引物进行PCR而获得。也可以将以从上述样本回收的mRNA为模板通过反转录反应合成的cDNA作为模板。另外，回收作为模板的核酸的样本优选为在温泉土壤等高温环境下采集的样本。

在上述(d)的碱基序列中，与序列号2或3所示碱基序列的序列一致性只要是80％以上且不足100％即可，没有特别的限制，但优选为85％以上且不足100％，更加优选为90％以上且不足100％，进一步优选为95％以上且不足100％。

另外，碱基序列之间的序列一致性(相似性)是以使对应碱基最多一致的方式，在相当于插入和缺失的部分加入空位的同时使两个碱基序列并列得到比对，再以一致的碱基相对于除去所得比对中的空位的碱基序列整体的比例求得。碱基序列之间的序列一致性可以使用上述技术领域中公知的各种相似性检索软件来求得。本发明的碱基序列的序列一致性的值是以利用公知的相似性检索软件BLASTN得到的比对为基础算得的。

例如，上述(b)、(c)或(d)的碱基序列所构成的多核苷酸分别可以通过对序列号2或3所示碱基序列构成的多核苷酸进行1个或2个以上碱基的缺失、取代或添加来人工合成。此外，作为上述(b)、(c)或(d)的碱基序列，可以是AR19M-346-18基因的同源基因的全长序列或其部分序列。AR19M-346-18基因的同源基因可以通过在获取碱基序列已知的基因的同源基因时所使用的基因重组技术来获得。

本发明的多核苷酸，可以仅为具有编码β-木糖苷酶催化区域的区域的多核苷酸，也可以除上述区域之外，还具有编码纤维素结合模块、连接序列、各种信号肽、各种标记等的区域。

[表达载体]

本发明的表达载体为整合了上述本发明的多核苷酸、可在宿主细胞中表达至少在85℃、pH6.0的条件下具有以PNPX为底物的水解活性的多肽的表达载体。即，以可表达上述本发明的耐热性β-木糖苷酶的状态整合上述本发明的多核苷酸的表达载体。具体而言，需要在表达载体中整合由从上游开始的具有启动子序列的DNA、上述本发明的多核苷酸、以及具有终止子序列的DNA所构成的表达盒。另外，可以利用众所周知的基因重组技术来进行多核苷酸向表达载体中的整合。多核苷酸向表达载体中的整合也可以使用市售的表达载体制作试剂盒。

在本说明书中，“表达载体”是指从上游开始包含具有启动子序列的DNA、具有用于整合外源DNA的序列的DNA、以及具有终止子序列的DNA的载体。

作为上述表达载体，可以是导入大肠杆菌等原核细胞的表达载体，也可以是导入酵母、丝状真菌、昆虫培养细胞、哺乳动物培养细胞、或植物细胞等真核细胞的表达载体。作为这些表达载体，可以分别对应宿主使用通常所使用的任意表达载体。

本发明的表达载体优选为不仅整合了上述本发明的多核苷酸，还整合了耐药基因等的表达载体。这是由于可以利用表达载体容易地进行转化宿主细胞和非转化宿主细胞的筛选。

作为上述耐药基因，例如可列举卡那霉素抗性基因、潮霉素抗性基因和双丙氨磷抗性基因等。

[转化体]

本发明的转化体导入有本发明的表达载体。在上述转化体中，可表达本发明的耐热性β-木糖苷酶。作为导入表达载体的宿主，可以是大肠杆菌等原核细胞，也可以是酵母、丝状真菌、昆虫培养细胞、哺乳动物培养细胞、或植物细胞等真菌细胞。即，本发明的转化体为导入有本发明的表达载体的大肠杆菌、酵母、丝状真菌、昆虫培养细胞、哺乳动物培养细胞、植物细胞等。

通过培养大肠杆菌的转化体，可以简便且大量的生产本发明的耐热性β-木糖苷酶。另一方面，由于在真核细胞内，蛋白质被实施了糖链修饰，通过使用真核细胞的转化体，能够比使用原核细胞的转化体时生产耐热性更加优异的耐热性β-木糖苷酶。

使用表达载体制作转化体的方法没有特别的限制，可以利用在制作转化体时通常使用的方法来进行。作为上述方法，例如有热休克法、农杆菌介导法、粒子枪法、电穿孔法及PEG(聚乙二醇)法等。其中，宿主为植物细胞的情况下，优选以粒子枪法或农杆菌介导法来进行。

在将原核细胞、酵母、丝状真菌、昆虫培养细胞、或哺乳培养细胞等用作宿主的情况下，所得到的转化体通常可以与转化前的宿主一样利用常规方法进行培养。

[耐热性β-木糖苷酶的制造方法]

本发明的耐热性β-木糖苷酶的制造方法，是在上述本发明的转化体中生产耐热性β-木糖苷酶的方法。若使用将上述本发明的多核苷酸整合到不具有控制表达时期等的能力的启动子下游的表达载体制备转化体，并对该转化体进行培养，则在上述转化体内稳定表达本发明的耐热性β-木糖苷酶。另一方面，对于使用通过特定化合物或温度条件等诱导表达的所有表达诱导型启动子制备的转化体，通过进行适应于各种表达诱导条件的诱导处理，在上述转化体中表达耐热性β-木糖苷酶。

