CN109554355A

CN109554355A - 具有纤维素降解增强活性的多肽及其应用

Info

Publication number: CN109554355A
Application number: CN201811563380.4A
Authority: CN
Inventors: 方诩; 吴琦; 侯少莉
Original assignee: Shandong Heng Lu Biotechnology Co Ltd
Current assignee: Shandong Heng Lu Biotechnology Co Ltd
Priority date: 2018-12-20
Filing date: 2018-12-20
Publication date: 2019-04-02
Anticipated expiration: 2038-12-20
Also published as: CN109554355B

Abstract

本公开涉及具有纤维素降解增强活性的多肽及其应用，提供一种氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示的多肽在制备具有纤维素分解增强活性的耐热性辅助活性酶中的应用。该多肽能够有效降解纤维素，和其他纤维素降解酶配合，可以提高含有纤维素原料的糖化效率，进一步应用于以秸秆等木质纤维素为原料发酵生产乙醇等化学品的工业生产中，达到提高秸秆等木质纤维素的利用效率。

Description

具有纤维素降解增强活性的多肽及其应用

技术领域

本公开涉及具有纤维素降解增强活性的多肽及其应用，特别涉及一种与纤维素酶有较好协同作用的多肽及其应用，属于生物工程技术领域。

背景技术

这里的陈述仅提供与本公开有关的背景信息，而不必然构成现有技术。

纤维素酶和广泛地应用于食品，纺织，木质纤维素生物转化等方面。提高纤维素酶对底物的糖化效率对于降低工业生产成本有十分重要的意义。

纤维素酶往往利用丝状真菌进行生产，而改造丝状真菌工业菌株提高纤维素酶酶活的方法有诱变育种技术，原生质体融合技术，基因重排技术等。

然而，传统的纤维素酶降解秸秆等木质纤维素的过程主要是在外切葡聚糖酶、内切葡聚糖酶、纤维二糖酶等一系列糖苷水解酶的作用下，通过打断β-1,4-糖苷键的方式来降解木质纤维素。但是由于木质纤维素物理结构复杂，相邻的多糖链之间可通过氢键形成高度有序的结晶结构，许多天然的纤维素还包埋在木质素和半纤维素中，这些复杂的结构仅仅通过糖苷水解酶水解多聚糖链，很难被有效降解。

因此，LPMO与传统糖苷水解酶水解多糖的方式不同，LPMO是一种全新的生物质降解酶，是通过氧化作用断裂糖苷键产生寡糖链，暴露更多糖苷水解酶结合的位点，从而加快反应进程，提高寡糖或单糖的生成量。近期研究发现，LPMO是一种新型的解构木质纤维素生物质的酶，属于纤维素酶促进酶，通过增强纤维素酶活性和减少参与反应的传统酶系的组装，可有效协同纤维素酶的作用，减少水解的成本。虽然纤维素酶常用生产微生物-里氏木霉在生产酶液时，酶液也有LPMO的活性，但是活性不高。因此，需要添加活性更高的LPMO或者用基因技术增强酶液中LPMO的酶活。同时，LPMO降解纤维素后，可以产生很多还原端被氧化的寡糖。

发明内容

针对背景技术，本发明人利用来源于Talaromyces cellulolyticus的一个多肽片段，在里氏木霉丝状真菌或大肠杆菌中异源表达后，获得含有可溶性多糖单加氧酶，提高了里氏木霉丝状真菌培养液的纤维素降解效率。本公开所述SEQ ID NO.1所示的多肽，提高了原有木质纤维素降解酶系中的LPMO酶活活性，改善了降解含有纤维素原料的酶系成分，从而提高含有纤维素原料制备可发酵单糖以及酒精产率的方法。同时，SEQ ID NO.1所示的多肽降解纤维素后，可以产生很多还原端被氧化的寡糖。

本公开具体采用以下技术方案：

在本公开的第一个典型的实施方式中，提供一种氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示的多肽(称为LPMO-N)在作为或制备具有纤维素分解增强活性的辅助活性酶中的应用。

在本公开的一个或多个实施方式中，所述SEQ ID NO.1所示的多肽的表达基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.2或3所示。

在本公开的一个或一些实施方式中，提供一种氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示的多肽在制备具有纤维素分解增强活性的耐热性辅助活性酶中的应用。

其中最适反应温度为45～50℃，尤其是在45℃、48h后酶活残留量依然在70％以上。

本领域的技术人员知晓现有的LPMO酶类酶活普遍低下，不耐热，而本发明人发现如SEQ ID NO.1所示的多肽在里氏木霉ATCC 26921异源表达后，在45℃、48h后酶活残留量较高。

在本公开的第二个典型的实施方式中，提供一种氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示的多肽在制备具有分解纤维素作用的耐热性混合纤维素酶中的应用。

不同来源的纤维素酶有不同的较适合的反应条件，而大多数的纤维素酶最适反应温度在45～65℃，而现有的LPMO酶类，在45℃下酶活较低，耐热性较差，不能很好地与纤维素酶发挥协同作用，从而影响纤维素降解效率。而本发明人发现如SEQ ID NO.1所示的多肽在里氏木霉ATCC 26921异源表达后，在45℃、48h后酶活残留量较高，正是因为其具有优异的耐热性，所以比一般的LPMO酶类能够更好地与纤维素酶发挥协同作用，提高了纤维素的降解效率。

在本公开的第三个典型的实施方式中，提供一种高效降解纤维素的里氏木霉工程菌，其特点是：将如SEQ ID No.2或3所示的基因序列导入里氏木霉ATCC 26921，制备得到高效降解纤维素的里氏木霉工程菌。

