CN110923219B

CN110923219B - 纤维二糖水解酶的突变体

Info

Publication number: CN110923219B
Application number: CN201911373641.0A
Authority: CN
Inventors: 方诩; 刘正垚; 杜志强
Original assignee: Rongcheng Huihai Chuangda Biotechnology Co ltd
Current assignee: Rongcheng Huihai Chuangda Biotechnology Co ltd
Priority date: 2019-12-27
Filing date: 2019-12-27
Publication date: 2022-08-12
Anticipated expiration: 2039-12-27
Also published as: CN110923219A

Abstract

本发明公开了一种纤维二糖水解酶的突变体，所述突变体是氨基酸序列为SEQ IDNO.1的纤维二糖水解酶在第133位、第165位和第183位中至少一个位点的氨基酸突变为丙氨酸。本发明通过对纤维二糖水解酶进行蛋白质工程改造，获得了突变蛋白。所述变体在相同条件下的酶活力更高，能大大提高纤维素的降解效率，进而促进在纤维素降解领域的应用。

Description

纤维二糖水解酶的突变体

技术领域

本发明涉及酶基因工程改造技术领域，具体涉及一种纤维二糖水解酶的突变体。

背景技术

目前石油，天然气等化石燃料的储量日益减少，空气污染、气候变化的问题日益严峻，寻找和开发新的环境友好型能源受到越来越多的关注。木质纤维素是地球上含量最丰富的有机分子，也是一种可再生资源，从纤维素中有效地生成可发酵的水解产物，是利用木质纤维素原料生产具有成本竞争力的生物燃料和其他可持续生物基产品的主要要求之一。纤维素水解酶正是将纤维素转化为可利用能源的一个关键因素。人们对于纤维素水解酶的知识大多数来源于对里氏木霉的研究，里氏木霉的纤维素酶系统在生产生物乙醇的方面已经得到广泛的研究。里氏木霉甚至被宣布成为木质纤维素酶降解方面的工业标准。里氏木霉分泌包括至少5种内切葡聚糖酶(EG I–V,or Cel7B,Cel5A,Cel12A,Cel61A andCel45A)，两种纤维二糖水解酶(CBHI,CBHII or Cel7A,Cel6A)和β-葡萄糖苷酶以及大量的木聚糖酶和至少一种β-木糖苷酶。

纤维二糖水解酶(cellobiohydrolases,CBH,exoglucanase,E.C.3.2.1.91)，又被称为外切葡聚糖酶，分为CBHI和CBHⅡ，对纤维素末端表现出特异性，分别作用于纤维素链的还原端和非还原端，其中CBHI又被称为Cel7A，而CBHⅡ被称为Cel6A。在里氏木霉中Cel7A占到了整个纤维素酶系统总量的40％-70％，Cel7A可以水解结晶纤维素，产生纤维二糖。改造Cel7A，提高其酶活力，对于提高纤维素酶水解，有重要的产业前景。

定点突变是指通过聚合酶链式反应(PCR)等方法向目的DNA片段(可以是基因组，也可以是质粒)中引入所需变化，包括碱基的添加、删除、点突变等。定点突变能迅速、高效的提高DNA所表达的目的蛋白的性状及表征，是基因研究工作中一种非常有用的手段。目前已有关于采用定点突变的方式对Cel7A进行改造的报道，例如CN 105176949 A、 CN104870641 A、CN 104870643 A、CN 104870642 A、CN 104870638 A、CN 104870644 A、200480007562.3、200480008007.2等。然而，多数位点的定点突变对酶蛋白的高级结构变化不大，导致对酶功能的改造效果较为有限。因此，如何确定突变的位点以及突变的方向，是定向突变改造Cel7A的难点所在。

需要说明的是，上述公开的背景技术部分的信息仅仅旨在增加对本公开的总体背景的理解，而不必然被视为承认或以任何形式暗示该信息构成已经成为本领域一般技术人员所公知的现有技术。

发明内容

针对上述现有技术，本发明的目的是提供一种纤维二糖水解酶的突变体，及其在木质纤维素降解中的应用。本发明通过对纤维二糖水解酶进行蛋白质工程改造，获得了突变蛋白。所述变体在相同条件下的酶活力更高，能大大提高纤维素的降解效率，进而促进在纤维素降解领域的应用。

