WO2015182570A1 - 熱安定性が改善されたセロビオハイドロラーゼ - Google Patents

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thermal stability
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石川　一彦
誠一郎 岸下
誠 中林
沙織 蒲池
敏彰 柳本
藤井　達也
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国立研究開発法人産業技術総合研究所
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    • C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
    • C12N9/14—Hydrolases (3)
    • C12N9/24—Hydrolases (3) acting on glycosyl compounds (3.2)
    • C12N9/2402—Hydrolases (3) acting on glycosyl compounds (3.2) hydrolysing O- and S- glycosyl compounds (3.2.1)
    • C12N9/2405—Glucanases
    • C12N9/2434—Glucanases acting on beta-1,4-glucosidic bonds
    • C12N9/2437—Cellulases (3.2.1.4; 3.2.1.74; 3.2.1.91; 3.2.1.150)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
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    • C12P19/12—Disaccharides
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
    • C12P19/00—Preparation of compounds containing saccharide radicals
    • C12P19/14—Preparation of compounds containing saccharide radicals produced by the action of a carbohydrase (EC 3.2.x), e.g. by alpha-amylase, e.g. by cellulase, hemicellulase
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Y—ENZYMES
    • C12Y302/00—Hydrolases acting on glycosyl compounds, i.e. glycosylases (3.2)
    • C12Y302/01—Glycosidases, i.e. enzymes hydrolysing O- and S-glycosyl compounds (3.2.1)
    • C12Y302/01091—Cellulose 1,4-beta-cellobiosidase (3.2.1.91)

Definitions

  • the present invention relates to a thermostable cellobiohydrolase with improved thermostability and applied technology thereof.
  • Cellulases which are cellulolytic enzymes, can be broadly divided into cellobiohydrase (also referred to as “CBH” in this document) that acts on the crystalline region of cellulose and endoglucanase that acts from the inside of the cellulose molecular chain to reduce the molecular weight. It is done.
  • ⁇ -glucosidase is an enzyme that acts on a water-soluble oligosaccharide or cellobiose to catalyze a reaction of hydrolyzing its ⁇ -glycoside bond.
  • CBH is classified into two types, CBHI and CBHII, depending on the mode of action.
  • CBHI is an enzyme classified as GH7, which is cleaved at the cellobiose unit from the reducing end of the cellulose chain to form a tunnel structure having four long loops covering the active site and the substrate binding site. Therefore, the cocoon cellulose chain passes through this tunnel and is cleaved by cellobiose from the end.
  • CBHII is classified as GH6 and is an enzyme that cleaves at the cellobiose unit from the non-reducing end of the cellulose chain.
  • an object of the present invention is to provide CBHI having more excellent thermal stability.
  • amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1 an amino acid sequence having 85% or more identity with the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1, or a substitution or insertion of one or several amino acids in the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1,
  • mutation (A) and / or (B) (A) one or more amino acid substitutions selected from the group consisting of S42Q, T43E, K45T, S46A, G47P, N53Q, S54N, T262G, S298P, A426P, and V451F; (B) substitution of the amino acid region of positions 413 to 416 in the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 1 with the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 2; And Cellobiohydrolase activity, and improved thermal stability, Having a polypeptide.
  • Item 2. A polynucleotide encoding the polypeptide according to Item 1.
  • Item 3. An expression vector incorporating the polynucleotide according to Item 2.
  • Item 4. A transformant transformed with the vector according to Item 3.
  • Item 5. Item 4.
  • Item 6. A method for producing cellobiose, comprising a step of allowing the polypeptide of Item 1 to act on a sample containing cellulose.
  • cellobiohydrolase having excellent thermostability is provided. Therefore, biomass can be efficiently saccharified by using the present invention.
  • FIG. 1 shows the results of measuring the residual activity of CBHI after heat treatment.
  • FIG. 2 shows the results of examining the optimum temperatures of mutant 6 and wild-type CBHI when microcrystalline cellulose is used as a substrate.
  • amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 1 is an amino acid sequence constituting wild-type CBHI derived from the filamentous fungus Talaromyces cerulolyticus, and this sequence is known.
  • CBHI with improved thermal stability is 1 in the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 1, the amino acid sequence having 85% or more identity with the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 1, or the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 1.
  • it is preferable that it is a polypeptide which has an amino acid sequence containing the specific amino acid substitution mentioned later in the amino acid sequence by which several amino acid was substituted, inserted, added, and / or deleted.
  • amino acid sequence having 85% or more identity with the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 1 and “one or several amino acids in the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 1 are substituted, inserted, added, And / or “deleted amino acid sequence” may be collectively referred to as “amino acid sequence corresponding to SEQ ID NO: 1”.
  • the calculation can be performed by using default (initial setting) parameters in Basic • Local • Alignment • Search • Tool (BLAST) of National • Center • for • Biotechnology • Information (NCBI).
  • the amino acid sequence having 85% or more identity with the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 1 preferably has 90% or more identity with the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 1, more preferably It has 95% or more identity with the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 1, more preferably 98% identity or more with the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 1, and still more preferably shown in SEQ ID NO: 1. And 99% or more identity with the amino acid sequence.
  • amino acid sequence in which one or several amino acids are substituted, inserted, added, and / or deleted in the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 1 means that CBHI is a cellobiohydrolase activity. And as long as it has improved thermal stability, it is not particularly limited, for example, 50, 45, 30, 25, 20, 15, 10, 5, 3, or 2. The “several” herein does not include the number of substituted amino acids added to improve the thermal stability described later.
  • the type of substitution is not particularly limited, but has a significant negative influence on the higher-order structure, phenotype or characteristics of the polypeptide. From the viewpoint of not giving a conservative amino acid substitution is preferable.
  • Constant amino acid substitution refers to substitution of an amino acid residue with an amino acid residue having a side chain of similar properties.
  • the amino acid residue is a basic side chain (for example, lysine, arginine, histidine), an acidic side chain (for example, aspartic acid, glutamic acid), an uncharged polar side chain (for example, glycine, asparagine, glutamine, serine, Threonine, tyrosine, cysteine), non-polar side chains (eg, alanine, valine, leucine, isoleucine, proline, phenylalanine, methionine, tryptophan), ⁇ -branched side chains (eg, threonine, valine, isoleucine), aromatic side chains ( For example, it can be classified into tyrosine, phenylalanine, tryptophan, histidine). Therefore, the amino acid substitution is preferably performed between other amino acid residues belonging to the same category as the amino acid present in the original amino acid sequence.
  • substitution here is different from the substitution added to improve the thermal stability described later.