由转化体生产的耐热性β-木糖苷酶能够以留存于上述转化体中的状态使用，也可以从上述转化体中提取纯化。

从转化体中提取或纯化耐热性β-木糖苷酶的方法只要是不损害耐热性β-木糖苷酶活性的方法即可，没有特别的限制，可以利用从细胞或活体组织中提取多肽时通常使用的方法来进行提取。作为上述方法，例如可列举将转化体浸入适当的提取缓冲液中，提取耐热性β-木糖苷酶后，将提取液与固体残渣分离的方法。作为上述提取缓冲液，优选为含有表面活性剂等增溶剂的提取缓冲液。转化体为植物的情况下，在浸入提取缓冲液前，可以预先将上述转化体切碎或粉碎。此外，作为分离提取液和固体残渣的方法，例如可使用过滤法、压缩过滤法、或离心分离处理法等公知的固液分离处理，也可以对浸入提取缓冲液状态的转化体进行挤压。提取液中的耐热性β-木糖苷酶可以利用盐析法、超滤法或层析法等公知的纯化方法进行纯化。

本发明的耐热性β-木糖苷酶在转化体中以具有分泌信号肽的状态表达时，在对上述转化体进行培养后，回收从所得到的培养物除去转化体的培养液上清，由此能够简便的获得含有耐热性β-木糖苷酶的溶液。此外，本发明的耐热性β-木糖苷酶具有His标记等标记时，通过利用上述标记的亲和层析法，能够简便的纯化提取液或培养液上清中的耐热性β-木糖苷酶。

即，本发明的耐热性β-木糖苷酶的制造方法包括在对上述本发明的转化体进行培养，在上述转化体中生产耐热性β-木糖苷酶，以及根据需要从上述转化体中提取纯化上述耐热性β-木糖苷酶。

[糖苷水解酶混合物]

本发明的糖苷水解酶混合物也可以以含有上述本发明的耐热性β-木糖苷酶、或者由上述本发明的耐热性β-木糖苷酶的制造方法制造的耐热性β-木糖苷酶与至少一种其他糖苷水解酶的糖苷水解酶混合物的形式使用。由上述本发明的耐热性β-木糖苷酶的制造方法制造的耐热性β-木糖苷酶可以是包含在转化体中的状态的耐热性β-木糖苷酶，也可以是从转化体中提取纯化的耐热性β-木糖苷酶。通过将本发明的耐热性β-木糖苷酶以与其他糖苷水解酶的混合物的形式用于多糖的水解反应，能够更高效地分解难分解的木质纤维素。

作为上述糖苷水解酶混合物中含有的上述耐热性β-木糖苷酶之外的其他糖苷水解酶，只要是具有木质纤维素水解活性的酶即可，没有特别的限制。作为上述糖苷水解酶混合物中含有的上述β-木糖苷酶之外的其他糖苷水解酶，例如可列举木聚糖酶等半纤维素酶、纤维二糖水解酶、β-葡糖苷酶、或内切葡聚糖酶等。作为本发明的糖苷水解酶混合物，除了上述耐热性β-木糖苷酶之外，还优选含有半纤维素酶和内切葡聚糖酶中的至少一种糖苷水解酶的混合物，更加优选含有半纤维素酶和内切葡聚糖酶这两种糖苷水解酶的混合物。其中，优选含有选自由木聚糖酶、β-木糖苷酶、纤维二糖水解酶及内切葡聚糖酶构成的组中的至少一种糖苷水解酶的混合物，更加优选含有木聚糖酶、β-木糖苷酶、纤维二糖水解酶及内切葡聚糖酶全部这些糖苷水解酶的混合物。

上述糖苷水解酶混合物中含有的其他糖苷水解酶优选为至少在85℃具有糖苷水解酶活性的耐热性糖苷水解酶，更加优选为在70～90℃具有糖苷水解酶活性的耐热性糖苷水解酶。通过使上述糖苷水解酶混合物含有的全部酶为耐热性的(例如酶活性的最适温度或酶蛋白的热变性温度为70℃以上)，能够在高温条件下高效进行基于上述糖苷水解酶混合物的木质纤维素分解反应。即，上述糖苷水解酶混合物仅含有耐热性糖苷水解酶时，通过将上述糖苷水解酶混合物用于木质纤维素糖化处理，使得可以在糖化温度为70～90℃的高温环境下进行木质纤维素水解反应(高温糖化：高温水解)。通过此高温糖化，可以显著减少酶量和糖化时间，大幅降低糖化成本(水解成本)。

[木质纤维素分解产物的制造方法]

本发明的木质纤维素分解产物的制造方法为包括利用本发明的耐热性β-木糖苷酶将由木聚糖酶水解半纤维素生成的低聚糖、或者由纤维二糖水解酶水解纤维素生成的低聚糖水解为单糖，从而得到木质纤维素分解产物的方法。

另外，此处所述“半纤维素分解产物”具体可列举出葡萄糖及木糖等单糖。

本发明的木质纤维素分解产物的制造方法的另一方面为，通过利用本发明的耐热性β-木糖苷酶对包含具有β-木糖苷键的低聚糖的材料进行水解，从而制造包含上述低聚糖的分解产物的木质纤维素分解产物的方法。

