CN104673713B - 一种嗜碱链霉菌及其产生的中性内切葡聚糖酶和应用 - Google Patents

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Abstract

本发明公开一种嗜碱链霉菌及其产生的中性内切葡聚糖酶和应用。该嗜碱链霉菌，是从深圳红树林土壤中筛选得到的产中性内切葡聚糖酶菌株。本发明还公开了上述嗜碱链霉菌产生的中性内切葡聚糖酶，该酶具有pH适应范围广，耐热、碱、金属离子和表面活性剂等适用于洗涤及造纸等工业的优良酶学特性，可在洗涤及造纸等工业中应用。本发明的嗜碱链霉菌属于耐碱的极端微生物，可在高碱性条件下培养，具有可有效抑制杂菌污染，有利于大规模的发酵生产的特点。

Description

一种嗜碱链霉菌及其产生的中性内切葡聚糖酶和应用
技术领域
本发明属于生物技术领域，特别涉及一种嗜碱链霉菌及其产生的中性葡聚糖酶和应用。
背景技术
纤维素是植物纤维的主要成分，约占其干重的30～50％，是目前分布最广的天然碳水化合物，也是地球上最丰富、最廉价的可再生资源。随着世界人口的激增、全球经济的飞速发展、粮食的短缺和石油、煤炭和天然气等不可再生资源正以惊人的速度减少，可再生纤维素资源的开发利用已引起全世界的普遍关注，成为世界各国研究的重大课题。纤维素酶的研究为此开辟了一条广阔的途径，特别是近10年来，随着现代生物技术迅速发展，基因重组技术及其一系列分子生物学技术的应用，使这一领域的研究更为深入，并在应用上将显示出其潜在的价值。
纤维素酶(cellulase)是降解天然纤维素生成纤维素分子链、纤维二糖和葡萄糖的一组酶的总称。所以，纤维素酶不是单一成分的酶，而是一组酶系的总称。目前根据其催化功能的不同，普遍认为纤维素酶可分为由三类不同水解功能的酶组成：内切葡聚糖酶，外切葡聚糖酶，β-葡萄糖苷酶。
I、内切型葡萄糖苷酶(endo-1,4-β-D glucanase，EC3.2.1.4，简称EBG)，也称Cx酶、CMC酶、EG。这类酶作用于纤维素分子内部的非结晶区，随机识别并水解β-1,4-糖苷键，将长链纤维素分子截短，产生大量非还原性术端的小分子纤维素；
II、外切型葡萄糖苷酶(exo-1,4-β-D glucanase，EC3.2.1.91)，也称C1酶、微品纤维素酶、纤维二糖水解酶(cellobiohydrolase，简称CBH)，这类酶从纤维长链的非还原性末端水解β-1,4-糖苷键，每次切下一个纤维二糖分子；
III、β-葡萄糖苷酶(β-glucosidase，EC3.2.1.21，简称BG)又称纤维二糖酶，它能水解纤维二糖以及短链的纤维寡糖生成葡萄糖，对纤维二糖和纤维三糖的水解很快，随着葡萄糖聚合度的增加水解速度下降，这种酶的专一性比较差。
纤维素的降解必须依靠三种组分的协同作用才能完成。外切β-葡聚糖苷酶从纤维索的非还原多聚体末端水解1,4-β-糖苷键，将天然纤维素分解为直链纤维素，使其转变成水合非结晶纤维素；内切β-葡聚糖苷酶则水解纤维素的内在糖苷键，将直链纤维素内部切断，分解为纤维二糖和纤维寡糖；而β-葡萄糖苷酶则将纤维二糖分解成两个葡萄糖单位。
科学技术的日新月异，电子顺磁共振和频域荧光技、串联质谱仪、X-射线、傅立叶红外光谱仪等技术在纤维素酶结构研究方面的应用，使纤维素酶的结构越来越清晰的摆在人们面前，这也更有利于研究者们进一步的诠释纤维素酶的功能。在一级结构和三维结构的研究中人们发现，纤维素酶分子普遍具有类似的结构，全酶分子呈蝌蚪状，由具有独立活性的两个结构域和连结序列构成大多数纤维素酶都有由一个或多个催化结构域(catalytic domain,CD)和纤维素结合区(cellulose binding domain，CBD)组成，中间由一段可辨认的连接肽(linker peptide)所连接，只有少数微生物和高等植物产生的纤维素酶不具有这类结构域，如Trichoderma reesei EG的EG3就没有CBD结构域。同时还发现T.reesei的EGI和CBHI、腐殖菌属(Humicola spp.)的Humicola insolens的EGV、纤维单胞菌属(Cellulomonas.fum)的CenEG在没有CBD的情况下仍然能水解纤维素，说明对于有些外切或内切酶来说，CBD的结构在水解纤维素的过程中并不是不可缺少的。
催化结构域呈球形，主要体现酶的催化机制和对水溶性底物的特异性。内切酶的活性中心位点存在于一个开放的裂口(cleft)中，它可与纤维素链的任何部位结合并切断纤维素链；外切酶的活性中心位点存在于一个隧道(tunnel)内部，它从纤维素链的非还原末端切下纤维二糖。最先被阐明的催化结构域是T.reesei的CBHII的催化域结构，它是α/β由组成的筒状结构：由5个α螺旋和7条β链组成，活性部位由两个延伸至表面的环(loop)形成一个隧道状(tunnel)结构，长度大约2nm，包含4个结合位点，水解糖苷键发生在第2和第3结合位点之间。
