MX2013008766A - Celobiohidrolasa mutante. - Google Patents

Abstract

La invención se refiere a una celobiohidrolasa mutante, que es una mutante de la SEQ ID NO: 1, que tiene una sustitución en la posición N247 (I, F, H, W) de la SEQ ID NO: 1, caracterizada por que la celobiohidrolasa mutante tiene una identidad de secuencia de al menos 50% con la SEQ ID NO: 1 y caracterizada por que la celobiohidrolasa mutante tiene actividad CEHI.

Description

CELOBIOHIDROLASA MUTANTE CAMPO DE LA INVENCIÓN La invención se refiere a nuevas celobiohidrolasas mutantes y a celobiohidrolasas que comprenden composiciones que tienen actividad CBHI mejorada. Específicamente, la presente invención se refiere a una familia de celobiohidrolasas de hongos y bacterias que está relacionada con la CBH-I producida por Talaromyces emersonii , que tiene determinadas mutaciones.

ESTADO DE LA INVENCIÓN Las celulasas son enzimas que pueden realizar la hidrólisis de los enlaces beta-D-glucosídicos en celulosas. Las enzimas celulolíticas se han dividido tradicionalmente en tres principales clases: endoglucanasas , exoglucanasas o celobiohidrolasas y beta-glucosidasas (Knowles, J. et -al., (1987), TIBTECH 5, 255-261); y se sabe que una gran cantidad de bacterias, levaduras y hongos las producen.

Entre las aplicaciones principales que $ han desarrollado para el uso en las enzimas celulolítica!s se encuentran las que implican la degradación de la pulpa de celulosa (madera) en azúcares para la producción de (bio)etanol, tratamientos textiles como 'lavado a la piedra' y "biopulido" y en composiciones de detergentes.

Por tanto, se ha demostrado que las celulasas son eficaces en muchos procesos industriales. Por consiguiente, ha habido una tendencia en el campo para investigar composiciones de celulasa especificas o componentes que tengan perfiles de rendimiento particularmente eficaces con respecto a una o más aplicaciones especificas. Desde éste punto de vista, las celulasas producidas (expresadas) en hongos y bacterias han sido objeto de atención. Por ejemplo, se ha prestado mucha atención a las celulasas producidas por determinados hongos tales como Tríchoderma 1 spp. (especialmente Tríchoderma longibrachiatum) porque mediante procesos de fermentación se produce fácilmente, en grandes cantidades, un sistema completo de celulasa capaz de degradar formas cristalinas de celulosa. Esta compleja celulasa especifica se ha analizado ampliamente para determinar la naturaleza de sus componentes específicos y la capacidad de estos componentes para funcionar en procesos industriales. Por ejemplo, Wood et al., "Methods in Enzymology", 160, 25, páginas 234 y posteriores (1988), desvelan que los sistemas completos de celulasas fúngicas comprenden diversas clasificaciones enzimáticas diferentes incluyendo ¦' las identificadas como exo-celobiohidrolasas (EC 3,2.1.91) ( "CBH" ) , endoglucanasas (EC 3.2.1.4) ( "EG" ) , y. :beta-glucosidasas ( EC 3.2.1.21) ("BG"). Las clasificaciones de celulasas fúngicas de CBH, EG y BG pueden expandirse adicionalmente para incluir múltiples componentes dentro de cada clasificación. Se ha propuesto alguna modificación genética de CBH-I . S. P. Voutilainen, P. G. Murray, M. G. Tuohy y A. Koivula, Protein Engineering, Design and Selection, páginas 1-11,2009, desvelan la expresión de la celobiohidrolasa CEL7A de Talaro yces emersonii en Saccharomyces cerevisiae y la mutagénesis lógica para mejorar su termoestabilidad y actividad. En esta divulgación la N54C/P191C mutante mostró termoestabilidad aumentada y actividad mejorada kcat 35,9 min-1 (tabla II). Sin embargo esta actividad es aún relativamente baja. " : El documento WO2010/122141 desvela una CBH-I de Talararomyces emersonii y polinucleótidos que codifican la CBH-I y células que incorporan estos polinucleótidos. En el presente documento la secuencia de aminoácidos de la CBH-I del documento WO2010/122141 se proporciona como SEQ jlD NO: 1.

A pesar del conocimiento en la técnica relacionado con muchas composiciones de celulasa que tienen aplicaciones en algunas o en todas las áreas anteriores, existe una necesidad continua de nuevas composiciones de celulasa que , enga actividad mejorada en condiciones de conversión de 1 ignocelulosa . Por lo tanto existe una necesidad de mejorar la actividad CBH-I existente, en solitario o en combinación con otras celulasas.

DESCRIPCIÓN DE LA INVENCIÓN Un ob eto de la invención es proporcionar nuevas CBH-I variantes o composiciones de celulasa similares a CBH-I que tengan actividad CBH-I mejorada.

La actividad CBHI se mide como se describe en los ejemplos. Otro objeto de la invención es proporcionar una nueva CBH-I variante o composiciones de celulasa similares a CBH-I que tengan rendimiento mejorado en condiciones de estrés térmico.

Otro objeto de la invención es proporcionar una nueva CBH-I variante o celulasa similar a CBH-I que contenga composiciones que proporcionen excelente rendimiento ' éfi la degradación de material biológico, tal como lignocelulosa .

Otro objeto de la invención es proporcionar una: nueva CBH-I variante o una composición de celulasa similar a CBH-I que tenga características mejoradas para la reducción de biomasa, como un aditivo en pienso animal, en el procesamiento del almidón y en aplicaciones de horneado.

Uno o más de estos objetos se consiguen de acu rdo con la invención. De acuerdo con la presente invención, se proporciona una celobiohidrolasa mutante, que es una matante de la SEQ ID NO: 1, que tiene una sustitución en la posición N247 (I,F,H,W) de la SEQ ID NO: 1, en que la celobiohidrolasa mutante tiene una identidad de secuencia de al menos 50% con la SEQ ID NO: 1, y en que la celobiohidrolasa mutante tiene actividad CBHI .

En una realización, la mutante tiene la sustitución N247F. En otra realización, la mutante tiene la sustitución N247H.

BREVE DESCRIPCIÓN DEL LISTADO DE SECUENCIAS SEQ ID NO: 1 SEQ ID NO: 1 expone la secuencia de aminoácidos de la CBH-I de Talaromyces emersoníí, conocida como SEQ ID NO: 1 en el documento WO2010/122141.

SEQ ID NO: 2 La SEQ ID NO: 2 expone la secuencia señal para la celobiohidrolasa de la SEQ ID NO: 1. 1 1 SEQ ID NO: 3 La SEQ ID NO: 3 expone la secuencia de ADN de CBH-I (EBA205) .

DESCRIPCIÓN DETALLADA DE LA INVENCIÓN A lo largo de la presente memoria descriptiva y en las reivindicacoines adjuntas, las palabras "comprende" e "incluye" y variaciones tales como "que compende", "comprendiendo", "que incluye" e "incluyendo" deben interpretarse de manera inclusiva. Es decir, estas palabras pretenden transmitir la posible inclusión de otros elementos o números enteros no específicamente mencionados, cuantío el contexto lo permita. En el presente documento, los artículos "un", "una" y "uno" se usan para referirse a uno (a) o a más de uno (a) (es decir, a uno ( a ) o al menos uno ( a ) ) del objeto gramatical del articulo. Como ejemplo, "un elemento" puede significar un elemento o más de un elemento.

La celobiohidrolasa mutante de acuerdo con la invención, que es una mutante de la SEQ ID NO: 1, tiene una sustitución en la posición N247 ( I, F, H, ) de la SEQ ID NO: 1, en que la celobiohidrolasa mutante tiene una identidad de secuencia de al menos 50% con la SEQ ID NO: 1 y en que la celobiohidrolasa mutante tiene actividad CBHI .

En una realización, la mutante tiene la sustitución N247F. En otra realización, la mutante tiene la sustitución N247H.

En una realización adicional, la CBH-I tiene, en solitario o en combinación con las mutaciones previamente mencionadas, una sustitución o deleción en una posición correspondiente a uno o más de los residuos F445, 163, G357, S36, D77 y/o Q232. Las mutaciones en estas posiciones pueden ser una sustitución de C, P, G, A, V, L, I, M, F, , Y, H, S, T, N, Q, D, E, K, R o una deleción. En una realización adicional de la misma, la mutante tiene una o más dé las siguientes sustituciones: F445I, 163N, G357R, S36E, D77M y/o Q232A.

En otra realización, la celobiohidrolasa mutante¦ tiene , en solitario o en combinación con las mutaciones previamente mencionadas, una sustitución o deleción en una posición correspondiente a uno o más residuos T52, V101, S192, T198, T344, D345, A375 o A376 de la SEQ ID N0:1. Las mutaciones en estas posiciones pueden ser una sustitución de C, P, G, A, V, L, I, M, F, W, Y, H, S, T, N, Q, D, E, , R o una deleción. En una realización adicional de la misma, la mutante tiene una o más de las siguientes sustituciones: T52 (G,M,Y,D,H, ,R) , V101 (T, I, F, H) , SI 92 (A, I , F, Q, H) , T198(A,C,V,P,D,H), T246 ( G, A, Y, N , H ) , N247 ( G, E1, W) , T344 (A,S,C,L,I,Y,W) , D3 6 ( P, F, G, R ) , A375 ( G, I , W, Y, H, , R ) y/o A376 ( T, V, L, Y, W, D) . En una realización de la misma, la mutante tiene una o más de las sustituciones: T52(M,D,R), V101(t,F), S192F, T198A, N247F, T344(C,L), A375(Y,H), preferentemente A375H y/o A376D.

En otra realización, la celobiohidrolasa mutante tiene, en solitario o en combinación con las mutaciones previamente mencionadas, una sustitución o deleción en una posición correspondiente a uno o más de los residuos A6, T7, L34,' V41, Y47, T48, S99, V144, S171, L177, N194, N195, A196,. 1200, S205, T243, Y244, S245, Y249, P255, Q337, D343, H350, V367, D372, T393 y/o V396. : : : En el presente documento, la celobiohidrolasa (EC 3.2.1.91) es cualquier polipéptido que pueda catalizar la hidrólisis de enlaces 1, 4-p-D-glucosidicos en celulosa o celotetraosa, liberando la celobiosa de los extremos no reductores de las cadenas. Esta enzima también puede denominarse celulasa 1 , 4-p-celobiosidasa, 1,4-ß-celobiohidrolasa , 1 , 4 -ß-D-glucan celobiohidrolasa , avicelasa, exo-1, 4-p-D-glucanasa, exocelobiohidrolasa o exoglucanasa . En el presente documento la abreviatura de la "celobiohidrolasa" es "CBH". En el presente documentó la abreviatura de la celobiohidrolasa-I es "CBH-I". La abreviatura de la "celobiohidrolasa mutante" es "CBH mutante" o mutante. Un "polinucleótido CBH mutante" es, en el presente documento, un polinucleótido que codifica la CBH Mutante.

En la CBH Mutante, la identidad de secuencia con 1$ SEQ ID NO: 1 es de al menos 50%, al menos 60%, al menos 70%, al menos 75%, al menos 80%, al menos 85%, al menos 90%, ai tríenos 91%, al menos 92%, al menos 93%, al menos 94%, al menos 95%, al menos 96%, al menos 97%, al menos 98%, al menos el 99%.

En el presente documento las mutaciones se : indican mediante aminoácidos de una letra y las posiciones de estos aminoácidos. Por ejemplo, en el presente documento, A6 indica un aminoácido (un código de letra) en una determinada posición en la SEQ ID NO:l, en este caso A (Alanina)1 en la posición 6 de la proteína. A6 ( L/N/Q/G/V/ I/Y/S/E/K) indica, en este caso, la mutación del aminoácidos en una determinada posición, en este caso A (Alanina) en la posición 6 dé la proteína se intercambia por cualquiera de L (Leucina), N ( Asparagina ) , Q (Glutamina), G (Glicina), V (Valifta), I ( Isoleucina ) , Y (Tirosina), S (Serina), E (ácido Glutámico) o K ( Lisina ) .

Una CBH Mutante de la invención puede tener una o más actividades alternativas y/o adicionales distintas de las de la actividad de la celobiohidrolasa, por ejemplo una dé las otras actividades celulasa mencionadas en lo sucesivo en el presente documento.

Una CBH Mutante de acuerdo con la invención puede modificar un material de hidrato de carbono modificando química o físicamente dicho material. La modificación química del material de hidrato de carbono puede dar como resultado la degradación de dicho material, por ejemplo1, : por hidrólisis, oxidación u otra modificación química al, como mediante la adición de una liasa. La modificación físi a ha de ir, o no, acompañada de modificación química.

La mutante puede tener una o más de las siguientes actividades enzimáticas o una composición enzimática que comprenda la enzima CBH mutante de acuerdo con la invención que puede comprender una o más de las siguientes enzimas: Endo-1 , 4 -ß-glucanasas (EG) y exo-celobiohidrolasas : (CBH, por ejemplo CBH-I o CBH-II) que catalizan la hidrólisis de celulosa insoluble a celooligosacáridos (celobiasa como un producto principal), mientras que la ß-glucosidasas (BG) convierten los oligosacáridos, principalmente celobiosa y celotriosa a glucosa. Las actividades enzimáticas EG, CBH, BG, xilanasa y pectinasa pueden ser actividades de la CBH Mutante o actividades presentes en otros constituyentes de la composición peptidica que comprenda la CBH Mutante.

Xilanasas, que junto con otras enzimas accesorias, por ejemplo, cc-L- arabinofuranosidasas , feruloil y acetilxilan esterasas, glucuronidasas y ß- xilosidasas catalizan la hidrólisis de hemicelulosas .

