CN104630184A - 一种碱性木聚糖酶及其编码基因与应用 - Google Patents

一种碱性木聚糖酶及其编码基因与应用 Download PDF

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Abstract

本发明公开一种碱性木聚糖酶及其编码基因与应用。该S1基因序列为一个完整的开放阅读框(ORF)，该开放阅读框以起始密码子ATG开始而以终止密码子TAA结束，共包括609个核苷酸，其核苷酸序列如SEQ ID No：1所示。上述碱性木聚糖酶S1基因编码的蛋白质，其氨基酸序列如SEQ ID No：2所示。本发明还公开了上述碱性木聚糖酶S1在造纸等工业中的应用。

Description

一种碱性木聚糖酶及其编码基因与应用
技术领域
本发明属于生物技术领域，特别涉及一种碱性木聚糖酶及其编码基因与应用。
背景技术
半纤维素是地球上仅次于纤维素的第二大可再生资源。木聚糖是以木吡喃糖为单位的由β-1,4键连接的半纤维素，富含于阔叶树和大多数一年生植物体内。而半纤维素在自然界中含量占生物量的30％，仅次于纤维素。
木聚糖是一种杂聚多糖，它的主链由吡喃木糖通过β-1，4糖苷键连接而成。通常所说的木聚糖酶即内切β-1,4-D-木聚糖酶(endo-β-1,4-D-xylanase)[EC3.2.1.8]，它的主要作用是随机地切割木聚糖主链骨架吡喃木糖残基之间的β-1,4-糖苷键，生成不同长度的木糖、寡聚木糖或带有侧链的寡聚木糖。由于木聚糖酶在木聚糖降解过程中发挥了重要作用，它是木聚糖降解酶系中最关键、最重要的酶，也是木聚糖降解相关酶中研究最多、最有应用价值的一类酶。
内切β-1,4-木聚糖酶属于糖苷水解酶，其结构具有丰富的多样性。根据木聚糖酶催化结构域的氨基酸同源性和疏水簇分析，内切β-1,4木聚糖酶酶分布在糖苷水解酶第5，7，8，10，11，30，43等六个家族。截至目前，糖苷水解酶家族已达到131个(http://www.cazy.org)，随着木聚糖酶研究的发展，将可能会有更多新的木聚糖酶不断被鉴定出来。不同家族木聚糖酶的结构、作用方式、酶学性质及底物特异性都有很大区别。目前发现的木聚糖酶基本都分布在第10和第11家族，其他家族的木聚糖酶数量极少。
第10家族木聚糖酶一般具有较高分子量(大于30kD)，低等电点(pI)，常具有多结构域。其结构是典型的(β/α)8桶状结构，整体结构呈现出主要由α-螺旋和β-折叠重复出现而构成上面略大下面略小的形状。在相应的保守位置有相同的活性中心Glu，作催化反应的亲核中心和酸/碱催化氨基酸，其催化机制为酸碱催化机制。第10家族木聚糖酶对短链的寡聚木糖具有较高活性，揭示它们具有更小的底物结合位点。
第11家族木聚糖酶的特点是低分子量(小于30kD)，常常只具有一个以β-折叠为主的结构域，具有较高等电点(pI)。其催化结构域为β-jelly roll结构，由两个β-折叠片和一个α-螺旋形成，形似半握右拳状，这个结构域由两个β-折叠片层扭曲成近直角形状，形成一个深且狭长的沟缝状结构。其催化机制为双交换机制，两个Glu作为催化残基，从裂缝两侧伸入作为酶的活性中心，裂缝在反应中作为底物结合区，其两边有多个芳香族氨基酸残基，并且至少提供四个木糖结合残基。
木聚糖酶，广泛分布于细菌、真菌、酵母、放线菌、反刍动物瘤胃、蜗牛、甲壳动物、陆地植物组织和各种无脊椎动物中，其中细菌来源的中性或碱性木聚糖酶具有较高的耐碱性和热稳定性。木聚糖酶具有广泛的应用，在造纸工业中，可应用于纸浆漂白、废纸脱墨；在饲料行业中，木聚糖酶可降低小麦型日粮水溶性木聚糖导致的食糜黏性增高，从而提高消化酶对底物的作用效率，同时木聚糖酶可作用于不溶性非淀粉多糖，破碎植物细胞壁，并释放出营养物质；在酿酒和食品行业中应用也非常广泛,如木聚糖酶添加到面粉中，可以改善面团的持水性、稳定性和对过度发酵的耐受性，提高入炉急涨性能，增大烘烤后面包的体积，改善面包心质地，降低面包的老化速率，延长货架寿命。
