CN103275955A - 一种高木糖耐受性的木糖苷酶Xyl43B及其基因和应用 - Google Patents

Abstract

本发明涉及基因工程领域，具体地，本发明涉及一种高木糖耐受性的木糖苷酶Xyl43B及其基因和应用。本发明提供了一种来源于腐质霉Humicola sp.L8的木糖苷酶Xyl43B，其氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示，且本发明提供了编码上述木糖苷酶的编码基因xyl43B。本发明的木糖苷酶的具有以下性质：高木糖耐受性（K_i值292mM），最适pH7.0，pH5.5-10.0保持稳定，最适温度50℃，在50℃具有很好的热稳定性。做为一种新型的酶制剂，可广泛用于食品、饲料、能源工业等。

Description

一种高木糖耐受性的木糖苷酶Xyl43B及其基因和应用

技术领域

本发明涉及基因工程领域，具体地，本发明涉及一种高木糖耐受性的木糖苷酶Xyl43B及其基因和应用。

背景技术

半纤维素作为植物细胞壁的主要组分，是陆生植物中仅次于纤维素的含量颇为丰富的碳水化合物，提高其生物降解性能具有深远的生物学意义，因此目前半纤维素作为可持续能源的潜在性越来越被重视。其中木聚糖是半纤维素中的代表性主要组成组分，是自然界中含量继纤维素之后的第二丰富的多聚糖，也是最容易提取、降解和利用的一类半纤维素。由于木聚糖的主链是由木糖以β-1,4糖苷键连接形成，侧链上被各种不同的取代基所修饰，其降解需要主链水解酶和支链水解酶的协同作用。所以对木聚糖的彻底降解以实现生物转化需要一个完善的木聚糖酶系，主要包括主链酶木聚糖酶和β木糖苷酶（β-xylosidase或β-D-xyloside xylohydrolase EC3.2.1.37），侧链水解酶α-l-阿拉伯呋喃糖苷酶，α-葡萄糖醛酸，乙酰木聚糖酯酶等辅酶。

其中，β-木糖苷酶是一种外切酶，主要催化水解木糖苷和以外切方式从非还原性末端水解木二糖及木二糖以上的低聚木糖，水解产物为木糖。木聚糖类半纤维素酶解时一般由木聚糖酶从主链内部先作用于长链木聚糖的糖苷键上，将木聚糖随机切成不同链长的低聚木糖，再由β-木糖苷酶作用于低聚木糖的末端，将这些短链低聚木糖降解成木糖，其关键性作用不容忽视。

β-木糖苷酶可与木聚糖酶协同作用将木聚糖彻底分解，所以包括β-木糖苷酶在内的木聚糖酶系已在多个领域具有广泛应用：在能源工业中，工农业废弃物中的木聚糖可被木聚糖酶系转化为木糖，而木糖又可被细菌及真菌转化成酒精等有价值的燃料；在医药行业中，木聚糖酶系水解特定底物可产生在医药行业具有重要应用价值的中间转化产物；在造纸工业的纸浆漂白中，β-木糖苷酶与木聚糖酶协同作用可以有效提高漂白性能。鉴于木聚糖酶系具有如此广泛而重要的用途，人们对其中的木聚糖酶进行了系统的研究，但β-木糖苷酶却未得到足够重视。

众所周知，木糖是β-木糖苷酶的一种强抑制剂，这是一种竞争性抑制。β-木糖苷酶将低聚木聚糖降解为木糖或协助木聚糖酶将木聚糖降解为木糖的过程中，随时间增加，终产物木糖的产量也增加，当积累到一定量时，就会使酶促反应速率降低并抑制反应的继续进行。一般不同来源的β-木糖苷酶的木糖耐受性都是极低的，尤其是真菌仅能耐受2-10mM的木糖，因此，高木糖耐受性的β-木糖苷酶在半纤维素全降解过程中有的巨大潜在应用价值。本发明中纤维素酶Xyl43B具有以下性质：最适pH7.0，在pH5.5～10.0范围内具有80%以上的酶活力，最适温度50℃，并且具有很高的木糖耐受性，与中性木聚糖酶具有很好协同效应，能有效提高木聚糖的降解效率。这些优良特性使其在生物能源工业应用上具有很大的潜力。因此，开发新型的高木糖耐受性的β-木糖苷酶将对推动β-木糖苷酶在各种工业中应用。