在本公开的第四个典型的实施方式中，提供所述高效降解纤维素的里氏木霉工程菌的构建方法，该方法包括以下步骤：

(1)制备里氏木霉中的LPMO-N基因表达盒：

参照SEQ ID No.2或3进行基因合成，以基因合成DNA片段为模板，利用引物进行PCR扩增，制得片段3；

以里氏木霉基因组为模板，利用引物进行PCR扩增，分别制得片段4和片段7；

以质粒作为模板，利用引物进行PCR扩增硫胺嘧啶基因，制得片段5；

以质粒作为模板，利用引物进行PCR扩增trpC terminator，制得片段6；

将片段3、片段5、片段6按照设定比例混合，进行PCR扩增，制得大片段8；

以大片段8为模板，利用引物进行PCR扩增，制得用于下一轮融合PCR的大片段8；

将片段4、片段7、大片段8按照设定比例混合，进行PCR扩增，制得大片段9；

以大片段9为模板，利用引物进行PCR扩增，制得里氏木霉中的LPMO-N基因表达盒；

(2)将步骤(1)中的里氏木霉中的LPMO-N基因表达盒导入里氏木霉ATCC 26921，筛选得到稳定遗传的转化子，即得里氏木霉工程菌。

在本公开的第五个典型实施方式中，提供一种组合物，其包括氨基酸序列如SEQID NO.1所示的多肽和来源于里氏木霉的纤维素水解酶或者该组合物为里氏木霉工程菌的培养液或发酵液。

在本公开的第六个典型的实施方式中，提供所述氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示的多肽、所述高效降解纤维素的里氏木霉工程菌或所述组合物在处理纤维素材料或生物质中的应用。

所述应用具体包括以下几个方面：

(1)一种降解或转化纤维素材料的方法，该方法包括：采用所述高效降解纤维素的里氏木霉工程菌或所述组合物降解或转化所述纤维素材料；

进一步包括回收降解或转化的纤维素材料；

(2)一种产生发酵产物的方法，所述方法包括：采用所述高效降解纤维素的里氏木霉工程菌或所述组合物糖化所述纤维素材料；

用一种或多种(例如几种)发酵微生物发酵经糖化的纤维素材料以产生发酵产物；

和从发酵回收发酵产物。

(3)一种发酵纤维素材料的方法，所述方法包括：用一种或多种(例如几种)发酵微生物发酵纤维素材料，其中所述纤维素材料是采用所述高效降解纤维素的里氏木霉工程菌或所述组合物糖化的；

(4)一种将生物质转化为糖的方法，所述方法包括：使所述生物质与所述高效降解纤维素的里氏木霉工程菌或所述组合物接触。

进一步的，所述应用的具体步骤如下：

对纤维素材料进行前处理，按15～25％(质量百分比)固形物终浓度将前处理后的纤维素材料原料和水进行混合，然后调节pH值范围至5.0～6.0，加入所述组合物，在45～50℃(优选45℃)温度下反应32～40h，经固液分离，制得水解液。

进一步的，所述应用的另一个具体步骤如下：利用所述高效降解纤维素的里氏木霉工程菌或所述组合物降解的纤维素材料生产乙醇的方法，该方法包括：

对纤维素材料进行前处理，按15～25％(质量百分比)固形物终浓度将前处理后的纤维素材料原料和水进行混合，然后调节pH值范围至5.0～6.0，加入所述组合物，在45～50℃(优选45℃)温度下反应32～40h，经固液分离，制得水解液；

取步骤制得的水解液，按照质量百分比1～5％的比例接种酵母，在28～32℃进行厌氧发酵培养45～50小时，经纯化分离，制得乙醇。

更进一步的，所述前处理为酸处理、碱处理、水热处理、亚临界水处理、微粉碎处理、蒸煮处理、干燥处理、亚硫酸盐处理或水热处理；优选，亚硫酸盐处理、水热处理、碱处理或稀硫酸处理。

更进一步的，所述固液分离为离心分离，离心分离条件为8000rpm离心30min。

更进一步的，所述纯化分离为蒸馏分离。

与本发明人知晓的相关技术相比，本公开其中的一个技术方案具有如下有益效果：

SEQ ID NO.1所示的多肽和已经报道的来源于Thermoascus aurantiacus的多肽(基因库序列号AGO68294)相比较(利用the Needleman-Wunsch algorithm，https://www.ebi.ac.uk/Tools/psa/)，氨基酸序列的一致性仅为56.1％，相似性仅为63.1％。该多肽能够有效降解纤维素，和其他纤维素降解酶配合，可以提高含有纤维素原料的糖化效率，进一步应用于以秸秆等木质纤维素为原料发酵生产乙醇等化学品的工业生产中，达到提高秸秆等木质纤维素的利用效率。

附图说明

构成本公开一部分的说明书附图用来提供对本公开的进一步理解，本公开的示意性实施例及其说明用于解释本公开，并不构成对本公开的不当限定。

图1是LPMO-N_Ecoli降解磷酸溶胀纤维素产物的质谱图。

具体实施方式

应该指出，以下详细说明都是示例性的，旨在对本公开提供进一步的说明。除非另有指明，本文使用的所有技术和科学术语具有与本公开所属技术领域的普通技术人员通常理解的相同含义。

需要注意的是，这里所使用的术语仅是为了描述具体实施方式，而非意图限制根据本公开的示例性实施方式。如在这里所使用的，除非上下文另外明确指出，否则单数形式也意图包括复数形式，此外，还应当理解的是，当在本说明书中使用术语“包含”和/或“包括”时，其指明存在特征、步骤、操作和/或它们的组合。

术语说明：

多肽：是指由通过肽键连接的氨基酸残基的单链组成的化合物。

表达盒、表达载体：是通过重组或合成方式产生的核酸构建体，其具有一系列能让特定核酸在靶细胞内转录的指定核酸元件。可将重组表达盒掺入质粒、染色体、线粒体DNA、质体DNA、病毒或核酸片段中。通常，表达载体的重组表达盒部分包括待转录的核酸序列和启动子等序列。

表达：是指基于基因的核酸序列而产生多肽的过程。该过程包括转录和翻译二者。

丝状真菌：是指本领域技术人员所了解的任何和所有丝状真菌。优选的真菌选自曲霉属(Aspergillus)、木霉属(Trichoderma)、镰孢属(Fusarium)、金孢属(Chrysosporium)、青霉属(Penicillium)、腐质霉属(Humicola)、脉孢菌属(Neurospora)或其可选择的有性形式，诸如裸胞壳属(Emericella)、肉座菌属(Hypocrea)。现在已证明，无性工业真菌里氏木霉是子囊菌红褐肉座菌的克隆衍生物(参见Kuhls等人，PNAS，93：7755-7760，1996)。