为实现上述目的，本发明采用如下技术方案：

本发明的第一方面，提供一种纤维二糖水解酶的突变体，所述突变体是氨基酸序列为 SEQ ID NO.1的纤维二糖水解酶在第133位、第165位和第183位中至少一个位点的氨基酸突变为丙氨酸。

优选的，所述纤维二糖水解酶的突变体为如下1)-4)任一项所述：

1)突变体，其氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示；

2)突变体，其氨基酸序列如SEQ ID NO.3所示；

3)突变体，其氨基酸序列如SEQ ID NO.4所示；

4)突变体，其氨基酸序列如SEQ ID NO.5所示。

其中，SEQ ID NO.2所示的突变体，是氨基酸序列为SEQ ID NO.1的纤维二糖水解酶第133位氨基酸由T突变为A。

SEQ ID NO.3所示的突变体，是氨基酸序列为SEQ ID NO.1的纤维二糖水解酶第165 位氨基酸由S突变为A。

SEQ ID NO.4所示的突变体，是氨基酸序列为SEQ ID NO.1的纤维二糖水解酶第183 位氨基酸由K突变为A。

SEQ ID NO.5所示的突变体，是氨基酸序列为SEQ ID NO.1的纤维二糖水解酶第133 位氨基酸由T突变为A，第165位氨基酸由S突变为A，第183位氨基酸由K突变为A。

更优选的，所述纤维二糖水解酶的突变体，其氨基酸序列如SEQ ID NO.5所示。

本发明的第二方面，提供编码上述纤维二糖水解酶的突变体的基因。

本发明的第三方面，提供一种重组质粒，所述重组质粒携带编码上述纤维二糖水解酶的突变体的基因。

本发明的第四方面，提供一种重组菌株，所述重组菌株是将所述的重组质粒转化入宿主菌中制备的。

优选的，所述宿主菌为里氏木霉(Trichoderma reesei)。

上述重组质粒或重组菌株在生产纤维二糖水解酶中的应用也是本发明的保护范围。

本发明的第三方面，提供扩增上述基因的引物组，所述引物组包括：序列表中SEQID NO.6和SEQ ID NO.7所示的引物对、SEQ ID NO.8和SEQ ID NO.9所示的引物对以及SEQID NO.10和SEQ ID NO.11所示的引物对。

本发明的第四方面，提供上述突变体或编码突变体的基因在纤维素降解产物生产中的的应用。

本发明的有益效果：

本发明以保藏编号为CCTCC NO:M2015804的里氏木霉Trichderma reesei所产的Cel7A为出发酶，将该出发酶的第133位、第165位和第183位中至少一个位点的氨基酸突变为丙氨酸，获得纤维二糖水解酶的突变体。经本发明的方法改造的Cel7A，相比出发菌株所产的Cel7A的酶活效率更高。本发明方法改造的里氏木霉突变体所产酶液的降解纤维素的水解能力均高于出发菌株。将该改造方法应用于纤维素酶的改造，使其可以生产具有更高活性的纤维素酶，在同样培养成本的条件下大规模提高了外切酶的活性，具有良好的经济意义。

附图说明

图1：用于点突变的质粒图谱。

具体实施方式

应该指出，以下详细说明都是例示性的，旨在对本申请提供进一步的说明。除非另有指明，本文使用的所有技术和科学术语具有与本申请所属技术领域的普通技术人员通常理解的相同含义。

正如背景技术中所介绍的，改造Cel7A，提高其酶活力，对于提高纤维素酶水解，有重要的产业前景。对天然酶分子进行改造的方法主要有化学修饰、定点突变、定向进化和基因融合等，其中，酶的定点突变是在已知的DNA序列中替换、插入或缺失一定长度碱基，从而改变酶催化性质的一种方法。但多数位点的定点突变对酶蛋白的高级结构变化不大，导致对酶功能的改造效果较为有限。因此，如何确定突变的位点以及突变的方向，是定向突变改造Cel7A的难点所在。

本发明是以CCTCC NO:M2015804的里氏木霉Trichderma reesei所产的Cel7A为出发酶，该酶的空间三维结构以及蛋白质结构与功能之间的关系目前并没有相关报道，因此，进一步增加了对该酶进行定点突变的难度。

本发明在酶的改造过程中，还针对Cel7A其他多个突变位点进行了定点突变，以及对第133位、第165位和第183位的氨基酸突变方向进行了考察。结果发现，有些突变对其降解纤维素的水解能力没有影响，有些突变甚至导致酶的水解能力更差了，不同的改造方法其效果差异显著。最终，经试验确定将第133位、第165位和第183位的氨基酸突变为丙氨酸后得到的突变体的性能最优。