连接肽是保持CD和CBD之间的距离并有助于不同酶分子之间形成较稳定聚集体的一段多肽链。细菌纤维素酶的连接桥富含脯氨酸、苏氨酸，而真菌纤维素酶的连接桥富含甘氨酸、丝氨酸和苏氨酸，不同纤维素酶连接桥的糖基化程度不同，其糖基化的作用是避免因暴露于水相对蛋白酶敏感而被水解。Thr：细菌纤维素酶CBD与CD夹角为135°，而真菌为180°；细菌纤维素酶有两个酶切位点可将CBD与连接肽分别切去，而真菌纤维素酶一般只有一个酶切位点可将CBD与连接肽一同切去。由于纤维素全酶分子呈蝌蚪状，其连接肽高度糖基化却具有较强柔韧性，故很难得到结晶。
在纤维素酶的结构中，CBD是高度保守的，尤其是来源相同的纤维素酶。根据氨基酸序列的相似性，主要可分为3个家族，CBD家族1以T.reesei为代表，家族2和3则主要来源于细菌纤维素酶。结合区形状呈“楔形”，一面亲水，另一面疏水，一般是指纤维素的内切酶或外切酶中能够与结晶纤维素和无定形纤维素结合的功能域，大多数纤维素酶的CBD位于酶蛋白分子的氨基端或羧基端，少数位于中间，通过连接桥与催化结构域相连。CBD可能是通过芳香环与葡萄糖环的堆积力吸附到纤维素上，由CBD上其余的氢键与相邻的葡萄糖链从纤维素表面脱离开，以利于催化区的水解作用。通常认为CBD对高效降解纤维素起到关键的作用，但瑞氏木霉的CBHI和EGI在没有CBD的情况下仍具有水解纤维素的活性，说明在有些外切和内切酶中CBD的结构可能不是必需的。
内切葡聚糖酶可以分为三种类型：酸性内切葡聚糖酶(最适pH3～5)、中性内切葡聚糖酶(最适pH6～8)和碱性内切葡聚糖酶(最适pH8～10)。酸性纤维素酶主要用于棉及其混纺织物的生物抛光整理上。而中性纤维素酶主要用于牛仔布及其服装的洗旧石磨处理上。碱性纤维素酶主要家用洗涤剂中，可增强洗涤剂的去污能力，经常使用还可改善织物的表面特性。
酸性内切葡聚糖酶主要由丝状真菌产生，其产生菌主要包括里氏木霉、康宁木霉、黑曲霉等。酸性内切葡聚糖酶研究再早，但随着工业应用范围的不断扩展和应用研究的不断深入，酸性葡聚糖酶也显现出诸多不足。如中碱性条件下酶活性较低或根本没有活性、稳定性差、pH值食用范围窄，而且在酸性条件下处理纺织品后会产生褪色现象等，这极大限制了内切葡聚糖酶在碱性洗涤剂、纺织品酶洗整理等工业中的应用。因此，寻找新型、高效、稳定和pH值适应范围更广的内切葡聚糖酶意义重大。
由细菌产生的内切葡聚糖酶主要是中性和碱性内切葡聚糖酶，在中性和碱性条件下均具有一定的酶活性及稳定性。与真菌产生的酸性内切葡聚糖酶相比，由细菌产生的中性和碱性内切葡聚糖酶具有其共同而独特的优越性：(1)pH值适应范围广，一般在pH值6-10之间均具有较高的酶活性；(2)稳定性好，可以耐受60℃的高温；(3)酶成分单一，主要酶活性成分为内切葡聚糖酶，便于工业应用；(4)可用细菌发酵生产，发酵周期短；(5)可以承受很高的pH值，作为洗涤用酶可使衣物经过多次洗涤后手感、外观等保持鲜艳；(6)可以在中性环境中处理纺织品，不会造成纺织品褪色等。可见，对于条件要求甚高的洗涤和纺织工业用酶，细菌产中性纤维素酶有比传统酸性纤维素酶更好的优越性。
目前研究较多的是真菌和细菌，对放线菌研究得很少。但细菌产生的纤维素酶的量较少，主要是内切酶，大多数对结晶纤维素没有活性，多数不能分泌到细菌细胞外，因此工业上很少采用细菌作为酶的生产菌种。而霉菌的致病菌较多，其孢子易传播、感染。诸如此类的原因，限制了细菌和霉菌的使用和开发。相对而言，放线菌产生的纤维素酶活性较高，且放线菌是抗菌素的主要生产菌，同时，放线菌结构简单，为单细胞，便于遗传分析。产纤维素酶的放线菌主要有玫瑰色放线菌(Actinomyces Roseus)、纤维放线菌(A.Cellulase)、链霉属放线菌等，现在国外的许多研究者致力于放线菌的研究。
放线菌可产生较为完整的纤维素酶体系，且很多是耐热的。目前研究较多的能够产耐热纤维素酶的微生物主要包括Thermoactinomyces sp.，Trichoderma sp.，Aspergillus sp.，Thermus sp.，Bacillus sp.，Streptomycetes sp.，Humicola sp.等，其中嗜热菌产生的耐热纤维素酶的最适作用温度一般都介于50～80℃之间，甚至能够达到0℃或者100℃以上，pH多为中性或接近中性。由于嗜热菌分泌的纤维素酶的热稳定性好，同时对酸碱等不良因素也具有较高的耐受性，并且其培养过程中不易受其他微生物的污染，因而能够应用于一些特殊领域。
发明内容
为了克服现有技术的缺点与不足，本发明的首要目的在于提供一种嗜碱链霉菌Streptomyces sp.H31。该嗜碱链霉菌可产生一种中性内切葡聚糖酶。
本发明的另一个目的在于提供上述嗜碱链霉菌Streptomyces sp.H31产生的中性内切葡聚糖酶。该酶具有pH适应范围广，耐热、碱、金属离子和表面活性剂等适用于洗涤及造纸等工业的优良酶学特性。
本发明的再一目的在于提供上述嗜碱链霉菌及其产生的中性内切葡聚糖酶的应用。