  • Mutations such as amino acid substitutions, deletions, insertions and / or additions occur in regions that do not significantly affect the higher order structure of the polypeptide or in regions that are not directly involved in catalytic activity (eg, regions other than the active center). It is preferred that Examples of such a region include a region exposed on the surface of the protein.
  • Techniques for adding mutations such as substitution, deletion, insertion or addition of one or several amino acids to a specific amino acid sequence are known in the art, and can be performed using any method. For example, restriction enzyme treatment, treatment with exonuclease or DNA ligase, position-directed mutagenesis, random mutagenesis, etc. can be used.
  • Substitutions added to improve the thermal stability of CBHI are (A) from S42Q, T43E, K45T, S46A, G47P, N53Q, S54N, T262G, S298P, A426P, and V451F.
  • the symbols representing the respective substitutions in (A) above the numbers mean the amino acid positions in the amino acid sequence of SEQ ID NO: 1.
  • the alphabet before the number means the type of amino acid originally present at that position.
  • the alphabet after the number means the type of amino acid that replaces the naturally occurring amino acid.
  • S42Q means that the 42nd serine (S) in the amino acid sequence of SEQ ID NO: 1 is substituted with glutamine (Q). The same applies to symbols representing other substitutions.
  • amino acid sequence at positions 413 to 416 in the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 1 is NATG (SEQ ID NO: 11), and is shown by SEQ ID NO: 2 that replaces this region.
  • the amino acid sequence is DADPT.
  • amino acid substitutions (A) and (B) only one type may be added to the amino acid sequence of SEQ ID NO: 1 or the amino acid sequence corresponding thereto, or the amino acid sequence of SEQ ID NO: 1 in combination of two or more types Alternatively, it may be added to the corresponding amino acid sequence.
  • the combination is arbitrary.
  • the number of amino acid substitutions to be combined is also arbitrary, for example, 2 or more, 3 or more, 4 or more, 5 or more, 6 or more, 7 or more, 8 or more, 9 or more, 10 or more , 11 or more, or all 12 types.
  • preferred amino acid substitution combinations are S42Q, T43E, K45T, S46A, G47P, N53Q, and S54N.
  • a preferred amino acid substitution combination in one embodiment is T262G, S298P, and A426P in one embodiment.
  • preferred amino acid substitution combinations are T262G, S298P, A426P, N413D, T415D, and G416P.
  • the polypeptide has improved thermal stability. Improved thermostability refers to having higher thermal stability compared to wild type CBHI having the amino acid sequence of SEQ ID NO: 1 (ie, inactivated over wild type CBHI under the same temperature conditions). Meaning difficult).
  • Thermal stability can be measured by any method.
  • the protein-thermal-shift assay Kerishita et al., Protein-Expr Purif. Can be requested.
  • the denaturation temperature of wild-type CBHI is 63 ° C., and thus CBHI with improved thermal stability preferably has a denaturation temperature higher than 63 ° C.
  • Such denaturation temperatures are, for example, 64 ° C or higher, 65 ° C or higher, 66 ° C or higher, 67 ° C or higher, 68 ° C or higher, 69 ° C or higher, 70 ° C or higher, 71 ° C or higher, 72 ° C or higher, 73 ° C or higher, 74 More than 75 degreeC and 75 degreeC or more.
  • Thermal stability can be evaluated based on the residual activity after heat treatment by holding CBHI at a certain temperature for a predetermined time (heat treatment) and measuring the enzyme activity before and after that. If the residual activity is higher than the residual activity of wild-type CBHI, it can be evaluated that the thermal stability is improved.
  • CBHI has a residual activity of preferably 50% or more, more preferably 55% or more, and more preferably 60% or more when held at 65 ° C. for 5 minutes. More preferably, it is more preferably 70% or more.
  • activity and “enzyme activity” mean cellobiohydrolase activity, unless otherwise indicated.
  • a method for measuring cellobiohydrolase activity is known, and any method can be selected and measured.
  • a method of measuring free PNP using a synthetic substrate PNP-Lac as a substrate, which is employed in Examples described later, can be mentioned.
  • a polypeptide which is CBHI with improved thermal stability can be produced by genetic engineering techniques using a polynucleotide encoding it.
  • the polypeptide can also be produced using general protein chemical synthesis methods (for example, liquid phase method and solid phase method) based on the amino acid sequence information shown in SEQ ID NO: 1. .
  • a polynucleotide encoding a polypeptide that is CBHI with improved thermal stability is based on the nucleotide sequence encoding the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 1 and the type and position of the introduced substitution and other mutations. And can be easily obtained using a chemical DNA synthesis method (for example, phosphoramidite method) or a genetic engineering technique.
  • the polynucleotide is preferably a polynucleotide that is present in an isolated state.
  • the base sequence encoding the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 1 is known.
  • the above-described polypeptide can be produced by incorporating the above-described polynucleotide into an arbitrary vector in an expressible state, introducing it into a host suitable for the type of the vector, and expressing it.
  • the vector type can be appropriately selected in consideration of the host cell type.
  • a plasmid vector, a cosmid vector, a phage vector, a virus vector for example, an adenovirus vector, a retrovirus vector, a herpes virus vector, etc.
  • a virus vector for example, an adenovirus vector, a retrovirus vector, a herpes virus vector, etc.
  • the host cell used for introducing the expression vector is not particularly limited as long as the polypeptide can be produced, and may be either a prokaryotic cell or a eukaryotic cell.
  • Escherichia coli bacteria such as Escherichia coli (for example, HB101, MC1061, JM109, CJ236, MV1184 etc.), coryneform bacteria such as Corynebacterium glutamicum, actinomycetes such as Streptomyces bacteria, Prokaryotic cells such as Bacillus bacteria such as Bacillus subtilis, Streptococcus bacteria, Staphylococcus bacteria; Yeasts such as Saccharomyces, Pichia and Kluyveromyces, Aspergillus, Penicillium, Trichoderma and Acremonium And other fungal cells; insect cells such as Drosophila S2, Spodoptera Sf9, and silkworm cultured cells; and plant cells.
  • Polypeptides can also be produced in the medium using the protein secret
  • the method for introducing the expression vector into the host cell can be carried out by a conventionally used method.
  • a conventionally used method examples thereof include various methods such as a competent cell method, a protoplast method, an electroporation method, a microinjection method, and a liposome fusion method.
  • Specific examples of the method for introduction into coryneform bacteria include the protoplast method (Gene, 39, 281-286 (1985)) and the electroporation method (Bio / Technology, 7, 1067-1070) (1989)). Etc. can be used, but is not limited thereto.
  • a host cell for example, a transformant into which an expression vector has been introduced can be used to produce a polypeptide that is CBHI having improved thermostability.
  • the transformant can also be used as it is for saccharification of biomass containing cellulose.