由于碱性木聚糖酶在造纸工业上的特殊用途，对碱性木聚糖酶进行开发及研究显得非常重要。国际上已进行了木聚糖酶工业应用的开发，但也仅有少量公司能生产用于造纸工业的木聚糖酶，其耐碱度及耐热性仍有提高空间；国内目前尚无对耐热碱性木聚糖酶的系统性研究，也无法规模工业化生产耐热碱性木聚糖酶。因此，寻找新的具有优良性质的碱性木聚糖酶对我国造纸工业的可持续发展具有重要意义。
发明内容
为了克服现有技术的缺点与不足，本发明的首要目的在于提供一种碱性木聚糖酶S1基因的核苷酸序列及其氨基酸序列。本发明根据木聚糖酶保守序列设计简并引物，用PCR的方法成功克隆出碱性木聚糖酶的酶基因。
本发明的另一目的在于提供一种含有上述不含信号肽编码序列的S1基因的表达载体。
本发明的另一目的在于提供含有上述不含信号肽编码序列的S1基因的大肠杆菌菌株。
本发明的再一目的在于提供上述重组碱性木聚糖酶S1的应用。
本发明的目的通过下述技术方案实现：一种碱性木聚糖酶S1基因，所述S1基因的核苷酸序列如SEQ ID No：1所示：
ATGCTCCCGATGGGTTCCGCCCACGCCAATCCCATCAACTCGAACCAGACCGGCACCCACGGCGGGTACTTCTACTCGTTCTGGACCGACGGCGGCGGCTCGGTCTCCATGAACATGGGATCCGGCGGCAACTACAGCACGTCCTGGAGCAACACCGGCAACTTCGTGCTCGGCAAGGGCTGGCGCACCGGCAGCCGGATGAGCGTGAACTACTCGGGCACCTTCAACCCCTCCGGCAACGCTACCTGGCGATTTACGGATGGTGCGCGGAACCCGCTGGTGGAGTACTACATCGTCGACAACTGGGGCACCTACCGGCCCACCGGCAACTACAAGGGCACGGTGACCAGCGACGGCGGCACCTACGACATCTACGAGACCACCCGGTACAACTCCCCCTCGATCGACGGCGCCCAGACCTTCCAGCAGTACTGGAGCGTCCGTCAGACCCGCCGCACCGGCGGCACCATCACCACCGGCAACCACTTCGACGCGTGGGCCCGGCACGGGATGCGCCTCGGGAACCACGACTACATGATCATGGCGACCGAGGGCTACCAGAGCAGCGGCAACTCCAACATCACCGTCGGGGGCACCGCCCATCCGTAA。
所述碱性木聚糖酶S1基因序列为一个完整的开放阅读框(ORF)，该开放阅读框以起始密码子ATG开始而以终止密码子TAA结束，共包括609个核苷酸。其中，前27个核苷酸为信号肽编码序列(ATGCTCCCGATGGGTTCCGCCCACGCC)。
上述碱性木聚糖酶S1基因编码的蛋白质，其氨基酸序列如SEQ ID No：2所示：
MLPMGSAHANPINSNQTGTHGGYFYSFWTDGGGSVSMNMGSGGNYSTSWSNTGNF VLGKGWRTGSRMSVNYSGTFNPSGNATWRFTDGARNPLVEYYIVDNWGTYRPTGNYKGT VTSDGGTYDIYETTRYNSPSIDGAQTFQQYWSVRQTRRTGGTITTGNHFDAWARHGMRLG NHDYMIMATEGYQSSGNSNITVGGTAHP-。
碱性木聚糖酶S1基因开放阅读框编码202个氨基酸，其中，MLPMGSAHA序列(前9个氨基酸)为基因编码的信号肽，其在成熟酶蛋白分泌时在Ala9位点被切除。因此，成熟的酶蛋白从Asn10开始(用下划线表示)，共计191个氨基酸，其理论分子量(MWt)为27kD，酶蛋白的理论等电点(pI)为8.84。
一种含有本发明不含信号肽编码序列的S1基因的表达载体。