纤维低聚糖：是指包含2至8个葡萄糖单位并且具有β-1,4键的低聚糖类，例如，纤维二糖。

纤维素酶、纤维素分解酶：是指一类能够将纤维素聚合物水解成较短的纤维低聚糖低聚物、纤维二糖和/或葡萄糖的酶。纤维素酶的许多实例，诸如外切葡聚糖酶、外切纤维二糖水解酶、内切葡聚糖酶和葡萄糖苷酶已经从纤维素分解生物中获得，尤其包括真菌、植物和细菌。由这些微生物产生的酶是蛋白质的混合物，其具有三类用于将纤维素转化成葡萄糖的作用：内切葡聚糖酶(EG)、纤维二糖水解酶(CBH)和β-葡萄糖苷酶。这三种不同类型的纤维素酶协同作用以将纤维素及其衍生物转化成葡萄糖。

LPMO活性：是指可溶性多糖单加氧酶活力单位；一个单位的LPMO活性被定义为每分钟转换2微摩尔的2,6-dimethoxyphenol所用的酶量。参照以下文献(Breslmayr et al.Afast and sensitive activity assay for lytic polysaccharidemonooxygenase.Biotechnol Biofuels 2018,11:79)进行测定。准备116mM琥珀酸缓冲液/磷酸缓冲液，调pH至6.0，终浓度调至100mM；配制10mM 2,6-二甲氧基苯酚(DMP,dimethoxyphenol)，pH6.0；5mM H₂O₂；(均超纯水配制，配制12h内使用)。LPMO酶液离心(6000g，3min)，取上清放置冰上备用，860μl琥珀酸缓冲液/磷酸缓冲液，100μl 2,6-DMP，20μl H₂O₂充分混匀，30℃孵育15min后加入20μl处理好的LPMO酶液，分光光度计测定，469nm，300s。

滤纸酶活：向试管中加入50mg滤纸(用葡萄糖制作标准曲线)，1.5ml醋酸缓冲液(50mM，pH4.8)，加入0.5ml酶液，50℃水浴60min，后加入2.5ml DNS终止反应，煮沸10分钟后，定容到25ml，摇匀后OD₅₄₀测定吸光度值。截取在60min释放2.0mg葡萄糖当量的还原糖(转化率4％)计算滤纸酶活力(Filter Paperase Activity)，单位以是指滤纸酶活力单位FPU表示。

为了使得本领域技术人员能够更加清楚地了解本公开的技术方案，以下将结合具体的实施例详细说明本公开的技术方案。

微生物来源

实施例中的里氏木霉(Trichoderma reesei)来源于美国模式培养物集存库，菌种保藏编号ATCC 26921。

培养基

麸皮培养基组分如下，均为重量百分比：10wt％麸皮浸出液，2wt％琼脂，余量水。

基本培养基组分如下，每升组分如下：

葡萄糖20g，(NH₄)SO₄ 5g，KH₂PO₄ 15g，MgSO₄ 0.6g，CaCl₂ 0.6g，FeSO₄·7H₂O0.005g，MnSO₄·H₂O 0.0016g，ZnSO₄·7H₂O 0.0014g，CoCl₂ 0.002g，胰蛋白胨10g，pH 5.5。

微晶纤维素培养基：微晶纤维素20g，(NH₄)SO₄ 5g，KH₂PO₄ 15g，MgSO₄ 0.6g，CaCl₂0.6g，FeSO₄·7H₂O 0.005g，MnSO₄·H₂O 0.0016g，ZnSO₄·7H₂O 0.0014g，CoCl₂ 0.002g，pH5.5。

下层培养基组分如下,每升组分如下：

葡萄糖20g，KH₂PO₄ 15g，琼脂糖10g，0.2μg/ml的抗硫胺素，1.5％琼脂糖。

上层培养基组分如下,每升组分如下：

葡萄糖20g，(NH₄)SO₄ 5g，KH₂PO₄ 15g，MgSO₄ 0.6g，CaCl₂ 0.6g，FeSO₄·7H₂O0.005g，MnSO₄·H₂O 0.0016g，ZnSO₄·7H₂O 0.0014g，CoCl₂ 0.002g，胰蛋白胨10g，0.2μg/ml的抗硫胺素，1.5％琼脂糖。

选择培养基组分如下，每升组分如下：

生理盐水组分如下，均为重量百分比：0.9wt％NaCl，0.5wt％吐温80。

抽提缓冲液组分如下：200mM Tris-HCl，250mmol/L NaCl，25mmol/L EDTA，2％十二烷基硫酸钠，pH8.5。

pME2892质粒采用如下论文中记载的方法制备：

Kubodera T,Yamashita N,Nishimura A.Pyrithiamine resistance gene(ptrA)of Aspergillus oryzae:cloning,characterization and application as a dominantselectable marker for transformation.Bioscience,Biotechnology,andBiochemistry.64(7):1416-21,2000.

pSilent-1质粒采用如下论文中记载的方法制备：

Nakayashiki H,Hanada S,Nguyen BQ,Kadotani N,Tosa Y,Mayama S.RNAsilencing as a tool for exploring gene function in ascomycete fungi.FungalGenet Biol.42(4):275-83,2005.

实施例1

里氏木霉基因组的获得

(1)将里氏木霉在麸皮培养基上培养三天，然后用生理盐水将孢子洗脱下来，按照1×10⁸比例接入基本培养基中，200rpm，30℃生长两天，4000rpm离心，收集菌体，收集于1.5ml离心管中；

(2)向离心管中加入500μl抽提缓冲液和0.1g石英砂，漩涡剧烈振荡1min，使菌体分散于抽提缓冲液中，65℃，放置20min；加入500μl苯酚/氯仿(混合体积比例1：1)，漩涡剧烈振荡30s，12000rpm室温离心10min，收集上清；

(3)将上清液转至另一无菌的1.5ml离心管中，加入0.1倍体积的3M NaAc溶液(pH4.8)和0.6倍体积异丙醇，颠倒混匀，-20℃放置15min；12000rpm，4℃，10min，弃上清，加浓度为0.1μg/μl RNAase的ddH₂O 200μl，37℃，静置1h；加入200μl苯酚/氯仿(混合体积比例1：1)抽提一次，12000rpm，10min；上清转移至另一1.5ml离心管中，加0.1倍体积3M NaAc(pH4.8)和0.6倍体积异丙醇，-20℃放置20min，12000rpm，4℃，10min，收集沉淀；加700μl70％乙醇(v/v)，洗涤一次(12000rpm，2min)；待乙醇挥发完全，用50μl ddH₂O溶解基因组DNA，制得里氏木霉基因组DNA。