  • the production of the polypeptide using the transformant can be carried out by culturing the transformant and recovering the polypeptide from the culture.
  • the culture can be performed by subculture or batch culture using a medium suitable for the host. Culturing can be carried out until an appropriate amount is obtained using the activity of the polypeptide produced inside or outside the transformant as an index.
  • various media commonly used according to the host cell can be appropriately selected and used, and the culture can be performed under conditions suitable for the growth of the host cell.
  • a nutrient medium such as an LB medium or a medium obtained by adding a carbon source, a nitrogen source, a vitamin source or the like to a minimal medium such as an M9 medium can be used for culturing Escherichia coli.
  • Culture conditions can also be set as appropriate according to the type of host. Usually, the cells are cultured at 16 to 42 ° C., preferably 25 to 37 ° C. for 5 to 168 hours, preferably 8 to 72 hours. Depending on the host, either shaking culture or stationary culture is possible, but stirring may be performed as necessary, and aeration may be performed. When an inducible promoter is used, the culture can be performed by adding a promoter inducer to the medium.
  • Purification or isolation of the polypeptide from the culture can be performed by appropriately combining known techniques. For example, ammonium sulfate precipitation, ethanol or other solvent precipitation, dialysis, ultrafiltration, acid extraction, and various chromatography (eg gel filtration chromatography, anion or cation exchange chromatography, phosphocellulose chromatography, hydrophobic interaction chromatography) , Affinity chromatography, hydroxyapatite chromatography and lectin chromatography, high performance liquid chromatography, etc.).
  • a carrier used for affinity chromatography for example, a carrier to which an antibody against the polypeptide is bound, or a carrier to which a substance having an affinity for the tag is bound when a tag is added to the polypeptide. You can also.
  • the transformed cells can be disrupted and purified or isolated from the centrifuged supernatant of the disrupted product in the same manner as described above.
  • the cells collected by centrifugation are suspended in a cell disruption buffer (20-100 mM Tris-HCl (pH 8.0), 5 mM EDTA), subjected to ultrasonic disruption, and the disruption treatment solution is 10,000.
  • the supernatant can be obtained by centrifugation at ⁇ 15000 rpm for 10-15 minutes.
  • the precipitate after centrifugation can be further purified after solubilization with guanidinium hydrochloride or urea, if necessary.
  • the biomass resource By bringing the polypeptide into contact with a sample containing cellulose (for example, a cellulosic biomass resource), the biomass resource can be decomposed to produce a sugar solution.
  • a sugar solution can also be produced more efficiently by using an enzyme such as another cellulase together.
  • the type of cellulosic biomass is not particularly limited as long as it can be decomposed by CBHI.
  • Examples thereof include bagasse, wood, bran, wheat straw, rice straw, rice bran, soybean meal, soybean okara, coffee cake, rice cake, and the like. Can do.
  • the temperature condition can be set to 5 to 90 ° C., preferably 15 to 80 ° C., more preferably 30 to 75 ° C., more preferably 50 to 70 ° C. or 50 to 65 ° C.
  • temperature conditions can be set to 63 degreeC or more, 64 degreeC or more, 65 degreeC or more, and 66 degreeC or more.
  • the pH can be carried out under conditions of pH 4-9.
  • the amount of polypeptide to be added is not particularly limited, and can be, for example, in the range of 0.1 to 0.5% (w / w).
  • a gene (polynucleotide) encoding CBHI derived from Talalomyces cerulolyticus was cloned and ligated downstream of the starch-inducible glucoamylase promoter and the CBHI signal sequence derived from the same organism to construct an expression plasmid vector (Inoueouet al , J. Ind. Microbiol. Biotechnol., 2013, 40: 823-830). Escherichia coli (DH5 ⁇ ) was transformed with this expression vector. The obtained plasmid was purified, and mutations were introduced into the gene by the quick change method using this plasmid as a template.
  • mutants were prepared using the primer sets shown in Table 1 below alone or in combination: mutation in which threonine at position 262 was replaced with glycine in the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1 Body 1; Mutant 2 in which serine at position 298 is replaced with proline; Mutant 3 in which alanine at position 426 is replaced with proline; Asparagine at position 413 is replaced with aspartic acid and threonine at position 415 4 in which is substituted with aspartic acid and glycine at position 416 is replaced with proline; mutant 5 in which mutations 1 to 3 are combined; mutant in which mutations 1 to 4 are combined 6; Serine at position 42 is replaced with glutamine, threonine at position 43 is replaced with glutamic acid, lysine at position 45 is replaced with threonine, Mutant 7 wherein serine at position 6 is substituted with alanine, glycine at position 47 is replaced with proline, asparagine at position 53
  • a primer set (F1 and F2) corresponding to substitution of amino acids at positions 42 to 47 and a primer set (F2 and F2) corresponding to substitution of amino acids at positions 53 and 54 was used.
  • the sequence of the gene into which the mutation was introduced was confirmed by sequencing, and Talaromyces cerrolyticus was transformed with the plasmid in which each gene was incorporated.
  • the transformant was cultured in a starch medium, and mutant CBHI was secreted outside the cells.
  • the culture broth was collected and ammonium sulfate was added so as to be 60% saturated.
  • the precipitate was collected with a centrifuge, dissolved in 20 mM MES buffer (pH 6.5), and then desalted using a desalting column HiPrep desalting 26/10 equilibrated with the same buffer.
  • the desalted sample was applied to an ion exchange column ResourceQ equilibrated with 20 mM MES buffer (pH 6.5) and eluted with 20 mM MES buffer (pH 6.5) containing 1 M sodium chloride. After adding ammonium sulfate so that the elution fraction showing CBH1 activity becomes 1.2 M, it was applied to a hydrophobic column Resource Iso equilibrated with 20 mM sodium acetate buffer (pH 5.5) containing 1.2 M ammonium sulfate, and 20 mM. Elution with sodium acetate buffer (pH 5.5) and concentration of active fractions were concentrated. For this section, it was confirmed that SDS-PAGE showed a single band, and purification was completed. The enzyme purified in this way was measured for heat resistance and activity.
  • the enzyme activity was determined by measuring the released PNP using the synthetic substrate PNP-Lac.
  • the heat resistance is the denaturation temperature (Tm) at which the three-dimensional structure of the enzyme protein changes using the protein thermal shift assay (TSA) described in Kishishita et al., (Protein Expr Purif. 2014 Feb; ) Was measured and evaluated.
  • TSA protein thermal shift assay
  • TSA was performed using each CBHI mutant enzyme dissolved in 20 mM sodium acetate buffer (pH 5.0). The measurement results are shown in Table 2 below.
  • mutants 1 to 8 all had improved heat resistance (thermal stability) compared to the wild-type enzyme.