本发明的木质纤维素分解产物的制造方法的又一方面为，通过利用本发明的耐热性β-木糖苷酶对包含具有β-葡糖苷键的低聚糖的材料进行水解，从而制造包含上述低聚糖的分解产物的木质纤维素分解产物的方法。

另外，上述包含具有β-木糖苷键的低聚糖的材料可通过例如对包含半纤维素的木质纤维素进行木聚糖酶的水解而得到。上述包含具有β-葡糖苷键的低聚糖的材料可通过例如对包含纤维素的木质纤维素进行纤维二糖水解酶的水解而得到。

具体而言，本发明的木质纤维素分解产物的制造方法为，包括通过使木质纤维素所构成的材料、具体为包含半纤维素或纤维素的木质纤维素所构成的材料与本发明的耐热性β-木糖苷酶、本发明的转化体、利用本发明的耐热性β-木糖苷酶的制造方法制得的耐热性β-木糖苷酶、或者本发明的糖苷水解酶混合物接触，生产半纤维素或纤维素分解产物的方法。

作为本发明的木质纤维素分解产物的制造方法的另一方面，具体为包括通过使包含具有β-木糖苷键的低聚糖的材料与本发明的耐热性β-木糖苷酶、本发明的转化体、利用本发明的耐热性β-木糖苷酶的制造方法制得的耐热性β-木糖苷酶、或者本发明的糖苷水解酶混合物接触，生产上述低聚糖的分解产物的方法。

作为本发明的木质纤维素分解产物的制造方法的又一方面，具体为包括通过使包含具有β-葡糖苷键的低聚糖的材料与本发明的耐热性β-木糖苷酶、本发明的转化体、利用本发明的耐热性β-木糖苷酶的制造方法制得的耐热性β-木糖苷酶、或者本发明的糖苷水解酶混合物接触，生产上述低聚糖的分解产物的方法。

上述包含具有β-葡糖苷键的低聚糖的材料可通过对包含半纤维素的木质纤维素进行木聚糖酶的水解来进行调整。上述包含具有β-葡糖苷键的低聚糖的材料可通过对包含纤维素的木质纤维素进行纤维二糖水解酶的水解来进行调整。

作为上述含有半纤维素或纤维素的木质纤维素所构成的材料，只要含有半纤维素或纤维素即可，没有特别的限制。作为该材料，例如可列举杂草或农业废弃物等纤维素类生物质、或者废纸等。优选使上述材料与本发明的耐热性β-木糖苷酶接触前，先进行破碎或切碎等物理处理、利用酸或碱等的化学处理、或者浸渍或溶解于适当的缓冲液中的处理等。

即，本发明的木质纤维素分解产物的制造方法还可以进一步包括，使上述含有半纤维素或纤维素的木质纤维素所构成的材料与本发明的耐热性β-木糖苷酶接触前，先进行物理处理、化学处理、或者浸渍或溶解处理。

利用本发明的耐热性β-木糖苷酶进行半纤维素的水解反应的反应条件只要是使上述耐热性β-木糖苷酶表现出纤维寡糖水解活性的条件即可。例如优选在60～90℃、pH5.0～9.0的条件下进行反应，更加优选在70～90℃、pH5.0～9.0的条件下进行反应，进一步优选在70～90℃、pH6.0～8.5的条件下进行反应。上述水解反应的反应时间可考虑供水解的上述材料的种类、预处理方法、或者用量等进行适当的调整。例如进行10分钟～100小时，在分解纤维素类生物质的情况下，能够以1～100小时的反应时间进行上述水解反应。

在木质纤维素的水解反应中，除了本发明的耐热性β-木糖苷酶之外，优选还同时或者分别使用至少一种其他糖苷水解酶。作为上述其他糖苷水解酶，可以使用与上述糖苷水解酶混合物中含有的糖苷水解酶一样的糖苷水解酶，优选的是，至少在85℃、优选至少在70～90℃具有糖苷水解酶活性的耐热性糖苷水解酶。此外，上述木质纤维素分解产物的制造方法的一个方面为使用本发明的耐热性β-木糖苷酶、本发明的转化体、或者利用本发明的耐热性β-木糖苷酶的制造方法制得的耐热性β-木糖苷酶，另一方面为使用上述糖苷水解酶混合物。

实施例

下面示出实施例对本发明进行进一步的详细说明，但本发明并不局限于以下实施例。

[实施例1]来自于温泉土壤的新耐热性β-木糖苷酶的克隆

<1>来自于温泉土壤的DNA提取与全基因组序列(Whole Genome Sequence,WGS)

以在70～90℃表现出活性的新耐热性β-木糖苷酶的基因探索为目的，从中性～弱碱性温泉采集土壤DNA，进行构成这些土壤的微生物群的基因组DNA的碱基序列解码。

作为中性～弱碱性温泉土壤样本，从在野外有喷出高温温泉的日本国内的3处的5个地点(宏基因组DNA样本N2、AR19、AR15、OJ1和H1)采集含有土壤、泥、生物垫的温泉水。这些温泉土壤样本在采集温度58～78℃、pH7.2～8的范围内。