本发明的目的通过下述技术方案实现：一种嗜碱链霉菌，是从深圳红树林土壤筛选得到的产中性内切葡聚糖酶菌株Streptomyces sp.H31。所述菌株保藏单位：中国典型培养物保藏中心(CCTCC)，保藏日期：2015年1月5日，保藏地址：中国.武汉.武汉大学，保藏编号：CCTCC NO:M 2015003。
菌落形态特征：在琼脂平板上的菌落直径一般为4～6μm，呈米白色，粗糙粒状，表面起粉，不规则圆形，突起，干而不透明，不易挑起。
所述的琼脂平板，其配方为琼脂20g/L，葡萄糖10g/L，蛋白胨5g/L，酵母提取物5g/L，KH2PO4 1g/L，MgCl2 0.2g/L，NaCl 50g/L，Na2CO3 10g/L，pH 9.0；
该菌株的选择培养基配方：5～10g/L CMC-Na(羧甲基纤维素钠)，5～10g/L酵母粉，5～10g/L NaCl，2g/L KH2PO4，5g/L NH4NO3，0.3g/L MgSO4，1g/L(NH4)2SO4，固体培养基加琼脂15～20g/L，pH 7.0～9.0；培养温度为30～37℃。
所述嗜碱链霉菌Streptomyces sp.H31产生的中性内切葡聚糖酶，按下述方法制得：
将Streptomyces sp.H31菌种接到液体选择培养基中，于37℃、200rpm培养48h，将48h培养液以14000rpm的转速冷冻离心20min，取上清液；利用3000道尔顿超滤浓缩膜将上清液超滤浓缩，即得粗酶液；
所述的中性内切葡聚糖酶的蛋白分子量约为27KD，比活力达1.85IU/mL；最适pH为7左右，在pH3～9范围内，酶活性均可保持在70％以上；最适反应温度为60℃左右；在50℃以下酶活性稳定。具有耐Co2+、Mn2+、Na+、K+、Zn2+、Ca2+、Li+、Cu2+、Fe3+、Al3+、Mg2+等金属离子的良好特性，但Ag+对中性内切葡聚糖酶的酶活性有一定的抑制作用；螯合剂EDTA和低浓度的表面活性剂SDS对中性内切葡聚糖酶的酶活性影响甚微。
所述嗜碱链霉菌Streptomyces sp.H31及其产生的中性内切葡聚糖酶在洗涤及造纸等工业中的应用。
本发明相对于现有技术，具有如下的优点及效果：
(1)本发明筛选得到的Streptomyces sp.H31属于耐碱的极端微生物，可在高碱性条件下(pH9.0)培养，具有可有效抑制杂菌污染，有利于大规模的发酵生产的特点。
(2)本发明嗜碱链霉菌Streptomyces sp.H31产生的中性内切葡聚糖酶的比活力达1.85IU/mL；最适pH为7左右，在pH3～9范围内，酶活性均可保持在70％以上；最适反应温度为60℃左右；在50℃以下酶活性稳定。具有耐Co2+、Mn2+、Na+、K+、Zn2+、Ca2+、Li+、Cu2+、Fe3+、Al3+、Mg2+等金属离子的良好特性，但Ag+对中性内切葡聚糖酶的酶活性有一定的抑制作用；螯合剂EDTA和低浓度的表面活性剂SDS对中性内切葡聚糖对酶活性影响甚微。
附图说明
图1是Streptomyces sp.H31菌在1％刚果红平板上生长所产生的透明圈的结果图。
所述的1％刚果红平板的配方是：10g/L刚果红，10g/L CMC-Na，5g/L酵母粉，5g/LNaCl，2g/L KH2PO4，5g/L NH4NO3，0.3g/L MgSO4，1g/L(NH4)2SO4，固体培养基加琼脂15～20g/L，pH 9.0。
图2是Streptomyces sp.H31菌株的16Sr DNA电泳图；其中，泳道M为takara公司的DL2000Marker；泳道1和2为16Sr DNA序列。
图3是葡萄糖标准曲线图。
图4是中性内切葡聚糖酶H31的最适反应pH的结果图。
图5是中性内切葡聚糖酶H31的最适反应温度(℃)的结果图。
图6是中性内切葡聚糖酶H31的pH稳定性的结果图。
图7是中性内切葡聚糖酶H31的温度稳定性的结果图。
图8是金属离子对中性内切葡聚糖酶H31酶活力的影响的结果图。
图9是不同浓度的表面活性剂SDS对中性内切葡聚糖酶H31酶活力的影响的结果图。
图10是不同浓度的金属螯合物EDTA对中性内切葡聚糖酶H31酶活力的影响的结果图。
图11是Streptomyces sp.H31基因组DNA电泳图；其中：泳道M为takara公司的DL15000Marker；泳道1为基因组DNA。
图12是中性内切葡聚糖酶H31基因的保守序列PCR结果的电泳图；其中：泳道M为takara公司的DL5000Marker；泳道1为H31基因保守DNA序列。
图13是中性内切葡聚糖酶H31基因的保守序列的上游基因的PCR结果的电泳图；其中：泳道M为takara公司的DL2000Marker；泳道1、2分别为H31基因的保守序列的上游基因的AD1第2、3轮PCR结果；泳道3、4分别为H31基因的保守序列的上游基因的AD2第2、3轮PCR结果；泳道5、6分别为H31基因的保守序列的上游基因的AD3第2、3轮PCR结果；泳道7、8分别为H31基因的保守序列的上游基因的AD4第2、3轮PCR结果。