所述的表达载体为适于在大肠杆菌中表达的载体。
本发明的不含信号肽编码序列的S1基因被插入至pET-28a(+)载体中。
本发明的不含信号肽编码序列的S1基因被插入至pET-28a(+)载体中的EcoR I和Hind III酶切位点之间；
含有本发明的不含信号肽编码序列的S1基因的大肠杆菌菌株。
所述的大肠杆菌菌株含有本发明的表达载体。
一株表达碱性木聚糖酶S1的菌株，是将上述不含信号肽编码序列的核苷酸序列构建成载体后转染到大肠杆菌(Escherichia coli，E.coli)BL21Star(DE3)得到。
一株表达碱性木聚糖酶S1的菌株的制备方法，包括如下步骤：
用PCR方法从Micrococcus sp.S1(CCTCC No：M 2014295)的基因组DNA中克隆出不含信号肽编码序列的酶基因全长，将其插入到原核表达载体pET-28a(+)中，得到重组质粒pET-28a-S1，并转化大肠杆菌E.coli(Escherichia coli)BL21Star(DE3)菌株；经过筛选后得到表达所述的碱性木聚糖酶S1的重组大肠杆菌菌株E.coli BL21Star(DE3)-S1；
所述的PCR的所用的引物的序列：
上游引物：5′-ATCGAATTCAATCCCATCAACTCGAAC-3′；(下划线的序列表示的是EcoR I酶切位点)
下游引物：5′-CTTAAGCTTTTACGGATGGGCGGTGCC-3′；(下划线的序列表示的是Hind III酶切位点)
所述的PCR的反应体系为：
使用Takara的PCR Amplification Kit试剂盒，以Micrococcus sp.S1的基因组DNA为模板，按照如下反应体系配制PCR反应液：
所述的PCR的反应条件为：
然后按照以下条件进行Touchdown PCR反应：
所述的碱性木聚糖酶S1在造纸等工业中的应用。
本发明相对于现有技术具有如下的优点及效果：
根据酶基因序列BLAST分析结果结合酶蛋白在分子量、等电点及酶学特性等方面与己知蛋白的差异判断，碱性内切葡聚糖酶基因为一新发现的内切β-1,4-木聚糖酶基因。
附图说明
图1是pMD-18T克隆载体图谱。
图2是pMD-18T克隆载体的多克隆位点图。
图3是Micrococcus sp.S1菌基因组DNA电泳图；其中：泳道M为takara公司的DL15000Marker；泳道1为基因组DNA。
图4是碱性木聚糖酶S1基因保守序列PCR结果的电泳图；其中：泳道M为takara公司的DL5000Marker；泳道1和2为S1基因保守DNA序列。
图5是碱性木聚糖酶S1基因的保守DNA序列与Genbank基因序列比对结果，截取了其中相似性最高的序列的结果图。
图6是碱性木聚糖酶S1基因的保守DNA序列的上游PCR结果的电泳图；
其中：泳道M为takara公司的DL5000Marker；泳道1为S1基因的保守DNA序列的上游PCR结果。
图7是碱性木聚糖酶S1基因的保守DNA序列的下游PCR结果的电泳图；
其中：泳道M为takara公司的DL5000Marker；泳道1为S1基因的保守DNA序列的下游PCR结果。
图8是碱性木聚糖酶S1与Genbank氨基酸序列比对结果，截取了其中相似性最高的序列的结果图。
图9是pET-28a(+)表达载体图谱。
图10是pET-28a(+)表达载体的多克隆位点图。
图11是碱性木聚糖酶S1基因电泳图；其中：泳道M为takara公司的DL5000Marker；泳道1为S1基因的PCR结果。
图12是碱性木聚糖酶S1蛋白电泳图；其中：泳道M为Marker，fermentas公司proteinladder；泳道1为发酵液离心取上清液，并将上清液浓缩10倍得到的浓缩液；泳道2为发酵液离心收集菌体，并使细胞破碎，离心收集的上清液。
具体实施方式
