JP6332584B2 - Acremoniumcellulolyticus(アクレモニウム・セルロリティカス)由来のβ−グルコシダーゼ及びその利用 - Google Patents
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Description
項1.
下記の(a)又は(b)のポリヌクレオチド:
(a)配列番号1又は2の塩基配列を有するポリヌクレオチド;
(b)配列番号1又は2の塩基配列と90%以上の同一性を有し、且つ、β−グルコシダーゼ活性を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチド。
項2.
下記の(A)〜(E)のいずれかのポリペプチド:
(A)配列番号3のアミノ酸配列を有するポリペプチド;
(B)配列番号3のアミノ酸配列において第1位〜第18位の全部又は一部アミノ酸残基が欠失したアミノ酸配列を有するポリペプチド;
(C)配列番号3のアミノ酸配列において第734位〜第812位のアミノ酸残基の全部又は一部が欠失したアミノ酸配列を有するポリペプチド;
(D)配列番号3のアミノ酸配列において、1又は数個のアミノ酸が置換、欠失、挿入及び/又は付加されたアミノ酸配列を有し、且つ、β−グルコシダーゼ活性を有するポリペプチド;及び
(E)上記(A)〜(C)のポリペプチドのアミノ酸配列と90%以上の同一性を有し、且つ、β−グルコシダーゼ活性を有するポリペプチド。
項3.
項2に記載のβ−グルコシダーゼ、並びに、エンドグルカナーゼ及びエキソグルカナーゼから成る群より選択される1種以上から成る群より選択される1種以上のセルラーゼを含む、セルロース糖化用組成物。
項4.
項1に記載のポリヌクレオチドを含むベクター。
項5.
項4に記載のベクターで形質転換された形質転換体。
項6.
宿主が、大腸菌、酵母、放線菌、又は糸状菌である、項5に記載の形質転換体。
項7.
酵母が、サッカロミセス属、ハンゼヌラ属、ピキア属、又はScheffersomyces属に属する、項6に記載の形質転換体。
項8.
糸状菌が、アクレモニウム属、トリコデルマ属、Hypocrea属、アスペルギルス属、フミコーラ属、ペニシリウム属、Talaromyces属、クリスポリウム属、又はMyceliophthaora属に属する、項6に記載の形質転換体。
項9.
項5〜8のいずれかに記載の形質転換体を培養する工程を含む、β−グルコシダーゼ活性を有するポリペプチドの製造方法。
項10.
項9に記載の方法によって製造されるβ−グルコシダーゼ。
項11.
項1又は10に記載のβ−グルコシダーゼ及びセルラーゼを、セルロースを含む試料に作用させる工程を含む、糖の製造方法。
ポリヌクレオチドは、(a)配列番号1又は2の塩基配列を有するポリヌクレオチド、或いは(b)配列番号1又は2の塩基配列と90%以上の同一性を有し、且つ、β−グルコシダーゼ活性を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチドであることが好ましい。
ポリペプチドは、下記の(A)〜(E)のいずれかであることが好ましい。
(A)配列番号3のアミノ酸配列を有するポリペプチド
(B)配列番号3のアミノ酸配列において第1位〜第18位の全部又は一部アミノ酸残基が欠失したアミノ酸配列を有するポリペプチド
(C)配列番号3のアミノ酸配列において第734位〜第812位のアミノ酸残基の全部又は一部が欠失したアミノ酸配列を有するポリペプチド
(D)配列番号3のアミノ酸配列において、1又は数個のアミノ酸が置換、欠失、挿入及び/又は付加されたアミノ酸配列を有し、且つ、β−グルコシダーゼ活性を有するポリペプチド
(E)上記(A)〜(C)のポリペプチドのアミノ酸配列と90%以上の同一性を有し、且つ、β−グルコシダーゼ活性を有するポリペプチド。