图14是中性内切葡聚糖酶H31基因的保守序列的下游基因的PCR结果的电泳图；其中，泳道M为takara公司的DL2000Marker；泳道1、2分别为H31基因的保守序列的下游基因的AD1第2、3轮PCR结果；泳道3、4分别为H31基因的保守序列的下游基因的AD2第2、3轮PCR结果；泳道5、6分别为H31基因的保守序列的下游基因的AD3第2、3轮PCR结果；泳道7、8分别为H31基因的保守序列的下游基因的AD4第2、3轮PCR结果。
具体实施方式
下面结合实施例及附图对本发明作进一步详细的描述，但本发明的实施方式不限于此。
下列实施例中未注明具体实验条件的实验方法，通常按照常规实验条件或按照制造厂商所建议的实验条件。
实施例1菌株的分离培养
1、富集培养
从深圳红树林土壤中筛选得到产中性内切葡聚糖酶菌株。称取1g土样，加入到100mL的无菌水中，充分摇匀，制成菌悬液，分别取1mL菌悬液接入到事先灭好菌的5mL富集培养基中，37℃、200rpm富集培养48h。
富集培养基：CMC-Na 8.0g/L，蛋白胨10g/L，NaC1 15g/L，KH2PO4 1.5g/L，Na2HPO4·12H2O 9.0g/L，MgSO4·7H2O 2.0g/L，pH 9.0。
2、平板初筛
将富集培养后的菌液10倍逐级稀释，分别取稀释倍数为10-3、10-5、10-7的菌悬液0.5mL涂布于含有CMC-Na的碱性选择培养基平板，37℃培养48h，将透明圈较大的单菌落挑入碱性斜面培养基，如此反复多次，直至确定为纯菌为止，使用斜面培养基保藏原始菌种。
选择培养基：10g/L CMC-Na(羧甲基纤维素钠)，5g/L酵母粉，5g/L NaCl，2g/LKH2PO4，5g/L NH4NO3，0.3g/L MgSO4，1g/L(NH4)2SO4，固体培养基加琼脂15～20g/L，pH 9.0；培养温度为37℃。
斜面培养基：葡萄糖10g/L，蛋白胨5g/L，酵母提取物5g/L，KH2PO4 1g/L，MgCl20.2g/L，NaCl 50g/L，Na2CO3 10g/L，pH 9.0。
3、产中性内切葡聚糖酶菌株的筛选结果
本发明从选取的18个土样中，经过含CMC-Na的刚果红平板筛选，发现了一个能够产生微小的透明圈的菌株(如图1)，3％麦麸发酵培养基(麦麸3.0g/L，蛋白胨10g/L，NaC115g/L，KH2PO4 1.5g/L，Na2HPO4·12H2O 9.0g/L，MgSO4·7H2O 2.0g/L，pH 9.0)37℃、200rpm发酵培养7天后，测量粗酶液酶活，发现其活性高达1.85IU/mL。表明其具有较高的产酶能力。利用PCR扩增该菌株的16S rDNA序列，到GENBANK上进行比对，比对结果显示，该菌株的16S rDNA序列与其它多株链霉菌属的16S rDNA序列有99％的相似性，初步判断为链霉菌(Streptomyces sp.)，将其命名为Streptomyces sp.H31。
该嗜碱链霉菌，名称为Streptomyces sp.H31，保藏单位：中国典型培养物保藏中心(CCTCC)，保藏日期：2015年1月5日，保藏地址：中国.武汉.武汉大学，保藏编号：CCTCCNO:M 2015003。
与当前工业用酶菌株相比，Streptomyces sp.H31菌属于耐碱的极端微生物，可在高碱性条件下(pH9.0)培养，具有可有效抑制杂菌污染，有利于大规模的发酵生产的特点。
Streptomyces sp.H31菌株的16S rDNA的电泳结果，如图2所示。
Streptomyces sp.H31菌株的16S rDNA序列如下：全长1543bp，如SEQ ID No：1所示。
实施例2嗜碱链霉菌Streptomyces sp.H31产生的中性内切葡聚糖酶的的酶活性质
(一)材料
1、菌种
嗜碱链霉菌，是从深圳红树林土壤中筛选得到的产中性内切葡聚糖酶菌株Streptomyces sp.H31(CCTCC NO:M 2015003)。
2、培养基
选择培养基：10g/L CMC-Na(羧甲基纤维素钠)，5g/L酵母粉，5g/L NaCl，2g/LKH2PO4，5g/L NH4NO3，0.3g/L MgSO4，1g/L(NH4)2SO4，固体培养基加琼脂15～20g/L，pH 9.0；培养温度为37℃。
(二)实验方法
1、粗酶液的提取
将Streptomyces sp.H31菌种接到液体选择培养基中，于37℃、200rpm培养48h，将48h培养液以14000rpm的转速冷冻离心20min，取上清液；利用3000道尔顿超滤浓缩膜将上清液超滤浓缩，即得粗酶液。
2、酶活测定方法
用适当缓冲液制备质量百分比1％的CMC-Na溶液，加入经适当稀释的酶液，在特定条件下反应30min，终止反应后，用DNS法于540nm测定还原糖，并扣除空白试验测定值。将上述条件下每小时由底物产生1mg葡萄糖所需的酶量定义为一个酶活力国际单位，用U/mL表示。
3、葡萄糖标准曲线