下面结合实施例及附图对本发明作进一步详细的描述，但本发明的实施方式不限于此。
下列实施例中未注明具体实验条件的实验方法，通常按照常规实验条件或按照制造厂商所建议的实验条件。
实施例1
(一)材料
1、菌种
嗜碱微球菌，是从深圳红树林土壤中筛选得到的产碱性木聚糖酶菌株Micrococcus sp.S1。所述菌株保藏单位：中国典型培养物保藏中心(CCTCC)，保藏日期：2014年6月27日，保藏地址：中国.武汉.武汉大学，保藏编号：CCTCC NO:M 2014295。E.coli TOP10F′购自Invitrogen公司；
2、载体
大肠杆菌克隆载体pMD18-T购自大连宝生物公司，大肠杆菌表达载体pET-28a(+)(Novagen，KanR)购自Novagen公司；载体图谱见图1，其多克隆位点图见图2。
3、培养基
(1)选择培养基：木聚糖8.0g/L，KNO3 1.0g/L，MgSO4·7H2O 0.5g/L，NaC1 15g/L，KH2PO4 1.5g/L，固体培养基加琼脂15～20g/L，pH 9.0；
(2)LB培养基：胰蛋白胨10g/L，酵母提取物5g/L，NaCl 10g/L，固体培养基加琼脂15～20g/L，pH 9.0，121℃高压灭菌20min。
4、主要试剂
DNA聚合酶、DNA分子量标记为宝生物公司产品；Lysozyme(DNase RNase non-detected，>70,000U/mg)、一步法快速制备感受态细胞试剂盒(SSCS)为上海生工生物工程公司产品。PCR引物合成由上海生工完成，DNA序列测定由Invitrogen公司完成；基因提取试剂盒、PCR产物片段纯化试剂盒、胶回收试剂盒、质粒提取试剂盒为Oemga公司产品。
5、仪器
Thermal cycler PCR仪为Applied Biosystems By Life Technologies公司、DNA电泳系统为Bio-rad公司产品；分光光度计及微量分光光度计为Pharmacia Biotech公司产品；Thermomixercomfort温控振荡仪、移液枪、台式离心机为Eppendorf公司产品；低温高速离心机为Sigma公司产品；Dolphin-DOC凝胶成像系统为美国WEALTEC公司产品；恒温摇床及恒温水浴锅为WAGEN公司产品。
(二)实验方法和结果
1、基因组DNA的提取
在37℃、200r/min摇瓶培养Micrococcus sp.S1菌，48h后离心收集菌体，然后利用TheE.Z.N.A Bacterial DNA Kit试剂盒提取基因组总DNA。其基本步骤如下：
(a)培养基接种Micrococcus sp.S1菌，放入温控摇床中，于37℃，200rpm摇瓶培养36h后取出分装备用。
(b)将3mL Micrococcus sp.S1菌液在室温条件下8000rpm离心10min；
(c)弃去上清液，保留沉淀，然后加入180μL TE buffer重悬菌体，再加入20μL 50mg/mL溶菌酶溶液30℃条件下水浴10min；
(d)水浴完成后在室温条件下8000rpm离心5min，去掉上清，加入200μL BTL buffer，短暂涡旋；
(e)加入25～40mg玻璃珠，高速涡旋5min；
(f)加入25μL蛋白酶K溶液，短暂涡旋，然后55℃水浴60min；
(g)加入5μL RNaseA溶液，反复颠倒，然后室温放置5min；
(h)室温条件下12000rpm离心5min，吸取上清到另外一个干净的离心管中，避免吸到沉淀；
(i)加入220μL BDL buffer，短暂涡旋，然后65℃水浴10min；
(j)加入220μL无水乙醇，高速涡旋20s，然后将混合液转移到套有2.0mL收集管的Akibaiin Column中，12000rpm离心1min；
(k)弃去收集管中的液体，加入500μL的HB buffer，然后10000rpm离心1min；