发明内容

本发明的目的是提供一种能高效应用的高木糖耐受性的木糖苷酶。

本发明的再一目的是提供编码上述高木糖耐受性的木糖苷酶的基因。

本发明的另一目的是提供包含上述基因的重组载体。

本发明的另一目的是提供包含上述基因的重组菌株。

本发明的另一目的是提供一种制备上述高木糖耐受性的木糖苷酶的基因工程方法。

本发明的另一目的提供上述高木糖耐受性的木糖苷酶的应用。

本发明从腐质霉Humicola sp.L8中分离得到一种新的高木糖耐受性的木糖苷酶Xyl43B。

本发明提供了一种耐高温木糖苷酶Xyl43B，其氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示。

SEQ ID NO.1：

MPQVRNPILPGFNPDPSILRVGEDYYIATSTFEWYPGVQIHHSRDLANWELVARPLNRKSQLDMRGNPDSCGIWAPCLSHDGERFWLVYTDVKRKDGSFKDTPNYIVTAEKIEGPWSDPIYINSSGFDPSLFHDDDGRKWFVNMLWDHRRRPQLFEGIVLQEFDPKAGKLVGPRKNIFTGTDLALVEGPHLYKRNGWYYLLTAEGGTGYEHACTFARSRNIWGPYEVHPQKYILTSKDHPHAALQRAGHGDIVDTPDGRTYLVHLTGRPTTQFRRCVLGRETAIQEAYWGDDDWLYVKNGPVPSLWVDLPAARDDTKYWEEKRYTFESGLHKDFQWLRTPETDRIFRTREDGKLTLIGRESIGSWFEQALVARRQTHFSCDAETVIDFSPEDQRQFAGLTAYYCRYNFFYLAVSAHSDGQRELFIMASEASWPLGELRYPVPEGVRIPNEGKVRLALTIRGRELQFYYALEGEELKKIGPVLDASIVSDECGGHQKHGSFTGAFVGVAASDLNGTAAEATFDYFIYRPVQHPSDRYEI

其中，该酶包括539个氨基酸，无信号肽序列。

本发明的木糖苷酶Xyl43B具有好的木糖耐受性而且在常温下在中性的范围内均具有高活性。本发明筛选到腐质霉Humicola sp.L8所产生的木糖苷酶，其最适pH值为7.0，在pH6.0～7.5的范围内维持60%以上的酶活性；最适温度为50℃，在35～55℃仍具有50％以上的酶活力；木糖浓度达292mM时仍有50%以上的酶活力。

本发明提供了编码上述高木糖耐受性的木糖苷酶的基因Xyl43B。具体地，该基因的基因组序列如SEQ ID NO.2所示：

atgccccaagtccgtaaccctatcctgccgggcttcaatccggacccctccatcctccgggtgggcgaggattactacattgctacgtcgacgttcgaatggtatcccggtgtccaaattcaccactcgcgcgaccttgccaactgggaactggtcgcgcggcccctgaaccgcaaaagccaacttgatatgcgcggaaacccagacagctgcggcatctgggcaccctgtctgagccacgacggtgaaaggttttggctggtctacaccgatgtgaagcgcaaggatggctcgttcaaggatactcccaactacatagtgacggcggaaaagatcgagggtccttggtcagatcccatctacatcaactcatccggcttcgacccgtccctcttccacgatgacgacggtcgcaagtggttcgtcaacatgctgtgggaccaccgccggcggccacaactctttgaaggcattgttctacaggagttcgatcccaaagccggcaagctcgtgggtccgcgcaagaacatctttaccggcacagacttggccctcgtcgagggtcctcacttgtacaagcgcaacggttggtactacctcctgaccgcggagggcggtacggggtacgagcacgcgtgcacgtttgcgcggtcgcgcaatatttggggcccctacgaagttcacccacaaaagtacatcctgacgtccaaggaccacccgcacgcggcgctgcagcgcgccggccacggtgacatcgttgacacgccagacggtcgcacgtacctggtgcacctcacagggcggccgaccacgcagttccggcggtgcgtgcttggccgcgagacggccatccaagaggcgtactggggcgacgatgactggctgtacgtcaagaacggccccgtgcccagtctctgggtcgacctgcccgcggcccgcgacgacaccaagtactgggaggagaagcgctacacgttcgagtccgggctgcacaaggacttccagtggctgcggacacccgagacagaccgcatcttccggacgcgggaggacggaaagctcaccttgatcggtcgcgagagcatcggctcgtggtttgaacaggctctggtcgcacgccgccaaacacatttctcgtgcgacgccgagacggtcattgacttctccccggaggaccagcgccagtttgcgggactgacagcgtactactgccgatacaacttcttttacttggcagtgagcgctcactcggacggccagcgcgaactgttcatcatggcttccgaggcgtcttggcccctcggtgagctgcgctacccagtccctgagggcgtacggatcccgaacgaagggaaggttcgcctggccttgacgatcaggggaagggagttgcagttctattacgccctcgaaggcgaggagctcaagaagatcggaccggtcctcgacgcgagcatcgtgtcggacgagtgcggaggtcatcagaagcacggcagcttcacgggcgcctttgttggcgttgctgcgtcggacctgaatggcaccgctgctgaggccacgttcgactactttatttataggccagtccagcacccgagcgatcgctatgagatttga