Pectinasas, por ejemplo una endo poligalacturonasa , una pectin metil este.rasa, una endo-galactanasa, una' beta galactosidasa , una pectin acetil esterasa, una endo-pectin liasa, pectato liasa, alfa ramnosidasa, una : : exo-galacturonasa , una exo-poligalacturonato liasa, . , una ramnogalacturonan hidrolasa, una ramnogalacturonan li$óa, una ramnogalacturonan acetil esterasa, una ramnogalacturonan galacturonohidrolasa, una xilogalacturonasa, ' ? a-arabinofuranosidasa . , : ¡ Como se expone anteriormente, una CBH Mutante [ de la invención tendrá típicamente actividad celobiohidrolasa;. Sin embargo, una CBH Mutante de la invención puede tener una o más de las actividades expuestas anteriormente además de o alternativas a esta actividad. Además, una composición CBH Mutante de la invención, como se describe en el presente documento, puede tener una o más de las actividades mencionadas anteriormente además de la proporcionada por la celobiohidrolasa mutante de la invención que tiene actividad celobiohidrolasa o estas actividades pueden estar presentes en una composición enzimática que comprenda la enzima CBH mutante de la invención.

Secuencias de polinucleotidos Con la CBH Mutante y su secuencia de aminoácidos como se desvela en el presente documento, el experto puede determinar polinucleotidos adecuados que codifiquen la CBH Mutante .

Por lo tanto, la invención proporciona secuencias de polinucleotidos que comprende el gen que codifica ! la CBH Mutante, asi como su secuencia codificante. ; Los polinucleótidos de la invención pueden aislarse o sintetizarse. Los polinucleótidos sintéticos .pueden prepararse usando sintetizadores de polinucleótidos automáticos disponibles en el mercado.

Los polipéptidos CBH Mutantes y los polinucleótidos CBH Mutantes del presente documento pueden ser polipéptidos , polinucleótidos sintéticos, respectivamente. En los polinucleótidos sintéticos puede optimizarse el uso ^ de codones, preferentemente de acuerdo con los métodos descritos en los documentos WO2006/077258 y/o PCT/EP2007/055943, incorporados por referencia en el presente documento* El documento PCT/EP2007/055943 aborda la optimización con pares de codones .

El término se refiere a una molécula de polinucleótidos, que es una molécula de ácido ribonucleico (ARN) o de ácido desoxirribonucleico (ADN), monocatenario o bicatenario. Un polinucleótido puede estar presente en forma aislado, o estar comprendido en moléculas de ácido nucleico recombinante o' vectores, o estar comprendido en una célula hospedadora.

La palabra "polipéptido" se usa en el presente documento para cadenas que contienen más de siete residuos de aminoácidos. Todas las fórmulas o secuencias de oligopéptidos y polipéptidos del presente documento se describen de derecha a izquierda y la dirección desde el extremo amino al extremo carboxilo. El código de una letra de los aminoácidos usados en el presente documento es comúnmente conocido en la técnica.

Por polipéptido o proteína "aislado (a)" se entiende un polipéptido o una proteína retirado (a) de su medio pat,ural . Por ejemplo, los polipéptidos y las proteínas producidos de manera recombinante expresados en células hospedadoras se consideran aislados para los fines de la invención ya que son polipéptidos naturales o recombinantes que se han purificado sustancialmente mediante cualquier técnica adecuada tal como, por e emplo, el método de purificación de una sola , etapa desvelado en Smith y Johnson, Gene 67: 31-40 (1988) .

Los polinucleotidos de la presente invención, tales como un polinucleótido que codifica la CBH Mutante, pueden aislarse o sintetizarse usando técnicas convencionales de biología molecular y la información de secuencia proporcionada en el presente documento.

El polinucleótido que codifica la CBH Mutante de la invención puede amplificarse usando ADNc, ARNm o, como alternativa, ADN genómico, como un molde y cebadores oligonucleotidicos apropiados de acuerdo con técnicas convencionales de amplificación por PCR. El ácido nucleico amplificado de esta manera puede clonarse en un ; vector apropiado y caracterizarse por análisis de secuencia dé ADN.

Transformación Los polinucleotidos de acuerdo con la invención pueden expresarse en un hospedador adecuado. Por lo tanto 1 riüeden usarse técnicas de transformación convencionales. ; : Adicionalmente, la invención se refiere a ; una construcción de ácido nucleico que comprende' el polinucleotido como se ha descrito anteriormente, por ejemplo, un vector.

Por tanto, otro aspecto de la invención se refiere a vectores, incluyendo vectores de clonación y expresión, que comprenden un polinucleotido de la invención que codifica una proteina CBH o un equivalente funcional de la misma y a métodos de cultivo, transformación o transfección de dichos vectores en una célula hospedadora adecuada, por ejemplo, en condiciones en las que se produce la expresión de una1 CBH-I de la invención. Como se usa en el presente documentó, el término "vector" se refiere a una molécula de ácido nucleico que puede transportar otro ácido nucleico al cual se ha unido .

Los polinucleotidos de la invención pueden incorporarse en un vector replicable recombinante, por ejemplo, un vector de clonación o expresión. El vector puede usarse ' para replicar el ácido nucleico en una célula hospedadora compatible. Por tanto, en una realización adicional, la invención proporciona un método para fabricar los polinucleotidos de la invención introduciendo un polinucleotido de la invención en un vector replicable, introduciendo el vector en una célula hospedadora compatible y cultivando la célula hospedadora en condiciones en . las que se realice la replicación del vector. El vector, puede recuperarse de la célula hospedadora. A continuación se describen células hospedadoras adecuadas.

Los expertos en la técnica apreciarán que el diseñó del vector de expresión puede depender de factores tales cómo la elección de la célula hospedadora que va a transformarse, el nivel de expresión de la proteína deseada, etc. Los vectores, tales como los vectores de expresión de la invención, pueden introducirse en células hospedadoras para producir de esta manera proteínas o péptidos, codificados por ácidos nUpl icos como se describe en el presente documento (por ejemplo, proteínas CBH, formas mutantes de proteínas CBH, fragmentos, variantes o equivalentes funcionales de los mismos). Los vectores, tales como los vectores de expresión recombinantes de la invención, pueden diseñarse para la expresióh de proteínas CBH en células procariotas o eucariotas.

Por ejemplo, las proteínas CBH pueden expresarse en células bacterianas tales como E. coli, células de ¡insecto (usando vectores de expresión baculovirus ) , .' 'hongos filamentosos, células de levadura o células de mamíféró. En Goeddel, Gene Expression Technology: Methods ín Enzymology 185, Academic Press, San Diego, CA (1990) se analizan. células hospedadoras adecuadas. A continuación, en el presente documento, se describen e emplos representativos de hospedadores apropiados .

En la técnica se conocen medios y condiciones de cultivo apropiados para las células hospedadoras descritas anteriormente.

Para la mayoría de los hongos filamentosos y levaduras, el vector o construcción de expresión se integra preferentemente en el genoma de la célula hospedadora para obtener transformantes estables. Sin embargo, , para determinadas levaduras también puede disponerse de ectores episomales adecuados en los que puede incorporarse la construcción de expresión para una expresión estable y a alto nivel, como ejemplos de los mismos se incluyen vectores derivados de los plásmidos 2µ y p Dl de Saccharomyces y Kluyveromyces, respectivamente, o vectores que contienen una secuencia AMA (por ejemplo, AMAl de Aspergillus) . En el, caso de integrar las construcciones de expresión en el genoma de las células hospedadoras, las construcciones se integrán en locus al azar en el genoma, o en un locud diana predeterminado usando recombinación homologa, en cuyo caso el locus diana comprende preferentemente un gen altamente espesado. : Por consiguiente, los vectores de expresión útiles en la presente invención incluyen vectores cromosomales , episomales y derivados de virus, por ejemplo, vectores derivados de plásmidos bacterianos, bacteriófagos, elementos episomales de levaduras, cromosomales de levadura, virus tales como baculovirus, papovavirus, virus de la vacuna, adenovirus, virus de la viruela, virus de la pseudorrabia y retrovirus y vectores derivados de combinaciones de los mismos, tales como los derivados de elementos genéticos de plásmidos y bacteriófagos, tales como cósmidos y fagémidos .

Cuando el polipéptido de acuerdo con la invención Va a secretarse en el medio de cultivo a partir de la célula hospedadora, al polipéptido se le puede añadir una secuencia señal apropiada para dirigir el polipéptido sintetizado de nuevo en la vía de secreción de la célula hospedadora. El experto en la materia sabe como seleccionar una secuencia señal apropiada para un hospedador especifico.

El vector puede incluir adicionalmente secuencias que flanquean al polinucleotido que dan lugar a ARN que comprende secuencias homologas a las secuencias genómicas eucariotas o secuencias genómicas virales. Esto permitirá la introducción de polinucleótidos de la invención en el genoma de una célula hospedadora . ; „ , Un vector de clonación integrador puede integrarse al azar u en un locus diana predeterminado en el cromósofra (o cromosomas) de la célula hospedadora en la que se va a integrar.

El sistema vectorial puede ser un solo vector, tal como un solo plásmido, o dos o . más vectores, tal como dos o más plásmidos, que en su conjunto contienen el ADN total a introducir en el, genoma de la célula hospedadora.

El vector puede contener un polinucleótido de la invención orientado en una dirección antisentido para proporcionar la producción de ARN antisentido.

El ADN vectorial puede introducirse en células procariotas o eucariotas mediante técnicas de transformación o de transfección convencionales. Como se usa en el presente documento, los términos "transformación" y "transfección" pretenden referirse a una diversidad de técnicas reconocidas en la técnica para introducir ácido nucleico extraño (por ejemplo, ADN) en una célula hospedadora, incluyendo co-precipitación con fosfato de calcio o cloruro de calcio, transfección mediada por DEAE-dextrano, transducción, infección, lipofección, transfección mediada por libidos catiónicos o electroporación . En Sambrook, et al. (Molecular Cloning: A Laboratory Manual, segunda, 2a ed, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor Laboratory Press,, Cold Spring Harbor, Nueva York, 1989), Davis et al, Basic Metthods in Molecular Blology (1986) y en otros manuales de laboratorio, pueden encontrarse métodos adecuados para transformar o transfectar células hospedadoras. . , Como se ha indicado anteriormente, la invención proporciona un polipéptido aislado que tiene la secuencia de aminoácidos de acuerdo con la SEQ ID NO: 1, o SEQ ID NO: 2 con las mutaciones indicadas en la reivindicación 1.

La CBH mutante de acuerdo con la invención puede recuperarse y purificarse de los cultivos de células recombinantes por métodos conocidos en la técnica. Para la purificación se emplea, más preferentemente, cromatografía líquida, tal como, cromatografía líquida de alto rendimiento ("HPLC"), que puede comprender, pero sin limitación, el uso de cromatografía de intercambio iónico, cromatografía de interacción hidrófoba, cromatografía de afinidad y cromatografía de exclusión por tamaño para separar adicionalmente la CBH diana de la proteína a granel 'para permitir la recuperación de la CBH diana en un estado altamente purificado.

Los polipéptidos de la presente invención incluyen productos purificados naturalmente, productos de procedimientos sintéticos químicos y productos producidos por técnicas recombinantes a partir de un hospedador procariota o eucariota, incluyendo, por ejemplo, células de bacterias, levaduras, plantas superiores, insectos y mamíferos. Dependiendo del hospedador empleado en un procedimiento de producción recombinante, los polipéptidos de la presente invención pueden estar glucosilados o no glucosi lados .

Además, los polipéptidos de la invención también pueden incluir un resto de metionina inicial modificado o un piroglutamato, en algunos casos como resultado de procesos mediados por el hospedador. El ácido piroglutámico (conocido también como 5-oxoprolina, ácido pidólico o piroglutamato por su forma básica) es un derivado de aminoácido poco frecuente en el que el grupo amino libre del ácido glutámico se cicla para formar una lactama. Esto se encontró en muchas proteínas, incluyendo la bacteriorodopsina.

La invención también presenta fragmentos biológicamente activos de los polipéptidos de acuerdo con la invención.

También se proporcionan células hospedadoras ; que comprenden un polinucleótido o un vector de la invención. El polinucleótido puede ser heterólogo al genoma de la célula hospedadora. El término "heterólogo", normalmente con respecto a la célula hospedadora, significa que el polinucleótido no se produce de manera natural en el genoma de la célula hospedadora o que la célula no produce de , panera natural el polipéptido.

En otra realización, la invención presenta células, por ejemplo, células hospedadoras transformadas o células hospedadoras recombinantes que contienen un ácido nucleico incluido en la invención. Una "célula transformada" o "célula recombinante" es una célula en la que (o en cuyo ancestro) se ha introducido, mediante técnicas de ADN recombinante, un ácido nucleico de acuerdo con la invención. Se incluyen células tanto procariotas como eucariotas, por ejemplo, bacterias, hongos, levaduras y similares, prefiriéndose especialmente las células de hongos filamentosos, tales como Aspergí llus niger.

Puede seleccionarse una célula hospedadora que module la expresión de las secuencias insertadas, o que modifique y procese el producto génico de una manera específica deseada. Dichas modificaciones (por ejemplo, glucosilación ) y procesamiento (por ejemplo, escisión) de los productos proteicos pueden facilitar el funcionamiento óptimo de la proteína.