为了使得本领域技术人员能够更加清楚地了解本申请的技术方案，以下将结合具体的实施例详细说明本申请的技术方案。

本发明实施例中所用的试验材料均为本领域常规的试验材料，均可通过商业渠道购买得到。本发明实施例中所采用的方法中未做详细说明的均为本领域现有技术。

其中：本发明实施例中用到的部分试验材料和试剂如下：

微量元素配方为：2g CoCl₂，1.6g MnSO₄·H₂O，1.4g ZnSO₄·H₂O，0.5g FeSO₄·7H₂O，使用ddH₂O 溶解后定容至200mL。

(1)LB大肠培养基(1L)

(2)MM盐培养基(1L)

(3)种子培养基(1L)：

(4)产酶培养基

(5)GMM传代培养基(1L)

(6)TAE电泳缓冲液(1L,50×)

(7)8％SDS-PAG分离胶(10mL)

(8)5％SDS-PAG浓缩胶(4mL)

(9)SDS电泳缓冲液(1L,10×)

(10)蛋白胶染色液(1L)

(11)蛋白胶脱色液

(12)洗孢子液(1L)

(13)里氏木霉转化溶液

溶液1(200mL)

溶液2(200mL)

溶液3(200mL)

(14)抽提缓冲液(500mL)

(15)southern-blot溶液

(16)蛋白质纯化缓冲液：

(17)麸皮固体培养基：称取麸皮，加10倍重量的水煮沸，小火煮30min，用纱布过滤得麸皮汁，分装，加琼脂粉2％(w/v)，121℃灭菌30min。

(18)0.05M HAc-NaAc(pH4.8)：称取无水醋酸钠4.105g，溶解在900mL水中，用冰醋酸调节pH到 4.8，定容至1L。

(19)pH4.8的柠檬酸缓冲液：称取7.94g柠檬酸三钠(C₆H₅Na₃O₇·2H₂O)，4.83g一水柠檬酸(C₆H₈O₇·H₂O)，加800mL水溶解，定容至1L，用NaOH调pH到4.8，4℃保存。

(20)pNPC溶液:分别称取10mg pNPC和10mgD-葡萄糖酸-δ-内酯，溶解在醋酸-醋酸钠缓冲液(0.05M, pH4.8)，4℃避光保存。

(21)DNS溶液：称取50g 3,5-二硝基水杨酸(C₇H₄N₂O₇)，溶解到约4L蒸馏水中，50℃水浴加热搅拌至溶解，依次加入50gNaOH，1000g酒石酸钾钠，10g苯酚，25g亚硫酸钠，完全溶解后定容到5L，常温避光保存，7天后使用。

(22)RNase A溶液：将Ribonuclease A(RNase A)溶解在0.01M的NaAc(pH4.8)，使其浓度为1mg/mL，煮沸15min后冷却至室温，用1M Tris-HCl(pH8.0)调pH到7.4，分装至1.5mL离心管，-20℃保存。

(23)Lowrry法测蛋白所需试剂(甲液、乙液均要现配现用)：

甲液：2％Na₂CO₃、1％酒石酸钾钠、0.5％CuSO₄按照50:1:1的体积比混合均匀。

乙液：Folin和dd H₂O按照1:1的体积比混合均匀。

(24)质粒提取试剂盒Plasmid Mini KitΙ(Omega bio-tek公司)

(25)DNA凝胶回收试剂盒Gel Extraction Kit 200(Omega bio-tek公司)

(26)点突变试剂盒KOD-Plus-Mutagenesis Kit(Toyobo公司)

(27)FastDigest限制性内切酶(Thermo Fisher Scientific)

(28)高保真Phanta Max Super-Fidelity DNA Polymerase(Vazyme公司)

(29)抗生素Ampicillin(上海生工生物科技有限公司)

(30)抗生素Hygromycin B(Amresco有限公司)

(31)微晶纤维素Avicel PH-101(Sigma)

其他常用试剂均购自国药集团化学试剂有限公司或者北京鼎国昌盛生物技术公司。

本发明实施例中的出发菌株为里氏木霉Trichderma reesei(CCTCC NO:M2015804)，记载在专利 CN105779301A中，其Cel7A氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示。