使用DNA提取试剂盒(ISOIL Large for Beads ver.2,NIPPON GENE社制)，从所采集的温泉土壤样本各10g中提取DNA。利用罗氏诊断(Roche Diagnostics)社制GS FLXTitanium 454和Illumina社制测序仪HiSeq2000，对所提取的DNA进行宏基因组DNA的鸟枪法测序。在454测序仪中使用5μg所提取的DNA，在HiSeq2000测序仪中，使用由基因组DNA扩增试剂盒(GenomiPhi V2DNA扩增试剂盒，GE医疗社制)扩增的产物，进行宏基因组DNA的序列解码。在利用HiSeq2000进行的测序中，使用Illumina社制cBot，将DNA文库和试剂注入流动槽(flow cell)，在流动槽内由DNA1分子自动形成具有同一序列的基因簇。使用HiSeq2000进行101bp的配位末端测序，得到宏基因组序列数据。

对温泉土壤样本AR19进行宏基因组DNA的序列解码，在454测序仪中，得到平均解码长度(read length)为396bp、总解码数(total read number)为2,766,332个、总基因组解码量为1,106,243,280bp，在HiSeq2000测序仪中，得到配对末端的平均解码长度为92.65bp bp、总解码数为894,238,096个、总基因组解码量为83,112,168,755bp，共计84.2Gbp的全基因组序列(WGS)数据集。

<2>温泉宏基因组数据的拼接与统计量

对于用454测序仪和HiSep测序仪读取的碱基序列，使用CLCbio社制CLC GenomicsWorkbench(CLC高通量数据分析平台，5.5.1版)进行质量过滤和Denovo拼接。在质量过滤后，由454测序仪得到的解码的总解码长度变为2,766,328bp，由HiSeq2000测序仪得到的碱基序列数据的总解码长度变为81,323,692,563bp。拼接后，具有500bp以上长度的重叠群的数量为967,925个，总全长变为419,787,603bp，其中，最大重叠群长度为287,641bp。

<3>β-木糖苷酶的开放阅读框(OPF)预测

从Uniprot数据库(http://www.uniprot.org/)下载EC号为3.2.1.4(纤维素酶)、3.2.1.21(β-葡糖苷酶)、3.2.1.37(β-木糖苷酶)、3.2.1.91(纤维素1,4-β-纤维二糖糖苷酶)、3.2.1.8(内切-1,4-β-木聚糖酶)的序列(访问日期：2011/12/9)，构建这些糖苷水解酶基因的蛋白质组本地数据库。使用注释软件Metagene(Noguchi等，《DNA Research(DNA研究)》，2008，15(6))，由上述<2>所得重叠群序列推断基因区域(＝开放阅读框)(Metagene选项：-m)。为了从推断的ORF提取糖苷水解酶基因，使用了BLASTP(blastall ver.2.2.18)，参照了上述本地数据库。BLASTP的选项条件设为“过滤查询序列＝假”，“期望值(E)<1e^-20”[以下为默认值：空位开放罚分＝-1，空位扩展罚分＝-1，空位比对的X下降值＝0，阈值拓展命中＝0，字段长度＝默认(Cost to open a gap＝-1，Cost to extended gap＝-1，Xdropoff value for gapped alignment＝0，Threshold for extending hits＝0，Wordsize＝default)]，以命中ORF序列为糖苷水解酶基因进行收集。收集的碱基序列包含纤维素酶、内切半纤维素酶、脱支酶等糖苷水解酶基因的碱基序列。

<4>基因的糖苷水解酶(GH)家族分类

对于在上述<3>中收集的碱基序列，以蛋白质功能区域序列数据库pfam HMMs(Pfam 23.0版和HMMER v2.3；Finn等，《核酸研究数据库》，2010年，第38卷，第D211-222页)为标准进行功能分类。具体而言，使用了蛋白质基序检索程序HMMER(Durbin等，“Thetheory behind profile HMMs.Biological sequence analysis:probabilistic modelsof proteins and nucleic acids(概形HMM理论。生物序列分析理论：蛋白质和核酸的概率模型)”，1998年，剑桥大学出版社；hmmpfam(2.3.2版)中，E值截止值<1e^-5；数据库＝Pfam_fs(可用于查找所表示的结构域在序列中的片段的模型。))，由与Pfam结构域数据库的相似性确定糖苷水解酶(GH)家族。另外，将覆盖GH催化结构域的70％以上的碱基序列计入属于各家族的酶基因。

通过Metagene，从84.2Gbp长的宏基因组AR19序列数据预测了602,589个ORF，全长ORF为251,146个。

通过BLASTP的相似性检索，命中作为β-葡糖苷酶或β-木糖苷酶序列的406个ORF。这406个ORF中，通过pfam HMMs，168个预测为β-葡糖苷酶基因或β-木糖苷酶基因，238个的GH催化结构域的序列的覆盖率不足70％，或者为在pfam数据库中未命中的序列。

预测为β-葡糖苷酶基因或β-木糖苷酶基因的168个ORF的GH家族分类结果示于表1中。GH催化结构域的覆盖率不足70％以及与Pfam的相似性无法得到确认的序列分类为GH不明。如表1所示，从AR19宏基因组得到预测为β-葡糖苷酶或β-木糖苷酶的ORF的：19个属于GH1家族的全长ORF，57个属于GH3家族的全长ORF，13个属于GH31家族的全长ORF，13个属于GH43家族的全长ORF。对于推断为β-葡糖苷酶基因或β-木糖苷酶基因的全部全长ORF，设计引物，通过PCR从温泉土壤宏基因组DNA克隆基因。结果从属于GH3家族的、具有木糖苷酶序列的开放阅读框AR19M-346分离出β-木糖苷酶基因。