Diversas células hospedadoras tienen características y mecanismos específicos para el procesamiento post-traduccional y modificación de proteínas y productos génicos. Pueden seleccionarse líneas celulares o sistemas hospedadores apropiados conocidos por los expertos en la técnica de biología molecular y/o microbiología para garantizar la modificación y el procesamiento dejsegdo y correcto de la proteína extraña expresada. Con esta finalidad, pueden usarse células hospedadoras eucariótas que posean la maquinaria celular para procesar correctamente el transcrito primario, la glucosilación y la fosforilación del producto génico. Dichas células hospedadoras son muy conocidas en la técnica.

Si se desea, como se ha descrito anteriormente, en la preparación de un polipéptido de acuerdo con la invención puede usarse una célula. Dicho método comprende típicamente cultivar una célula hospedadora (por ejemplo, transformada o transfectada con un vector de expresión como se ha descrito anteriormente) en condiciones que proporcionen la expresión (por el vector) de una secuencia codificante que codifi'qúe el polipéptido, y opcionalmente, recuperar el polipéptido expresado. Los polinucleótidos de la invención pueden incorporarse en un vector replicable recombinante, por ejemplo, un vector de expresión. El vector puede usarse- para replicar el ácido nucleico en una célula hospedadora compatible. Por tanto, en una realización adicional, la invención proporciona un método para fabricar: un polinucleótido de la invención introduciendo ¦ un polinucleótido de la invención en un vector repiiqable, introduciendo el vector en una célula hospedadora compatible y cultivando la célula hospedadora en condiciones en las que se realice la replicación del vector. El vector! !puede recuperarse de la célula hospedadora.

Preferentemente el polipéptido se produce como una proteina secretada en cuyo caso la secuencia de nucleótidos que codifica una forma madura del polipéptido en la construcción de expresión está unida operativamente a una secuencia de nucleótidos que codifica una secuencia señal. Preferentemente, la secuencia señal es natural (homóloga) con respecto a la secuencia de nucleótidos que codifica el polipéptido. Como alternativa, la secuencia señal e$ ajena (heteróloga) con respecto a la secuencia de nucleótidos que codifica el polipéptido, en cuyo caso la secuencia señal es preferentemente endógena con respecto a la célula hospedadora en la que se expresa la secuencia de nucleótidos de acuerdo con la invención. Son ejemplos de secuencias señal adecuadas para células hospedadoras de levadura las secuencias señal derivadas de genes del factor a de levadura. De manera similar, una secuencia señal adecuada para céXulas hospedadoras de hongos filamentosos es, por ejemplo,; una secuencia señal derivada de un gen de amiloglucosidasa' (AG) de hongos filamentosos, por ejemplo, el gen glaA de A ni er. Este puede usarse en combinación con el propio promotor de la amiloglucosidasa (denominada también (gluco) amilasa.), asi como en combinación con otros promotores. También : pueden usarse secuencias señal híbridas con el contexto de la presente invención.

Las secuencias líder de secreción heterólogas preferidas son aquellas que se originan del gen de amiloglucosidasa (AG) de hongos {glaA, las dos versiones de 18 y 24 aminoácidos, por ejemplo, de ñspergíllus) , el gen del factor a (levaduras, por ejemplo Saccharomyces y Kluyveromyces) o el gen de : la oc-amilasa {Bacillus) .

Los vectores pueden transformarse o transíectarse en una célula hospedadora adecuada, como se ha descrito anteriormente, para proporcionar la expresión de un polipéptido de la invención. Este proceso puede comprender cultivar una célula hospedadora transformada con un vector de expresión, como se ha descrito anteriormente, en condiciones que proporcionen la expresión por el vector de una secuencia codificante que codifique el polipéptido. ¡ , En el presente documento, se utilizan técnicas convencionales de aislamiento, hibridación, transformación y clonación (como se describe, por ejemplo, en Sambrook, J. , Fritsh, EF, y Maniatis, T. Molecular Cloning: A Laboratory Manual. 2a. Ed., Cold Spring Harbor Laboratory, Cold.; Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, Nueva York, 1989) . ¦ i ; Homología e identidad Se dice que las secuencias de aminoácidos o nucleótidos son homologas cuando presentan un determinado nivel de similitud. Dos secuencias que son homologas indican un origen evolutivo común. Si dos secuencias homologas están estrechamente relacionadas o vagamente más relacionadas se indica por "porcentaje de identidad" o "porcenta e de similitud", el cual es elevado o bajo respectivamente. Aunque debatible, para indicar "porcentaje de identidad" o "porcentaje de similitud", frecuentemente se usa indistintamente "nivel de homología" o "porcentaje de homología".

Usando algoritmo matemático puede realizarse una comparación de secuencias y una determinación del porcentaje de identidad entre dos secuencias. El experto será consciente de que para alinear dos secuencias y determinar la homología entre dos secuencias se dispone de diversos programas informatizados diferentes ( ruskal, J.B. (1983) An overview of squence comparison in D. Sankoff y JB Kruskal, (ed,), Time warps, string edits and macromolecules : the theory and practice of sequence comparison, páginas 1-44 : Áddison Wesley) . El porcentaje de identidad entre dos secueriói^s de aminoácidos puede determinarse usando el algoritmo de Needleman y Wunsch para alinear dos secuencias. (Needleman, S.B. y Wunsch, C.D. (1970) J. Mol. Biol . 48, 443-453;). El algoritmo alinea secuencias de aminoácidos así, , como secuencias de nucleótidos. El algoritmo de Needlemarii-Wunsch se ha implementado en el programa informático NEEDLE. Pgra el fin de la presente invención, se usó el programa NEEDLE del paquete informático EMBOSS (versión 2.8.0 o mayor, ÉMBOSS: The European Molecular Bíology Open Software Suite (2000) Rice, P. Longden,I. y Bleasby, A. Trends in Genetics 16, (6) páginas 276-277, http: //emboss . bioinformatics . ni/ ) . Para las secuencias de proteínas, se usó EBLOSUM62 para la matriz de sustitución. Para las secuencias de nucleótidos, se usó EDNAFULL. Pueden especificarse otras matrices. Los parámetros opcionales usados para el alineamiento de secuencias de aminoácidos son una penalización de 10 por apertura de hueco y una penalización de 0,5 por extensión de hueco. El experto apreciará que todos estos diferentes parámetros producirán resultados ligeramente diferentes pero que, cuando se usan algoritmos diferentes, el porcentaje de identidad global de dos secuencias no se modifica significativamente. ; Definición de homología Global La homología o identidad es el porcentaje de coincidencias idénticas entre las dos secuencias completas a lo largo de toda la región alineada incluyendo cualquiera de los huecos o extensiones. La homología o identidad entre las dos secuencias alineadas se calcula de la siguiente; manera: número de posiciones correspondientes en el alineamiento que muestra un aminoácido idéntico en ambas secuencias dividido entre la longitud total del alineamiento incluyendo los huecos. La identidad, como se define en el presente documento, puede obtenerse a partir del programa NEEDLE y se identifica como "IDENTIDAD" en la salida del programa.

Definición de identidad más larga La homología o identidad entre las dos secuencias alineadas se calcula de la siguiente manera: número de posiciones correspondientes en el alineamiento que muestra un aminoácido idéntico en ambas secuencias dividido entré la longitud total del alineamiento después de restar el número total de huecos en el alineamiento. La identidad, como se define en el presente documento, puede obtenerse a partir del programa NEEDLE usando la opción NOBRIEF y se identifica en la salida del programa como "identidad más larga". Preferentemente, la identidad más larga se usa para Calcular la identidad. ' ; Células hospedadoras Por tanto, la invención proporciona células hospedadoras transformadas o trans fectadas con o que comprenden un polinucleótido o un vector de la invención. Preferentemente el polinucleótido está incluido en un vector para la replicación y expresión del polinucleótido. Se seleccionarán células que sean compatibles con dicho vector y podrán ser, por ejemplo, células procariotas (por ejemplo bacterianas), de hongos, levaduras o plantas.

También puede seleccionarse un hospedador heterólogo en el que se produce el polipéptido de la invención en una forma sustancialmente libre de otras enzimas degradadoras de hemicelulosa o degradadoras de celulosa. Esto , puede conseguirse seleccionando un hospedador que normalmente no produzca dichas enzimas.

La invención incluye procesos para la producción del polipéptido de la invención mediante la expresión recombinante de una secuencia de ADN que codifica el polipéptido. Para esta finalidad la secuencia de ADN de la invención puede usarse para la amplificación del gen y/o intercambio de señales de expresión, tales como promotores, secuencias señal de secreción, para permitir una producción rentable del polipéptido en una célula hospedadora homól ga o heteróloga adecuada. Una célula hospedadora homóloga es una célula hospedadora que es de la misma especie o que: es una variante dentro de la misma especie que la especie a: partir de la cual deriva la secuencia de ADN. . , Las células hospedadoras adecuadas son preferentemente microorganismos procariotas tales como bacterias o más preferentemente organismos eucariotas, por ejemplo, hongos, tales como levaduras u hongos filamentosos o céTulás de plantas. En general, se prefieren las células de levadura sobre las células fúngicas porque son más fáciles de manipular. Sin embargo, algunas proteínas se secretan mal en las levaduras o en algunos casos no se procesan adecuadamente (por ejemplo, hiperglucosilación en levaduras). En estos casos, debe seleccionarse un organismo hospedador fúngico.

La célula hospedadora puede sobreexpresar el polipéptido, y se conocen bien técnicas para modificar la sobreexpresión por ingeniería genética. El hospedador puede tener por tanto dos o más copias del polipéptido codificante (y por consiguiente el vector puede tener dos o más copias).

Las bacterias del género Bacillus son muy idóneas , como hospedadores heterólogos debido a su capacidad para secretar proteínas en el medio de cultivo. Otras bacterias idóneas como hospedadores son las de los géneros Streptotnyces y Pseudomonas . Una célula hospedadora de levadura preferida para la expresión de la secuencia de ADN que codifica el polipéptido es la de los géneros Saccharbmyces, Kluyveromyces, Hansenula , Pichia, Yarrowiü [ y Schizosaccharomyces. ; Más preferen emente una célula hospedadora de levadura se selecciona del grupo que consiste en las especies Saccharomyces cerevisiae, Kluyveromyces lacbís (también conocida como Kluyveromyces marxianus var. lactis) , Hansenula polymorpha, Pichia pastoris, Yarrowia lipolytí'tiá , y Schizosaccharomyces pombe.

Sin embargo, se prefieren más las células hospedadoras fúngicas (por ejemplo, filamentosas). Las células hospedadoras fúngicas filamentosas preferidas se seleccionan del grupo que consiste en los géneros Aspergíllus, Trichoderma / Hypocrea , Fusariu , Disporotriphu , Penicillium, Acremonium, Neurospora , ThermóaScus, Myceliophtora , Sporotrichum, Thielavia, Chryosporium, Fusarium, Humicola , Neurospora y Talaromyces . 1 1 Más preferentemente una célula hospedadora fúngica filamentosa es de las especies Aspergíllus oryzae, Aspergíllus sojae, Aspergíllus nidulans o una especie del grupo Aspergíllus niger. Estas incluyen, pero sin limitación, Aspergíllus niger, Aspergíllus awamori , Aspergíllus tubingensis, Aspergíllus aculeatus, Aspergíllus foetidus, Aspergíllus nidulans, Aspergíllus japonicus, Aspergíllus oryzae y Aspergíllus ficuum y adicionalmente consta dé las especies Trichoderma reesei / Hypocrea jacorina, Fusarium graminearum, Talaromyces emersonii, Penicillium decumbens, alabamense Acremonium, Neurospora crassa, Myceliophtora thernaophilurri , Sporotrichum cellulophilum, Dísporotiichum dimorphosporum, Talaromyces emersonii , Talaromyces stipitatus y Thielavia terrestris .

Como e emplos de hospedadores de expresión preferidos dentro del ámbito de la presente invención se encuentran los hongos tales como especies de Aspergillus, especies de Penicillium y especies de Tríchoderma; bacterias tales como especies de Bacillus, por ejemplo, Bacillus subtilis, Bacillus licheniformis, Bacillus amyloliquefaciens, especies de Pseudomonas, y levaduras tales como especies de Kluyvero yces, por ejemplo, Kluyveromyces lactís y. especies de Saccharomyces, por ejemplo, Saccharomyces cerevisiae.

Las células hospedadoras de acuerdo con la invención incluyen células vegetales y la invención por lo tanto se amplia a organismos transgénicos , tales como plantas y partes de las mismas que contienen una o más células de la invención. Las células pueden expresar el polipéptido de la invención de manera heteróloga o pueden contener de manera heteróloga uno o más de los polinucleótidos de la invención. Por tanto, en el genoma de la planta transgénica (o modificada genéticamente) puede insertarse (por ejemplo, de manera estable) una secuencia que codifique uno o más 'de los polipéptidos de la invención. La transformación de células vegetales puede realizarse usando técnicas conocidas, por ejemplo usando un plásmido Ti o un plásmido R% de Agrobacterium turnefaciens . El plásmido (o vector) puede por tanto contener secuencias necesarias para infectar una planta, y pueden emplearse derivados de los plásmidos.Ti y/o Ri.

Como alternativa, la infección directa de una parte de una planta, tal como una hoja, raíz o tallo, puede verse afectada. En esta técnica, en la planta a infectar, puede realizarse una herida, por ejemplo, cortando la planta con una cuchilla o perforando la planta con una aguja o frotando la planta con un abrasivo. Después, en la herida se inocula Agrobacterium. La planta o la parte de la planta pueden después cultivarse en un medio de cultivo adecuado y dejar que se desarrolle hasta convertirse en una planta madura. La regeneración de células transformadas en plantas modificadas genéticamente puede conseguirse usando técnicas conocidas, por ejemplo, seleccionando brotes transformados usando un antibiótico y subcultivando los brotes en un medio' que contenga los nutrientes, fitohormonas y similares adecuados.