实施例1：里氏木霉Cel7A突变株构建

I.构建pTCI-133/165/183三点突变质粒以及pTCI-133，pTCI-165，pTCI-183单点突变质粒：

通过RED-ET技术构建表达质粒pTCI，用于点突变，质粒图谱见图1。

利用Toyobo公司的点突变试剂盒进行定点突变，构建pTCI-133/165/183三点突变菌株，以及pTCI-133，pTCI-165，pTCI-183单点突变菌株，测序结果表明突变成功。

表1：所用的引物

Primer	Sequence	SEQ ID NO
			T133A-F	GAGCGACACGGCCTACCAGGAATT	SEQ ID NO.6
T133A-R	GCCATAAGGTAAAGTCGAGCTCCAA	SEQ ID NO.7
			S165A-F	CTACTTCGTGGCCATGGACGCGGATG	SEQ ID NO.8
S165A-R	AGAGCTCCGTTCAAGCCGCACGGCAG	SEQ ID NO.9
			K183R–F	CTGGCGCCCGGTACGGCACGG	SEQ ID NO.10
K183R–R	CGGTGTTGGTGGGATACTTGCTCACGC	SEQ ID NO.11
			Cel7A-CS-F	GGGTCGGCAACGGCAAAAAAGCACG	SEQ ID NO.12
CBM-R	TTACAGGCACTGAGAGTAGTAAGGG	SEQ ID NO.13
			CBHI-F	CCCAAGCATCGATATGTATCGGAAGTTGGCCGTC	SEQ ID NO.14
CBHI-R	GCATGGCTACTAAGGAATCG	SEQ ID NO.15
			CBHI-UP-F	CAGAGCTGAAGGTCGCACAACCG	SEQ ID NO.16
CBHI-UP-R	CAGGCTTTTTCATGATGCGCAGTCCGCGGTTGAC	SEQ ID NO.17
			Hph-F	GGACTGCGCATCATGAAAAAGCCTGAACTCACC	SEQ ID NO.18
Hph-R	GTCGGCATCTACTCTATTCCTTTGCCCTCGGACG	SEQ ID NO.19
			Trp-P-F	CCAGCCCCTGGGTTGACGTTAACTGATATTGAAGGAGC	SEQ ID NO.20
Trp-P-R	CAACTTCCGATACATATCGATGCTTGGGTAGAATAGG	SEQ ID NO.21
			TrpC-T-F	GGGCAAAGGAATAGAGTAGATGCCGACCGGATCGATCC	SEQ ID NO.22
Trp-T-R	ATCAGTTAACGTCAACCCAGGGGCTGGTGACGG	SEQ ID NO.23

注：引物T133A-F和T133A-R是用于扩增包含第133位突变位点的PCR片段的；引物S165A-F和S165A-R是用于扩增包含第165位突变位点的PCR片段的；引物K183R–F 和K183R–R是用于扩增包含第183位突变位点的PCR片段的。

用高保真Phanta Max Super-Fidelity DNA Polymerase，以CBHI-UP-F/CBHI-UP-R，为引物，保藏编号为CCTCC NO:M2015804的里氏木霉Trichderma reesei的cDN A 为模板扩增CBHI上游同源臂片段，以CBHI-F/CBHI-R为引物，分别以本实验室保存的pTCI，pTCI-133/165/183，pTCI-133，pTCI-165，pTCI-183质粒为模板扩增包含突变位点的CBHI 片段，以Hph-F/Hph-R为引物，pCBHIa质粒为模板扩增Hygromycin B抗性基因，以 Trp-P-F/Trp-P-R，TrpC-T-F/TrpC-T-R为引物，本实验室保存的CBHⅡ质粒为模板，扩增 TrpC启动子以及终止子。以PCR反应扩增结束后，用胶回收试剂盒回收每个片段，保证每个DNA片段的浓度较高以保证后续试验的成功。然后用融合PCR技术将片段连接构成 Line-pTCI，Line-pTCI-133/165/183，Line-pTCI-133，Line-pTCI-165，Line-pTCI-183。

反应体系如下:

融合PCR体系、反应程序如下：

II.Tr_T133A/S165A/K183A，Tr_T133A，Tr_S165A，Tr_K183A菌株的构建：

采用PEG诱导法将pTCI-133/165/183三点突变质粒、以及pTCI-133，pTCI-165，pTCI-183单点突变质粒和pTCI质粒转化进Tr_control菌株(即保藏编号为CCTCC NO:M2015804的里氏木霉Trichderma reesei)进行同源重组，提取转化子基因组DNA，以验证-F/验证-R为引物进行PCR验证，验证-F/验证-R的引物序列即表1中的T133A-F， T133A-R，S165A-F，S165A-R，K183R–F，K183R–R；切胶回收PCR产物，进行测序，结果表明转化成功。