准确称取无水葡萄糖1g定容至100mL，然后分别取1％标准葡萄糖液0.01、0.02、0.03、0.04、0.05、0.06mL定容至100mL，再分别取上述不同浓度溶液各1.1mL于试管中(另设一管取1.1mL蒸馏水作对照)，各加1mL DNS(3,5-二硝基水杨酸)，煮沸显色10min，冷却后测540nm处的吸光度(测3次取平均值)。以吸光度为纵坐标，对应标准葡萄糖溶液含糖量为横坐标，绘制标准曲线(如图3)。
4、最适反应pH及pH稳定性
取适量获得的中性内切葡聚糖酶的粗酶液，分别加入不同pH值的1％CMC-Na溶液，按常规方法测定酶活力。同时，分别将粗酶液置于不同的预定pH条件下保存30min，再按常规方法于pH 7.0条件下测定其酶活力。
5、最适反应温度和温度稳定性研究
取适量获得的中性内切葡聚糖酶的粗酶液分别置于不同温度条件下反应30min，测定其酶活力。同时，将粗酶液分别置于不同的温度条件下(30℃～80℃)保温30min，然后于50℃反应30min测定其酶活力。
6、金属离子、表明活性剂和金属螯合物对酶活力的影响
取适量获得的中性内切葡聚糖酶的粗酶液分别置于终浓度为10mM的各种金属离子以及不同浓度的金属螯合物EDTA，表面活性剂SDS(十二烷基磺酸钠)后，按照常规方法测定其酶活力。
(三)实验结果
1、最适反应pH
取适量粗酶液，分别加入不同pH值的1％CMC-Na溶液，按常规方法测定酶活力，结果如图4所示。由图4可见，H31酶的最适pH为7左右，为一典型的中性内切葡聚糖酶。
2、最适反应温度
将粗酶液分别置于不同温度条件下反应30min，测定其酶活力，结果如图5。由图5可见，H31的最适反应温度为60℃。
3、pH稳定性
为研究H31蛋白的pH稳定性，分别将粗酶液置于不同的预定pH条件下保存30min，再按常规方法于pH7.0条件下测定其酶活力。结果(如图6)表明，该酶在pH3～9的范围内，酶活性可保持70％以上。可见该中性内切葡聚糖酶酶在弱酸和中碱性条件下均具较强的稳定性。
4、温度稳定性研究
将粗酶液分别置于不同的温度条件下(30℃～80℃)保温30min，然后于50℃反应30min测定其酶活力。结果(如图7)表明，该酶50℃以下具有较好稳定性，表明H31酶蛋白为优良的耐热性中性内切葡聚糖酶，在生产应用方面显示了良好的应用前景。
5、金属离子、表面活性剂和金属螯合物对酶活力的影响
把H31粗酶蛋白分别置于终浓度为10mM的各种金属离子，不同浓度的SDS和EDTA后，按照常规方法测定其酶活力。结果(见图8)表明，H31酶蛋白在10mM Co2+、Mn2+、Na+、K+、Zn2+、Ca2+、Li+、Cu2+、Fe3+、Al3+、Mg2+等金属离子中的酶活均保持在80％以上，具有耐多种金属离子的良好特性，但Ag+对酶活有一定的抑制作用。而Fe3+、Mn2+和Al3+对该酶酶活性有一定的促进作用，其中Al3+对该酶的促进作用最大。
由图9和10可知，SDS浓度低于0.2％时，其作用对于内切葡聚糖酶的酶活性影响不大，而当SDS浓度高于0.5％以后，内切葡聚糖酶的酶活性被抑制的程度高。然而，高浓度金属螯合剂EDTA对该内切葡聚糖酶的酶活性几乎没有影响作用，在2％浓度的EDTA条件下，该酶还剩下有85％的相对酶活性。这说明，该内切葡聚糖酶不是一种金属酶，并且在洗涤及造纸工业中有非常广泛的应用价值。
因此，螯合剂EDTA和低浓度的表面活性剂SDS对酶活性影响甚微。可见，H31酶具有耐多种金属离子和表面活性剂的优良特性，符合洗涤及造纸等工业用酶的基本要求。
实施例3
(一)材料
1、菌种。嗜碱链霉菌，是从深圳红树林土壤中筛选得到的产中性内切葡聚糖酶菌株Streptomyces sp.H31(CCTCC NO:M 2015003)。E.coli TOP10F′购自Invitrogen公司；
2、载体。大肠杆菌克隆载体pMD-19T(simple)购自大连宝生物公司，大肠杆菌表达载体pET-28a(+)(Novagen，KanR)购自Novagen公司。
3、培养基
(1)选择培养基：10g/L CMC-Na(羧甲基纤维素钠)，5g/L酵母粉，5g/L NaCl，2g/LKH2PO4，5g/L NH4NO3，0.3g/L MgSO4，1g/L(NH4)2SO4，固体培养基加琼脂15～20g/L，pH9.0；培养温度为37℃。
(2)LB培养基：胰蛋白胨10g/L，酵母提取物5g/L，NaCl 10g/L，固体培养基加琼脂15～20g/L，pH 9.0，121℃高压灭菌20min。
4、主要试剂。DNA聚合酶、DNA分子量标记为宝生物公司产品；Lysozyme(DNaseRNase non-detected，>70,000U/mg)、一步法快速制备感受态细胞试剂盒(SSCS)为上海生工生物工程公司产品。PCR引物合成由上海生工完成，DNA序列测定由Invitrogen公司完成；基因提取试剂盒、PCR产物片段纯化试剂盒、胶回收试剂盒、质粒提取试剂盒为Oemga公司产品。
5、仪器。Thermal cycler PCR仪为Applied Biosystems By Life Technologies公司、DNA电泳系统为Bio-rad公司产品；分光光度计及微量分光光度计为PharmaciaBiotech公司产品；Thermomixer comfort温控振荡仪、移液枪、台式离心机为Eppendorf公司产品；低温高速离心机为Sigma公司产品；Dolphin-DOC凝胶成像系统为美国WEALTEC公司产品；恒温摇床及恒温水浴锅为WAGEN公司产品。