  • thermal stability the improvement in thermal stability was remarkable.
  • mutants 1 to 8 have a slightly reduced enzyme activity compared to wild type, but are negligible considering the improved thermal stability.
  • a 20 mM sodium acetate buffer (pH 5.0) containing either wild type CBHI or mutants 1 to 8 at a concentration of 0.02 to 0.05 mg / ml was prepared. This was maintained at a temperature of 65 ° C., and after 1 minute, 5 minutes, 10 minutes, 15 minutes, 30 minutes, 60 minutes, and 90 minutes, a part of the enzyme solution was taken out and its remaining activity was reduced to 45%. Measured at ° C. The substrate was 1 mM PNP-Lactose and the same measurement method as described above was used. The residual activity was calculated with the activity at the start of treatment at 65 ° C. (that is, 0 minute) as 100%. The results are shown in FIG. As shown in FIG.
  • mutants 6 and 8 showed no decrease in activity even after 60 minutes.
  • mutant 6 and wild type CBHI were examined using microcrystalline cellulose (Avicel) (FIG. 2).
  • Mutant 6 and wild-type CBHI were reacted in a buffer solution (pH 5.0) containing a microcrystalline cellulose (Avicel) substrate at 50 ° C. to 75 ° C. for 2 hours, and the solubilized sugar released was quantified by reducing power. .
  • FIG. 2 it was confirmed that the mutant 6 has an optimum temperature higher than that of the wild type even when microcrystalline cellulose is used as a substrate. Similar trends are expected for other mutants.

Abstract

熱安定性に優れたＣＢＨＩを提供すること 配列番号１に示されるアミノ酸配列、配列番号１に示されるアミノ酸配列と８５％以上の同一性を有するアミノ酸配列、或いは配列番号１に示されるアミノ酸配列において１又は数個のアミノ酸が置換、挿入、付加、及び／又は欠失されたアミノ酸配列において、下記（Ａ）及び／又は（Ｂ）の変異： （Ａ）Ｓ４２Ｑ、Ｔ４３Ｅ、Ｋ４５Ｔ、Ｓ４６Ａ、Ｇ４７Ｐ、Ｎ５３Ｑ、Ｓ５４Ｎ、Ｔ２６２Ｇ、Ｓ２９８Ｐ、Ａ４２６Ｐ、及びＶ４５１Ｆから成る群より選択される１種以上のアミノ酸置換； （Ｂ）配列番号１に示されるアミノ酸配列における第４１３位～第４１６番目のアミノ酸領域の配列番号２で示されるアミノ酸配列との置換； を有し、且つ、 セロビオハイドロラーゼ活性、及び 改善された熱安定性、 を有する、ポリペプチド。

Description

熱安定性が改善されたセロビオハイドロラーゼ
　本発明は、熱安定性が改善された熱安定性を有するセロビオハイドロラーゼ及びその応用技術等に関する。
　セルロースの糖化には様々な手法があるがエネルギー使用量が少なく、かつ糖収率の高い酵素糖化法が開発の主流となっている。セルロース分解酵素であるセルラーゼを大別すると、セルロースの結晶領域に作用するセロビオハイドラーゼ（本書では、「ＣＢＨ」とも称する）とセルロース分子鎖内部から作用して分子量を低減させるエンドグルカナーゼとに分けられる。またβグルコシダーゼは、水溶性オリゴ糖又はセロビオースに作用し、そのβ－グリコシド結合を加水分解する反応を触媒する酵素である。これらの中で、セロビオハイドラーゼはセルロースの結晶領域に作用してセルロースを末端から加水分解するため、効率的な糖化に最も重要であり、大量に使用される酵素である。ＣＢＨは作用様式の違いからＣＢＨＩとＣＢＨＩＩという２種類に分類される。ＣＢＨＩはＧＨ７に分類される酵素でセルロース鎖の還元性末端からセロビオース単位で切断し、活性部位及び基質結合部位を覆う4つの長いループを持つトンネル構造を形成している。そのため、 セルロース鎖はこのトンネルを通過し末端からセロビオース単位で切断される。ＣＢＨＩＩは、ＧＨ６に分類され、セルロース鎖の非還元性末端からセロビオース単位で切断する酵素であり、活性部位を覆う２つのループ構造が存在し、このループによって触媒部位がトンネル状の構造を形成する。
　これらの酵素群を用いたバイオマスの糖化反応は、その更なる効率化が望まれている。特に、酵素の熱安定性（耐熱性）を向上させることにより、雑菌汚染回避、反応効率の向上、及び酵素の再利用を通した効率化が可能になる。
特開2001-17180
Inoue et al., J.Ind. Microbiol. Biotechnol. 2013 Aug;40(8):823-30. Kishishita et al., Protein Expr Purif. 2014 Feb;94:40-5. Grassick et al., European Journal of Biochemistry Volume 271, Issue 22, pages 4495-4506, November 2004