实施例2

大肠杆菌中的成熟多肽LPMO-N表达与纯化

(1)将SEQ ID NO.1的成熟多肽进行密码子优化，获得SEQ ID NO.2后，进行基因合成。选用引物，用TOYOBO公司的KOD FXDNA聚合酶扩增获得目标基因。琼脂糖凝胶电泳验证条带大小正确后切取条带，用OMEGA凝胶提取试剂盒回收基因片段。

E.coli-LPMO-N-F:

GGCCAGTCGAACCACGCAATGCGTCTCGATCCGCAGTGTCTTGCGTCTCTATGCCGAGCACCAAAGTGGCAGCGT，如SEQ ID NO.4所示；

E.coli-LPMO-N-R:

GCACACAGGAAACAGCTATGACCGTCTCGGTTGGCAGTGACTCCGTCTCTTCAGTGATGATGATGATGATGCAGC，如SEQ ID NO.5所示；

PCR条件为：94℃5min；98℃10s，58℃30s，68℃1.5min，30个循环；68℃，10min，4℃保存，制得片段1。

(2)以EMD Biosciences(Novagen)公司的pet21a质粒为模板，利用引物进行PCR扩增，引物序列如下：

Pet21a-F:AGAGACGGAGTCACTGCCAACCGAGA，如SEQ ID NO.6所示；

Pet21a-R:AGAGACGCAAGACACTGCGGATCGA，如SEQ ID NO.7所示；

PCR条件为：94℃5min；98℃10s，58℃30s，68℃2.5min，30个循环；68℃，10min，4℃保存，制得片段2。

(3)成熟多肽LPMO-N表达大肠杆菌获得：将含有GBdir+pSC101-BAD-ETgA-tet质粒的E.coli菌株，在含有四环素抗性的平板上挑取单菌落至装有1mL LB液体培养基(灭菌，含4ug/mL四环素)的EP管中，30℃，900rpm培养过夜。取40μl上述菌液接种于含有1.4ml LB液体培养基(灭菌，含4μg/mL四环素)的EP管中，30℃，900rpm培养2h。向管中加入25μl 10％的_L-阿拉伯糖，37℃培养40min，10000rpm离心1min，1ml的ddH₂O重悬菌体，重复一次。离心，弃上清，留菌体。向菌体中加入20ul片段1和片段2的混合物，混匀，转移至电转杯进行电转，电转条件为：电压：1350v，电阻：200Ω。吸取电转菌体接种于1ml LB液体培养基(灭菌，无抗性)的EP管中，37℃，900rpm培养1h。离心，弃上清，剩下50-100μl菌液，混匀，涂布到LB固体培养基平板(灭菌，含50μg/mL的氨苄)上，37℃过夜培养。挑取单克隆菌落进行测序验证，将验证正确的菌株进行培养，提取质粒转化E.coli BL21(DE3)感受态细胞，获得大肠杆菌的表达菌株。

(4)大肠杆菌中成熟多肽LPMO-N的表达：

将(3)获得的菌株在LB培养基中活化作为种子液，在37℃，200rpm条件下培养至OD₆₀₀为0.8，然后取种子液以1‰接种量接种于2瓶含有100μg/ml氨苄抗性的1L液体LB培养基中，在37℃，200rpm条件下培养至OD₆₀₀为0.8，接着向每瓶中加入1‰浓度为0.5mM IPTG(isopropylβ-D-1-thiogalactopyranoside)作为诱导剂，然后将培养温度降低至16℃，在200rpm条件下过夜(16h以上)诱导培养。

将上述步骤中诱导好的大肠杆菌在8000rpm条件下离心10min，弃去上清液，加入50ml50mM Tris-HCl buffer(pH 8.0)，超声破碎，弃上清，收集细胞碎片。洗涤细胞碎片两次。加20ml变性液，混匀，室温变性40min，在4℃，32000rpm的条件下离心50min。取上清，即为目标蛋白溶液，至于冰上。

(5)大肠杆菌中成熟多肽LPMO-N的纯化：

利用镍柱进行亲和色谱层析，首先利用重悬缓冲液来平衡预装好的镍柱，然后将上述目标蛋白溶液进行上样，使得目标蛋白与镍柱中的填料充分结合，因亲和作用而发生特异性吸附，从而达到富集目标蛋白的效果。进样结束后，首先利用重悬缓冲液来洗涤柱子，从而将与镍柱没有结合的能力的蛋白进行洗脱，然后利用分离缓冲液进行洗涤镍柱，从而将与镍柱有非特异性结合的杂蛋白洗脱，最后用洗脱缓冲液利用高浓度的咪唑与目标蛋白竞争结合镍柱填料，从而将目标蛋白从色谱柱中洗脱下来，收集后即得到目标蛋白。

将上述收集到的目标蛋白利用Econo-Pac脱盐柱(购自BIO-RAD公司)进行脱盐，将脱盐柱上下封口拧开，用pH 7.4的PBS洗涤5次，每次5ml。取目标蛋白溶液上样2.5ml，待溶液流尽时，向脱盐柱中加入3.5ml PBS溶液并进行收集目标蛋白，获得LPMO-N_Ecoli成熟多肽。目标蛋白收集后于4℃保存。

实施例3

磷酸溶胀纤维素降解实验：

根据公布的方法从Avicel制备磷酸溶胀纤维素(PASC)(参见下述参考文献)。

在100mM的甲酸铵缓冲液中进行反应，pH 6.0，反应体系中包含：4mM的抗坏血酸，0.5％(w/v)PASC，混入实施例2中纯化后LPMO-N_Ecoli多肽，20℃温浴16小时后，终止水解反应。在室温下以3000rpm离心5min。通过MALDI-TOF/TOF MS检测分析来分析上清液中的水解反应产物，质谱图如图1。产物中含有以下物质：C-1,C-4和C-6oxidized oligosaccharides(氧化低聚糖),aldonic acid(醛糖酸，m/z+16),C4-ketoaldose(酮醛)或C6-hexodialdose(己二醛)(m/z-2),minor double C4和C6oxidized oligosaccharides(m/z-4),double C1和C4oxidized oligosaccharides(1,5δ-lactone和gemdiol,或aldonic acid和4-ketoaldose,m/z+14；aldonic acid和gemdiol,m/z+32),C1和C6oxidizedoligosaccharides(m/z+30),和C1-,C4-和C6-oxidized cello-oligosaccharides(m/z+28)。

经过该实验可知，该多肽属于LPMO酶，氧化作用位点包括C1、C4和C6位。

参考文献：

Quinlan RJ,et al.Insights into the oxidative degradation of celluloseby a copper metalloenzyme that exploits biomass components,Proc Natl Acad SciUSA,2011,vol.108(pg.15079-84).