具体方法如下。

1.里氏木霉原生质体化学转化法(PEG诱导)：

培养菌体：

(1)取Tr_control新鲜生孢的平板(平板培养4-5天)，在平板中加入3mL洗孢子液，用涂布棒将孢子洗下来。

(2)除去平板上的水分，用镊子夹取玻璃纸平铺在麸皮平板上，并用涂棒铺平玻璃纸，在玻璃纸上加上200μL的孢子悬液，涂布均匀，做10个左右的同样处理，30℃培养大约12-15小时。

原生质体的制备：

(1)检查昨天培养的平板，玻璃纸上应该有新鲜生长的菌丝，否则应适当延长生长时间。

(2)0.1g裂解酶(sigma)到20mL溶液1中，轻轻摇匀。

(3)吸取2-3mL酶液到无菌培养皿中，加一层玻璃纸(玻璃纸上有萌发的孢子)，再加2-3ml酶液，依次叠加8-10层。

(4)酶解约2小时后，用镊子挑取玻璃纸，在另一平皿中倒入溶液1，用移液器吸取溶液冲掉玻璃纸上残留的菌丝体，大的菌丝团块可用移液器缓慢吹打。

(5)准备带有4层擦镜纸的漏斗，并滴加数滴溶液1到玻璃棉，用玻璃棉漏斗过滤原生质体悬液到置于冰上的50mL离心管中，后用几毫升溶液1冲洗玻璃棉，过滤液的总体积不超过40mL。

(6)2000rpm，在水平转子离心机中，4℃离心10min，小心去掉上清液，并用4mL溶液2重悬原生质体(操作均在冰上进行，可用移液器轻柔吹打)。

(7)2000rpm，在水平转子离心机中，4℃离心10min，小心去掉上清液，并用0.5-1mL溶液2重悬原生质体，置原生质体于冰上。

(8)原生质体的制备：在载玻片上滴加3μL原生质体悬液，在盖玻片旁滴加3μL无菌水，原生质体涨破，而孢子不受影响；通过血球计数板计算原生质体数量，原生质体数量应大于10⁸，如果原生质体数量太高，可用溶液2稀释到5×10⁸。

转化

(1)转化所用DNA应纯化，转化体系中DNA浓度应≥1μg/μL，转化体系操作在冰上进行。

轻柔混匀PEG，冰上放置20min。

(2)2mL PEG，轻柔混匀(室温)，20℃放置5min，加入4mL溶液2，轻柔混匀。

(3)吸取0.2-1mL到4mL预保温的上层培养基中(加抗性)，轻轻混匀，倒在铺有下层培养基的平板上(含抗性)，等培养基凝固后，30℃倒置培养。

2.转化子验证

(1)在筛选培养基上培养3-4天，用10μL枪头挑取转化子到传代培养基上；

(2)2-3天后提取转化子基因组，进行PCR验证，具体操作如下：

真菌基因组的提取：挑取部分转化子于1.5mL离心管中，加入500μL抽提缓冲液，及1g石英砂，旋涡剧烈震荡3min，使菌体分散于抽提缓冲液中，65℃水浴30min，将液体转移到新的1.5mL离心管。加入500μL三氯甲烷，旋涡剧烈震荡30s，在13000×g的离心力下室温离心10min。转移300μL上清液到另一无菌1.5mL离心管，加入0.1倍体积的 3M NaAc(pH4.8)溶液，加入0.6倍体积的异丙醇，颠倒混匀，-20℃放置20min，4℃，在13000×g的离心力下离心10min，去上清。加入700μL的70％乙醇，洗涤2次(在13000×g 的离心力下，2min)后倒掉，离心5min，待乙醇完全挥发后，用20μL ddH₂O溶解基因组。