　上記のような現状の下、本発明は、より熱安定性に優れたＣＢＨＩを提供することを一つの目的とする。
　上記課題等を解決すべく鋭意研究を重ね、本発明者らは、タラロマイセス・セルロィティカス由来のＣＢＨＩのアミノ酸配列の特定のアミノ酸を置換することにより、その酵素活性を維持しつつ、熱安定性を顕著の向上させることが可能であることを見出した。本発明者らは、斯かる知見を基に更なる研究を重ね、本発明を完成するに至った。代表的な本発明を下記に示す。
項１．
配列番号１に示されるアミノ酸配列、配列番号１に示されるアミノ酸配列と８５％以上の同一性を有するアミノ酸配列、或いは配列番号１に示されるアミノ酸配列において１又は数個のアミノ酸が置換、挿入、付加、及び／又は欠失されたアミノ酸配列において、下記（Ａ）及び／又は（Ｂ）の変異：
（Ａ）Ｓ４２Ｑ、Ｔ４３Ｅ、Ｋ４５Ｔ、Ｓ４６Ａ、Ｇ４７Ｐ、Ｎ５３Ｑ、Ｓ５４Ｎ、Ｔ２６２Ｇ、Ｓ２９８Ｐ、Ａ４２６Ｐ、及びＶ４５１Ｆから成る群より選択される１種以上のアミノ酸置換；
（Ｂ）配列番号１に示されるアミノ酸配列における第４１３位～第４１６番目のアミノ酸領域の配列番号２で示されるアミノ酸配列との置換；
を有し、且つ、
セロビオハイドロラーゼ活性、及び
改善された熱安定性、
を有する、ポリペプチド。
項２．
項１に記載のポリペプチドをコードするポリヌクレオチド。
項３．
項２に記載のポリヌクレオチドを組み込んだ発現ベクター。
項４．
項３に記載のベクターで形質転換された形質転換体。
項５．
項４に記載の形質転換体を培養する工程を含む、項１に記載のポリペプチドの製造方法。項６．
項１に記載のポリペプチドをセルロースを含む試料に作用させる工程を含む、セロビオースを製造する方法。
　本発明に従えば、熱安定性に優れたセロビオハイドロラーゼが提供される。よって、本発明を利用することにより、効率的にバイオマスの糖化を行うことができる。
図１は、熱処理後のＣＢＨＩの残存活性を測定した結果を示す。 図２は、微結晶性セルロースを基質とした場合の変異体６及び野生型ＣＢＨＩの最適温度を調べた結果を示す。
　配列番号１に示されるアミノ酸配列は、糸状菌であるタラロマイセス・セルロィティカス由来の野生型ＣＢＨＩを構成するアミノ酸配列であり、当該配列は公知である。
　熱安定性が改善されたＣＢＨＩは、配列番号１に示されるアミノ酸配列、配列番号１に示されるアミノ酸配列と８５％以上の同一性を有するアミノ酸配列、或いは配列番号１に示されるアミノ酸配列において１又は数個のアミノ酸が置換、挿入、付加、及び／又は欠失されたアミノ酸配列において、後述する特定のアミノ酸置換を含むアミノ酸配列を有するポリペプチドであることが好ましい。本書において、「配列番号１に示されるアミノ酸配列と８５％以上の同一性を有するアミノ酸配列」、並びに、「配列番号１に示されるアミノ酸配列において１又は数個のアミノ酸が置換、挿入、付加、及び／又は欠失されたアミノ酸配列」を纏めて「配列番号１に相当するアミノ酸配列」と称する場合がある。
　アミノ酸配列の同一性は、市販の又は電気通信回線（インターネット）を通じて利用可能な解析ツールを用いて算出することができ、例えば、ClustalW ver2.1 Pairwise Alignment（http://clustalw.ddbj.nig.ac.jp/index.php?lang=ja）を使用し、デフォルトのパラメータを用いて算出することができる。また、National Center for Biotechnology Information（NCBI）のBasic Local Alignment Search Tool（BLAST）においてデフォルト（初期設定）のパラメータを用いることにより、算出することができる。
　一実施形態において、配列番号１に示されるアミノ酸配列と８５％以上の同一性を有するアミノ酸配列は、好ましくは配列番号１に示されるアミノ酸配列と９０％以上の同一性を有し、より好ましくは配列番号１に示されるアミノ酸配列と９５％以上の同一性を有し、更に好ましくは配列番号１に示されるアミノ酸配列と９８％以上の同一性を有し、より更に好ましくは配列番号１に示されるアミノ酸配列と９９％以上の同一性を有する。
　上述する「配列番号１に示されるアミノ酸配列において１又は数個のアミノ酸が置換、挿入、付加、及び／又は欠失されたアミノ酸配列」における「数個」とは、CBHIがセロビオハイドロラーゼ活性及び改善した熱安定性を有する限り特に制限されず、例えば、５０個、４５個、３０個、２５個、２０個、１５個、１０個、５個、３個、又は２個である。尚、ここでいう「数個」には、後述する熱安定性を向上させるために加えられる置換されたアミノ酸の数は含まれない。
　配列番号１に示されるアミノ酸配列において１又は数個のアミノ酸が置換されている場合、その置換の種類は、特に制限されないが、ポリペプチドの高次構造、表現形又は特性に顕著な負の影響を与えないという観点から保存的アミノ酸置換が好ましい。「保存的アミノ酸置換」とは、あるアミノ酸残基を、同様の性質の側鎖を有するアミノ酸残基に置換することをいう。アミノ酸残基はその側鎖によって塩基性側鎖（例えば、リシン、アルギニン、ヒスチジン）、酸性側鎖（例えば、アスパラギン酸、グルタミン酸）、非荷電極性側鎖（例えば、グリシン、アスパラギン、グルタミン、セリン、スレオニン、チロシン、システイン）、非極性側鎖（例えば、アラニン、バリン、ロイシン、イソロイシン、プロリン、フェニルアラニン、メチオニン、トリプトファン）、β分岐側鎖（例えば、スレオニン、バリン、イソロイシン）、芳香族側鎖（例えば、チロシン、フェニルアラニン、トリプトファン、ヒスチジン）に分類することができる。よって、アミノ酸置換は、もとのアミノ酸配列に存在するアミノ酸と同一の上記カテゴリーに属する他のアミノ酸残基間で置換されることが好ましい。尚、ここでいう「置換」は、後述する熱安定性を向上させるために加えられる置換とは異なる。
　アミノ酸の置換、欠失、挿入及び／又は付加等の変異は、ポリペプチドの高次構造に顕著に影響しない領域や触媒活性に直接的に関与しない領域（例えば、活性中心以外の領域）において成されることが好ましい。そのような領域としては、例えば、タンパク質の表面に露出している領域を挙げることができる。
　１又は数個のアミノ酸の置換、欠失、挿入若しくは付加といった変異を特定のアミノ酸配列に加える技術は当該技術分野において公知であり、任意の手法を用いて行うことができる。例えば、制限酵素処理、エキソヌクレアーゼやＤＮＡリガーゼ等による処理、位置指定突然変異導入法、ランダム突然変異導入法等を利用して行なうことができる。