Bgl3-S及びBgl3-Lは、いずれもエンドグルカナーゼ及びエキソグルカナーゼを含む他のリグノセルロースの糖化に使用される酵素と共に使用されることにより、他の酵素の活性を賦活化し、全体としての糖化活性を相乗的に高める性質を有する。よって、このような観点からも、Bgl3-S及びBgl3-Lは、他の酵素と組み合わせた使用に特に適している。従って、β−グルコシダーゼは、他の酵素と組み合わされた、セルロース糖化用組成物として存在し得る。
ベクターは、上述する(a)又は(b)のポリヌクレオチドを含むことが好ましい。ベクターは、(a)又は(b)のポリヌクレオチドを発現可能な状態で含む限り、他のタンパク質をコードするポリヌクレオチドを更に含んでいてもよい。
形質転換体は、上記組換えベクターで形質転換され、それを発現可能な状態で保持していることが好ましい。形質転換に使用される宿主細胞は、上述する(a)又は(b)のポリヌクレオチドを発現することにより、β−グルコシダーゼを産生できる限り特に制限されず、原核細胞及び真核細胞のいずれでも良い。具体的には、エシェリヒア・コリ等の大腸菌(例えば、HB101、MC1061、JM109、CJ236、MV1184等)、コリネバクテリウム・グルタミカム等のコリネ型細菌、ストレプトミセス属細菌等の放線菌、バチルス・サブチリス等のバチルス属細菌、ストレプトコッカス属細菌、スタフィロコッカス属細菌等の原核細胞;サッカロミセス属、バンゼヌラ属、ピキラ属、Scheffersomyces属、及びクルイベロマイセス属等の酵母、アスペルギルス属、ペニシリウム属、Myceliophtaora属、Hypocrea属、Talaromyces属、クリスポリウム属、トリコデルマ属及びアクレモニウム属等の糸状菌;ドロソフィラS2、スポドプテラSf9、カイコ培養細胞等の昆虫細胞;並びに植物細胞等を挙げることができる。枯草菌、酵母、麹菌、放線菌等のタンパク質分泌能を利用して、ポリペプチドを培地中に生産させることもできる。Bgl3-S及びBgl3-Lという2種類のβ−グルコシダーゼを発現させるという観点から好ましい宿主は、アクレモニウム属、ペニシリウム属、及びTalaromyces属に属する微生物であり、より好ましくはアクレモニウム属に属する微生物である。
上記の形質転換体を培養し、培養物からβ−グルコシダーゼ活性を有するポリペプチドを回収することにより、β−グルコシダーゼを製造することができる。培養は、宿主に適した培地を用いて継代培養又はバッチ培養を行うことができる。また、培養は、形質転換体の内外に生産されたポリペプチドの活性を指標にして、適当量得られるまで実施することができる。
β−グルコシダーゼを単独又は他の酵素との組合せでセルロースを含む試料(即ち、リグノセルロース系バイオマス)に作用させることにより、セルロースを分解し、グルコースに糖化することができる。上述の通り、本発明のβ−グルコシダーゼは、エンドグルカナーゼ及びエキソグルカナーゼを含む他のセルロースと組み合わせて使用することにより、それらの活性を賦活化し、全体的な糖化活性を相乗的に高めることが可能である。よってβ−グルコシダーゼは、他の酵素との組み合わせで試料に作用させることが、効率的な糖化を実現するという観点から好ましい。尚、β−グルコシダーゼは、活性を発揮し得る限り、単離精製されたものであっても、粗精製されたものであっても、培養上清のような精製処理されていない状態であっても、組換え微生物の状態であっても良い。好適な一実施形態においては、本発明のβ−グルコシダーゼを産生するように、本発明のポリヌクレオチドで形質転換された微生物(形質転換体)が、そのまま使用される。当該形質転換体は、上述するような他の酵素も同時に産生する能力を有することが好ましい。