(3)用验证引物，基因组做模板进行PCR验证，并送测序检测是否突变成功。

3.southern-blot

(1)液氮法大提基因组

a.接种孢子悬液到100mL(500ml的锥形瓶)GMM液体培养基中，30℃，200rpm 培养三天；

b.抽滤菌悬液除去培养基，并用0.09M的NaCl溶液洗涤，抽滤一次，放入一次性手套内，-20℃冰箱储存。将抽干后的菌丝液氮研磨至粉末状，转移到50ml离心管，加入20ml抽提缓冲液，漩涡震荡混匀，65℃水浴30min。

c.在样品中加入等体积的酚/氯仿/异戊醇溶液，颠倒混匀，在13000×g的离心力下室温离心10min，将上清液转移到另一50ml离心管，重复抽提一次，缓慢吸取上层水相到另一50ml离心管中，加入0.6倍体积的异丙醇，混匀，置于-20℃，20min，然后在13000×g 的离心力下，4℃离心10min，收集沉淀。

d.用70％乙醇洗涤沉淀两次，室温晾干，用适量ddH₂O溶解基因，然后转移到1.5ml离心管中。加入100μl终浓度为0.1μg/μL的RNaseA，37℃，酶切15小时。

e.在酶切产物中加入等体积的酚/氯仿/异戊醇抽提一次，在13000×g的离心力下室温离心10min。

上清液转移到另一离心管中，加入0.1倍体积的3M NaAc(pH4.8)溶液，加入0.6 倍体积的异丙醇，颠倒混匀，-20℃放置20min，4℃，在13000×g的离心力下离心10min，去上清。加入700μL的70％乙醇，洗涤2次(在13000×g的离心力下，2min)后倒掉，离心5min，待乙醇完全挥发后，用20μl ddH₂O溶解基因组。

(2)

a.电泳：用0.8％-1％的琼脂糖凝胶电泳，40-50V电压跑4-5小时，然后EB染色观察。

b.将电泳凝胶用蒸馏水冲洗后，放入0.25M的HCl中脱嘌呤处理，室温条件下缓慢震荡浸泡15min，溴酚蓝完全变黄色。

c.用蒸馏水冲洗凝胶后，转移到100mL变性溶液中，缓慢震荡溶液20min，溴酚蓝完全恢复到原来的蓝色，然后换新的变性溶液，再震荡浸泡20min。

d.凝胶用蒸馏水冲洗，转移到中性溶液，缓慢振动，浸泡15min，换新的中性溶液，再振荡15min。

e.转膜作用。

(3)

a.拆卸转膜装置，取出尼龙膜，反转后置于一张平的滤纸上，剪角标记。

b.在2×SSC溶液中非常缓慢的转动，洗膜2min，将膜取出，放在滤纸上，自然风干。

c.固定：将膜夹在2张滤纸中，在120℃烘30min。

(4)预杂交

a.37℃化掉DIG-Easy-Hyb(管7)，杂交杯中加入4mL DIG-Easy-Hyb，42℃预热，另取3.5mL DIG-Easy-Hyb于5mL离心管中预热。

b.目的探针2μL，marker 0.2μL，100μL ddH₂O于1.5mL离心管，沸水浴5min，冰中冷却10min，加入到上述预热的3.5mL DIG-Easy-Hyb中，不能有气泡。

c.倒去预杂交液，加入杂交液，过夜。

(5)洗膜

a.弃去杂交液：向杂交管中加入50mL洗膜液(10mL 20×SSC+90mL H₂O+1mL10％SDS)，室温反应5min，重复一次。

b.倒掉上述洗膜液，加入0.5×洗膜液(2.5mL 20×SSC+97.5mL H₂O+1mL10％SDS)，68℃重复一次，每次50mL，每次15min。

c.将膜置于马来酸缓冲液中，反应1-5min，有基因的一面朝上。

d.将膜置于用马来酸缓冲液稀释为1×blocking solution(72mL马来酸 +8mL10×blocking solution)中，室温放置30min。

e.将膜置于用1×blocking solution稀释10000倍的antibody solution中。

f.倒出antibody solution，加入80μL washing buffer(马来酸+0.3％吐温-20)现用现加，最好加至页面下，室温反应15min，重复一次。倒出washing buffer，加入16mLdetecting buffer，室温放置25min。

g.10ml detecting buffer+200μl BCIP(见光分解，现用现配)，避光，3h后观察。

表2：本实施例中所构建的突变菌株

实施例2：里氏木霉Cel7A突变菌株和Tr_control的产酶培养和蛋白纯化

接种突变菌株Tr_T133A/S165A/K183A，Tr_T133A，Tr_S165A，Tr_K183A和Tr_control 于麸皮固体培养基上，培养4～5天待生孢后，接种于50mL种子培养基，30℃，200rpm 培养48小时，用移液器吸取10mL种子液接种于100mL的产酶培养基，30℃，200rpm培养7天，离心收集酶液，用10KDa的超滤管将酶液浓缩10倍，后利用AKTA Avent进行蛋白纯化获得纯化后的Cel7A^T133A、Cel7A^K183、Cel7A^S165、Cel7A^{T133A/S165A/K183A}以及 Cel7A^Control。