(l)弃去收集管中的液体，加入700μL的DNA Wash buffer，然后10000rpm离心1min；
(m)重复加入700μL的DNA Wash buffer，然后10000rpm离心1min；
(n)弃去收集管中的液体，再用12000rpm离心2min以除尽剩余的Wash buffer；
(h)将Akibaiin Column放入一个洁净的EP管中，然后在Akibaiin Column膜的中央处加入50～100μL的Elution Buffer，室温放置2min，10000rpm离心1min将DNA抽提下来。
采用1％琼脂糖凝胶电泳对提取产物进行检测。结果如图3所示，能看到一条较为明显的条带，所用DNA Ladder Marker最大条带为15,000bp，基因组条带在Marker最大条带之上，说明其大小超过15,000bp，符合基因组大小要求。
2、TouchDown PCR克隆木聚糖酶基因保守序列
(1)使用PrimerPremier 5.0软件设计上下游引物。根据已知的11家族木聚糖酶保守序列设计上游引物(GCTACCTGKCNNTNTAYGGNTGG)和下游引物(GACCAGTAYTGNKIRAANGT)，送去合成。
(2)使用Takara的PCR Amplification Kit试剂盒，以基因组DNA为模板，按照如下反应体系配制PCR反应液：
然后按照以下条件进行Touchdown PCR反应：
采用1％琼脂糖凝胶电泳对PCR产物进行检测。结果如图4所示。在泳道1、2中，有一条大小约为200bp的条带，符合已知的11家族木聚糖酶基因保守序列大小，所以对该条带进行回收。
3、Touchdown PCR产物回收
PCR产物回收使用的是Omega公司生产的Gel Extraction Kit(100)D2500-01，主要步骤如下：
(1)在紫外灯下切出含有目的DNA的琼脂糖凝胶，用纸巾吸尽凝胶表面的液体，此时应注意尽量切除不含目的DNA部分的凝胶，减小凝胶体积，提高DNA回收率，之后放入EP管中。(注意切胶时不要将DNA长时间暴露于紫外灯下，以防止DNA损伤)
(2)切碎胶块。胶块切碎后可以加快操作步骤(3)的胶块融化时间，提高DNA的回收率。称量胶块重量，计算胶块体积。计算胶块体积时，以1mg＝1μL进行计算，向胶块中加入等量的胶块融化液Binding Buffer。
(3)50℃溶解7～15min，保证溶胶要完全，否则会影响后续回收。
(4)将溶胶放入层析柱中(不超过700μL)，12,000rpm离心1min，倒掉收集管中的液体。
(5)加入300μL的Binding Buffer，12,000rpm离心1min，倒掉收集管中的液体。
(6)加入700μL的SPW，12,000rpm离心1min，倒掉收集管中的液体。
(7)重复步骤(6)。
(8)将空柱13,000rpm离心2min，以去掉残存的乙醇，否则会严重影响后续DNA的回收。
(9)弃掉收集管，换成干净的EP管，往吸附柱正中间的吸附膜小心加入15μL ElutionBuffer，室温静置3min，13,000rpm离心2min，不立即用的话保存于-20℃冰箱中。
4、感受态细胞制备
感受态细胞的制备使用TaKaRa公司的Competent Cell Prepatation Kit试剂盒制备，步骤如下：
(1)用接种针挑取大肠杆菌在含氨苄青霉素(AMP，终浓度为100μg/mL)的LB固体培养基上分级划线，以能够出现单菌落为宜，37℃过夜培养。
(2)挑取菌落置于含20mL液体LB培养基的三角烧瓶中，37℃、220rpm培养。
(3)测定OD值，当OD600值达到0.35～0.5时，放置冰中停止培养，若OD值超出此范围将不能保证感受态细胞的转化效率。
(4)取1mL上述菌液于1.5mL EP管中，4,000rpm、4℃离心5min，弃上清(尽量除去上清)。