アクレモニウム・セルロリティカスCF-2612株を特開2008-271927に記載の方法でセルロースパウダーを炭素源として培養し、培養液を遠心して上澄み液を得た。上澄み液を20 mM 2-(N-morpholino) ethanesulfonic acid(MES) 緩衝液 (pH 6.5)で平衡化したHiprep 26/1脱塩カラム(GE ヘルスケア製)で脱塩した。脱塩溶液を同緩衝液で平衡化したSource 15Q陰イオン交換カラム(GE ヘルスケア製)に供し、0.5 M塩化ナトリウムを含む同緩衝液にてグラジエント溶出を行い、β-グルコシダーゼ活性及びエキソグルカナーゼ活性の両方を有する画分を得た。得られた画分に最終濃度が1.2 Mになるように硫酸アンモニウムを加え、1.2 M硫酸アンモニウムを含む20 mM酢酸ナトリウム緩衝液 (pH 5.5)で平衡化したSource 15ISO疎水性相互作用カラム(GE ヘルスケア製)に供し、硫酸アンモニウムを含まない20 mM酢酸ナトリウム緩衝液 (pH 5.5)にてグラジエント溶出を行ったが、依然としてβ-グルコシダーゼ活性及びエキソグルカナーゼ活性の両方を有する画分が得られた。また、本画分中の両活性は、Source 15ETH疎水性相互作用カラム(GE ヘルスケア製)、及びSource 15PHE疎水性相互作用カラム(GE ヘルスケア製)を用いても分離することが出来なかった。即ち、当該画分に存在するβ-グルコシダーゼ及びエキソグルカナーゼの疎水相互作用やイオン的な相互作用は殆ど同じであることが判明した。更に、Superdex 75ゲル濾過カラム(GE ヘルスケア製)によっても両者を分離することは出来なかった。以上のように、種々の手法によりβ−グルコシダーゼとエキソグルカナーゼとを容易に分離することはできなかった。
Bgl3-Sをポリアクリルアミドゲル内でトリプシン消化し、得られたペプチド断片をTOF-MSを用いて解析した。ペプチド断片の分子量は、Mascot Search法を用いてアクレモニウム・セルロリティカスのゲノム情報に基づいて解析した。その結果、Bgl3-Sの内部配列に相当する7種類のペプチド断片(LDDMVTR(配列番号4)、HYIGNEQELNR(配列番号5)、 LSLAAGASGTATFDLTR(配列番号6)、WVVPSGAFTVYVGASSR(配列番号7)、TLHELYLWPFADAVR(配列番号8)、YANPVTAFPAGTNAGMTWDR(配列番号9)、QASDYGTAVVSGSDNYPEGLFIDYR(配列番号10)に相当することが明らかになった。これらの内部アミノ酸配列及びアクレモニウム・セルロリティカスのゲノム情報から、Bgl3-Sは配列番号1の塩基配列を有するポリヌクレオチドによってコードされることが判明した。
Bgl3-Sの各種基質に対する活性を調べた。即ち、2量体から6量体のセロオリゴ糖に酵素を作用させたところ、いずれの場合もグルコースを生成した。また、p−ニトロフェニル−β−D−グルコピラノシド(以下pNPG)にBgl3-Sを作用させたところ、グルコースを生成した。pNPG分解活性は、pH約4.0〜 6.0において高い活性を有し、バイオマス糖化に適した多くのセルラーゼの作用最適pHと同じpH 5.0で最も高い活性を示した(図2の菱形凡例)。pNPG分解活性における至適温度は、約40〜55℃であった。Bgl3-SのpNPGを基質とした場合の活性(U)を、1 min間に1 μmolのpNPGを生成する酵素量として決定した。45℃、pH 5.0にて反応させた時の酵素の比活性(U/mg蛋白質量)は、52.2 U/mgであった。