本发明通过PCR的方法分离克隆了木糖苷酶Xyl43B，DNA全序列分析结果表明，木糖苷酶xyl43B全长1617bp。。

成熟蛋白理论分子量为62kDa，将木糖苷酶Xyl43B序列及推导出的氨基酸序列在GenBank中进行BLAST比对，确定Xyl43B是一种新的木糖苷酶。

本发明还提供了包含上述木糖苷酶Xyl43B的重组载体，优选为pPET28a-xyl43B。将本发明的木糖苷酶基因插入到表达载体合适的限制性酶切位点之间，使其核苷酸序列可操作的与表达调控序列相连接。作为本发明的一个最优选的实施方案，优选为将本发明的木糖苷酶基因插入到质粒pPET-28a(+)上的NdeI和HindIII限制性酶切位点之间，得到重组表达质粒pPET28a-xyl43B。

本发明还提供了包含上述高木糖耐受性的木糖苷酶Xyl43B的重组菌株，优选所述菌株为大肠杆菌、酵母菌、芽孢杆菌或乳酸杆菌，优选为重组菌株BL21/xyl43B。

本发明还提供了一种制备高木糖耐受性的木糖苷酶Xyl43B的方法，包括以下步骤：

1)用上述的重组载体转化宿主细胞，得重组菌株；

2)培养重组菌株，诱导重组木糖苷酶表达；

3)回收并纯化所表达的木糖苷酶Xyl43B。

其中，优选所述宿主细胞为大肠杆菌细胞，优选将重组原核表达质粒转化大肠杆菌BL21(DE3)，得到重组菌株BL21/xyl43B。

本发明还提供了上述木糖苷酶Xyl43B的应用。

本发明首先所要解决的技术问题是克服现有技术的不足，提供一种性质优良的、适合于在饲料、食品工业中应用新的木糖苷酶。本发明的木糖苷酶具有高的木糖耐受性，抑制常数达292mM。其最适pH为7.0，最适温度50℃。在pH6.0～7.5都有较高的酶活性；pH稳定性好。本木糖苷酶适用于饲料工业，可与木聚糖酶协同作用，有效消除或降低因粘度增加而引起的抗营养作用。在酿酒工业中，可有效降解可溶性和不可溶性的阿拉伯木聚糖，有效降低麦芽汁的粘度提高过滤效率澄清啤酒。另外，在白酒、清酒的酿造中有助于增加酿酒过程中萜烯醇的浓度，增加香味。因此，本木糖苷酶在食品工业中的应用显示出其巨大的潜力。

附图说明

图1：在大肠杆菌中表达的重组木聚糖酶的SDS-PAGE分析，其中，M:低分子量蛋白质Marker；2:通过镍柱纯化的达到电泳纯的Xyl43B蛋白。

图2重组木糖苷酶的最适pH。

图3重组木糖苷酶的pH稳定性。

图4重组木糖苷酶的最适温度。

图5重组木糖苷酶的热稳定性。

图6重组木糖苷酶的木糖耐受性。

具体实施方式

试验材料和试剂

1、菌株及载体：本发明从腐质霉Humicola sp.L8中分离得到一种新的高木糖耐受性的木糖苷酶Xyl43B。大肠杆菌表达载体pPET-38(a)及菌株Ecoli BL21(DE3)购自于Invitrogen公司。

2、酶类及其它生化试剂：内切酶购自TaKaRa公司，连接酶购自Invitrogen公司。p-nitrophenyl-a-L-xylopyranoside(pNPX)、微晶纤维素购自Sigma公司，其它都为国产分析纯试剂（均可从普通生化试剂公司购买得到）。