(二)实验方法和结果
1、基因组DNA的提取
在37℃、200r/min摇瓶培养Streptomyces sp.H31菌，48h后离心收集菌体，然后利用The E.Z.N.A Bacterial DNA Kit试剂盒提取基因组总DNA。其基本步骤如下：
(a)培养基接种Streptomyces sp.H31菌，放入温控摇床中，于37℃，200rpm摇瓶培养36h后取出分装备用。
(b)将3mL Streptomyces sp.H31菌液在室温条件下8000rpm离心10min；
(c)弃去上清液，保留沉淀，然后加入180μL TE buffer重悬菌体，再加入20μL50mg/mL溶菌酶溶液30℃条件下水浴10min；
(d)水浴完成后在室温条件下8000rpm离心5min，去掉上清，加入200μL BTLbuffer，短暂涡旋；
(e)加入25～40mg玻璃珠，高速涡旋5min；
(f)加入25μL蛋白酶K溶液，短暂涡旋，然后55℃水浴60min；
(g)加入5μL RNaseA溶液，反复颠倒，然后室温放置5min；
(h)室温条件下12000rpm离心5min，吸取上清到另外一个干净的离心管中，避免吸到沉淀；
(i)加入220μL BDL buffer，短暂涡旋，然后65℃水浴10min；
(j)加入220μL无水乙醇，高速涡旋20s，然后将混合液转移到套有2.0mL收集管的Akibaiin Column中，12000rpm离心1min；
(k)弃去收集管中的液体，加入500μL的HB buffer，然后10000rpm离心1min；
(l)弃去收集管中的液体，加入700μL的DNA Wash buffer，然后10000rpm离心1min；
(m)重复加入700μL的DNA Wash buffer，然后10000rpm离心1min；
(n)弃去收集管中的液体，再用12000rpm离心2min以除尽剩余的Wash buffer；
(h)将Akibaiin Column放入一个洁净的EP管中，然后在Akibaiin Column膜的中央处加入50～100μL的Elution Buffer，室温放置2min，10000rpm离心1min将DNA抽提下来。
采用1％琼脂糖凝胶电泳对提取产物进行检测。结果如图11所示，能看到一条较为明显的条带，所用DNA Ladder Marker最大条带为15,000bp，基因组条带在Marker最大条带之上，说明其大小超过15,000bp，符合基因组大小要求。
2、TouchDown PCR克隆内切葡聚糖酶基因保守序列
(1)使用PrimerPremier 5.0软件设计上下游引物。根据已知的链霉菌属内切葡聚糖酶保守序列设计上游引物(TNCARAAYAAYMGNTGGGG)和下游引物(CCANGGYTCRAANCCNGCYTG)，送去合成。
(2)使用Takara的PCR Amplification Kit试剂盒，以基因组DNA为模板，按照如下反应体系配制PCR反应液：
然后按照以下条件进行Touchdown PCR反应：
采用1％琼脂糖凝胶电泳对PCR产物进行检测。结果如图12所示。在泳道1中，有一条大小约为560bp的条带，符合已知的12家族的内切葡聚糖酶基因保守序列大小，所以对该条带进行回收。
3、Touchdown PCR产物回收
PCR产物回收使用的是Omega公司生产的Gel Extraction Kit(100)D2500-01，主要步骤如下：(1)在紫外灯下切出含有目的DNA的琼脂糖凝胶，用纸巾吸尽凝胶表面的液体，此时应注意尽量切除不含目的DNA部分的凝胶，减小凝胶体积，提高DNA回收率，之后放入EP管中。(注意切胶时不要将DNA长时间暴露于紫外灯下，以防止DNA损伤)。
(2)切碎胶块。胶块切碎后可以加快操作步骤(3)的胶块融化时间，提高DNA的回收率。称量胶块重量，计算胶块体积。计算胶块体积时，以1mg＝1μL进行计算，向胶块中加入等量的胶块融化液Binding Buffer。
(3)50℃溶解7～15min，保证溶胶要完全，否则会影响后续回收。
(4)将溶胶放入层析柱中(不超过700μL)，12,000rpm离心1min，倒掉收集管中的液体。
(5)加入300μL的Binding Buffer，12,000rpm离心1min，倒掉收集管中的液体。
(6)加入700μL的SPW，12,000rpm离心1min，倒掉收集管中的液体。
(7)重复步骤(6)。
(8)将空柱13,000rpm离心2min，以去掉残存的乙醇，否则会严重影响后续DNA的回收。
(9)弃掉收集管，换成干净的EP管，往吸附柱正中间的吸附膜小心加入15μLElution Buffer，室温静置3min，13,000rpm离心2min，不立即用的话保存于-20℃冰箱中。