　ＣＢＨＩの熱安定性を改善させるために加えられる置換（上記「特定の置換」）とは、（Ａ）Ｓ４２Ｑ、Ｔ４３Ｅ、Ｋ４５Ｔ、Ｓ４６Ａ、Ｇ４７Ｐ、Ｎ５３Ｑ、Ｓ５４Ｎ、Ｔ２６２Ｇ、Ｓ２９８Ｐ、Ａ４２６Ｐ、及びＶ４５１Ｆから成る群より選択される１種以上のアミノ酸置換；及び／又は（Ｂ）配列番号１に示されるアミノ酸配列における第４１３位～第４１６番目に相当するアミノ酸領域の配列番号２で示されるアミノ酸配列との置換である。ここで、前記（Ａ）の各置換を表す記号に関して、数字は、配列番号１のアミノ酸配列におけるアミノ酸の位置を意味する。また、数字の前のアルファベットは、その位置に本来存在するアミノ酸の種類を意味する。数字の後のアルファベットは、本来存在するアミノ酸を置換するアミノ酸の種類を意味する。よって、例えば、「Ｓ４２Ｑ」とは、配列番号１のアミノ酸配列における第４２番目のセリン（Ｓ）がグルタミン（Ｑ）に置換されることを意味する。他の置換を表す記号についても同様である。
　前記（Ｂ）の置換に関し、配列番号１に示されるアミノ酸配列における第４１３位～第４１６位のアミノ酸配列とは、ＮＡＴＧ(配列番号１１)であり、この領域を置換する配列番号２で示されるアミノ酸配列とは、ＤＡＤＰＴである。
　上記特定のアミノ酸置換（Ａ）及び（Ｂ）は、１種だけが配列番号１のアミノ酸配列又はそれに相当するアミノ酸配列に加えられていてもよく、２種以上の組み合わせで配列番号１のアミノ酸配列又はそれに相当するアミノ酸配列に加えられていてもよい。２種以上のアミノ酸置換が組み合わせて配列番号１のアミノ酸配列又はそれに相当するアミノ酸配列に加えられる場合、その組み合わせは任意である。また、組み合わせられるアミノ酸置換の数も任意であり、例えば、２種以上、３種以上、４種以上、５種以上、６種以上、７種以上、８種以上、９種以上、１０種以上、１１種以上、又は１２種全てであり得る。
　一実施形態において、好ましいアミノ酸置換の組み合わせは、Ｓ４２Ｑ、Ｔ４３Ｅ、Ｋ４５Ｔ、Ｓ４６Ａ、Ｇ４７Ｐ、Ｎ５３Ｑ、及びＳ５４Ｎである。一実施形態において好ましいアミノ酸置換の組み合わせは、一実施形態において、好ましいアミノ酸置換の組み合わせは、Ｔ２６２Ｇ、Ｓ２９８Ｐ、及びＡ４２６Ｐである。一実施形態において、好ましいアミノ酸置換の組み合わせは、Ｔ２６２Ｇ、Ｓ２９８Ｐ、Ａ４２６Ｐ、Ｎ４１３Ｄ、Ｔ４１５Ｄ、及びＧ４１６Ｐである。
　上述の特定のアミノ酸置換を配列番号１に示されるアミノ酸配列又はそれに相当するアミノ酸配列に有することにより、ポリペプチドは、改善された熱安定性を有する。改善された熱安定性とは、配列番号１のアミノ酸配列を有する野生型のＣＢＨＩと比較して、高い熱安定性を有すること（即ち、同じ温度条件下において、野生型のＣＢＨＩよりも失活し難いこと）を意味する。
　熱安定性は、任意の手法で測定することができる。例えば、後述する実施例で用いたprotein thermal shift assay（Kishishita et al., Protein Expr Purif. 2014 Feb;94:40-5.)で、タンパク質の立体構造が変化する温度を測定して熱安定性を求めることができる。この測定方法を採用する場合、野生型ＣＢＨＩの変性温度は６３℃であるため、熱安定性が改善されたＣＢＨＩは、６３℃よりも高い変性温度を有することが好ましい。そのような変性温度は、例えば、６４℃以上、６５℃以上、６６℃以上、６７℃以上、６８℃以上、６９℃以上、７０℃以上、７１℃以上、７２℃以上、７３℃以上、７４℃以上、７５℃以上である。
　熱安定性は、ＣＢＨＩを一定の温度で所定の時間保持(熱処理)し、その前後の酵素活性を測定して熱処理後の残存活性に基づいて評価することもできる。残存活性が野生型のＣＢＨＩの残存活性と比較して高ければ、熱安定性が改善されていると評価することができる。例えば、後述する実施例に示すように、ＣＢＨＩは、６５℃で５分間保持した場合の残存活性が、５０％以上であることが好ましく、５５％以上であることがより好ましく、６０％以上であることが更に好ましく、７０％以上であることがより更に好ましい。
　本書において、「活性」及び「酵素活性」とは、別段の表示をする場合を除いて、セロビオハイドロラーゼ活性を意味する。セロビオハイドロラーゼ活性の測定方法は公知であり、任意の方法を選択して測定することができる。例えば、後述する実施例で採用した、合成基質PNP-Lacを基質とし、遊離PNPを測定する方法を挙げることができる。
　熱安定性が改善したＣＢＨＩであるポリペプチドは、それをコードするポリヌクレオチドを利用して遺伝子工学的手法で製造することができる。また、当該ポリペプチドは、配列番号１に示されるアミノ酸配列の情報に基づいて、一般的なタンパク質の化学合成法（例えば、液相法及び固相法）を用いて製造することも可能である。
　熱安定性が改善したＣＢＨＩであるポリペプチドをコードするポリヌクレオチドは、配列番号１に示されるアミノ酸配列をコードする塩基配列を基に、導入された置換及び他の変異の種類及び位置を考慮して設計し、化学的なＤＮＡの合成法（例えば、フォスフォアミダイト法）や遺伝子工学的手法を用いて容易に取得することができる。ポリヌクレオチドは、単離された状態で存在するポリヌクレオチドであることが好ましい。尚、配列番号１に示されるアミノ酸配列をコードする塩基配列は公知である。
　上記ポリヌクレオチドを発現可能な状態で任意のベクターに取り込み、それを用いてベクターの種類に適合した宿主に導入し、発現させることにより、上記ポリペプチドを生産することができる。
　ベクターの種類は、宿主細胞の種類を考慮して適宜選択することができる。例えば、プラスミドベクター、コスミドベクター、ファージベクター、ウイルスベクター（例えば、アデノウイルスベクター、レトロウイルスベクター、ヘルペスウイルスベクター等）等を挙げることができる。
　発現ベクターの導入に使用される宿主細胞は、当該ポリペプチドを産生できる限り特に制限されず、原核細胞及び真核細胞のいずれでも良い。具体的には、エシェリヒア・コリ等のエシェリヒア・コリ属細菌（例えば、HB101、MC1061、JM109、CJ236、MV1184等）、コリネバクテリウム・グルタミカム等のコリネ型細菌、ストレプトミセス属細菌等の放線菌、バチルス・サブチリス等のバチルス属細菌、ストレプトコッカス属細菌、スタフィロコッカス属細菌等の原核細胞；サッカロミセス属、ピシア属及びクルイベロマイセス属等の酵母、アスペルギルス属、ペニシリウム属、トリコデルマ属及びアクレモニウム属等の真菌細胞；ドロソフィラS2、スポドプテラSf9、カイコ培養細胞等の昆虫細胞；並びに植物細胞等を挙げることができる。枯草菌、酵母、麹菌、放線菌等のタンパク質分泌能を利用して、ポリペプチドを培地中に生産させることもできる。