(5)在每个EP管中加入100μL冰中预冷的Solution A，轻轻弹动EP管使沉淀悬浮，禁止剧烈振荡，4,000rpm、4℃离心5min，弃上清(尽量除去上清)。
(6)在每个EP管中加入100μL冰中预冷的Solution B，轻轻弹动EP管使沉淀悬浮，禁止剧烈振荡。感受态细胞制备完成，若不立即使用，置于-80℃保存。
5、Touchdown PCR产物的连接、转化和测序
(1)从-80℃冰箱中取100μL感受态细胞悬液，冰中使其解冻。
(2)将4.5μL回收的PCR产物、1.5μL pMD18-T(Simple Vector)和4μL Solution I转化酶(TaKaRa公司生产)加入100μL感受态细胞中混匀，16℃水浴连接3h。
(3)加入连接后的重组DNA溶液轻轻摇匀，冰上放置30min。
(4)42℃水浴中放置90s，之后迅速置于冰上冷却15min。
(5)向管中加入1mL LB液体培养基(不含氨苄青霉素)，混匀后37℃、250rpm振荡培养1h，使细菌恢复正常生长状态，以表达质粒编码的抗生素抗性基因(Ampr)。
(6)取1mL上述菌液6,000rpm离心5min，去除约1mL上清，剩下的混匀。取100μL涂布于含氨苄青霉素的筛选平板上，正面向上放置半小时，待菌液完全被培养基吸收后倒置培养皿，37℃培养16～24h。
(5)用接种环挑选长出的单菌落放于1mL LB培养基(加入1μL氨苄青霉素，终浓度为100μg/mL)中，37℃、250rpm摇菌直至菌液变浑浊(4～10h)，每组选取1个送去测序。
测序得到Micrococcus sp.S1木聚糖酶基因保守序列的测序结果，其序列如下：
(a)核苷酸序列如SEQ ID No：3所示(193bp)：
TACCTGGCGATTTACGGATGGTGCGCGGAACCCGCTGGTGGAGTACTACATCGTCGACAACTGGGGCACCTACCGGCCCACCGGCAACTACAAGGGCACGGTGACCAGCGACGGCGGCACCTACGACATCTACGAGACCACCCGGTACAACTCCCCCTCGATCGACGGCACCCAGACGTTCCCGCAGTACTGG；
(b)NCBI核苷酸序列比对结果
将该核苷酸序列在NCBI数据库上进行比对(BLAST)，发现该保守序列与同为11家族的木聚糖酶(Micrococcus thermoviolaceus stxII,stxIII genes for xylanase II)具有88％的较高相似性，可推断克隆的保守序列所在的基因属于11家族木聚糖酶基因。比对结果见图5。
6、TAIL-PCR克隆木聚糖酶基因保守序列的上下游基因
(1)TAIL-PCR是为了得到Micrococcus sp.S1木聚糖酶基因保守序列上游和下游的基因，使用PrimerPremier 5.0软件设计特异性引物和随机引物。根据Touchdown PCR产物测序所得到的保守序列，分别设计2组20bp左右的上下游特异性引物，每组上游特异性引物(Upstream primer，简称USP)和下游特异性引物(Downstream primer，简称DSP)各有3个嵌套的引物用于TAIL-PCR的三轮反应。同时设计出7对随机引物(Arbitrary degenerateprimer，简称AD)。保守序列和引物序列见表1。引物送去合成后，即可进行下一步实验。
表1Micrococcus sp.S1木聚糖酶基因保守序列及用于TAIL-PCR的引物
(2)TAIL-PCR克隆上游基因
使用Takara的PCR Amplification Kit试剂盒，以基因组DNA为模板，按照如下反应体系配制PCR反应液：
然后按照以下条件进行第一轮TAIL-PCR反应：
第二轮TAIL-PCR反应体系同第一轮，但是将第一轮反应的PCR产物用ddH2O稀释100倍后作为模板DNA，USP1换为USP2，反应条件如下：