La invención también incluye células que se han modificado para expresar la celobiohidrolasa de la invención o una variante de la misma. Dichas células incluyen lineas de células eucariotas superiores transitorias o preferentemente estables, tales como células de mamífero o células de insecto, células eucariotas inferiores, tales como células de levadura y fúngicas (por ejemplo, filamentosas) o ¦ células procariotas tales como células bacterianas.

También es posible que las proteínas de la invención se expresen de manera transitoria en una linea celular o en una membrana, tal como por e emplo en un sistema de expresión de baculovirus. Dichos sistemas, que están adaptados para expresar las proteínas de acuerdo con la invención, también se incluyen dentro del ámbito de la presente invención.

De acuerdo con la presente invención, la producción del polipéptido de la invención puede efectuarse mediante el cultivo de hospedadores de expresión microbianos, que se han transformado con uno o más polinucleótidos de la preáente invención, en un medio de fermentación con nutrientes convencionales .

La invención también se refiere a un método de producción de una CBH mutante que comprende las etapas de: (a) cultivar la célula hospedadora de acuerdo con la invención en un medio de cultivo adecuado en condiciones adecuadas para producir la CBH mutante; (b) obtener dicha CBH mutante producida; y opcion,a,lmerite (c) purificar dicha CBH mutante para proporcionar un producto CBH mutante purificado.

Adicionalmente la invención se refiere a una composición enzimática que comprende una o más CBH mutantes de acuerdo con la invención y o producida de acuerdo con el método de la invención.

Adicionalmente la invención se refiere a un proceso para la degradación de material lignocelulósico o hemicelulósico, en que el material lignocelulósico o hemicelulósico $e pone en contacto con una composición enzimática de acuerdo con la invención. En una realización, en dicho proceso de la invención, se produce uno o más azúcares. En una realización, el azúcar producido se fermenta para dar un producto de fermentación. En una realización, el producto de fermentación es uno o más de etanol, butanol, ácido láctico, un plástico, un ácido orgánico, un disolvente, un complemento para pienso animal, un producto farmacéutico, una vitamina, un aminoácido, una enzima o una materia prima química.

Producción de polipéptidos/enzimas Las células hospedadoras recombinantes de acuerdo con la invención pueden cultivarse usando procedimientos conocidos en la técnica. Para cada combinación de un promotor' y una célula hospedadora, se dispone de condiciones de cultivo que son favorables para la expresión de la secuencia de ;ÁDK que codifica el polipéptido. Después de alcanzar la dén'sidad celular o la titulación del polipéptido deseada, el ' cultivo se detiene y el polipéptido se recupera usando procedimientos conocidos .

El medio de fermentación puede comprender un medio, de cultivo conocido que contenga una fuente de carbono, (por ejemplo, glucosa, maltosa, melazas, almidón, celulosa, xilano, pectina, hidrolizados de biomasa 1-ignocelulósica , etc. ) , una fuente de nitrógeno (por ejemplo, sulfato amónico, nitrato amónico, cloruro amónico , etc. ) , una fuente de nitrógeno orgánico (por ejemplo extracto de levadura, extracto de malta, peptona, etc.) y fuentes de nutrientes inorgánicos (por ejemplo fosfato, magnesio, potasio,- zinc, hierro, etc. ) . Opcionalmente, puede incluirse un inductor (por ejemplo, celulosa, pectina, xilano, maltosa, maltodextrina o xilogalacturonano).

La selección del medio apropiado puede basarse , en la elección del hospedador de expresión y/o basarse en los requisitos reguladores de la construcción de expresión. Dichos medios son conocidos por los expertos en la téchica. Si se desea, el medio puede contener componentes adi£io¡nales que favorezcan los hospedadores de expresión transformados sobre otros microorganismos posiblemente contaminantes.

La fermentación puede realizarse durante un periodo de desde aproximadamente 0,5 a aproximadamente 30 días., Puede ser un proceso discontinuo, continuo o semi-discontinuo, adecuadamente a una temperatura en el intervalo, por ejemplo, de aproximadamente 0 a aproximadamente 45 °C y/o a un pH, por ejemplo, de aproximadamente 2 a aproximadamente 10. Las condiciones de fermentación preferidas son una temperatura en el intervalo de desde aproximadamente 20 a aproximadamente 37 °C y/o a un pH de aproximadamente 3 a aproximadamente 9. Las condiciones apropiadas se seleccionan normalmente en base a la elección del hospedador de expresión y de la proteina que vaya a expresarse.

Después de la fermentación, si fuera necesario, las células pueden retirarse del caldo de fermentación mediante centrifugación o filtración. Después de haber detenido la fermentación o después de haber retirado las células/ el polipéptido de la invención puede entonces recuperarse' y, si se desea, purificarse y aislarse por medios convencionales.

Composiciones enzimáticas La invención proporciona adicionalmente composiciones enzimáticas que comprenden una o más celobiohidro|Lasas mutantes. En una realización, la composición enZ^^ica comprende una o más CBH mutantes, una o más celulasas , y/o una hemicelulasa y/o una pectinasa.

Una composición enzimática de la invención : puede comprender una, dos, tres o más clases de celulasas, por ejemplo una, dos o todas de una endo-1, 4-p-glucanasa (EG) incluyendo preferentemente una GH61, una exo-celobiohldrolasa (CBH) y una ß-glucosidasa (BGL) .

Una composición enzimática de la invención puede comprender un polipéptido que tenga la misma actividad enzimática, por ejemplo, el mismo tipo de actividad celulosa, hemicelulasa y/o pectinasa y que se proporcione por un polipéptido de la invención.

Una composición enzimática de la invención puede comprender un polipéptido que tenga un tipo de actividad celulasa y/o actividad hemicelulasa y/o actividad pectinasa diferente a la de la proporcionada por un polipéptido de la invención. Por ejemplo, una composición de la invención puede comprender un tipo de actividad celulasa y/o hemicelulasa y/o actividad pectinasa proporcionada por un polipéptido de la invención y un segundo tipo de actividad celulasa y/o hemicelulasa y/o actividad pectinasa proporcionada por una hemicelulasa/pectinasa adicional .

En el presente documento, una celulasa es cualquier polipéptido que pueda degradar o modificar celulüsa. Un polipéptido que pueda degradar celulosa es un polipéptido que puede catalizar el proceso de degradación de la celulosa en unidades más pequeñas, parcialmente, por ejemplo en celodextrinas , o completamente en monómeros de glucosas Una celulasa de acuerdo con la invención puede dar lugar 'á una población mixta de celodextrinas y monómeros de glucosa cuando se ponen en contacto con la celulasa,, .Dicha degradación tendrá lugar típicamente mediante una reacción de hidrólisis .

En el presente documento, una hemicelulasa es cualquier polipéptido que pueda degradar o modificar hemicelulosa,. Esto significa que, una hemicelulasa puede degradar o modificar uno o más de xilano, glucuronoxilano, arabinoxilano, glucomanano y xiloglucano. Un polipéptido que puede degradar una hemicelulosa es un polipéptido que puede catalizar el proceso de degradación de la hemicelulosa en polisacáridos más pequeños, parcialmente, por ejemplo en oligosacáridos o completamente en monómeros de azúcar, por ejemplo hexosa o monómer s de azúcar pentosa. Una hemicelulasa de acuerdó con la invención puede dar lugar a una población mixta de oligosacáridos y monómeros de azúcar cuando se pone en contacto con la hemicelulasa. Dicha degradación tendrá lugar típicamente mediante una reacción de hidrólisis.

En el presente documento, una pectinasa es cualquier polipéptido que pueda degradar o modificar pectina;. Un polipéptido que pueda degradar pectina es un polipéptido que puede catalizar el proceso de degradación de la pectina en unidades más pequeñas, parcialmente, por ejemplo^ en oligosacáridos, o completamente en monómeros de azúcar. Una pectinasa de acuerdo con la invención puede dar lugar ,a una población mixta de oligosacáridos y monómeros de · ázúcar cuando se pone en contacto con la pectinasa, ; Dicha degradación tendrá lugar típicamente mediante una reacción de hidrólisis .

En el presente documento, una endo-ß-?, 4-glucanasa (EC 3.2.1.4) es cualquier polipéptido que pueda catalizar la endohidrólisis de enlaces 1, 4-p-D-glucosídicos en celulosa, liquenina o ß-D-glucanos de cereales. Dicho polipéptido también puede hidrolizar enlaces 1,4 en ß-D-glucanos que también contienen enlaces 1,3. Esta enzima también puede denominarse celulasa, avicelasa, ß-1 , -endoglucán hidrolasa, ß-l, 4-glucanasa, carboximetil celulasa, celudextrinasa , éndo- 1 , 4 - ß-D-glucanasa , endo-1 , 4 -ß-D-glucanohidrolasa , endo-1, -ß-glucanasa o endoglucanasa . Las endoglucanasas GH61 ' (EC 3.2.1.4) se clasificaron originalmente como una familia de glucósido hidrolasas en base a la medición de la actividad endo-1 , 4 -b-D-glucanasa muy débil en un miembro de la familia. La estructura y el modo de acción de estas enzimas no : son por supuesto canónicas y no pueden considerarse como auténticas glucosidasas . Sin embargo, se mantienen en la clasi ficiación CAZy por su capacidad de potenciar la degradación .: de la lignocelulosa cuando se usan junto con una celulasa: o una mezcla de celulasas. ' En el presente documento, una p-glucosidas;a ¡ (EC 3.2.1.21) es cualquier polipéptido que pueda catalizar la hidrólisis de restos de ß-D-glucosa no reductores terminales con liberación de ß-D-glucosa. Dicho polipéptido puede tener una amplia especificidad por ß-D-glucósidos y también puede hidrolizar uno o más de los siguientes: a ß-D-galactosidasa, una a-L-arabinosida, una ß-D-xilosida o una ß-D-fucosida . Esta enzima también puede denominarse amigdalasa, ß-D-glucosido glucohidrolasa, celobiasa o gentobiasa.

En el presente documento, una ß- ( 1 , 3 ) ( 1 , 4 ) -glucanasá (EC 3.2.1.73) es cualquier polipéptido que pueda catalizar la hidrólisis de enlaces 1 , 4^-D-glucosídicos en ß-D-glucanos que contienen enlaces 1,3 y 1,4. Dicho polipéptido puede actuar sobre liquenina y ß-D-glucanos de cereales, pero no sobre ß-D-glucanos que sólo contienen enlaces 1,3 o 1/4.' Esta enzima también puede denominarse liqueninasa, 1 , 3-1 4 '-ß-?-glucán 4-glucanohidrolasa, ß-glucanasa, endo-ß^-1 , 3-1, 4 glucanasá, liquenasa o ß- glucanasá de enlace mixto. Una alternativa para este tipo de enzima es la EC 3.2.1.6 que se describe como una endo-1,3 ( 4 ) -beta-glucanasa . Este tipo de enzima hidroliza enlaces 1,3- o 1,4- en beta -D-giucanos cuando el propio resto de glucosa, cuyo grupo reductor; está implicado en el enlace a hidrolizar, se sustituye n C-3. Como nombres alternativos se incluyen endo-1 , 3-beta-glucanasa, laminarinasa , 1,3-(1,3; 1 , 4 ) -beta-D-glucáh; 3 (4) glucanohidrolasa sustratos que incluyen lamiharina, liquenina y beta-D-glucanos de cereales.

Por consiguiente, una composición de la invención puede comprender, además de una CBH mutante, una o más de cualquier celulasa, por ejemplo, una celobiohidrolasa (por ejemplo CBH-II), una endo-ß-? , 4-glucanasa, una ß-glucosidasa o una ß-(1,3) ( 1 , 4 ) -glucanasa .

Una composición enzimática de acuerdo con la invención puede comprender adicionalmente una o más de las siguientes actividades enzimáticas: endoxilanasa (EC 3.2.1.8), ß-xilosidasa (EC 3.2.1*37), oí-L-arabinofuranosidasa (EC 3.2.1.55), a-D-glucuronidasa (EC 3.2.1.139), xilán al fa-1 , 2-glucuronosidasa ( EC 3.2.1.131), feruloil esterasa (EC 3.1.1.73), coumaroil esterasa: (EC 3.1.1.73), a-galactosidasa (EC 3.2.1.22), ß-galactosidasá (EC 3.2.1.23), ß-mannanasa (EC 3.2.1.78), ß-mannosida a ; (EC 3.2.1.25), endo-poligalacturonasa (EC 3.2.1.15), pectír ítietil esterasa (EC 3.1.1.11), endo-galactanasa (EC 3.2.1.89),; endo-pectin liasa (EC 4.2.2.10), pectato liasa ( EC 4.2.2.2 ), , al fa ramnosidasa (EC 3.2.1.40), exo-galacturonasa (EC 3.2.1;,82), exo-galacturonasa (EC 3.2.1.67), exopoligalacturonato liasa (EC 4.2. 2,9), ramnogalacturonán hidrolasa, ramnogalacturonán liasa, ramnogalacturonán acetil, ramnogalacturonán galacturonohidrolasa , xilogalacturonasa , Oí—L-arabinofuranosidasa ( EC 3.2.1.55), endo-arabinanasa ( EC 3.2.1.99), proteasa (3.4), lipasa, ligninasa, por ejemplo, peroxidasas de lignina (EC 1.11.1), peroxidasas de manganeso (EC 1.11.1.13), laccasas (EC 1.10.3.2) y feruloil estefasas (EC 3.1.1.73), hexosiltrans ferasa (EC 2.4.1), glucuronidasa , por ejemplo, ß-glucuronidasa (EC 3.2.1.31), hialurono-glucuronidasa (EC 3.2.1.36), glucuronosil-disul fogludosamina glucuronidasa (3.2.1.56), glicirricinato ß-glucuronidasa (3.2.1.128) o -D-glucuronidasa (EC 3.2.1.139), una expansina o una proteina similar a expansina, tal como una swólélina (véase Salheimo et al., Eur. J. Biohem. 269, 4202-4211, 2002) o una proteina similar a swolelina, escafoldinas y proteínas integradoras de celulosa.