3、培养基：

（1）腐质霉Humicola sp.L8培养基为：麸皮，15.0g/l；微晶纤维素，30.0g/l；氮源粉，8.0g/l；玉米浆，10.0g/l；(NH₄)₂SO₄，5.0g/l;KH₂PO₄，1.0g/l；KCl，0.5g/l；MgSO₄·7H₂O，0.5g/l；CaCl₂，0.1g/l；FeSO₄·7H₂O，0.01g/l。通过1:1(w/w)的NaOH调整pH值为7.5。

（2）大肠杆菌培养基LB(1%蛋白胨、0.5%酵母提取物、1%NaCl,pH7.0)。

说明：以下实施例中未作具体说明的分子生物学实验方法，均参照《分子克隆实验指南》（第三版）J.萨姆布鲁克一书中所列的具体方法进行，或者按照试剂盒和产品说明书进行。

实施例1腐质霉Humicola sp.L8木糖苷酶编码基因xyl43B的克隆

提取腐质霉Humicola sp.L8基因组DNA：

将液体培养3天的菌体离心后放入研钵中,加入2mL提取液，研磨5min,然后将研磨液置于50mL离心管中，65℃水浴锅裂解20min，每隔10min混匀一次,在4℃下10000rpm离心5min。取上清于酚/氯仿中抽提除去杂蛋白,再取上清加入等体积异丙醇,于室温静置5min后,4℃下10000rpm离心10min。弃上清,沉淀用70%的乙醇洗涤两次,真空干燥,加入适量TE溶解,置于-20℃备用。

设计43家族木糖苷酶基因的表达引物P1，P2

P1:5'-GGGCATATGCCCCAAGTCCGTAACCCTATCC-3'；

P2:5'-GGGAAGCTTTCAGAATCTCATAGCGATCGCTCGGG-3'。

以Humicola sp.L8总DNA为模板进行PCR扩增。PCR反应参数为：94℃变性5min；然后94℃变性30sec，60℃退火30sec，72℃延伸2min，30个循环后72℃保温10min。得到一约1.6kb片段，将该片段回收后与pEASY-T3载体相连送三博远志生物技术有限公司测序。

测序显示木糖苷酶Xyl43B基因全长1617bp，编码538个氨基酸和一个终止密码子。用SignalP(http://www.cbs.dtu.dk/services/SignalP)进行分析表明该基因无信号肽。预测该基因所编码的成熟蛋白的理论分子量为62kDa，实际成熟蛋白为52kDa左右（图1）。

实施例2重组木糖苷酶的制备

将表达载体pPET-28a进行双酶切(Ecoli I+Not I)，同时将编码木糖苷酶的基因xyl43B双酶切(NdeI+HindIII)，切出编码成熟木糖苷酶的基因片段与表达载体pPET-28a连接，获得含有木糖苷酶基因xyl43B的重组质粒pPET-xyl43B并转化大肠杆菌BL21(DE3)，获得重组大肠杆菌菌株BL21/xyl43B。

取含有重组质粒的BL21菌株，接种于300mL LB(50μg/mL的卡那霉素)培养液中，37℃220rpm振荡培养2～3h(OD₆₀₀达到0.6)后，加入终浓度0.6mM IPTG在30℃180rpm诱导5～8h。重组木糖苷酶表达量为4.7U/mL。SDS-PAGE结果(图1)表明，重组木糖苷酶在大肠杆菌中得到了表达。所表达的木聚糖酶经过纯化之后，其蛋白质的含量达到总蛋白的95％以上。重组木聚糖的比活为1.7U/mg。

实施例3重组木糖苷酶的活性分析

木糖苷酶活性的测定：在405nm下测定酶水解底物pNPX生成的产物p-nitrophenol的量。反应步骤：250μL2mM pNPX底物与150μL缓冲液混匀，加入100μL适当稀释的酶液，于50℃反应10min，加入1.5mL1M Na2CO3终止反应，于405nm处测定OD值。