[表1]

<5>开放阅读框AR19M-346

开放阅读框AR19M-346编码由773个氨基酸残基构成的多肽(序列号1)，上述多肽为从第1位氨基酸残基蛋氨酸开始、在编码上述多肽的碱基序列的3’末端以终止密码子终止的全长序列(序列号2)。从基序的序列相似性推测，编码开放阅读框AR19M-346的多肽编码多结构域蛋白，该多结构域蛋白由第23位的苏氨酸(T)至第347位的缬氨酸(V)的325个氨基酸的糖苷水解酶第3家族催化结构域的N末端侧结构域、第379位的异亮氨酸(I)至第638位的苏氨酸(T)的260个氨基酸的糖苷水解酶第3家族催化区域的C末端侧结构域、以及第673位的谷氨酸(E)至第742位的丝氨酸(S)的70个氨基酸的纤连蛋白III型样结构域构成。根据利用信号序列预测软件SignalP4.1进行的分析，作为开始密码子的第1位的蛋氨酸至第22位的氨基酸序列不编码分泌信号肽，其功能不明。

<6>基因克隆

使用由序列号6所示碱基序列构成的正向引物(5’-CACCATGGAGATTTATAAGGATCCA-3’：在序列号4所示碱基序列的5’末端添加4个碱基(CACC)而成。5’一侧所添加的CACC为用于插入载体的序列。)与由序列号5所示碱基序列构成的反向引物(5’-TTATATAATTTTAACCTCGGTAAAGAATATCCTTT-3’)，以通过基因组DNA扩增试剂盒(GenomiPhiV2DNA扩增试剂盒，GE医疗社制)扩增的温泉土壤DNA为模板，进行PCR。序列号4所示碱基序列与由序列号2或3所示碱基序列的第1～21位碱基所构成的部分序列为相同的(同一)碱基序列。此外，序列号5所示碱基序列与由序列号2或3所示碱基序列的第2288～2322位碱基构成的部分序列为互补的碱基序列。所扩增的PCR产物插入Champion pET Directional TOPO表达试剂盒(生命技术(Life Technologies)社制)的pET101/D-TOPO载体中，转化至OneShot TOP10菌株。通过菌落PCR选择阳性克隆，使用含有100mg/L氨苄青霉素的LB液体培养基，以37℃、200rpm培养17～20小时后，使用小提试剂盒(Miniprep Kit，Wizard plus SVMinipreps DNA Purification System，Promega社制)进行质粒的制备。所制备的质粒用生命技术(Life Technologies)社的3730DNA分析测序仪进行序列确认。

通过PCR克隆，从开放阅读框AR19M-346得到2个基因克隆AR19M-346-18和AR19M-346-43。作为β-木糖苷酶候选基因的基因克隆AR19M-346-18的碱基序列(序列号3)与开放阅读框AR19M-346(序列号2)同样包含2322bp，与所预测的ORF有1个碱基不同。即，第1653位的碱基在所预测的ORF(序列号2)中为胸腺嘧啶(T)，而在所克隆的基因(序列号3)中为胞嘧啶(C)。然而，两者所编码的氨基酸序列(序列号1)未发现有所不同。

β-木糖苷酶候选基因AR19M-346-18(下面称为“AR19M-346-18基因”)编码的多肽(AR19M-346-18)由773个氨基酸构成，并由与开放阅读框AR19M-346编码的773个氨基酸残基所构成的多肽(序列号1)相同的氨基酸序列构成。AR19M-346-18为多结构域蛋白，该多结构域蛋白由第23位的苏氨酸至第347位的缬氨酸的325个氨基酸(T23-V347)的糖苷水解酶第3家族催化结构域的N末端侧结构域、第379位的异亮氨酸至第638位的苏氨酸的260个氨基酸(I379-T638)的糖苷水解酶第3家族催化区域的C末端侧结构域、以及第673位的谷氨酸至第742位的丝氨酸的70个氨基酸(E673-S742)的纤连蛋白III型样结构域构成。

图1中示出了基因克隆AR19M-346-18的β-木糖苷酶活性催化区域的氨基酸序列与细菌热袍菌门Fervidobacterium gondwanense的GH3木糖苷酶(Genbank登录ID：：AFY97406.1)的氨基酸序列的比对图。在图1中，黑白对比的氨基酸表示这些全部氨基酸序列中的相同氨基酸残基(一致序列)，网点的氨基酸表示这些氨基酸序列中的相似氨基酸残基(相似序列)，“-”表示缺失(空位)。包含空位的基因克隆AR19M-346-18的β-木糖苷酶活性催化区域与Fervidobacterium gondwanense的GH3木糖苷酶表现出76％的序列一致性。