实施例4

参照实施例3，用木聚糖、淀粉、几丁质为底物，混入实施例2中纯化后LPMO-N_Ecoli多肽，发现该多肽不能降解木聚糖、淀粉、几丁质。

表1 LPMO-N多肽对于不同底物的降解

+：代表可降解；-：代表不可降解

实施例5

里氏木霉酶液的制备：

取里氏木霉(Trichoderma reesei)，接种于麸皮培养基中，在30℃的条件下培养3天，然后各取同等大小琼脂块转接于下述种子培养基中，在30℃、200rpm的条件下培养2.5天，制得微生物培养液，再将培养液转接到下述产酶培养基中，在30℃、200rpm的条件下发酵培养5天，制得微生物培养液。将培养液14000r/min离心10min，得粗酶液，将粗酶液34000r/min，4℃离心40min得酶液。

上述的种子培养基组分如下，均为重量百分比：

葡萄糖1％，蛋白胨1％，麸皮1％，玉米芯1％，硫酸铵0.2％，磷酸二氢钾0.3％，硫酸镁0.05％，碳酸钙0.5％，余量水。自然pH,115℃灭菌30min。

上述的产酶培养基组分如下，均为重量百分比：

玉米芯粉3％，蛋白胨0.5％，麸皮3％，微晶纤维素0.6％，硝酸钠0.2％，硫酸铵0.2％，磷酸二氢钾0.3％，硫酸镁0.05％，尿素0.1％，吐温80 0.3％，碳酸钙0.5％，余量水。自然pH,121℃灭菌30min。

实施例6

将实施例2中纯化后的LPMO-N_Ecoli多肽和实施例5获得的里氏木霉培养液混合后的糖化实验：

预处理后的玉米秸秆的制备方法：将玉米秸秆浸渍在1wt％的硫酸溶液中，一边搅拌一边在180℃进行20分钟高压釜处理。

降解含纤维素原料的方法如下：分别以微晶纤维素和预处理后的玉米秸秆为底物，以对每克底物5mg蛋白的比例进行实施例5获得的里氏木霉酶液的添加，然后在体系中按照对每克底物加入0.1mg实施例2中纯化后的LPMO-N_Ecoli蛋白(对照组用牛血清蛋白代替)，加入6.25mM的没食子酸，45℃，pH4.8进行糖化，反应七天后分别取样，HPLC测定其葡萄糖产量。

表1降解后7天纤维素二糖和葡萄糖的得率(mM)

酶液	微晶纤维素	预处理后的玉米秸秆
			里氏木霉+牛血清蛋白	11.3	15.8
里氏木霉+LPMO-N<sub>Ecoli</sub>	13.8	19.9

实施例7

里氏木霉中的LPMO-N基因表达盒的获得：

(1)参照SEQ ID NO.3进行基因合成，以基因合成DNA片段为模板，利用引物进行PCR扩增，引物序列如下：

上游引物Tr-LPMO-N-F:

GCAAGCTCAACTGCATAGTATCGACTTCAAGGAAAACACGCACAAATAATCATCATGCCTTCTACTAAAGTCGCTGCCC，如SEQ ID NO.8所示；

下游引物Tr-LPMO-N-R:

GCTGTTTGATGATTTCAGTAACGTTAAGTGGATCGATCCGGTCGGCATCTACTTTAAAGGACAGTAGTGGTGATGACGG，如SEQ ID NO.9所示；

PCR条件为：94℃5min；98℃10s，58℃30s，68℃1.5min，30个循环；68℃，10min，4℃保存，制得片段3。

(2)以实施例1中获得的里氏木霉基因组为模板，利用引物进行PCR扩增，

引物序列如下：

xyn1up-F：GCATATTTCGTTGGCTGGCAGATTGAAG，如SEQ ID NO.10所示；

LPMO-N-xyn1up-R：

GGGCAGCGACTTTAGTAGAAGGCATGATGATTATTTGTGCGTGTTTTCCT，如SEQ ID NO.11所示；

PCR条件为：94℃5min；98℃10s，58℃30s，68℃2min，30个循环；60℃，10min，4℃保存，制得片段4。

(3)以pME2892质粒作为模板，利用引物进行PCR扩增硫胺嘧啶基因，引物序列如下：

trpC terminator-ptrA-F:

AAAAAAAGAGGAAAAGACCGTCCGTAACGAAATGTAAAAGCTAGGAGA，如SEQ ID NO.12所示；

xyn1down-ptrA-R:

ACTCCAAGTCAACATCAACAGAACTTACTCAGCACACTCGCGCTGACG，如SEQ ID NO.13所示；

PCR条件同上，制得片段5。

(4)以pSilent-1质粒作为模板，利用引物进行PCR扩增trpC terminator，引物序列如下：

LPMO-N-trpC terminator-F:

GTCATCACCACTACTGTCCTTTAAAGTAGATGCCGACCGGATCGATCC，如SEQ ID NO.14所示；

PtrA-trpC terminator-R:

TCTCCTAGCTTTTACATTTCGTTACGGACGGTCTTTTCCTCTTTTTTT，如SEQ ID NO.15所示；

PCR条件同上，制得片段6。

(5)以上述得到的里氏木霉基因组为模板，利用引物进行PCR扩增，

引物序列如下：

PtrA-xyn1down-F：

CGTCAGCGCGAGTGTGCTGAGTAAGTTCTGTTGATGTTGACTTGGAGT，如SEQ ID NO.16所示；

xyn1down-R：CCTCGCGGAAGTGAAGAAAGAGTGTAA，如SEQ ID NO.17所示；

PCR条件为：94℃5min；98℃10s，58℃30s，68℃2min，30个循环；60℃，10min，4℃保存，制得片段7。

(6)将片段3、片段5、片段6以摩尔比1：1：2混合，进行PCR扩增，采用的PCR条件为：94℃5min；98℃10s，58℃10min，68℃3.5min，13个循环；68℃终延伸10min，4℃保存。制得大片段8。