Una composición de la invención puede estar compuesta por un miembro de cada una de las clases de los polipéptidos mencionados anteriormente, por diversos miembros de uña clase de polipéptidos o por cualquier combinación de estas clases de polipéptidos.

Una composición de la invención puede estar compuesta por polipéptidos, por ejemplo enzimas, de (1) proveedores comerciales; (2) genes clonados que expresan polipéptidos, por ejemplo enzimas; (3) caldos complejos tales como los resultantes del cultivo de una cepa microbiana en medios, en los que las cepas secretan proteínas y enzimas en los medios; (4) Usados celulares de cepas cultivadas como en <3); y/o (5) material vegetal que expresa polipéptidos , por ejemplo enzimas. A partir de diferentes fuentes, en una composición de la invención pueden obtenerse diferentes polipéptidos, por ejemplo, enzimas.

En una realización, se proporciona una CBHI en una composición enzimática que comprende BG, EG y CBHII. En una realización de la misma, las cantidades de las enzimas se seleccionan de tal manera que BG está presente a 2-12%, CBHI a 10-65%, CBHII a 10-40% y EG a 12-70%, o en una realización de la misma BG a 4-12%, EG a 18-50%, CBHII a 10-35% y CBHI a 10-60% de la dosis de proteina total (p/p).

Uso de los polipéptidos Los polipéptidos y las composiciones enzimáticas de acuerdo con la invención pueden usarse en muchas aplicaciones diferentes. Por ejemplo pueden usarse para producir azúcares fermentables . Los azúcares fermentables pueden por 'tanto, transformarse, como parte de un proceso biocombustíble, en un biogás o etanol, butanol, isobutanol, 2 butanol u ;otras sustancias adecuadas. Como alternativa los polipéptidos y sus composiciones pueden usarse como enzimas, por ejemplo, en la producción de productos alimenticios, en composiciones de detergentes, en la industria del papel y paéta, en formulaciones antibacterianas y en productos farmacéu icos, tales como pastillas para la garganta, dentífricos y colutorios. Algunos de estos usos se ilustrarán más adelante con más detalle.

En los usos y métodos descritos a continuación, los componentes de las composiciones descritas anteriormente pueden proporcionarse simultáneamente (es decir, como una sola composición de por sí) o por separado o secuencialmente .

La invención también se refiere al uso de la celobiohidrolasa de acuerdo con la invención y a composiciones que comprenden dicha enzima en propesos industriales. , , A pesar de la gran experiencia obtenida con éstos procesos, la celobiohidrolasa de acuerdo con la invención puede representar un número de ventajas significativas, £obre las enzimas actualmente utilizadas. Dependiendo $ la aplicación específica, estas ventajas pueden incluir Aspectos tales como costes de producción inferiores, , . mayor especificidad hacia el sustrato, antigenicidad reducida, pocas actividades secundarias no deseables, mayores rendimientos cuando se producen en un microorganismo adecuado, intervalos de pH y temperatura más adecuados, no inhibición por productos hidrófobos derivados de lignina o menor inhibición de productos o, en el caso de la industria alimenticia, un mejor sabor o textura de un producto ¡final así como aspectos de uso alimentario y kosher (autorizados).

En principio, en cualquier proceso que requiera el tratamiento de un material que comprenda polisacáridos , puede usarse una celobiohidrolasa o una composición de la invención. Por tanto, en el tratamiento de material polisacárido, puede usarse un polipéptido o una composición de la invención. En el presente documento, el material polisacárido es un material que comprende o consta básicamente de uno o, más típicamente, de más dé un polisacárido.

Típicamente, las plantas y los materiales derivados de las mismas comprenden cantidades significativas de material polisacárido que no es almidón. Por consiguiente, en el tratamiento de un material vegetal o fúngico o un material derivado de los mismos, puede usarse un polipéptido de la invención. · 1 Materiales de hidratos de carbono adecuados Un hidrato de carbono que no es almidón, adecuado, para la modificación por una CBH mutante de la invención,, es la lignocelulosa . Los polisacáridos principales que comprenden diferentes restos lignocelulósicos , que pueden considerarse como una posible materia prima renovable, son celulosa 1 (glucanos), hemicelulosas (xilanos, heteroxilano? y xiloglucanos ) . Además, alguna hemicelulosa puede estar presente como glucomananos , por ejemplo, en materias primas derivadas de madera. La hidrólisis enzimática de estos polisacáridos en azúcares solubles, por ejemplo, gl.uóosa, xilosa, arabinosa, galactosa, fructosa, mañosa, ramñosa, ribosa, ácido D-galacturónico y otras hexosas y pentósas se produce bajo la acción de diferentes enzimas que actúan en concierto. , , Además, las pectinas y otras sustancias pécticas, tales como arabinanos, pueden constituir una proporción considerable de la masa seca de típicamente paredes celulares de tejidos de plantas no leñosas (aproximadamente de una cuarta parte a la mitad de masa seca pueden ser pectinas).

Por consiguiente, considerando la materia ' prima (denominada también sustrato) particular que vaya a usarse puede diseñarse una composición de la invención . decir, el espectro de actividades en una composición de la invención puede variar dependiendo de la materia prima en cuestión.

Las combinaciones enzimáticas o tratamientos físicos pueden administrarse simultánea o secuencialmente . Las enzimas pueden producirse exógenamente en microorganismos, levaduras, hongos, bacterias o plantas, después aislarse y añadirse a la materia prima lignocelulósica . , ; Como alternativa, las enzimas se producen, pero no se aísíán y el caldo de fermentación de la masa celular en bruto, o material vegetal (tal como forraje de maíz) y similar se añade á la materia prima.' Como alternativa, la masa celular en bruto o el medio de producción enzimático o el material vegetal puede tratarse para impedir el crecimiento microbiano adicional (por ejemplo, calentando o añadiendo agentes antimicrobianos), después añadirse a la materia prima. Éstas mezclas enzimáticas en bruto pueden incluir el organismo que produce la enzima. Como alternativa, la enzima puede producirse en una fermentación que usa materia prima (tal como forraje de maíz) para proporcionar alimento a un organismo que produce una enzima (o enzimas). De esta manera, las plantas que producen las enzimas pueden servir como la materia prima lignocelulósica y pueden añadirse a la materia prima lignocelulósica.

Lignocel losa Un importante componente de material polisacárido vegetal que no es almidón es la lignocelulosa (denominada también en el presente documento biomasa lignocelulolí ica ) . La lignocelulosa es un material vegetal que comprende celulosa y hemicelulosa y lignina. Los polímeros de hidratos de carbono (celulosa y hemicelulosa) están fuertemente Uñidos a la lignina por enlaces de hidrógeno y covalentes. Por consiguiente, en el tratamiento de material lignocelulolítico puede usarse un polipéptido de la invención. En el presente documento, un material lignocelulolítico es un material que comprende o consta esencialmente de celulosa. Por tanto, en un método de la invención para el tratamiento de un polisacárido que no es almidón, el polisacárido que no es almidón puede ser un material/biomasa lignocelulósico ( a ) .

Por consiguiente, la ¦ invención proporciona un .método para el tratamiento de un sustrato que comprende polisacárido que no es almidón en que el tratamiento comprende la degradación y/o la hidrólisis y/o la modificación de celulosa y/o hemicelulosa y/ o una sustancia péctica. : En este contexto, degradación indica que el tratamiento da como resultado la generación de productos de hidrólisis de celulosa y/o hemicelulosa y/o una sustancia péctica, es decir, como resultado del tratamiento están presientes sacáridos de menor longitud en comparación con los que están presentes en un polisacárido que no es almidón no tratado similar. Por tanto, en este contexto, la degradación puede dar como resultado la liberación de oligosacáridos y/o monómeros de azúcar. 1 : Todas las plantas contienen polisacáridos que nó son almidones al igual que prácticamente todos los materiales polisacáridos derivados de plantas. Por consiguiente, en un método de la invención para el tratamiento de sustratos que comprenden un polisacárido que no es almidón, dicho sustrato' puede proporcionarse en forma de una planta o un material derivado de planta o un material que comprende una planta o un material derivado de planta, por ejemplo, una pulpa de planta, un extracto de planta, un producto alimenticio :o un ingrediente del mismo, una tela, un tejido o una prenda de vestir.

La biomasa lignocelulolitica adecuada para su uso1 en la invención incluye biomasa y puede incluir biomasa virgen- y/o biomasa no virgen tal como biomasa agrícola, productos orgánicos comerciales, residuos de construcción ¡ de demolición, basura urbana, papel usado y restos vegetales. Las formas comunes de biomasa incluyen árboles, arbustos e hierbas, trigo, paja de trigo, bagazo de caña de azúcar, maíz, vainas de maíz, mazorcas de maíz, granos de, Jmaíz, incluyendo fibra de granos, productos y subproductos de la molienda de granos tales como maíz, trigo y ; ; cebada (incluyendo molienda en húmedo y molienda en sedo), denominados frecuentemente "salvado o fibra". La biomasa también puede ser, pero sin limitación, material herbáceo, biomasa agrícola, restos forestales y restos de molienda de pulpa y papel. Como "biomasa agrícola" se incluye ¿amas, arbustos, cañas, maíz y cáscaras de maíz, cultivos energéticos, bosques, frutos, flores, granos, hierbas, cultivos herbáceos, hojas, corteza, aciculas, troncos de árboles, raices, retoños, cuerpos leñosos de corta rotación, arbustos, pasto varilla, árboles, verduras, cáscaras1 de fruta, viñas, pulpa de remolacha azucarera, harinillas de trigo, cáscaras de avena y maderas duras y blandas (excluyendo maderas con materiales nocivos). Además, la biomasa agricola incluye materiales de residuos orgánicos generados a partir de procesos agrícolas que incluyen actividades agrícolas y forestales, incluyendo específicamente residuos de madera forestal. La biomasa agrícola puede ser cualquiera de las mencionadas anteriormente en solitario o en cualquier combinación o mezcla de las mismas. Otros ejemplos de biomasa adecL|ad$ son los cebados para huertos, chaparral, restos de almazara, residuos urbanos de madera, basura urbana, residuos de: ¡tala, rastrojos forestales, cuerpos leñosos de corta rotación, residuos industriales, paja de trigo, paja de avena, ,paja de arroz, paja de cebada, paja de centeno, paja de lino, cáscaras de soja, cáscaras de arroz, paja de arroz, pienso de gluten de maíz, cáscaras de avena, caña de azúcar, forraje de maíz, tallos de maíz, panojas de maíz, cáscaras de, maíz, pastos, pastizales, cola de zorro, pulpa de remolacha azucarera, pulpa de cítricos, cáscaras de semillas, ¿residuos celulósicos de animales, recortes de césped, algodón, algas, árboles, arbustos, hierbas, trigo, paja de trigo, bagazo de caña de azúcar, maíz, cáscaras de maíz, granos de maíz, granos de fibra, productos y subproductos de trigo o molienda seca de granos, residuos sólidos urbanos, restos de papel, restos de hierba, material herbáceo, restos agrícolas, restos forestales, pulpa, restos de molienda de papel, ramas, arbustos, cañas, maiz, cáscaras de maíz, y aultivos energéticos, bosques, un fruto, una flor, un grano, una hierba, un cultivo herbáceo, una hoja, madera, una acídula, un tronco, una raíz, un retoño, un arbusto, pasto varilla, un árbol, una verdura, cáscara de fruta, una vid, pulpa de caña de azúcar, harinillas de trigo, madera blanda o ¡ dura, material residual orgánico generado de procesos agrícolas, residuos de forestales de madera o una combinación de cualesquiera dos o más de los mismos. , „ ; Además de la biomasa virgen o de las materias primas ya procesadas en industrias de alimentación y pi^nsps y papelera, la biomasa/materia prima puede adi cionalmente pretratarse con calor, realizar modificaciones mecánicas y/o químicas o cualquier combinación de dichos métodos para potenciar la degradación enzimática.

Pretratamiento Antes del tratamiento enzimático, el material lignocelulósico puede pretratarse. El pretratamiento puede comprender exponer el material lignocelulósico a un ácido, una base, un disolvente, calor, un peróxido, o¿ono, desmenuzado mecánico, trituración, molienda o despresurización rápida o una combinación de cualquiera de dos o más de los mismos. Este pretratamiento químico se combina frecuentemente con pretratamiento térmico por ejemplo entre 150-220 °C durante 1 a 30 minutos.