　発現ベクターの宿主細胞内への導入方法は、従来の慣用的に用いられている方法により行うことができる。例えば、コンピテントセル法、プロトプラスト法、エレクトロポレーション法、マイクロインジェクション法、リポソーム融合法等の種々の方法が挙げられる。コリネ型細菌への導入方法としては、具体的には例えば、プロトプラスト法（Ｇｅｎｅ，　３９，　２８１－２８６（１９８５））、エレクトロポレーション法（Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，　７，　１０６７－１０７０）（１９８９））等を使用することができるが、これらに限定されない。
　発現ベクターを導入した宿主細胞（例えば、形質転換体）は、改善された熱安定性を有するＣＢＨＩであるポリペプチドを産生するために用いることが可能である。また形質転換体をそのままセルロースを含むバイオマスの糖化に使用することもできる。
　上記形質転換体を用いたポリペプチドの製造は、形質転換体を培養し、培養物から当該ポリペプチドを回収することにより実施することができる。培養は、宿主に適した培地を用いて継代培養又はバッチ培養等を行うことができる。また、培養は、形質転換体の内外に生産されたポリペプチドの活性を指標にして、適当量得られるまで実施することができる。
　培地としては、宿主細胞に応じて慣用される各種のものを適宜選択して利用でき、培養も宿主細胞の生育に適した条件下で実施できる。例えば、大腸菌の培養にはＬＢ培地などの栄養培地や、Ｍ９培地などの最少培地に炭素源、窒素源、ビタミン源等を添加した培地を用いることができる。
　培養条件も宿主の種類に応じて適宜設定することができる。通常、１６～４２℃、好ましくは２５～３７℃で５～１６８時間、好ましくは８～７２時間培養される。宿主に依存して、振盪培養と静置培養のいずれも可能であるが、必要に応じて攪拌を行ってもよく、通気を行ってもよい。誘導型プロモーターを用いる場合は、培地にプロモーター誘導剤を添加して培養を行うこともできる。
　培養物からのポリペプチドの精製又は単離は、公知の手法を適宜組み合わせて行うことができる。例えば、硫酸アンモニウム沈殿、エタノール等の溶媒沈殿、透析、限外濾過、酸抽出、及び各種クロマトグラフィー（例えば、ゲル濾過クロマトグラフィー、アニオン又はカチオン交換クロマトグラフィー、ホスホセルロースクロマトグラフィー、疎水性相互作用クロマトグラフィー、アフィニティークロマトグラフィー、ハイドロキシアパタイトクロマトグラフィー及びレクチンクロマトグラフィー、高速液体クロマトグラフィー等）等を用いた手法が挙げられる。アフィニティークロマトグラフィーに用いる担体としては、例えば、当該ポリペプチドに対する抗体を結合させた担体や、当該ポリペプチドにタグを付加した場合は、そのタグに親和性のある物質を結合した担体を利用することもできる。
　当該ポリペプチドが宿主の細胞内に蓄積される場合は、形質転換細胞を破砕し、破砕物の遠心上清から上記と同様にして精製又は単離することができる。例えば、培養終了後、遠心により集菌した菌体を菌体破砕用バッファー（２０～１００　ｍＭ　Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ（ｐＨ８．０）、５ｍＭ　ＥＤＴＡ）に懸濁し、超音波破砕し、破砕処理液を１００００～１５０００ｒｐｍで１０～１５分間遠心して上清を得ることができる。遠心後の沈殿は、必要に応じて塩酸グアニジウム又は尿素などで可溶化したのち更に精製することもできる。
　当該ポリペプチドを、セルロースを含む試料（例えば、セルロース系バイオマス資源）に接触させることにより、バイオマス資源を分解し、糖液を製造することができる。当該ポリペプチドを用いてバイオマス資源を糖化する場合、更に他のセルラーゼ等の酵素を併用することで、より効率的に糖液を製造することもできる。
　セルロース系バイオマスの種類は、ＣＢＨＩによって分解可能である限り特に制限されないが、例えば、バガス、木材、ふすま、麦わら、稲わら、もみがら、大豆粕、大豆オカラ、コーヒー粕、コメ糠等を挙げることができる。
　当該ポリペプチドを水溶液中でセルロースに接触させる場合は、反応液のｐＨおよび温度を、ＣＢＨＩが失活しない範囲に設定することが好ましい。熱安定性が改善されているため、至適温度又はその付近の温度で反応を行うことが効率的に試料を分解し、糖液を得るという観点から好ましい。例えば、温度条件は、５～９０℃、好ましくは１５～８０℃、より好ましくは３０～７５℃、より好ましくは５０～７０℃又は５０～６５℃に設定することができる。また、一実施形態において、温度条件は、６３℃以上、６４℃以上、６５℃以上、６６℃以上に設定することができる。ｐＨは、ｐＨ４～９の条件で実施することができる。添加するポリペプチドの量は、特に制限されないが、例えば、０．１～０．５％（ｗ／ｗ）の範囲とすることができる。
　以下、実施例により本発明についてさらに詳細に説明するが、本発明はこれらに制限されるものではない。
　タラロマイセス・セルロィティカス由来のＣＢＨＩの活性ドメインの構造座標データを用いて、タラロマイセス・セルロィティカスＣＢＨＩの活性ドメインの立体構造を予測し、モデル構築を行った。次に、タラロマイセス・セルロィティカス由来のＣＢＨＩの活性ドメイン構造とタラロマイセス・エマルソーニ由来のＣＢＨＩの活性ドメイン構造を比較して、タラロマイセス・セルロィティカス由来のＣＢＨＩの安定性に影響していると思われる個所を探索した。得られた比較構造情報及びタンパク質安定化原理（例えば、疎水性相互作用、水素結合の強化、プロリンによるペプチドループ構造の安定化等）を利用して、タラロマイセス・セルロィティカス由来のＣＢＨＩのアミノ酸置換をタンパク質工学的に行った。具体的には、後述する変異を導入した。