实施例3：里氏木霉Cel7A突变菌株所产Cel7A蛋白检测、pNPC酶活及糖化反应

I.蛋白检测：

使用Bradford方法进行胞外蛋白含量的测定，在酶标条中加入200μL Bradford，后加入20μL蛋白，在吸光值OD₅₉₅处进行测量

II.pNPC酶活测定：

在1.5ml的离心管中，加入50μL的pNPC，实验组加入100μL纤维素酶酶液，吹打混匀，50℃水浴反应30min，对照组加入100μL纤维素酶酶液。接下来加入150μL 10％ Na₂CO₃将反应终止，使用分光光度计测量OD₄₂₀时的吸光值并进行酶活换算，测定结果见表3。

表3：对照与突变后Cel7A的pNPC比酶活

由表3可以看出，Cel7A^{T133A/S165A/K183A}的pNPC比酶活最高远高于Cel7A^Control，Cel7A^T133A、Cel7A^S165A、Cel7A^K183A的pNPC比酶活也都高于Cel7A^Control。

III.糖化反应

1培养T1-X1酶液，纯化β-葡萄糖苷酶，测β-葡萄糖苷酶酶活

2糖化实验，按照下列表格添加糖化体系，45℃，70rpm糖化，分别在6h，12h，24h，36h，48h，72h取样。添加30mg微晶纤维素为底物，所加各Cel7A酶液酶量均为150μg，每个体系中加入的β-葡萄糖苷酶量约70U，NaN₃10μL，柠檬酸缓冲液补充至1mL。每组做三个平行，利用生物传感器葡萄糖的含量。

用突变前后的蛋白降解每千克微晶纤维素经过24，48小时后所产葡萄糖的克数，结果见表4。

表4：糖化反应检测结果

由表4可以看出，突变蛋白Cel7A^T133A、Cel7A^K183A和Cel7A^{T133A/S165A/K183A}的糖化能力都高于Cel7A^Control。

以上所述仅为本申请的优选实施例而已，并不用于限制本申请，对于本领域的技术人员来说，本申请可以有各种更改和变化。凡在本申请的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本申请的保护范围之内。

SEQUENCE LISTING

<110> 荣成市慧海创达生物科技有限公司

<120> 纤维二糖水解酶的突变体

<130> 2019

<160> 23

<170> PatentIn version 3.5

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<212> PRT

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Leu

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<212> PRT

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<212> PRT

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<211> 33

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 23

atcagttaac gtcaacccag gggctggtga cgg 33

Claims

1.一种纤维二糖水解酶的突变体，其特征在于，所述纤维二糖水解酶的突变体为如下1）-4）任一项所述：

1）突变体，其氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示；

2）突变体，其氨基酸序列如SEQ ID NO.3所示；

3）突变体，其氨基酸序列如SEQ ID NO.4所示；

4）突变体，其氨基酸序列如SEQ ID NO.5所示。

2.编码权利要求1所述的突变体的基因。

3.一种重组质粒，其特征在于，所述重组质粒携带权利要求2所述的基因。

4.一种重组菌株，其特征在于，所述重组菌株是将权利要求3所述的重组质粒转化入宿主菌中制备的。

5.根据权利要求4所述的重组菌株，其特征在于，所述宿主菌为里氏木霉（Trichoderma reesei）。

6.权利要求3所述的重组质粒或权利要求4-5任一项所述的重组菌株在生产纤维二糖水解酶中的应用。

7. 扩增权利要求2所述突变体的基因的引物组，其特征在于，SEQ ID NO.6、SEQ IDNO.7为氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示突变体的引物对，SEQ ID NO.8、SEQ ID NO.9为氨基酸序列如SEQ ID NO.3所示突变体的引物对，SEQ ID NO.10、SEQ ID NO.11为氨基酸序列如SEQ ID NO.4所示突变体的引物对。

8.权利要求1所述的突变体或权利要求2所述的编码突变体的基因在微晶纤维素降解产物生产中的的应用。