上記(1)と同様に、アクレモニウム・セルロリティカスCF-2612株を特開2008-271927に記載の方法に従ってセルロースパウダーを炭素源として培養した。培養液を遠心して上澄み液を得た。この上澄み液を20 mM 2-(N-morpholino) ethanesulfonic acid(MES) 緩衝液 (pH 6.5)で平衡化したHiprep 26/1脱塩カラム(GE ヘルスケア製)で脱塩した。脱塩溶液を同緩衝液で平衡化したSource 15Q陰イオン交換カラム(GE ヘルスケア製)に供し、0.5 M塩化ナトリウムを含む同緩衝液にてグラジエント溶出を行い、β-グルコシダーゼ活性のみを有する画分を得た。得られた画分に最終濃度1.2 Mになるように硫酸アンモニウムを加え、1.2 M硫酸アンモニウムを含む20 mM酢酸ナトリウム緩衝液 (pH 5.5)で平衡化したSource 15ISO疎水性相互作用カラム(GE ヘルスケア製)に供し、硫酸アンモニウムを含まない20 mM酢酸ナトリウム緩衝液 (pH 5.5)にてグラジエント溶出を行った。その結果、SDS-ポリアクリルアミド電気泳動分析によって電気泳動的に単一な精製β-グルコシダーゼ(以下Bgl3-L)を含む画分(図3)を得た。図3からBgl3-Lの分子量は、86,000と推定された。また、TSKgel G3000SWXLサイズ排除クロマトグラフィーカラム(東ソー製)を用いたHPLC分析により、Bgl3-Lは、分子量92,000の単量体酵素と見積もられた。このように、Bgl3-Lは、上記Bgl3-Sと明らかに異なる分子量を有することが判明した。
Bgl3-Lの各種基質に対する活性を調べた。即ち、2量体から6量体のセロオリゴ糖に酵素を作用させたところ、いずれの場合もグルコースを生成した。また、pNPGにBgl3-Lを作用させたところ、グルコースを生成した。pNPG分解活性は、pH約4.0〜 6.0において高い活性を有し、バイオマス糖化に適した多くのセルラーゼの作用最適pHと同じpH 5.0で最も高い活性を示した(図2の丸型凡例)。pNPG分解活性における至適温度は、約40〜55℃であった。Bgl3-Lの変性温度は、66℃であった。Bgl3-LのpNPGを基質とした場合の活性(U)を、1 min間に1 μmolのpNPを生成する酵素量として決定した。45℃、pH 5.0にて反応させ時の酵素の比活性(U/mg蛋白質量)は、27.0 U/mgであった。以上から、上記(1)で得られたBgl3-SとBgl3-Lとは、多くの酵素特性が共通するが、分子量及びpNPGを基質とした場合の比活性が大きく異なることが判明した。即ち、Bgl3-Sは、Bgl3-Lの約2倍の比活性を有する。
特開2008-271927に記載の方法でアクレモニウム・セルロリティカスCF-2612株からセルラーゼを製造し、これに、精製Bgl3-S、Bgl3-L及び市販β-グルコシダーゼ(Novozyme 188)のいずれかを添加して酵素混合液を調製した。水熱前処理を施した農産廃棄物由来のリグノセルロース基質に酵素混合液を作用させ、酵素糖化性を比較した。糖化反応条件は以下の通りである。2%(w/v)の基質に対し、基質1gあたり2.5 mgのセルラーゼ及び0.1 mgの上記いずれかのβ-グルコシダーゼを混合し、45℃、pH 5.0で24時間反応させた後に生成したグルコース及びセロビオースを高速液体クロマトグラフィーによって測定した(図4左)。
上記(4)で精製したBgl3-L をポリアクリルアミドゲル内でリジルエンドペプチダーゼ消化し、得られたペプチド断片のN-末配列を分析することにより、Bgl3の内部配列を8アミノ酸残基決定した。決定されたアミノ酸配列は、GLGVHVQL(配列番号11)であった。この内部アミノ酸配列及び既に独自に同定しているアクレモニウム・セルロリティカスCF-2612株のゲノム情報からBgl3-Lをコードする塩基配列を同定した。驚くべきことに、同定したBgl3-Lをコードする塩基配列は、上記(2)で同定したBgl3-Sをコードする2633bpの塩基配列(配列番号1)と同一であった。即ち、Bgl3-LとBgl3-Sとは、同じ遺伝子によってコードされることが判明した。Bgl3-Sは、遺伝子の発現からタンパク質として菌体外に分泌されるまでの間にアミノ酸配列の一部が切除され、結果としてBgl3-Lとは異なる性質を獲得したものと考えられる。