<7>基因表达及β-木糖苷酶蛋白的纯化

序列确认后，具有目标基因的质粒通过热休克法导入蛋白质表达用大肠杆菌。转化用感受态细胞使用了Champion pET Directional TOPO表达试剂盒(生命技术(LifeTechnologies)社制)中附带的BL21Star(DE3)菌株。将具有目标基因的大肠杆菌接种到含有100mg/L氨苄青霉素的LB培养基中，培养至OD₆₀₀＝0.2～0.8左右之后，添加IPTG(异丙基-β-D(-)-硫代吡喃半乳糖苷)，进一步培养5～20小时，由此进行目标蛋白质的诱导表达。培养后，进行离心分离回收大肠杆菌，添加培养液的1/10体积的50mM Tris-HCl缓冲液(pH8.0)进行悬浊。然后，使用超声波破碎装置astrason3000(MISONIX社制)，重复7～8次破碎5分钟-暂停5分钟的步骤，得到含有目标蛋白质的基因重组大肠杆菌的粗提物。上述基因重组大肠杆菌粗提物用过滤器(孔径Millipore社制)过滤，将所得滤液作为基因重组大肠杆菌破碎上清液。

将上述基因重组大肠杆菌破碎上清液填充(load)到用50mM Tris-HCl缓冲液(pH8.0)平衡的离子交换柱HiTrap Q HP(GE医疗社制)中，用中高压液相色谱系统AKTAdesign(GE医疗社制)，在含有1M NaCl的50mM Tris-HCl缓冲液(pH8.0)中以0～50％的浓度梯度对蛋白质进行分级。将具有β-木糖苷酶活性的级分收集混合后，通过离心式超滤膜VIVASPIN20(Sartorius stedim社制)与含有750mM硫酸铵的50mM Tris-HCl缓冲液(pH8.0)进行溶液交换。将溶液交换后的β-木糖苷酶活性级分填充到以相同溶液平衡的疏水相互作用分离柱HiTrap Phennyl HP(GE医疗社制)中，通过50mM Tris-HCl缓冲液(pH8.0)以0～100％的浓度梯度对蛋白质进行分级。将具有β-木糖苷酶活性的级分收集混合后，用VIVASPIN20浓缩到液量为8mL左右。将所浓缩的样本添加到由含有150mM NaCl的50mMTris-HCl缓冲液(pH8.0)平衡的凝胶过滤柱Hiload26/60superdex200pg(GE医疗社制)中，使柱子体积的1～1.5倍体积的相同缓冲液以2～3mL/分钟的流速流过来进行分级。将具有β-木糖苷酶活性的级分收集混合后，通过VIVASPIN20进行与1mM磷酸缓冲液(pH6.8)的溶液交换与浓缩，填充到以相同缓冲液平衡的羟磷灰石柱CHT5-1(伯乐社制)中，通过400mM磷酸缓冲液(pH6.8)以0～100％的浓度梯度对蛋白质进行分级。将具有β-木糖苷酶活性的级分收集混合后，进行与50mM Tris-HCl缓冲液(pH8.0)的溶液交换和浓缩，得到终浓度约3.5mg/mL的纯化酶。

通过SDS-PAGE分析对基因重组大肠杆菌破碎上清液和纯化酶进行了确认。对于5μg基因重组大肠杆菌破碎上清液和0.5μg纯化酶，分别以使含有2-巯基乙醇的试剂缓冲液的4倍浓缩液成为1倍的方式混合，然后在95℃处理4分钟之后，用10％的标准TGX免染预制胶(伯乐(Bio-Rad)社制)进行电泳。电泳结束后，通过ChemiDoc(伯乐社制)使蛋白质的条带可视化。

图2中示出了由导入有AR19M-346-18基因的转化大肠杆菌制备的基因重组大肠杆菌破碎上清液和由上述基因重组大肠杆菌破碎上清液纯化而成的纯化酶的SDS-PAGE分析结果。泳道1为蛋白质量标准，泳道2为基因重组大肠杆菌破碎上清液，泳道3为纯化酶的电泳图案。结果，在上述基因重组大肠杆菌破碎上清液(泳道2)中，确认到在由氨基酸序列(序列号1)预测的质量附近的强条带，在纯化酶(泳道3)中，确认到对应于上述条带的单一条带(图中的箭头)。

<8>以PNPX为底物的β-木糖苷酶活性测定(PNPX水解活性)

在β-木糖苷酶活性测定中，使用PNPX作为底物。将PNPX(Sigma社制)溶于水，将调整为3.4mM的溶液(下面有时称为“3.4mM的PNPX水溶液”)用作底物溶液。另外，以下实验中使用的PNPX底物溶液全都使用了通过上述方法制备的3.4mM的PNPX水溶液。

对AR19M-346-18基因编码的酶蛋白(AR19M-346-18)的PNPX水解活性进行了研究。具体而言，将100μL 3.4mM的PNPX水溶液、50μL 200mM醋酸缓冲液(pH6.0)、20μL在上述<7>中得到的基因重组大肠杆菌破碎上清液或用水将纯化酶(3.5mg/mL)稀释为10ng/μL的纯化酶溶液、以及30μL纯化水构成的混合液在30～100℃反应20分钟。在整个测算过程中，添加纯化水替代基因重组大肠杆菌破碎上清液或纯化酶，将以相同条件反应的混合液作为对照区。另外，底物溶液和酶(基因重组大肠杆菌破碎上清液或纯化酶)在反应温度下分别各自保温5分钟后进行混合，开始反应。反应中的任何混合液均用恒温混匀器(ThermoMixer，Eppendorf社)设定为特定的温度。反应结束后，向各混合液添加等量的0.2M Na₂CO₃溶液并进行搅拌，使反应停止，然后进行离心，得到上清液。上清液中的对硝基苯酚含量是用分光光度计测算420nm的吸光度，使用预先制作的对硝基苯酚含量与420nm吸光度的校准曲线进行计算，由与对照区的差求得通过酶的水解生成的对硝基苯酚含量。以1分钟生成1μmol对硝基苯酚的酶活性为1U，除以蛋白质量得到的值为比活性(U/mg)。此外，各个测算通过3次独立的试验进行，求得平均值和标准误差(standard errors)。