4、感受态细胞制备
感受态细胞的制备使用TaKaRa公司的Competent Cell Prepatation Kit试剂盒制备，步骤如下：
(1)用接种针挑取大肠杆菌在含氨苄青霉素(AMP，终浓度为100μg/mL)的LB固体培养基上分级划线，以能够出现单菌落为宜，37℃过夜培养。
(2)挑取菌落置于含20mL液体LB培养基的三角烧瓶中，37℃、220rpm培养。
(3)测定OD值，当OD600值达到0.35～0.5时，放置冰中停止培养，若OD值超出此范围将不能保证感受态细胞的转化效率。
(4)取1mL上述菌液于1.5mL EP管中，4,000rpm、4℃离心5min，弃上清(尽量除去上清)。
(5)在每个EP管中加入100μL冰中预冷的Solution A，轻轻弹动EP管使沉淀悬浮，禁止剧烈振荡，4,000rpm、4℃离心5min，弃上清(尽量除去上清)。
(6)在每个EP管中加入100μL冰中预冷的Solution B，轻轻弹动EP管使沉淀悬浮，禁止剧烈振荡。感受态细胞制备完成，若不立即使用，置于-80℃保存。
5、Touchdown PCR产物的连接、转化和测序
(1)从-80℃冰箱中取100μL感受态细胞悬液，冰中使其解冻。
(2)将4.5μL回收的PCR产物、1.5μL pMD18-T(Simple Vector)和4μL Solution I转化酶(TaKaRa公司生产)加入100μL感受态细胞中混匀，16℃水浴连接3h。
(3)加入连接后的重组DNA溶液轻轻摇匀，冰上放置30min。
(4)42℃水浴中放置90s，之后迅速置于冰上冷却15min。
(5)向管中加入1mL LB液体培养基(不含氨苄青霉素)，混匀后37℃、250rpm振荡培养1h，使细菌恢复正常生长状态，以表达质粒编码的抗生素抗性基因(Amp)。
(6)取1mL上述菌液6,000rpm离心5min，去除约1mL上清，剩下的混匀。取100μL涂布于含氨苄青霉素的筛选平板上，正面向上放置半小时，待菌液完全被培养基吸收后倒置培养皿，37℃培养16～24h。
(7)用接种环挑选长出的单菌落放于1mL LB培养基(加入1μL氨苄青霉素，终浓度为100μg/mL)中，37℃、250rpm摇菌直至菌液变浑浊(4～10h)，每组选取1个送去测序。
测序得到Streptomyces sp.H31内切葡聚糖酶基因保守序列的测序结果，其序列如下：
(a)核苷酸序列如SEQ ID No：2所示(569bp)。
(b)编码的氨基酸(189个)：如SEQ ID No：9所示。
(c)NCBI氨基酸序列比对结果
将该氨基酸序列在NCBI数据库上进行比对(BLAST)，发现该保守序列与1,4-β-内切葡聚糖酶(Streptomyces davawensis JCM 4913)具有85％的较高相似性，可推断克隆的保守序列所在的基因属于1,4-β内切葡聚糖酶基因。
6、TAIL-PCR克隆内切葡聚糖酶基因保守序列的上下游基因
(1)TAIL-PCR是为了得到Streptomyces sp.H31内切葡聚糖酶基因保守序列上游和下游的基因，使用PrimerPremier 5.0软件设计特异性引物和随机引物。根据TouchdownPCR产物测序所得到的保守序列，分别设计2组20bp左右的上下游特异性引物，每组上游特异性引物(Upstream primer，简称USP)和下游特异性引物(Downstream primer，简称DSP)各有3个嵌套的引物用于TAIL-PCR的三轮反应。同时设计出7对随机引物(Arbitrarydegenerate primer，简称AD)。保守序列和引物序列见表1。引物送去合成后，即可进行下一步实验。
表1 Streptomyces sp.H31内切葡聚糖酶基因保守序列的用于TAIL-PCR的引物
名称 序列(5′-3′)
H31-USP1 AGCATCTCCTACGGCTACGTGC；
H31-USP2 ACGGGCAGCAACGGCAC；
H31-USP3 CCATCACGAGCTGGAGCTTCG；
H31-DSP1 GCACGTAGCCGTAGGAGATGCT；
H31-DSP2 GGCGAACAGTTGGTGTAGTGGC；
H31-DSP3 GTGTAGTGGCAGCCGTTGAAGA；
AD1 NTCGASTWTSGWGTT；
AD2 NGTCGASWGANAWGAA；
AD3 WGTGNAGWANCANAGA；
AD4 TGWGNAGWANCASAGA；
AD5 AGWGNAGWANCAWAGG；
AD6 CAWCGICNGAIASGAA；
AD7 TCSTICGNACITWGGA；
(2)TAIL-PCR克隆上游基因
使用Takara的PCR Amplification Kit试剂盒，以基因组DNA为模板，按照如下反应体系配制PCR反应液：
然后按照以下条件进行第一轮TAIL-PCR反应：
第二轮TAIL-PCR反应体系同第一轮，但是将第一轮反应的PCR产物用ddH2O稀释100倍后作为模板DNA，USP1换为USP2，反应条件如下：