Después de la etapa de pretratamiento, puede utilizarse una licuefacción/hidrólisis o una etapa de presacari ficación que implica la incubación con una enzima o una ;mezcla enzimática. La etapa de presacari ficación puede realizarse a muchas temperaturas diferentes pero se prefiere que la presacarificación se produzca a una temperatura que mejor se adapte a la mezcla enzimática que vaya a ensayarse o al óptimo enzimático previsto de las enzimas a ensayar. La temperatura de la presacari ficación puede variaf de aproximadamente 10 °C a aproximadamente 95 °C, de aproximadamente 20 °C a apro imadamente 85 °c, de aproximadamente 30 °C a aproximadamente 70 °c, de aproximadamente 40 °C a aproximadamente 60 °c, de aproximadamente 37 °C a aproximadamente 50 °c, preferentemente de aproximadamente 37 °C a aproximadamente 80 °C, más preferentemente de aproximadamente 60 - 70 °C incluso más preferentemente aproximadamente 65 °C. El pH de la mezcla de presacarificación puede variar de aproximadamente 2,0 a aproximadamente 10,0, pero preferentemente es de 3,0 a aproximadamente 7,0, más preferentemente de aproximadamente 4,0 a aproximadamente 6,0 incluso más preferentemente de aproximadamente 4,0 a aproximadamente 5,0. De nuevo, el pH puede ajustarse para maximizar la actividad enzimática y puede ajustarse con la adición de la enzima. La comparación de los resultados de los resultados del ensayo a partir de este ensayo permitirá modificar el método que mejor se .ajuste a las enzimas que vayan a ensayarse. ¦ 1 ¦ La reacción de la etapa de licuefacción/hidrólisis o presacarificación puede producirse desde varios minutos a varias horas, tal como de aproximadamente 1 hoía a aproximadamente 120 horas, preferentemente de aproximadamente 2 horas a aproximadamente 48 horas, más preferentemente de aproximadamente 2 a aproximadamente 24 horas, : más preferentemente de aproximadamente 2 a aproximadamente 6 horas. El tratamiento de la celulasa puede producirse ,desde varios minutos a varias horas, tal como de aproximadamente 6 horas a aproximadamente 120 horas, preferentemente de aproximadamente 12 horas a aproximadamente 72 horcas t más preferentemente de aproximadamen e 24 a 48 horas.

Por tanto la biomasa puede someterse a diversos pretratamientos para hacer que la celulosa sea más accesible a la degradación enzimática (hidrólisis) y solubilizar los azúcares de hemicelulosa . "Features of Promising Technologies for Pretreatment of Lignocellulosic Biomass," Biorésource Technology 96(3), 673-86. Yi Zheng, Zhongli Pan, Ruihong Zhang, Overview of biomass pre-treatment for cellulosic ethanol production. Int J Agrie & Biol Eng, 2009; 2(3'): 51-68.

Sacarificación La invención proporciona un método para producir un azúcar a partir de un material lignocelulósico cuyo método comprende poner en contacto un polipéptido de la invención con una composición de la invención con el material lignocelulósico.

Dicho método permite generar azúcares libres (monómeros ) y/u oligosacáridos a partir de biomasa lignocelulosica. Estos métodos implican convertir la biomasa lignocelulosica en azúcares libres y pequeños oligosacáridos con un polipéptido o composición de la invención.

El proceso de transformar un hidrato de carbono complejo, tal como lignocelulosa , en azúcares permite preferentemente la transformación en azúcares formentables .

Dicho proceso puede denominarse "sacarificación". Por consiguiente, un método de la invención puede dar como resultado la liberación de uno o más de azúcares de hexósa y/o pentosa, tal como uno o más de glucosa, xilosa, arabinosa, galactosa, ácido galacturonico, ácido glucuróñico, mañosa, ramnosa, ribosa y fructosa.

Por consiguiente, otro aspecto de la invención incluye métodos que utilizan el polipéptido de la composición1 de la invención descrita anteriormente junto con otras enzimas o tratamientos físicos tales como temperatura y pH : para transformar la biomasa vegetal lignocelulósica en azúcares y oligosacáridos . ; Aunque que la composición se ha analizado como una mezcla sencilla se reconoce que las enzimas pueden añadirse secuencialmente donde la temperatura, el pH y., .otras condiciones pueden modificarse para aumentar la actividad de cada enzima individual. Como alternativa, para la ; mezcla enzimática puede determinarse un pH y una temperatura óptimos.

Las enzimas reaccionan con sustratos en cualquiera de las condiciones apropiadas. Por ejemplo, las enzimas pueden incubarse a aproximadamente 25° C, aproximadamente 30° C, aproximadamente 35° C, aproximadamente 37° C, aproximadamente 40° C, aproximadamente 45° C, aproximadamente : 50° C, aproximadamente 55° C, aproximadamente 60° C, aproximadamente 65° C, aproximadamente 70° C, aproximadamente 75° C, aproximadamente 80o' C, aproximadamente 85° C, aproximadamente 90° C o superior. Es decir, pueden incubarse a una temperatura de desde aproximadamente 20° C a aproximadamente 95° C, por ejemplo en tampones de fuerza iónica baja a media y/o pH bajo a neutro. Por "fuerza iónica media" se entiende que el tampón tiene una concentración iónica de aproximadamente 200 milimolar (mM) o menor para cualquier componente iónico sencillo. El pH puede variar de aproximadamente pH 2,5, aproximadamente pH 3,0, aproximadamente pH 3,5, aproximadamente pH 1 '4,0, aproximadamente pH 4,5, aproximadamente pH 5, aproximadamente pH 5,5, aproximadamente pH 6, aproximadamente pH 6,5, aproximadamente pH 7, aproximadamente pH 7,5, aproximadamente pH 8,0, a aproximadamente pH 8,5. Generalmente, el intervalo de pH será de aproximadamente pH 3,0 a aproximadamente JpH 7. Para la producción de etanol en medio ácido se prefiere.y por ejemplo, un pH=4, mientras que para la producción de ' bio'gás es deseable un pH neutro, por ejemplo, un pH=7. La incubación de combinaciones enzimáticas en estas condiciones dar' como resultado la producción o liberación de cantidades sustanciales del azúcar a partir de la lignocelulosa : Por cantidad sustancial se entiende al menos el 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 95% o más de azúcar disponible.

Los polipéptidos , tales como enzimas, pueden producirse exógenamente en microorganismos, levaduras, hongos, bacterias o plantas, después aislarse y añadirse, por ejemplo, a materia prima lignocelulósica . Como alternativa, las enzimas se producen, pero no se aislan, y el caldo de fermentación de la masa celular en bruto, o material vegetal (tal como forraje de maíz) y similar puede añadirse, por ejemplo, a la materia prima. Como alternativa, la masa celular en bruto o el medio de producción enzimático o material vegetal puede tratarse para impedir el crecimiento microbiano adicional (por ejemplo, calentando o añadiendo agentes antimicrobianos) y después añadirse, por ejemplo, a la materia prima.' Estas mezclas enzimáticas en bruto pueden incluir el organismo productor de la enzima. Como alternativa, la enzima puede producirse en una fermentación que use materia prima (tal como forraje de maíz) para proporcionar aliment a un organismo que produzca una enzima (o enzimas) . De esta manera, las propias plantas que producen las enzimas pueden servir como una materia prima lignocelulósica y añadirse a la materia prima lignocelulósica.

Fermentación de azúcares Los azúcares fermentables pueden transformarse en productos de fermentación útiles de valor añadidor, como ejemplos no limitantes de los mismos se incluyen aminoácidos, vitaminas, compuestos farmacéuticos, complementos de piensos animales, productos químicos especializados, materias primas químicas, plásticos, disolventes, combustibles y otros polímeros orgánicos, ácido láctico, y etanol incluyendo etanol combustible. En particular, los azúcares pueden usarse como materias primas para fermentación en productos químicos, plásticos, tales como, por ejemplo, ácido succínico y (bio ) combustibles, incluyendo etanol, metanol, bütanol, combustibles líquidos sintéticos y biogás.

Por ejemplo, en el método de la invención, una enzima o combinación de enzimas actúa sobre un sustrato lignocelulósico o biomasa vegetal, que sirve como la materia prima, para transformar este sustrato complejo en azúcares simples y oligosacáridos para la producción de etanol' u productos de fermentación útiles. '¦ Los azúcares liberados de la biomasa : pueden transformarse en productos de fermentación útiles, tales como uno de los que incluyen, pero sin limitación, aminoácidos, vitaminas, productos farmacéuticos, complementos para piensos animales, productos químicos especializados, materias primas químicas, plásticos, y etanol, incluyendo etanol combustible.

Por consiguiente, la invención proporciona un < método para la preparación de un producto de fermentación, cuyo método comprende: a. la degradación de la lignocelulosa usando un método como se describe en el presente documento; y b. la fermentación del material resultante, mediante lo cual para preparar de esta manera un producto de fermentación.

La fermentación puede realizarse en condiciones aerobias o anaerobias. Preferentemente, el proceso se realiza en condiciones microaerófilas o limitadas de oxigeno.

En el presente documento un proceso de fermentación anaerobia se define como una ejecución del proceso de fermentación en ausencia de oxigeno o en el cual no se consume sustancialmente oxigeno, preferentémente aproximadamente 5 o menor, aproximadamente 2,5 o menor, o aproximadamente 1 mmol/l/h o menor y en que las moléculas orgánicas actúan como donantes de electrones y como ' aceptoras de electrones . : ; Un proceso de fermentación limitado de oxigeno1 es un proceso en que el consumo de oxigeno está limitado por la transferencia de oxigeno desde el gas al liquido. El g:rado de limitación de oxigeno se determina por la cantidad y composición del flujo de gas entrante asi como por; las propiedades de transferencia de masa/mezcla reales dél équipo de fermentación utilizado. Preferentemente, en un proceso en condiciones limitantes de oxigeno, la tasa de consumo de oxigeno es de al menos aproximadamente 5,5, más preferentemente de al menos aproximadamente 6 e incluso más preferentemente de al menos aproximadamente 7 mmol/l/h* Opcionalmente, un método para la preparación de un producto de fermentación puede comprender la recuperación del producto de fermentación.

SSF La fermentación y sacarificación también pueden ejecutarse en modo de Sacarificación y Fermentación Simultáneas (SSF, Simultaneous Saccharifícation, and Fer entation) . Una de las ventajas de ese modo es la reducción de la inhibición de azúcar sobre la hidrólisis enzimática (la inhibición de azúcar sobre celulasas se describe en Caminal B & B Vol. XXVII Páginas 1282-1290)..: Productos de fermentación Los productos de fermentación que pueden producirse de acuerdo con la presente invención incluyen aminoácidos , vitaminas, productos farmacéuticos, complementos para; piensos animales, productos químicos especializados, materias' primas químicas, plásticos, disolventes, combustibles u1 otros polímeros orgánicos, ácido láctico y etanol, incluyendo etanol combustible (entendiéndose que el término "etanol" incluye alcohol etílico o mezclas de alcohol etílico y agua) .

Los productos específicos de valor añadido que piieden producirse mediante los métodos de la invención incluyen, pero sin limitación, biocombustibles (incluyendo etanol y butanol y biogás); ácido láctico; un plástico; un prpducto químico especializado; un ácido orgánico, incluyendo ácido cítrico, ácido succínico, ácido fumárico, ácido itacónico y ácido maleico; ácido 3-hidroxi-propiónico, ácido "acrílico; ácido acético, 1 , 3-propano-diol , etileno, glicerol, un disolvente; un complemento para piensos animales; un producto farmacéutico, tal como un antibiótico ß-lactámico o una cefalosporina; vitaminas; un aminoácido, tal como lisina, metionina, triptófano, treonina y ácido aspártico; una enzima industrial, tal como una proteasa, una celulasa, una amilasa, una glucanasa, una lactasa, una lipasa, una liasa, una oxidorreductasas , una transferasa o una xilanasa y/o una materia prima química. , , : Biogas La invención también proporciona el uso de un polipéptido o composición como se describe en el presente documento en un método para la preparación de biogás., Biogás típicamente se refiere a un gas producido por la degradación biológica de materia orgánica, por ejemplo, material que contiene hidratos de carbono que no son almidones, en ausencia de oxígeno. El biogás se origina a partir de material biogénico y es un tipo de biocombustible . Un tipo de biogás se produce por digestión anaerobia o fermentación de materiales biodegradables tales como biomasa, estiércol o aguas residuales, basura urbana y cultivos energéticos. Este tipo de biogás comprende principalmente metano y dióxido de carbono. El gas metano puede arder u oxidarse con oxígeno. El aire contiene 21% de oxígeno. Esta liberación de energía permite que el biogás se use como un combustible. El biogás puede usarse como un combustible económico en cualquier país para calentar, tal como para cocinar. También ' puede utilizarse en instalaciones modernas de tratamiento residual donde puede usarse para ejecutar cualquier tipo dé; termo maquinaría, para generar energía mecánica o eléctrica. ; La primera etapa en la producción de biogás microbiano consiste en la degradación enzimática de polímeros y sustratos complejos (por ejemplo hidratos de carbono que no son almidones). Por consiguiente, la invención proporciona un método para la preparación de un biogás en el que un sustrato que comprende hidratos de carbono que no son almidonas se pone en contacto con un polipéptido o composición ' de la invención, mediante lo cual se produce material fermentable que puede transformarse en un biogás por un organismo tal como un microorganismo. En dicho método, puede proporcionarse un polipéptido de la invención a través de un organismo, por ejemplo un microorganismo que exprese dicho polipéptido.

Uso de enzimas en productos alimenticios Los polipéptidos y composiciones de la invención pueden usarse en un método de procesamiento de material vegetal para degradar o modificar la celulosa o hemicelulosa o constituyentes de sustancias pécticas de las paredes celulares del material vegetal o fúngico. Dichos métodos pueden ser útiles en la preparación de productos alimenticios. Por consiguiente, la invención proporciona un método para preparar un producto alimenticio cuyo método comprende incorporar un polipéptido o composición; · de la invención durante la preparación del producto alimenticio.

La invención también proporciona un método de procesamiento de un material vegetal cuyo método comprende poner en contacto el material vegetal con un polipéptido o composición de la invención para degradar o modificar la celulosa en el material (vegetal). Preferentemente, el material vegetal es pulpa vegetal o extracto vegetal,, tal como zumos .

La presente invención también proporciona un método para reducir la viscosidad, transparencia y/o filtrabilidad de un extracto vegetal cuyo método comprende poner en contacto un extracto vegetal con un polipéptido o composición dé la invención en una cantidad efectiva en la degradación de celulosa o hemicelulosa o sustancias pécticas contenidas en el extracto vegetal.