　タラロマイセス・セルロィティカス由来のＣＢＨＩをコードする遺伝子（ポリヌクレオチド）をクローニングし、同生物由来のデンプン誘導性のグルコアミラーゼプロモーター及び該ＣＢＨＩのシグナル配列の下流に繋ぎ、発現プラスミドベクターを構築した（Inoue et al., J. Ind. Microbiol. Biotechnol., 2013, 40: 823-830）。この発現ベクターで大腸菌（ＤＨ５α）を形質転換した。得られたプラスミドを精製し、これをテンプレートとしてクイックチェンジ法により遺伝子に変異導入を行った。変異の導入には、下記表１に示すプライマーセットを単独又は組み合わせて用いて次の変異体を作製した：配列番号１で示されるアミノ酸配列において、第２６２位のトレオニンがグリシンに置換された変異体１；第２９８位のセリンがプロリンに置換された変異体２；第４２６位のアラニンがプロリンに置換された変異体３；第４１３位のアスパラギンがアスパラギン酸に置換され、第４１５位のトレオニンがアスパラギン酸に置換され、且つ、第４１６位のグリシンがプロリンに置換された変異体４；変異体１～３の変異を組み合わせた変異体５；変異体１～４の変異を組み合わせた変異体６；第４２位のセリンがグルタミンに置換され、第４３位のスレオニンがグルタミン酸に置換され、第４５位のリジンがスレオニンに置換され、第４６位のセリンがアラニンに置換され、第４７位のグリシンがプロリンに置換され、第５３位のアスパラギンがグルタミンに置換され、且つ、第５４位のセリンがアスパラギンに置換された変異体７；変異体１～４及び変異体７を組み合わせた変異体８。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000001
　変異体７の作成には、第４２位～第４７位のアミノ酸の置換に対応するプライマーセット（F1及びF2）と第５３位及び５４位のアミノ酸の置換に対応するプライマーセット（F2及びF2）を用いた。
　変異を導入した遺伝子の配列をシークエンシングで確認し、各遺伝子を組み込んだプラスミドでタラロマイセス・セルロィティカスを形質転換した。形質転換体をデンプン培地で培養し、菌体外に変異型ＣＢＨＩを分泌させた。培養液を回収し６０％飽和となるように硫酸アンモニウムを添加した。沈殿物を遠心分離器で回収し、２０ｍＭ　ＭＥＳ緩衝液（ｐＨ６．５）に溶解後、同緩衝液で平衡化した脱塩カラムＨｉＰｒｅｐ　ｄｅｓａｌｔｉｎｇ　２６／１０を用いて脱塩処理を行った。脱塩されたサンプルは２０ｍＭ　ＭＥＳ緩衝液（ｐＨ６．５）で平衡化したイオン交換カラムＲｅｓｏｕｒｃｅＱにアプライされ、１Ｍ塩化ナトリウムを含む２０ｍＭ　ＭＥＳ緩衝液（ｐＨ６．５）で溶出された。ＣＢＨ１活性を示す溶出画分は１．２Ｍになるように硫酸アンモニウムを加えた後、１．２Ｍ硫酸アンモニウムを含む２０ｍＭ酢酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ５．５）で平衡化した疎水カラムＲｅｓｏｕｒｃｅ　Ｉｓｏにアプライされ、２０ｍＭ酢酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ５．５）によって、溶出し、活性を示す画分を濃縮した。当該か区分についてＳＤＳ－ＰＡＧＥで単一バンドを示すことを確認し、精製を完了した。このようにして精製した酵素について、耐熱性と活性を測定した。
　酵素活性の測定は、合成基質ＰＮＰ－Ｌａｃを用いて遊離するＰＮＰを測定することにより求めた。耐熱性は、Kishishita et al., (Protein Expr Purif. 2014 Feb;94:40-5.)に記載されるｐｒｏｔｅｉｎ　ｔｈｅｒｍａｌ　ｓｈｉｆｔ　ａｓｓａｙ（ＴＳＡ）を用いて酵素蛋白質の立体構造が変化する変性温度（Ｔｍ）を測定して評価した。ＴＳＡは、それぞれのＣＢＨＩ変異体酵素を２０ｍＭ　酢酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ５．０）に溶解させたものを用いて行った。測定結果を下記の表２に示す。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000002
　表２に示される通り、変異体１～８は、いずれも野生型の酵素と比較して耐熱性（熱安定性）が向上していた。特に、複数の変異を導入した変異体４～６及び８では、熱安定性の向上が顕著であった。一方、変異体１～８は、野生型と比較して酵素活性が若干低下しているが、改善された熱安定性を考慮すれば、無視できる程度である。
　次に、野生型ＣＢＨＩ及び変異体１～８のいずれかを０．０２～０．０５ｍｇ／ｍｌの濃度で含む20 mM 酢酸ナトリウム緩衝液（pH 5.0）を調製した。これを65℃の温度で維持し、１分後、５分後、１０分後、１５分後、３０分後、６０分後、及び９０分後に酵素溶液を一部取りだし、その残存活性を45℃で測定した。基質は、1mM PNP-Lactoseを用いて、上記と同様の測定方法で行った。残存活性は、６５℃での処理開始時（即ち、０分）の時の活性を１００％として算出した。結果を図１に示す。図１に示される通り、加熱5分後の残総活性は、野生型４０％であったが、変異体１は５５％、変異体２は８０％、変異体３と４は８０－９０％、変異体５、６及び８は１００％、変異体７は７３％であった。特に、変異体６及び８は６０分後も活性の低下は見られなかった。 
　更に、微結晶性セルロース（Ａｖｉｃｅｌ）を用いて、変異体６及び野生型ＣＢＨＩの最適温度を調べた（図２）。変異体６及び野生型ＣＢＨＩを微結晶性セルロース（Ａｖｉｃｅｌ）基質を含む緩衝液（pH5.0）中で、５０℃～７５℃、2時間反応させて遊離する可溶化糖を還元力により定量した。その結果、図２に示される通り、変異体６は微結晶性セルロースを基質とした場合においても、野生型よりも高い最適温度を有することが確認された。同様の傾向が他の変異体にも期待される。

Claims (6)

  1. 配列番号１に示されるアミノ酸配列、配列番号１に示されるアミノ酸配列と８５％以上の同一性を有するアミノ酸配列、或いは配列番号１に示されるアミノ酸配列において１又は数個のアミノ酸が置換、挿入、付加、及び／又は欠失されたアミノ酸配列において、下記（Ａ）及び／又は（Ｂ）の変異：
    （Ａ）Ｓ４２Ｑ、Ｔ４３Ｅ、Ｋ４５Ｔ、Ｓ４６Ａ、Ｇ４７Ｐ、Ｎ５３Ｑ、Ｓ５４Ｎ、Ｔ２６２Ｇ、Ｓ２９８Ｐ、Ａ４２６Ｐ、及びＶ４５１Ｆから成る群より選択される１種以上のアミノ酸置換；
    （Ｂ）配列番号１に示されるアミノ酸配列における第４１３位～第４１６番目のアミノ酸領域の配列番号２で示されるアミノ酸配列との置換；
    を有し、且つ、
    セロビオハイドロラーゼ活性、及び
    改善された熱安定性、
    を有する、ポリペプチド。
  2. 請求項１に記載のポリペプチドをコードするポリヌクレオチド。 
  3. 請求項２に記載のポリヌクレオチドを組み込んだ発現ベクター。 
  4. 請求項３に記載のベクターで形質転換された形質転換体。 
  5. 請求項４に記載の形質転換体を培養する工程を含む、請求項１に記載のポリペプチドの製造方法。 
  6. 請求項１に記載のポリペプチドをセルロースを含む試料に作用させる工程を含む、セロビオースを製造する方法。
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