第三轮TAIL-PCR反应体系同第一轮，但是将第二轮反应的PCR产物用ddH2O稀释100倍后作为模板DNA，USP2换为USP3，反应条件同第二轮反应的一样。反应结束后，采用1％琼脂糖凝胶电泳对第三轮PCR产物进行检测。
通过3个嵌套的上游特异性引物和随机引物AD3进行TAIL-PCR，克隆出Micrococcus sp.S1木聚糖酶基因保守序列的上游基因，其PCR产物电泳图如图6所示。从图6中可以看出，经过3轮PCR，此时出现的明显条带只有一条，大小约为600bp，符合目标基因大小要求，初步确定为保守序列上游基因。通过PCR产物回收、连接、转化并测序。
经过测序，Micrococcus sp.S1木聚糖酶基因保守序列上游基因测序结果如下(344bp)：其核苷酸序列如SEQ ID No：4所示：
ATTACGCCAAGTTTGCACGCCTGCCGTTCGACGATTCCATCCGTAAATCGCCAGGTAGCTGTACCGGGTGGCCACGGTGATGCTCCCGATGGGTTCCGCCCACGCCAATCCCATCAACTCGAACCAGACCGGCACCCACGGCGGGTACTTCTACTCGTTCTGGACCGACGGCGGCGGCTCGGTCTCCATGAACATGGGATCCGGCGGCAACTACAGCACGTCCTGGAGCAACACCGGCAACTTCGTGCTCGGCAAGGGCTGGCGCACCGGCAGCCGGATGAGCGTGAACTACTCGGGCACCTTCAACCCCTCCGGCAACGCTACCTGGCGATTTACGGATGGTC。
(3)TAIL-PCR克隆下游基因
反应体系、反应条件同上游基因的克隆，相应的上游特异性引物换为下游特异性引物。反应结束后，采用1％琼脂糖凝胶电泳对第三轮PCR产物进行检测。
通过3个嵌套的下游特异性引物和随机引物AD3进行TAIL-PCR，克隆出Micrococcus sp.S1木聚糖酶基因保守序列的下游基因，其PCR产物电泳图如图7所示。从图7中可以看出，经过3轮PCR，此时出现的明显条带只有一条，大小约为339bp，符合目标基因大小要求，初步确定为保守序列下游基因。通过PCR产物回收、连接、转化并测序。
经过测序，Micrococcus sp.S1木聚糖酶基因保守序列下游基因测序结果如下(339bp)：其核苷酸序列如SEQ ID No：5所示：
TGATTACGCCAAGTTTGCACGCCTGCCGTTCGACGATTAAGGGCACGGTGACCAGCGACGGCGGCACCTACGACATCTACGAGACCACCCGGTACAACTCCCCCTCGATCGACGGCGCCCAGACCTTCCAGCAGTACTGGAGCGTCCGTCAGACCCGCCGCACCGGCGGCACCATCACCACCGGCAACCACTTCGACGCGTGGGCCCGGCACGGGATGCGCCTCGGGAACCACGACTACATGATCATGGCGACCGAGGGCTACCAGAGCAGCGGCAACTCCAACATCACCGTCGGGGGCACCGCCCATCCGTAAATCGCTGGTCACCGTGCCCTTAATC。
7、获得Micrococcus sp.S1木聚糖酶基因全长序列
根据TAIL-PCR克隆得到的保守序列上下游基因的测序结果进行拼接，得到Micrococcussp.S1木聚糖酶完整的酶基因序列。其核苷酸序列如SEQ ID No：1所示。
碱性木聚糖酶基因序列为一个完整的开放阅读框(ORF)，该开放阅读框以起始密码子ATG开始而以终止密码子TAA结束，共包括609个核苷酸。其中，前21个核苷酸为信号肽编码序列。
碱性木聚糖酶基因编码的氨基酸序列如SEQ ID No：2所示。