Los materiales que contienen vegetales y celulosa/hemicelulosa/sustancias pécticas incluyen : pulpa vegetal, partes de vegetales y extractos vegetales. En el contexto de la presente invención un extracto de un material vegetal es cualquier sustancia que pueda proceder de material vegetal por extracción (mecánica y/o química), procesado o mediante otras técnicas de separación. El extracto puede ser zumo, néctar, bases o concentrados fabricados a' partir d$ los mismos. El material vegetal puede comprender o proceder de vegetales, por ejemplo, zanahorias, apio, cebollas, legumbres o plantas leguminosas (soja, semilla de soja, guisantes) o frutas, por ejemplo, frutas con pipa o con semillas (manzanas, peras, membrillo, etc.), uvas, tomates, cítricos (naranja, limón, lima, mandarina), melones, ci uelas, cerezas, grosella negra, grosella roja, frambuesa, fresa, arándano, piña y otras frutas tropicales, árboles y partes de los mismos (por ejemplo, polen, de pinos) o cereales (avena, cebada, trigo, maíz, arroz). El material (a hidrolizar) también puede ser restos agrícolas, tal como pulpa de remolacha azucarera, mazorcas de maíz, paja de ,t£igo, cáscaras de nuez (molidas), o materiales reciclables, por ejemplo, papel (residual).

Los polipéptidos de la invención pueden por tanto usarse para tratar material vegetal incluyendo pulpa vegetal y extractos vegetales. También pueden usarse para 'tratar productos alimenticios líquidos o sólidos o ingredientes de productos alimenticios comestibles, o usarse en la extracción de café, aceites vegetales, almidón o como un espesante en los alimentos.

Típicamente, los polipéptidos de la invención se usan como una composición/preparación enzimática como s£ ha descrito anteriormente. La composición generalmenté se añadir-á a la pulpa vegetal obtenible, por ejemplo,' por procesamiento mecánico, tal como aplastamiento o molienda del material vegetal. La incubación de la composición' CG/n el material vegetal se realizará típicamente durante un tiempo de desde 10 minutos a 5 horas, tal como de 30 minutos a 2 horas, preferentemente durante aproximadamente 1 hora. La temperatura de procesamiento es preferentemente de aproximadamente 10° C a aproximadamente 55° C, por ejemplo de aproximadamente 15° C a aproximadamente 25° C, óptimamente de aproximadamente 20° C y pueden usarse de aproximadamente 10 g a aproximadamente 300 g, preferentemente de aproximadamente 30 g a aproximadamente 70 g, óptimamente de aproximadamente 50 g de enzima por tonelada de material a tratar.

Todas las enzimas (o enzima) o sus composiciones usadas pueden añadirse secuencialmente o al mismo tiempo a la pulpa vegetal- Dependiendo de la composición de la preparación enzimática el material vegetal puede macerarse primero (por ejemplo hasta una pureza) o licuarse. Usando los polipéptidos de la invención pueden mejorarse parámetros de procesamiento, tales como el rendimiento de la extracción, viscosidad del extracto y/o calidad del extracto.

Como alternativa, o además de lo anterior, un polipéptido de la invención puede añadirse a un zumo1 Crudo obtenido presionando o licuando la pulpa vegetal* El tratamiento del zumo crudo puede realizarse de una manera similar al de la pulpa vegetal con respeto a la dosificación, temperatura y tiempo de conservación. De nuevo, pueden incluirse otras enzimas tales como las descritas anteriormente. Las condiciones de incubación típicas son como se describe en el párrafo anterior.

Una vez que el zumo crudo se ha incubado con los polipéptidos de la invención, el zumo se centrifuga después o se ( ultra ) filtra para producir el producto final. : ¦: Después del tratamiento con el polipéptido de la invención, el producto (final) puede tratarse con calor, por ejemplo, a aproximadamente 100 °C durante un tiempo de' desde aproximadamente 1 minuto a aproximadamente 1 hora, en condiciones que inactiven parcial o totalmente el polipéptido (o los polipéptidos ) de la invención.

También puede usarse, durante la preparación de purés de frutas o verduras, una composición que contenga un polipéptido de la invención.

El polipéptido de la invención también puede usarse en la elaboración de cerveza, vino, destilería u horneado.; Puede por lo tanto usarse en la preparación de bebidas alcohólicas tales como vino y cerveza. Por ejemplo puede mejorar la filtrabilidad o transparencia, por ejemplo, de cervezas, mosto (que contenga, por ejemplo, malta de cebada y/o de sorgo) o vino.

Además, un polipéptido o composición de la invehción puede usarse para el tratamiento de cereal ya procesado, para la elaboración de cerveza, es decir, productos residuales de mosto de cerveza que contienen cebada o cebada maljte^da u otros cereales, para mejorar la utilización de los roductos residuales, por ejemplo, para piensos de animales. : ; ; La proteina puede ayudar a eliminar las sustancias orgánicas disueltas de los caldos o de los medios de cultivo, por ejemplo, cuando los residuos de destilería de origen orgánico se bioconvierten en biomasa microbiana. El polipéptido de la invención puede mejorar la filtrabilidad y/o reducir la viscosidad en jarabes de glucosa, tales como de cereales producidos por licuefacción (por ejemplo, con OÍ-amilasa ) .

En el horneado el polipéptido puede mejorar la estructura de la masa, modificar su cohesión o flexibilidad, mejorar el volumen de la barra de pan y/o la estructura de la miga o conferir mejores características de textura, tales como, descomposición, cizalla o calidad de la miga.

La preparación de una masa es muy conocida en la técnica y comprende mezclar dichos ingredientes y adyuvantes de procesamiento y una o más etapas de moldeo y opcionalmente fermentación. La preparación de masa congelada la describen ulp y Lorenz en Frozen and Refrigerated Doughs and Battérs.

Los polisacáridos que no son almidones (NSP, Nofí-Starch Polysaccharides) pueden aumentar la viscosidad del , bolo alimenticio que, a su vez, puede disminuir la disponibilidad de los nutrientes y la producción animal. El uso. d la celobiohidrolasa mutante de la presente invención' ¡püede mejorar la utilización del fósforo así como de minerales catiónicos y proteínas durante la digestión animal. ¦ ¡ La adición de nutrientes específicos a los alimentos mejora la digestión animal y por lo tanto reduce costes alimenticios. Actualmente se están utilizando muchos aditivos alimenticios y continuamente se están desarrollando nüevos conceptos. El uso de enzimas especificas, como enzimas degradadoras de hidratos de carbono que no son almidones, podría descomponer la fibra liberando energía, así cómo aumentar la digestibilidad de las proteínas debido a la mejor accesibilidad de las mismas cuando se consigue descomponer la fibra. De este modo podrían reducirse costes alimenticios así como los niveles de proteína en el alimento.

Los polisacáridos que no son almidones (NSP) taftibién están presentes prácticamente en todos los ingredientes alimenticios de origen vegetal. Los NSP se utilizan poco, y cuando se disuelven, pueden ejercer efectos adversos sobre la digestión. Las enzimas exógenas pueden contribuir a una mejor utilización de estos NSP y como consecuencia reducir cualquiera de los efectos anti-nutricionales . Las enzimas degradadoras de hidratos de carbono que no son almidones de la presente invención pueden usarse con esta finalidad en dietas basadas en cereales para aves de corral y, a µ? ;menor grado, para especies porcinas u otras. ; ·' Un polipéptido/enzima degradador ( a ) de hidratos de carbono que no son almidones de la invención ¦(ø una composición que comprenda el polipéptido/enzima de la invención) puede usarse en la industria de detergentes, por ejemplo, para eliminar de la ropa de lavado las manchas basadas en hidratos de carbono. Una composición de detergente puede comprender un polipéptido/enzima de la invención y, además, uno o más de una celulosa, una hemicelulasa, una pectinasa, una proteasa, una lipasa, una cutinasa, una amilasa o una carbohidrasa .

Uso de enzimas en composiciones de detergente Una composición de detergente gue comprende un polipéptido o composición de la invención puede estar en cualguier forma conveniente, por ejemplo, una pasta, un gel, un polvo o un líguido. Un detergente líguido puede ser acuoso, que típicamente contenga hasta aproximadament , uh 70% de agua y de aproximadamente 0 a aproximadamente un 30% de disolvente orgánico o material no acuoso.

Dicha composición de detergente puede, por ejemplo, formularse como una composición de detergente para el : lavado a mano o a máguina gue incluye una composición de aditivo adecuada para lavar para el tratamiento previo de tejidos teñidos y una composición de suavizante para tejidos' añadida al aclarado, o puede formularse como una composición de detergente para su uso en operaciones de limpieza generales de superficies duras del hogar, o puede formula^áe' para operaciones de lavado a mano o en lavavaj illas . En general, las propiedades de la enzima deben ser compatibles con el detergente seleccionado (por ejemplo, pH óptimo, compatibilidad con otros ingredientes enzimáticos y/o no enzimáticos, etc.) y la enzima (o enzimas) deben estar presentes en una cantidad efectiva. Una composición de detergente puede comprender un tensioactivo, por ejemplo, un tensioactivo aniónico o no iónico, un agente formador de detergente o un agente formador de complejos, uno o más polímeros, un sistema de blangueamiento (por ejemplo una fuente de H202) o un estabilizante enzimático. Una composición de detergente también puede comprender cualquier otro ingrediente para detergentes convencional tal como por ejemplo, un acondicionador que incluya una arcilla^ un intensificador de espuma, un supresor sud, un agente anticorrosión, un agente de suspensión de suelo, un agente de redeposición de suelo, un colorante, un bactericida, un abrillantador óptico, un hidrótropo, un inhibidor medular o un perfume.

Uso de enzimas en el procesamiento de papel y past En la industria del papel y pasta, puede usarse un polipéptido o composición de la presente invención,! entre otras cosas, en el proceso de blanqueamiento para potenciar el brillo de las pastas blanqueadas por lo que : puede reducirse la cantidad de cloro usado en las fases de blanqueamiento, y para aumentar el refinado de las pastas en el proceso de reciclado del papel (Eriksson, K. E. L., Wood Science and Technology 24 ( 1990 ) : 79-101 ; Paice, et al., Biotechnol. y Bioeng. 32 ( 1988 ) : 235-239 y Pommier et al., Tappi Journal ( 1989 ) : 187 -191 ) . Además, un polipéptido o composición de la invención puede usarse para el tratamiento de pasta lignocelulósica para mejorar su blanqueo. Por lo tanto puede reducirse la cantidad de cloro que se necesita para obtener un blanqueamiento satisfactorio de la pasta.

Un polipéptido o composición de la invención puede usarse en un método para reducir la tasa de endurecimiento de los tejidos que contienen celulosa o de reducción de la dureza de los tejidos que contiene celulosa, comprendiendo el método tratar los tejidos que contienen celulosa con un polipéptido o composición como se ha descrito anteriormente. La presente invención se refiere adicionalmente a un método para proporcionar el aclarado del color de tejidos teñidos que contienen celulosa, comprendiendo el método tratar los . .i ¡ tejidos teñidos que contienen celulosa con un polipéptido o composición como se ha definido anteriormente, y un método para proporcionar un cambio localizado de color de. tejidos teñidos que contienen celulosa, comprendiendo el método el tratamiento de tejidos teñidos que contienen celulosa con un polipéptido o composición como se ha. descrito anteriormente. Los métodos de la invención pueden realizarse tratando durante el lavado los tejidos que contienen celulosa. Sin embargo, si se desea, el tratamiento de tejidos también puede realizarse durante su inmersión o aclarado o simplemente añadiendo el polipéptido o la composición, como se ha descrito anteriormente, al agua en la que se encuentran los tejidos o en la que estos van a sumergirse.

Otros usos de las enzimas Adicionalmente, un polipéptido o composición de la presente invención también puede usarse en la formulación antibacteriana así como en productos farmacéuticos tales como pastillas para la garganta, dentríficos y colutorios.

Los siguientes Ejemplos ilustran la invención: EJEMPLOS Materiales y Métodos Procedimientos de ADN Salvo que se especifique otra cosa, los procedimientos de ADN convencionales se realizaron como se describe en cualquier documento bibliográfico (Sambrook et al., 1989, Molecular cloning: a laboratory manual, 2a Ed., Cold : Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, Nueva York) . El ADN se. amplificó usando la enzima correctora Physion polimerasa (Finnzymes). Las enzimas de restricción procedían de Invitrogen o de New England Biolabs. .

Se diseñaron mutantes que tenían mutaciones en ; las posiciones 6, 7, 34, 36, 41, 47, 48, 52, 77, 99, 101,, 144, 171, 177, 192, 194, 195, 196, 198, 200, 205, 232 , 243, 244, 245, 246, 247, 249, 255, 337, 343, 344, 346, 350, 367, -372, 375, 376, 393, y 396 de CBH-I. Los genes correspondientes optimizados por codones que expresaban las CBH mutantés se produ eron sintéticamente.