结果，在使用基因重组大肠杆菌破碎上清液和使用纯化酶的两种情况下均确认到具有β-木糖苷酶活性(PNPX水解活性)。

<9>AR19M-346-18的底物特异性

对于AR19M-346-18基因编码的酶蛋白(AR19M-346-18)，研究其相对于各种纤维素底物及半纤维素底物的水解活性。测算使用了在上述<7>中得到的纯化酶(3.5mg/mL)被水稀释为10ng/μL的纯化酶溶液。此外，作为底物，使用了PNPX(Sigma社制)、PNPG(Sigma社制)、PSA、Avicel粉末、CMC(Sigma社制)、木聚糖(来源于榉木，Sigma社制)、地衣多糖(MPBiomedicals社制)、海带多糖(来源于掌状海带，Sigma社制)。

PSA是通过Avicel粉末(微晶纤维素粉末，Merck社制)一溶解到磷酸溶液后即添加灭菌蒸馏水(purified water)而析出，然后对其进行清洗直至pH达到5以上而制备的。另外，以下实验中使用的PSA全都是通过上述方法制备的。

具体而言，首先，作为反应液，将由50μL 200mM的醋酸缓冲液(pH6.0)、20μL纯化酶溶液(10ng/μL)和30μL纯化水构成的混合液在70℃预温育5分钟后，进一步添加100μL各底物溶液(PSA、Avicel粉末、CMC、木聚糖、地衣多糖和海带多糖为1质量％水溶液，PNPX和PNPG为3.4mM水溶液)，所得混合液在70℃温育20分钟(以Avicel粉末为底物时为2小时)，由此进行酶促反应。在以PSA、avicel粉末或木聚糖为底物的情况下，在反应中，为了防止不溶性底物的沉淀，利用恒温混匀器(ThermoMixer，Eppendorf社制)对混合液进行1400rpm的振荡来对其进行搅拌。

反应结束后，在以PNPG或PNPX为底物的反应中，以与上述<8>的研究AR19M-346-18的PNPX水解活性时相同的方式，测定反应后的混合液的上清液的420nm的吸光度，计算通过水解生成的对硝基苯酚含量，求得比活性(U/mg)。在以PSA、Avicel粉末、CMC、木聚糖、地衣多糖或海带多糖为底物的反应中，反应结束后，添加等量的3,5-二硝基水杨酸试剂(DNS溶液)在100℃进行5分钟热处理，冷却5分钟后，在25℃下，以15.000rpm进行5分钟的离心，得到上清液。上清液中的还原糖含量是用分光光度计测算540nm的吸光度，使用由葡糖糖制作的校准曲线(以木聚糖为底物时为由木糖制作的校准曲线)进行计算，由与对照区的差求得通过酶的水解生成的还原糖含量。以1分钟生成1μmol还原糖(Reduced Sugar)的酶活性为1U，除以蛋白质量得到的值为比活性(U/mg)。

各个测算通过3次独立的试验进行，求取平均值和标准误差。测定结果示于图3中。结果，AR19M-346-18表现出对于PNPX的高分解活性。对于PNPG也表现出了分解活性。另一方面，对于其他底物，几乎没有表现出分解活性。

<10>以PNPX为底物的β-木糖苷酶活性的pH及温度依赖性

对AR19M-346-18基因编码的酶蛋白(AR19M-346-18)的PNPX水解活性的温度依赖性及pH依赖性进行了研究。测算中使用了在上述<7>中得到的纯化酶(3.5mg/mL)被水稀释为10ng/μL的纯化酶溶液。

纯化的AR19M-346-18的PNPX水解活性的pH依赖性的测定除了将由100μL 3.4mM的PNPX水溶液、50μL McIlvaine缓冲液(pH3～8)、50μL醋酸缓冲液(pH3.5～6)或50μL磷酸缓冲液(pH6～8)、30μL纯化水和20μL纯化酶溶液(10ng/μL)构成的混合液在70℃反应20分钟之外，以与上述<8>相同的方式进行，求得因酶的水解生成的对硝基苯酚含量，算出PNPX水解活性(U/mg)。

纯化的AR19M-346-18的PNPX水解活性的温度依赖性的测定除了使反应温度为30、40、50、60、65、70、75、80、85、90、95或100℃来进行之外，以与上述<8>相同的方式进行，求得因酶的水解生成的对硝基苯酚含量，算出PNPX水解活性(U/mg)。