(7)将大片段8稀释10倍，利用引物进行PCR扩增，引物序列如下：

T.reesei-LPMO-N-F:

GCAAGCTCAACTGCATAGTATCGACTTCAAGGAAAACACGCACAAATAATCATCATGCCTTCTACTAAAGTCGCTGCCC，如SEQ ID NO.18所示；

xyn1down-ptrA-R:

ACTCCAAGTCAACATCAACAGAACTTACTCAGCACACTCGCGCTGACG，如SEQ ID NO.19所示；

进行PCR扩增，PCR条件：94℃5min；98℃10s，58℃60s，68℃4min，30个循环；68℃，10min，4℃保存，制得用于下一轮融合PCR的大片段8。

(8)将片段4、片段7、大片段8以摩尔比1：1：2混合，进行PCR扩增，采用的PCR条件为：94℃5min；98℃10s，58℃10min，68℃7min，13个循环；68℃终延伸10min，4℃保存。制得大片段9。

(9)里氏木霉中LPMO-N基因表达盒的获得：将大片段9稀释10倍，利用引物进行PCR扩增，引物序列如下：

xyn1up-F：GCATATTTCGTTGGCTGGCAGATTGAAG，如SEQ ID NO.20所示；

xyn1down-R：CCTCGCGGAAGTGAAGAAAGAGTGTAA，如SEQ ID NO.21所示；

进行PCR扩增，PCR条件：94℃5min；98℃10s，58℃60s，68℃10min，30个循环；68℃，10min，4℃保存，制得里氏木霉中的LPMO-N基因表达盒。

实施例8

里氏木霉中蛋白表达：

构建好的LPMO-N基因表达盒导入里氏木霉中

(1)将里氏木霉菌株在麸皮培养基上培养三天，利用生理盐水，洗脱下孢子，在麸皮培养基上盖一玻璃纸，并在其上面加入100μl孢子悬液，涂布均匀，30℃培养约16h，制得带有萌发孢子的玻璃纸。

(2)加0.1g裂解酶(购自sigma公司，商品名称sigma#L-1412)到20ml溶液1(1.2M山梨醇，0.1M KH₂PO₄)中，轻轻摇均；吸取2～3ml酶液到无菌培养皿中，加一层带有萌发孢子的玻璃纸，再加2～3ml酶液，依次叠放10层。放置培养皿于30℃培养箱中。酶解约90min后，用镊子(无菌)挑取玻璃纸，用移液枪吸取溶液冲掉玻璃纸上残留的菌丝体，用玻璃棉漏斗过滤原生质体悬液到置于冰上的50ml离心管中，然后用数毫升溶液1冲洗玻璃棉，然后2000rpm，4℃离心10min，去除上清液并用4ml溶液2(1M山梨醇，50mmol/L CaCl₂，10mmol/LTrisHCl)重悬原生质体，2000rpm，4℃离心10min，去除上清液，用0.5～1.0ml溶液2(4℃)重悬原生质体，放置原生质体在冰上，制得原生质体悬液。

(3)将转化体系(200μl原生质体悬液，10μl纯化pE，50μl聚乙二醇分子量(5000-7000))在冰上放置20min，后加2ml PEG(室温)，轻轻混匀，20℃放置5min，加入4ml溶液2，混匀；吸取0.2～1ml到4ml预保温的上层培养基中，轻轻混匀，倒在下铺有下层培养基的平板上，等培养基凝固后，置30℃培养。在筛选培养基上培养3～4d后，用接种针挑取转化子到选择培养基，培养生孢。

(4)传两代后(培养3天)，将孢子转入基本培养基中，提取染色体进行验证后，获得基因工程菌TrLPMO-N。

实施例9

里氏木霉ATCC 26921和实施例8中变异菌株TrLPMO-N培养液糖化实验：

(1)取里氏木霉(Trichoderma reesei)ATCC 26921和变异菌株TrLPMO-N，接种于麸皮培养基中，在30℃的条件下培养3天，然后各取同等大小琼脂块转接于下述产酶培养基中，在30℃、180rpm的条件下发酵培养8天，制得微生物培养液。将培养液14000r/min离心10min，得粗酶液，将粗酶液34000r/min，4℃离心40min得酶液。

上述的产酶培养基组分如下，均为重量百分比：

玉米芯粉3％，蛋白胨1％，麸皮3％，微晶纤维素0.4％，硝酸钠0.1％，硫酸铵0.1％，磷酸二氢钾0.1％，硫酸镁0.04％，尿素0.15％，吐温80 0.2％，余量水。

检测酶液的滤纸酶活和LPMO酶活。

表2酶液FPU和LPMO酶活结果

菌株	滤纸酶活	LPMO酶活
			ATCC 26921	100％	100％
TrLPMO-N	128.51±0.11％	148.16±0.05％

里氏木霉和变异菌株TrLPMO-N酶液的滤纸酶活和LPMO酶活结果如表2示，可见LPMO-N在里氏木霉中表达后，滤纸酶活有所增强，提高了28％以上。另一方面，虽然里氏木霉ATCC 26921本身有LPMO的酶活活性，但是LPMO-N在ATCC 26921中表达后，LPMO酶活都有显著地提高，提高了48％以上；另外，经过试验验证，与其他受体菌株异源表达的LPMO酶液相比较，LPMO-N在ATCC 26921中表达后，LPMO酶活有显著地提高。

(2)里氏木霉ATCC 26921和变异菌株TrLPMO-N酶液的LPMO酶活的耐热性比较结果如表3所示，可见LPMO-N在里氏木霉中表达后，滤纸酶活有所增强和里氏木霉ATCC26921本身的LPMO酶活耐热性比较，在45℃下耐热性显著地提高；另外，经过试验验证，与其他受体菌株异源表达的LPMO酶液相比较，变异菌株TrLPMO-N酶液的LPMO酶活的耐热性能显著提高。

表3里氏木霉ATCC 26921和变异菌株TrLPMO-N酶液的LPMO酶活残留量(48小时)