第三轮TAIL-PCR反应体系同第一轮，但是将第二轮反应的PCR产物用ddH2O稀释100倍后作为模板DNA，USP2换为USP3，反应条件同第二轮反应的一样。反应结束后，采用1％琼脂糖凝胶电泳对第二轮、第三轮PCR产物进行检测。
通过3个嵌套的上游特异性引物和随机引物AD1、AD2、AD3及AD4进行TAIL-PCR，克隆出Streptomyces sp.H31内切葡聚糖酶基因保守序列的上游基因，其PCR产物电泳图如图13所示。从图13中可以看出，经过3轮PCR，此时泳道2、4出现了明显条带，大小约为400bp，符合目标基因大小要求，初步确定为保守序列上游基因。通过PCR产物回收、连接、转化并测序。
经过测序，Streptomyces sp.H31内切葡聚糖酶基因保守序列上游基因测序结果如下(425bp)：其核苷酸序列如SEQ ID No：3所示。
(3)TAIL-PCR克隆下游基因
反应体系、反应条件同上游基因的克隆，相应的上游特异性引物换为下游特异性引物。反应结束后，采用1％琼脂糖凝胶电泳对第二轮、第三轮PCR产物进行检测。
通过3个嵌套的下游特异性引物和随机引物AD1、AD2、AD3及AD4进行TAIL-PCR，克隆出Streptomyces sp.H31内切葡聚糖酶基因保守序列的下游基因，其PCR产物电泳图如图14所示。从图14中可以看出，经过3轮PCR，此时泳道2、8出现了明显条带，大小约为250bp，符合目标基因大小要求，初步确定为保守序列下游基因。通过PCR产物回收、连接、转化并测序。
经过测序，Streptomyces sp.H31内切葡聚糖酶基因保守序列下游基因测序结果如下(227bp)：其核苷酸序列如SEQ ID No：4所示。
7、获得Streptomyces sp.H31内切葡聚糖酶基因全长序列
根据TAIL-PCR克隆得到的保守序列上下游基因的测序结果进行拼接，得到Streptomyces sp.H31内切葡聚糖酶完整的酶基因序列。其核苷酸序列如SEQ ID No：5所示。
中性内切葡聚糖酶基因序列为一个完整的开放阅读框(ORF)，该开放阅读框以起始密码子ATG开始而以终止密码子TAG结束，共包括762个核苷酸。其中，前11个核苷酸为信号肽编码序列。
中性内切葡聚糖酶基因编码的氨基酸序列如SEQ ID No：6所示。
经DNAssist Version 2.2软件分析得到，中性内切葡聚糖酶基因开放阅读框编码253个氨基酸，其中，前11个氨基酸为基因编码的信号肽，其在成熟酶蛋白分泌时在Ala11位点被切除。因此，成熟的酶蛋白，共计242个氨基酸，其理论分子量(MWt)为25.51kD，与分离得到的天然酶蛋白分子量一致；酶蛋白的等电点(pI)4.84。
将该氨基酸序列在NCBI数据库进行比对(BLAST)，发现该氨基酸序列与同为12家族的内切葡聚糖酶(Streptomyces davawensis)具有最高的同源性，其相似性仅为84％，可初步推断编码该氨基酸序列的基因为新的内切葡聚糖酶基因。
根据序列分析结果结合酶蛋白在分子量、等电点及酶学特性等方面的差异判断，中性内切葡聚糖酶基因为一新发现的内切β-1,4-内切葡聚糖酶基因。
上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。

Claims (5)

1.一种链霉菌，其特征在于：名称为链霉菌(Streptomyces sp.)H31，于2015年1月5日保藏于位于中国武汉武汉大学的中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCC NO:M2015003。
2.根据权利要求1所述的链霉菌，其特征在于：用于培养权利要求1所述的链霉菌的液体选择培养基的配方为：5～10g/L CMC-Na，5～10g/L酵母粉，5～10g/L NaCl，2g/L KH2PO4，5g/L NH4NO3，0.3g/L MgSO4，1g/L(NH4)2SO4，pH 7.0～9.0。
3.根据权利要求2所述的链霉菌，其特征在于：所述的液体选择培养基的配方为：10g/LCMC-Na，5g/L酵母粉，5g/L NaCl，2g/L KH2PO4，5g/L NH4NO3，0.3g/L MgSO4，1g/L(NH4)2SO4，pH 9.0。
4.一种中性内切葡聚糖酶的制备方法，其特征在于：所述的中性内切葡聚糖酶按下述方法制得：
将权利要求1所述的链霉菌H31菌种接到液体选择培养基中，于37℃、200rpm培养48h，得到培养液，将上述培养液以14000rpm的转速冷冻离心20min，取上清液；利用3000道尔顿超滤浓缩膜将上清液超滤浓缩，即得粗酶液。
5.权利要求1所述的链霉菌在洗涤及造纸工业中的应用。
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Granted publication date: 20171020

Termination date: 20190123