测算结果示于图4和图5中。图4为以温度为横轴表示各温度的纯化酶AR19M-346-18的PNPX水解活性(pH6.0)的测算结果的图，图5为以pH为横轴表示各pH的纯化酶AR19M-346-18的PNPX水解活性(70℃)的测算结果的图。图5中，分别以“MB”表示使用McIlvaine缓冲液(pH3～8)时的结果，以“SAB”表示使用醋酸缓冲液(pH3.5～6)时的结果，以“PB”表示使用磷酸缓冲液(pH6～8)时的结果。pH标绘出底物、缓冲液和酶的混合液的测量值。

纯化酶AR19M-346-18在80～90℃的温度范围内表现出高PNPX水解活性(图4)。表现出最高活性的最适温度(T_opt)是在pH6.0时为85℃。将酶反应温度设为95℃以上时，纯化酶AR19M-346-18的PNPX水解活性急剧降低。

此外，纯化酶AR19M-346-18在反应温度70℃下、pH4.0～8.0的范围内表现出PNPX水解活性。纯化酶AR19M-346-18特别是在70℃、pH6时表现出最高的PNPX水解活性。

<11>利用差示扫描荧光测定法(Differential scanning fluorimetry)进行的β-木糖苷酶的热稳定性测定

差示扫描荧光测定法(DSF)是使用了荧光色素和实时PCR装置的、测算蛋白质的热变性的方法之一，可以应用于各种蛋白质。SYPRO Orange等用于DSF的荧光色素在与疏水性部位结合的非极性条件下发出荧光，另一方面，在溶于水的极性条件下发光受到抑制。通常，蛋白质在其热变性温度下折叠结构发生解聚，内部的疏水性部位暴露于蛋白质表面。若此暴露的疏水性部位与SYPRO Orange结合，则通过波长470～480nm的激发光，发出在波长595nm附近具有峰的强荧光。使蛋白质溶液的温度以一定的间隔逐步升高，测算荧光强度，由此算出热解温度(＝荧光强度的变化点)。

测量中使用了在<7>中得到的纯化酶(3.5mg/mL)被水调整为1mg/mL的纯化酶溶液。

具体而言，在96孔PCR板(Multiplate 96孔板MLL-9651，伯乐社制)的孔中，加入2μL稀释100倍的SYPRO Orange(生命技术社制)、1μL浓度为1mg/mL的纯化酶、5μL 200mM磷酸缓冲液(pH6.0)、以及12μL纯化水，使各孔的容积为20μL。PCR板用平顶8联管盖(OpticalFlat 8-Cap Strips，伯乐社制)密封，使用实时PCR装置(CFX96Touch实时PCR系统，伯乐社制)，每次0.2℃，使孔的温度从30℃升高至100℃，达到目标温度后再经过10秒后，同时测算各孔的荧光强度。用波长带450～490nm的光的发光二极管(LED)激发SYPRO Orange，SYPROOrange发射光通过560～580nm范围的带通滤波器，用CCD摄像机进行荧光强度的测算，荧光强度变化以温度的函数的形式标绘。使用实时PCR所附带的分析软件CFX Manager(伯乐社制)进行数据解析。

图6中示出了由DSF法测得的AR19M-346-18酶蛋白显示的、伴随热变性而引发的SYPRO Orange的荧光强度变化。图6的上图为测量数据，图6的下图中示出了图6的上图的荧光强度变化曲线的一级微分“-d(荧光)/dt”。热变性温度(解链温度；Tm值)定义为作为温度函数的荧光强度曲线的一级微分(图6的下图的Y轴所示“-d(荧光)/dt”)的极小值。由荧光强度曲线的一级微分求得的AR19M-346-18酶蛋白的热变性温度(Tm)在pH6.0时为91.1±0.1℃(n＝3)，表现为与PNPX水解活性的最适温度T_opt＝85℃相近的值。

Claims

1.一种多肽，其仅由序列号1所示氨基酸序列构成。

2.根据权利要求1所述的多肽，其进一步具有β-葡糖苷酶活性。

3.一种多核苷酸，其仅由编码仅由序列号1所示氨基酸序列构成的多肽的碱基序列构成。

4.根据权利要求3所述的多核苷酸，所述多肽进一步具有β-葡糖苷酶活性。

5.一种表达载体，其整合了根据权利要求3或4所述的多核苷酸，在宿主细胞中可表达具有β-木糖苷酶活性的多肽。

6.一种转化体，其导入有根据权利要求5所述的表达载体。

7.根据权利要求6所述的转化体，其为真核微生物。

8.一种耐热性β-木糖苷酶的制造方法，其包括在根据权利要求6或7所述的转化体中生产耐热性β-木糖苷酶。

9.一种糖苷水解酶混合物，其包含根据权利要求1或2所述的多肽、根据权利要求3或4所述的多核苷酸编码的多肽、或者利用根据权利要求8所述的耐热性β-木糖苷酶的制造方法制得的耐热性β-木糖苷酶及至少一种其他糖苷水解酶。

10.一种木质纤维素分解产物的制造方法，其包括使含有纤维素、半纤维素及木质素的木质纤维素所形成的材料与根据权利要求1或2所述的多肽、根据权利要求3或4所述的多核苷酸编码的多肽、根据权利要求6或7所述的转化体、利用根据权利要求8所述的耐热性β-木糖苷酶的制造方法制得的耐热性β-木糖苷酶、或者根据权利要求9所述的糖苷水解酶混合物接触，由此生产木质纤维素分解产物。