Bgl3-S及びBgl3-Lをコードする遺伝子を発現させる発現プラスミドを構築するため、特許4257759号に記載のセルロースで誘導されるセロビオヒドロラーゼ遺伝子のプロモーター領域の1376 bpを含むDNA断片を、アクレモニウム・セルロリティカスCF-2612株のゲノムDNAを鋳型としてPCR反応により増幅させた。以下の2種類のオリゴヌクレオチドをプライマーとして用いた。
プライマー1:5’-ATTGAATTCGGAAAGTATTTAAGCTTGGAAGC(配列番号12)
プライマー2:5’-TATGATATCTGTGTCGATTGCTTCTGACTGTTGC(配列番号13)
プライマー3:5’-TTTGATATCCTGCAGGAGAATTACCGGGGTAGGATATG(配列番号14)
プライマー4:5’-TAAGTCGACTCGACTGATTACTAATCGTTTGATAG(配列番号15)
プライマー5:ATTGTTAACAGAATGTATTCCGCATTTCTTTTGC(配列番号16)
プライマー6:AATCCTGCAGGCTATTGTAGGCATTGAGAATACCATT(配列番号17)
C-311株又はCF-2612株からセルラーゼ(培養上清)を取得し、これらを用いて希硫酸前処理した農産廃棄物を基質として酵素糖化性を評価した。糖化反応条件は以下の通りである。3%(w/v)の基質に対し、基質1gあたり3 mgの酵素を加えて45℃、pH 5.0で24時間保温した。糖化反応終了後に生じたグルコースをグルコースセンサーによって測定した。その結果、C-311株由来のセルラーゼは、CF-2612株由来のセルラーゼに比較して基質1gあたり生成するグルコース量が30%増加することが示された(図5)。
Claims (5)
- 下記の(a)又は(b)のポリヌクレオチドを含むベクターで形質転換された形質転換体を培養する工程(1):
(a)配列番号1又は2の塩基配列を有するポリヌクレオチド;
(b)配列番号1又は2の塩基配列と90%以上の同一性を有し、且つ、β−グルコシダーゼ活性を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチド;及び
工程(1)で得られた培養物から、SDS-PAGEによって測定した分子量が約86kDaであるポリペプチド及び約69kDaであるポリペプチドを別個に単離する工程(2)
を含む、β−グルコシダーゼ活性を有するポリペプチドの製造方法。 - セルラーゼの活性を高めるための、下記の(A)〜(D)のいずれかのポリペプチドの使用
:
(A)配列番号3のアミノ酸配列を有するポリペプチド;
(B)配列番号3のアミノ酸配列において第1位〜第18位の全部又は一部アミノ酸残基が欠失したアミノ酸配列を有するポリペプチド;
(C)配列番号3のアミノ酸配列において第734位〜第812位のアミノ酸残基の全部又は一部が欠失したアミノ酸配列を有するポリペプチド;
(D)上記(A)〜(C)のポリペプチドのアミノ酸配列と90%以上の同一性を有し、且つ、β−グルコシダーゼ活性を有するポリペプチド。 - 形質転換体の宿主が、大腸菌、酵母、放線菌、又は糸状菌である、請求項1に記載の方法。
- 酵母が、サッカロミセス属、ハンゼヌラ属、ピキア属、又はScheffersomyces属に属する、請求項3に記載の方法。
- 糸状菌が、アクレモニウム属、トリコデルマ属、Hypocrea属、アスペルギルス属、フミコーラ属、ペニシリウム属、Talaromyces属、クリスポリウム属、又はMyceliophthaora属に属する、請求項3に記載の方法。
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