实施例4重组木糖苷酶的性质测定

1、重组木糖苷酶Xyl43B的最适pH和pH稳定性的测定方法如下：

将纯化的重组木糖苷酶在不同的pH下进行酶促反应以测定其最适pH。底物木聚糖用不同pH的0.1mol/L柠檬酸-磷酸氢二钠缓冲液中50℃下进行活力测定。结果(图2)表明，重组酶Xyl43B的最适pH为7.0，在Ph6.0～7.5有60%以上的相对酶活性。木糖苷酶于上述各种不同pH的缓冲液中37℃处理60min，再在pH7.0缓冲液体系中50℃下测定酶活性，以研究酶的pH耐性。结果(图3)表明酶在pH5.5-10.0之间均很稳定，在此pH范围内处理60min后剩余酶活性在50%以上，这说明此酶在宽泛的pH范围内具有较好的pH稳定性。

2、木糖苷酶的最适温度及热稳定性测定方法如下：

木糖苷酶的最适温度的测定为在柠檬酸-磷酸氢二钠缓冲液(pH7.0)缓冲液体系及不同温度下进行酶促反应。耐温性测定为木糖苷酶在不同温度下处理不同时间，再在50℃下进行酶活性测定。酶反应最适温度测定结果(图4)表明其最适温度为50℃。酶的热稳定性性试验表明(图5)，Xyl43B有良好的热稳定性，在50℃下温育1h，酶活几乎不丧失。

3、木糖苷酶的K_m值测定方法如下：

用不同浓度的pNPX为底物，在柠檬酸-磷酸氢二钠缓冲液(pH7.0)缓冲液体系中，50℃下测定酶活性，计算出其在50℃下的K_m值。经测定，K_m值为1.29mM，最大反应速度V_max为2.18μmol/min/mg。

4、不同金属离子化学试剂对木糖苷酶酶活的影响测定如下：

在酶促反应体系中加入不同浓度的不同的金属离子及化学试剂，研究其对酶活性的影响，各种物质终浓度为5mmol/L。在50℃、pH7.0条件下测定酶活性。结果表明，大多数离子和化学试剂EDTA在浓度为5mmol时重组木糖苷酶的活力没有明显变化。但是Cu²⁺，Co³⁺，Ni²⁺，Zn²⁺，Ag⁺，SDS和β-巯基乙醇强烈抑制其活力。而Mn²⁺和Pb²⁺有明显得促进作用（表1）。

表1.各种化学试剂对木糖苷糖酶Xyl43B活力的影响

5、木糖苷酶的木糖耐受性

在酶促反应体系中加入不同浓度的木糖，使其终浓度范围为0-400mM，在50℃、pH7.0条件下测定酶活性。结果表明，当木糖浓度为400mM时仍有43.8%的相对剩余酶活（图6）。通过计算得出该木糖苷酶的抑制常数为292mM。

6、木糖苷酶与中性木聚糖酶的协同作用

取适量的木糖苷酶与同菌来源的10家族中性木聚糖酶(XynA)按不同组合协同作用于桦木、榉木两种底物。协同作用实验又分为同时作用和连续作用。前者是指将木糖苷酶与木聚糖酶一起与底物反应；后者是先加入一种酶与底物反应，反应一定时间后灭活，再加入第二种酶进行反应。利用DNS法测定两种底物产生的还原糖的量，见表2。协同作用度的定义是协同作用产生的总还原糖与每一种酶单独作用于底物时生成还原糖总和的比值。结果发现木糖苷酶与木聚糖酶具有明显的协同作用，协同效率最高为两种酶混合作用，先加木聚糖酶后加木糖苷酶也具有一定的协同作用。

表2木糖苷酶与中性木聚糖酶的协同作用

Claims (8)

1.一种木糖苷酶Xyl43B，其特征在于，其氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示。

2.一种木糖苷酶基因xyl43B，其特征在于，编码权利要求1所述的木糖苷酶Xyl43B。

3.根据权利要求2所述的木糖苷酶基因xyl43B，其特征在于，其碱基序列如SEQID NO.2所示。

4.包含权利要求2所述木糖苷酶基因xyl43B的重组载体。

5.包含权利要求2所述木糖苷酶基因xyl43B的重组菌株。

6.根据权利要求5的重组菌株，其特征在于，其所述菌株为大肠杆菌。

7.一种制备高木糖耐受性的木糖苷酶Xyl43B的方法，其特征在于，包括以下步骤：

1)用权利要求4的重组载体转化宿主细胞，得重组菌株；

2)培养重组菌株，诱导重组木糖苷酶表达；

3)回收并纯化所表达的木糖苷酶Xyl43B。

8.权利要求1所述木糖苷酶Xyl43B的应用。

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