菌株	40℃	45℃	50℃
				ATCC 26921	87.74％	31.35％	0.42％
TrLPMO-N	99.50％	74.75％	0.45％

(3)预处理后的玉米秸秆的制备方法：将玉米秸秆浸渍在1wt％的硫酸溶液中，一边搅拌一边在180℃进行20分钟高压釜处理。

(4)降解含纤维素原料的方法如下：分别以微晶纤维素和预处理后的玉米秸秆为底物，以5μg蛋白/mg底物的比例进行等蛋白添加，体系中加入6.25mM的没食子酸，45℃，pH4.8进行糖化，48小时后取样，HPLC测定其葡萄糖产量。

里氏木霉和变异菌株TrLPMO-N酶液降解含纤维素原料的结果如表4所示：

表4降解后48小时纤维素葡萄糖的得率(mM)

菌株	微晶纤维素	预处理后的玉米秸秆
			ATCC 26921	6.31	11.14
TrLPMO-N	7.65	13.71

由此可见，通过将来源于Talaromyces cellulolyticus的多肽LPMO-N和来源于里氏木霉的糖苷水解酶混合，或者将多肽LPMO-N的基因在里氏木霉中表达，提高了里氏木霉中LPMO的酶活水平，改善了里氏木霉的酶系组成，在它们的协同作用下，通过水解和氧化两种方式断裂木质纤维素中的糖苷键，更为高效地降解了预处理后的玉米秸秆。该酶在工业应用中能够有效降解纤维素，和其他纤维素降解酶配合，可以提高含有纤维素原料的糖化效率，提高以秸秆等木质纤维素为原料发酵生产乙醇等化学品的经济竞争力。

上述实施例为本公开较佳的实施方式，但本公开的实施方式并不受上述实施例的限制，其他的任何未背离本公开的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本公开的保护范围之内。