Usando procedimientos de ADN convencionales, para ' cada una de las posiciones, como se ha indicado anteriormente en el presente documento, el codón se aleatorizó y se ensayaron aproximadamente 96 clones que abarcaban aproximadamente 15-17 aminoácidos diferentes. Los genes correspondientes a las CBH mutantes, se transformaron en A. niger. Para obtener la expresión de las mutantes de un modo tan uniforme cofao fuese posible, tanto el vector de transformación como los protocolos de transformación se optimizaron para dirigir la integración a los loci preferidos, lo que minimiza la probabilidad de integración al azar así como la introducción de genes múltiples. , , Método para la determinación de las proteínas CBHI ' La CBHI se cuantificó con LC-MS, usando un procedimiento experimental adaptado a partir del método de Cuantificación Absoluta (AQUA) (Gerber, M. . efc al, 2003, Absolute quantification of proteins and phosphoproteins from cell lysates by tándem MS, , PNAS 100, páginas 6940-6945) , El patrón interno sintético LYLLQDDETYQI* F . LLNR que contenía isótopos pesados estables se usó para la cuanti ficación y el desarrollo del método. El patrón se graduó por cuanti ficación NMR antes de realizar los experimentos para garantizar que se añadía la cantidad de patrón interno correcta absoluta. El método de optimización se realizó usando el sobrenadante de la cepa que expresaba la CBHI WT (de tipo silvestre) con el patrón interno incorporado. El protocolo de digestión se optimizó en base al sitio de escisión de la Tripsina incluido en el patrón interno, monitorizando la versión no escindida y escindida del patrón interno.

Las muestras de CBHI mutante se procesaron en MTp unidos a lo recientes. Para purificar la proteína se realizó precipitación con TCA. Para mejorar la precipitación de la proteína se añadió BSA. La proteína precipitada se recogió por centrifugación y el sobrenadante se retiró- Los sedimentos de proteína se disolvieron en urea 8 1 M que contenía el patrón interno. Las muestras se diluyeron ,a \ < 2 M urea con NH4HC03 y se añadió Tripsina para la digestión proteolitica .

Las muestras se analizaron usando un Accela-LTQ-Orbitrap. La cuantificación se realizó determinando la proporción del área LC-MS del péptido de los mutantes CBHI o CBHI y el área LC-MS del patrón interno.

Método para determinación de la actividad CBHI Todas las CBH mutantes se exploraron con respectó a la actividad sobre paja de trigo lavada previamente tratada con ácido, al 2% DM en tampón acetato a pH 4,5 en combinación con una cantidad fija de beta-glucosidasa . La beta-glucosidasa que se usó en la mezcla procedía de Talaromyces emersonii , y se expresó en Aspergillus niger. Los filtrados concentrados de las enzimas se produjeron como se describe en el docujnento O2004/030468. Después del cultivo de Aspergillus níger que contenía los plásmidos de expresión apropiados, se prepararon los sobrenadantes acelulares por centrifugación del caldo de fermentación a 5000 xg durante 30 minutos a 4° C. manera opcional, el sobrenadante puede ajustarse a pH = 5 con KOH 4 N y filtrarse de modo estéril en un filtro de 2 µ?t? (frasco con tapón) con succión para eliminar cualquier material fúngico. Además, los sobrenadantes pueden filtrarse adicionalmente en un filtro de microfibra GF/A Whatma Glass (150 mm 25) para eliminar cualquier sólido. Los sobrenadantes pueden concentrarse y conservarse hasta su uso a 4o C o congelarse a -20° C.

La cantidad de BG y CBHI en este ensayo de exploración es de 2-3 mg de beta-glucosidasa por g de materia Seca de paja de trigo y 1-2 mg de CBHI por g de materia seca de paja de trigo. Las incubaciones se realizaron a 65 °C durante periodos de tiempo que variaban de 4 a 96 horas.

Un método alternativo seria ensayar la CBHI en una mezcla con BG, EG y CBHII en la que los intervalos de las diferentes enzimas pueden seleccionarse de la siguiente manera BG a 4-12%, EG a 18-50%, CBHII a 10-35% y CBHI a 10-60% de la dosis de proteina total de 10 mg por gramo de materia seca de paja de trigo. Las incubaciones se realizaron durante periodos de tiempo que variaban de 4 a 96 horas, y se compararon con un blanco al inicio de la incubación. Las reacciones finalizaron en el momento determinado, centrifugando el resto, pipeteando el sobrenadante y congelando las muestras hasta el análisis. El método de exploración para variantes mejoradas no está limitado a los ensayos proporcionados anteriormente. El sustrato puede ser de diferente origen. La forma en la que se reajl'ija" el tratamiento previo puede diferir. Las condiciones : dé los ensayo pueden variar, por ejemplo, sacarificación a diferente pH o a diferente temperatura. Además, la naturaleza de BG, EG y CBHII podría modificarse así como el ensayo podría comprender una, dos o tres clases de celulosa, por ejemplo uno, dos o todas de una endo-1 , 4 -ß-glucanasa (EG), una exo-celobiohidrolasa (CBH) y una ß-glucosidasa (BGL). Además pueden añadirse enzimas accesorias adicionales, tales como, por ejemplo, hemicelulasas y/o pectinasa. El ensayó se configura de tal manera que la enzima diana a mejorar s$a el factor limitante con respecto al rendimiento.

El análisis se realizó usando NMR en el modo de flujo. Los espectros 1H NMR se registraron en un sistema NMR de Bruker AVANCE II BEST que opera a una frecuencia protónica de 500 MHz y una temperatura de sonda de 27 °C.

Las mutantes que mostraban la mayor liberaCióh de glucosa y/o celobiosa se seleccionaron para la caracterización adicional.

Un método alternativo para explorar las mutantes fue incubar los sobrenadantes con un sustrato artificial, tal como para-nitrofenol-beta-celobiósido, como se describe en "Kinetic parameters and mode of action of , the cellobiohydrolases produced by Talaromyces emersonii , Biochimica et Biophysica Acta 1596 ( 2002 ): 366-380. ¦ ¦ Ejemplo 1 Actividad de CBHI mutantes sobre pNP celobiosido La cantidad de proteina CBHI en el sobrenadante filtrado de las fermentaciones de los matraces de agitación de transformantes que expresaban CBHI (EBA205 y mutantes) se determinó usando LC-MS. Se incubaron muestras que contenían 0,02 mg/ml de proteína CBHI, pNP-celobiósido 3 mM y gluconolactona 10 mM a 65 °C, pH 4,5 durante 10 y 30 minutos.

En la tabla se aprecia claramente que la actividad de las CBHI mutantes se ha mejorado tanto a los 10 como a los 30 minutos de medir el tiempo.

Tabla 1. Actividad de CBHI mutantes sobre pNP- celibiósido (U/mg). 1 U es la cantidad de enzima que puede liberar pNP 1 µ???? por min/ml en las condiciones del enrayo Ejemplo 2 Actividad de CBHI mutantes sobre paja d$ trigo previamente tratada La cantidad de proteína CBHI en el sobrenadante filtrado de las fermentaciones de los matraces de agitación de transformantes que expresaban CBHI (EBA205 y mutantes) se determinó usando LC-MS . Se incubaron muestras que contenían 1,0 mg/ml de proteína CBHI a 65 °C, pH 4,5 durante 17 y 70 horas.

Los resultados de la Tabla 2 muestran claramente la mejora de las CBHI mutantes en la liberación de glucosa a partir de pa a de trigo previamente tratada.

Tabla 2. Actividad CBHI mutantes sobre paja de, trigo previamente tratada. La actividad se proporciona mM de glucosa liberada a las 17 y 70 horas.

Ejemplo 3 Relaciones de respuesta a la dosis de CBHI mutantes en una mezcla de celulasa La actividad de las CBHI mutantes en una mezcla de celulasa se sometió a ensayo a diferentes dosis. Se determinó la dosis de las mutantes que podían liberar la misma cantidad de glucosa que una dosis de 1,5 y 3,0 mg/ml de EBA205 y se presentó en las Tablas 3 y 4 respectivamente .

La actividad de las CBHI mutantes se sometió a ensayo con una mezcla enzimática que contenia EG, BG y CBHII en la proporción 4,1: 1:2,8. La mezcla enzimática se dosificó1 a 7,0 mg/g de DM y se añadieron diferentes dosis de CBHI. Se determinó la dosis de las mutantes que podían liberar la misma cantidad de glucosa que una dosis de 1,5 y 3,0 mg/ml de EBA205 y se presentó en las Tablas 3 y 4.

Las Tablas 3 y 4 muestran claramente que las CBHI mutantes permiten una dosis más baja de CBHI en la mezcla de celulasa .

Tabla 3. Dosis de CBHI mutante para obtener liberaciones de glucosa similares a EBA205 a 1,5 mg/g de1 DM a diferentes momentos (n.d. no determinado) Tabla 4. Dosis de CBHI mutantes para obtener liberaciones de glucosa similares a EBA205 a 3,0 mg/g e DM a diferentes momentos (n.d. no determinado) ; 83

Claims (20)

NOVEDAD DE LA INVENCIÓN Habiendo descrito la presente invención como antecede/ se considera como una novedad, y por lo tanto, se reclama como propiedad lo contenido en las siguientes: REIVINDICACIONES

1. - Celobiohidrolasa mutante, que es una mutante de la SEQ ID NO; 1, que tiene una sustitución en la posición N247(I, F, H, W) de la SEQ ID NO: 1, caracterizada por que la celobiohidrolasa mutante presenta una identidad de secuencia de al menos 50% con la SEQ ID NO: 1 y por que la celobiohidrolasa mutante tiene actividad CBHI . , ,

2. - La celobiohidrolasa mutante de acuerdo con la reivindicación 1, caracterizada por que la mutante tiene la sustitución N247F. 1 '

3. - La celobiohidrolasa mutante de acuerdo . Qon la reivindicación 1, caracterizada por que la mutante ¾¾efte la sustitución N247H.

4. - La celobiohidrolasa mutante de acuerdo ¡ con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, caracterizada por que la CBH-I tiene la secuencia de aminoácidos como se, expone en la SEQ ID NO: 1 y dicha mutante tiene una sustitución o deleción en una posición que corresponde a uno o má$ de los residuos F427, 163 , G357, S36, D77 y o Q232. : :: :

5. - La celobiohidrolasa mutante de acuerdo con la reivindicación 4, caracterizada por que la mutante tiene una o más de las siguientes sustituciones: F427I, 163N, G357R, S36E, D77M y/o Q232A.

6. - La celobiohidrolasa mutante de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5, caracterizada por que la CBH-I tiene la secuencia de aminoácidos Como se expone en la SEQ ID NO: 1 y dicha mutante tigne una sustitución o deleción en una posición que corresponde, a uno o más de los residuos T52, V101, S192, T198, T246,, T344, D346, A375 y/o A376.

7. - La celobiohidrolasa mutante de acuerdo con la reivindicación 6, caracterizada por que la mutante tiene una o más de las siguientes sustituciones: T52(G, M, Y, D, H, , R), V10MT, I, Ff H), S192(A, I, F, Q, H), T198(A, G,: V, P, D, H), T246(Gr A, Y, N, H), T344(A, S, C, L, I, ¾f, , W) , D346(P, F, G, R), A375(G, I, W, Y, H, K, R) y/o ?376(? ;V, L, Y, W, D) . .

8. - La celobiohidrolasa mutante de acuerdo con la reivindicación 1, caracterizada por que la mutante tiene una o más de las siguientes sustituciones: T52 (M, D, R), V101(I, F), S192F, T198(A, H), T246N, T344(Y, C, L), D346( ¡, G) , A375(Y, H) y/o A376(Y, W) .

9. - La celobiohidrolasa mutante de acuerdo con la reivindicación 8, caracterizada por que la mutante tiene una o más de las siguientes sustituciones: T52D, V101F, S192F, T198H, T246N, T344Y, D346G, A375Y y/o A376Y.

10. - La celobiohidrolasa mutante de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 9, caracterizada por que la mutante tiene una o más sustiticiones o deleciones en una posición que corresponde a uno o más de los residuoá A6, T7, L34, V41, Y47, T48, S99, V144, S171, L177, N194, N195, A196, 1200, S205f T243, Y244, S245, Y249, P255, Q337, 0343, H350, V367, D372, T393 y/o V396.

11. - La celobiohidrolasa mutante de acuerdo con la reivindicación 8, que comprende una sustitución de C,' P, G, A, V, L, I, M, F, W, Y, H, S, T, N, Q, D, E, , R, o una deleción, en cualquiera de las posiciones. ? i

12. - Polinucleótido que codifica la celobiohidrolasa mutante de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 11.

13.- Construcción de ácido nucleico que comprende el polinucleótido de la reivindicación 12. : 1

14. - Célula hospedadora transformada con la construcción de ácido nucleico de la reivindicación 13. , ;

15. - Método para producir una CBH mutante que comprende las etapas de: (a) cultivar la célula hospedadora transformada de acuerdo con la reivindicación 14 en un medio de cultivo adecuado en condiciones adecuadas para producir una celobiohidrolasa mutante; (b) obtener dicha celobiohidrolasa mutante producida; y opcionalmente (c) purificar dicha celobiohidrolasa mutante para proporcionar una celobiohidrolasa mutante purificada.

16.- Composición enzimática que comprende una o más celobiohidrolasas mutantes de acuerdo con cualquiera dé las reivindicaciones 1 a 7 o producida de acuerdo con el , método de la reivindicación 15.

17. - Procedimiento para la degradación de material ligno-celulósico o hemi-celulósico caracterizado por que el material ligno-celulósico o hemi-celulósico se pone en contacto con una composición enzimática de acuerdOi con la reivindicación 16. ;'" 1

18. - El procedimiento de acuerdo con la reivindicación I I 17, caracterizado por que se produce uno o más azúcares.

19. - El procedimiento de acuerdo con la reivindicación 18, caracterizado por que el azúcar producido se fermenta para proporcionar un producto de fermentación.

20.- El procedimiento de acuerdo con la reivindicación 19, caracterizado por que el producto de fermentación es uno o más de etanol, butanol, ácido láctico, un plástico, un ácido orgánico, un disolvente, un complemento para pienso animal, un producto farmacéutico, una vitamina, un aminoácido, una enzima o una materia prima química.