SEQUENCE LISTING

<110> 山东恒鲁生物科技有限公司

<120> 具有纤维素降解增强活性的多肽及其应用

<130> 2018

<160> 21

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 310

<212> PRT

<213> LPMO-N多肽

<400> 1

Met Pro Ser Thr Lys Val Ala Ala Leu Ser Ala Val Leu Ala Leu Ala

1 5 10 15

Ser Thr Val Ala Gly His Gly Phe Val Gln Asn Ile Val Ile Asp Gly

20 25 30

Lys Ser Tyr Ser Gly Tyr Leu Val Asn Gln Phe Pro Tyr Glu Ser Asn

35 40 45

Pro Pro Ala Val Ile Gly Trp Ala Thr Thr Ala Thr Asp Leu Gly Phe

50 55 60

Val Ala Pro Ser Glu Tyr Thr Asn Ala Asp Ile Ile Cys His Lys Asn

65 70 75 80

Ala Thr Pro Gly Ala Leu Ser Ala Pro Val Ala Ala Gly Gly Thr Val

85 90 95

Glu Leu Gln Trp Thr Thr Trp Pro Asp Ser His His Gly Pro Val Ile

100 105 110

Ser Tyr Leu Ala Asn Cys Asn Gly Asn Cys Ser Thr Val Asp Lys Thr

115 120 125

Lys Leu Asn Phe Val Lys Ile Asp Gln Gly Gly Leu Ile Asp Asp Thr

130 135 140

Thr Pro Pro Gly Thr Trp Ala Ser Asp Lys Leu Ile Ala Ala Asn Asn

145 150 155 160

Ser Trp Thr Val Thr Ile Pro Ser Thr Ile Ala Pro Gly Asn Tyr Val

165 170 175

Leu Arg His Glu Ile Ile Ala Leu His Ser Ala Gly Asn Ala Asp Gly

180 185 190

Ala Gln Asn Tyr Pro Gln Cys Ile Asn Leu Glu Ile Thr Gly Ser Gly

195 200 205

Thr Ala Ala Pro Ser Gly Thr Ala Gly Glu Lys Leu Tyr Thr Ser Thr

210 215 220

Asp Pro Gly Ile Leu Val Asn Ile Tyr Gln Ser Phe Gly Ala Ala Asn

225 230 235 240

Gly Ala Val Ala Thr Gly Ser Ala Thr Ala Val Ala Thr Thr Ala Ala

245 250 255

Ala Ser Ala Thr Ala Thr Pro Thr Thr Leu Val Thr Ser Val Ala Pro

260 265 270

Ala Ser Ser Thr Ser Ala Thr Ala Val Val Thr Thr Val Ala Pro Ala

275 280 285

Val Thr Asp Val Val Thr Val Thr Asp Val Val Thr Val Thr Thr Val

290 295 300

Ile Thr Thr Thr Val Leu

305 310

<210> 2

<211> 891

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 2

atgcatggtt ttgtgcagaa cattgtgatt gacggcaaaa gctatagcgg ctatctggtg 60

aaccagtttc cgtatgaaag caacccgccg gcggttattg gttgggcaac caccgcgacc 120

gatttaggct ttgttgcgcc gagcgaatat accaacgcgg acatcatttg ccataaaaac 180

gcgaccccgg gtgcattatc agcacctgtt gcggcaggtg gtaccgttga attacagtgg 240

accacctggc cggatagcca tcatggcccg gtgattagct atctggcgaa ctgcaacggc 300

aattgcagca ccgtggataa aaccaaactg aacttcgtga aaattgatca gggcggcctg 360

attgatgata ccacccctcc tggtacctgg gcgagcgata aactgattgc ggcgaacaac 420

agctggaccg tgaccattcc gtcaacgatt gcgccgggca attatgtgct gcgccatgaa 480

attattgcgc tgcatagcgc gggcaacgca gatggtgcgc agaattatcc tcaatgcatc 540

aacctggaaa ttaccggctc aggtaccgca gcacctagcg gtaccgcggg tgaaaaactg 600

tataccagca ccgatccggg cattctggtg aacatttatc agagctttgg cgcagcaaat 660

ggcgcggttg cgaccggttc agcaactgca gttgcaacta ccgcagcagc aagcgcaact 720

gcaaccccta ccaccttagt taccagcgtt gcgcctgcat catcaaccag cgcgactgcg 780

gttgttacca ctgttgcgcc tgcggttacc gatgttgtga ccgtgaccga tgttgtgacc 840

gtgaccaccg tgattaccac caccgtgctg catcatcatc atcatcactg a 891

<210> 3

<211> 933

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 3

atgccttcta ctaaagtcgc tgccctttct gctgttctag ctttggcctc cacggttgct 60

ggccatggtt ttgtgcaaaa catcgttatc gacggtaaat cttactctgg ataccttgtg 120

aatcagttcc cctacgagtc caacccacca gctgttattg ggtgggcaac aactgcaacc 180

gacctgggat tcgtcgctcc cagtgagtac accaatgcag acattatctg ccacaagaac 240

gccacacctg gcgcgctttc tgctccagtt gctgcagggg gcactgtcga gctccagtgg 300

actacatggc ccgatagtca tcacggtcct gtcatcagct acctcgccaa ctgcaatggc 360

aattgttcta ccgtggataa gactaagcta aactttgtca agattgacca aggtggtttg 420

atcgacgata ctaccccccc gggtacatgg gcttccgaca aacttatcgc tgccaacaac 480

agctggactg taactatccc ctccaccatc gcgcctggaa actacgtttt gcgccacgaa 540

atcattgctc ttcattccgc tggaaacgca gacggtgccc aaaactaccc tcaatgcatc 600

aacttggaga tcaccggcag cggaaccgcc gctccctctg gtaccgctgg cgaaaagctc 660

tacacctcta ctgaccccgg tatcttggtc aatatctacc aatccttcgg tgctgccaat 720

ggcgctgttg ccactggttc tgctactgcg gttgctacga ctgccgctgc ttctgcgacc 780

gctactccta ccacacttgt tacctctgtc gctccagctt catctacctc tgccactgct 840

gttgtgacca ctgtcgctcc tgcagtaact gatgtcgtga ctgtcaccga tgtagttacc 900

gtgaccaccg tcatcaccac tactgtcctt taa 933

<210> 4

<211> 75

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 4

ggccagtcga accacgcaat gcgtctcgat ccgcagtgtc ttgcgtctct atgccgagca 60

ccaaagtggc agcgt 75

<210> 5

<211> 75

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 5

gcacacagga aacagctatg accgtctcgg ttggcagtga ctccgtctct tcagtgatga 60

tgatgatgat gcagc 75

<210> 6

<211> 26

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 6

agagacggag tcactgccaa ccgaga 26

<210> 7

<211> 25

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 7

agagacgcaa gacactgcgg atcga 25

<210> 8

<211> 79

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 8

gcaagctcaa ctgcatagta tcgacttcaa ggaaaacacg cacaaataat catcatgcct 60

tctactaaag tcgctgccc 79

<210> 9

<211> 79

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 9

gctgtttgat gatttcagta acgttaagtg gatcgatccg gtcggcatct actttaaagg 60

acagtagtgg tgatgacgg 79

<210> 10

<211> 28

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 10

gcatatttcg ttggctggca gattgaag 28

<210> 11

<211> 50

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 11

gggcagcgac tttagtagaa ggcatgatga ttatttgtgc gtgttttcct 50

<210> 12

<211> 48

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 12

aaaaaaagag gaaaagaccg tccgtaacga aatgtaaaag ctaggaga 48

<210> 13

<211> 48

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 13

actccaagtc aacatcaaca gaacttactc agcacactcg cgctgacg 48

<210> 14

<211> 48

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 14

gtcatcacca ctactgtcct ttaaagtaga tgccgaccgg atcgatcc 48

<210> 15

<211> 48

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 15

tctcctagct tttacatttc gttacggacg gtcttttcct cttttttt 48

<210> 16

<211> 48

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 16

cgtcagcgcg agtgtgctga gtaagttctg ttgatgttga cttggagt 48

<210> 17

<211> 27

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 17

cctcgcggaa gtgaagaaag agtgtaa 27

<210> 18

<211> 79

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 18

gcaagctcaa ctgcatagta tcgacttcaa ggaaaacacg cacaaataat catcatgcct 60

tctactaaag tcgctgccc 79

<210> 19

<211> 48

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 19

actccaagtc aacatcaaca gaacttactc agcacactcg cgctgacg 48

<210> 20

<211> 28

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 20

gcatatttcg ttggctggca gattgaag 28

<210> 21

<211> 27

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 21

cctcgcggaa gtgaagaaag agtgtaa 27

Claims

1.一种氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示的多肽在作为或制备具有纤维素分解增强活性的辅助活性酶中的应用。

2.一种氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示的多肽在制备具有纤维素分解增强活性的耐热性辅助活性酶中的应用。

3.一种氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示的多肽在制备具有分解纤维素作用的耐热性混合纤维素酶中的应用。

4.如权利要求3所述的应用，其特征是：最适反应温度为45～50℃，尤其是在45℃、48h后酶活残留量依然在70％以上；

进一步的，所述SEQ ID NO.1所示的多肽的表达基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.2或3所示。

5.一种高效降解纤维素的里氏木霉工程菌，其特征是：将如SEQ ID No.2或3所示的基因序列导入里氏木霉ATCC 26921，制备得到高效降解纤维素的里氏木霉工程菌。

6.权利要求5所述的里氏木霉工程菌的构建方法，其特征是：该方法包括以下步骤：

(1)制备里氏木霉中的LPMO-N基因表达盒：

7.一种组合物，其特征是，该组合物包括氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示的多肽和来源于里氏木霉的纤维素水解酶或者该组合物为里氏木霉工程菌的培养液或发酵液。

8.一种氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示的多肽、权利要求5所述高效降解纤维素的里氏木霉工程菌或权利要求7所述组合物在处理纤维素材料或生物质中的应用。

9.一种降解或转化纤维素材料的方法，其特征是，该方法包括以下步骤：

对纤维素材料进行前处理，按15～25％固形物终浓度将前处理后的纤维素材料原料和水进行混合，然后调节pH值范围至5.0～6.0，加入权利要求7所述组合物，在45～50℃温度下反应32～40h，经固液分离，制得水解液。

10.一种生产乙醇的方法，其特征是，该方法包括以下步骤：

对纤维素材料进行前处理，按15～25％固形物终浓度将前处理后的纤维素材料原料和水进行混合，然后调节pH值范围至5.0～6.0，加入权利要求7所述组合物，在45～50℃温度下反应32～40h，经固液分离，制得水解液；