经DNAssist Version 2.2软件分析得到，碱性木聚糖酶基因开放阅读框编码202个氨基酸，其中，前9个氨基酸为基因编码的信号肽，其在成熟酶蛋白分泌时在Ala9位点被切除。因此，成熟的酶蛋白，共计191个氨基酸，其理论分子量(MWt)为27kD，与分离得到的天然酶蛋白分子量一致；酶蛋白的等电点(pI)8.84。
将该氨基酸序列在NCBI数据库进行比对(BLAST)，发现该氨基酸序列与同为11家族的木聚糖酶(Thermobifida halotolerans)具有最高的同源性，其相似性仅为79％，可初步推断编码该氨基酸序列的基因为新的木聚糖酶基因。比对结果具体见图8。
根据序列分析结果结合酶蛋白在分子量、等电点及酶学特性等方面的差异判断，碱性木聚糖酶基因为一新发现的内切β-1,4-木聚糖酶基因。
实施例2
(一)材料
1、菌种
嗜碱微球菌Micrococcus sp.S1菌株(CCTCC No：M 2014295)。宿主菌E.coli BL21Star(DE3)、E.coli TOP10F′均购自Invitrogen公司；
2、载体
大肠杆菌表达载体pET-28a(+)(Novagen，KanR)购自Novagen公司；载体图谱见图9，其多克隆位点图见图10。
3、培养基及缓冲液
(1)选择培养基：木聚糖8.0g/L，KNO3 1.0g/L，MgSO4·7H2O 0.5g/L，NaC1 15g/L，KH2PO4 1.5g/L，固体培养基加琼脂15～20g/L，pH 9.0；
(2)LB培养基：胰蛋白胨10g/L，酵母提取物5g/L，NaCl 10g/L，固体培养基加琼脂15～20g/L，pH 9.0，121℃高压灭菌20min。
(3)TE缓冲液：10mmol/L Tris-Hcl，pH8.0，1mmol/L EDTA，pH8.0。
(4)碱裂解液I、II、III(质粒提取)：碱裂解液I：葡萄糖50mmol/L，Tris-HCl(pH 8.0)25mmol/L，EDTA 10mmol/L。每瓶约100mL，灭菌后4℃贮存。碱裂解液II：NaOH 0.2mmol/L，SDS 1％(w/v)。溶液不可贮存，现用现配。碱裂解液III：乙酸钾5mmol/L，冰乙酸11.5％(v/v)。
4、主要试剂
Acrylamide、N,N-甲叉双丙烯酰胺由Serva进口分装。DNA聚合酶、限制性内切酶、DNA分子量标记、T4连接酶为宝生物公司产品；Lysozyme(DNase RNase non-detected，>70,000U/mg)、IPTG、一步法快速制备感受态细胞试剂盒(SSCS)为上海生工生物工程公司产品；蛋白分子量标记为Fermentas(MBI)公司产品；PCR引物合成由上海生工完成，DNA序列测定由Invitrogen公司完成；基因提取试剂盒、PCR产物片段纯化试剂盒、胶回收试剂盒、质粒提取试剂盒为Oemga公司产品。
5、仪器
Thermal cycler PCR仪为Applied Biosystems By Life Technologies公司、DNA及蛋白电泳系统为Bio-rad公司产品；分光光度计及微量分光光度计为Pharmacia Biotech公司产品；Thermomixer comfort温控振荡仪、移液枪、台式离心机为Eppendorf公司产品；低温高速离心机为Sigma公司产品；Dolphin-DOC凝胶成像系统为美国WEALTEC公司产品；恒温摇床及恒温水浴锅为WAGEN公司产品。
(二)实验方法和结果
1、目的基因的分离
采用PCR的方法从Micrococcus sp.S1菌中分离目的基因。在37℃，220r/min摇瓶培养Micrococcus sp.S1菌，48h后离心收集菌体，然后利用The E.Z.N.A Bacterial DNA Kit试剂盒提取基因组总DNA。根据不含信号肽编码序列的目的基因，设计引入Hind III和EcoR I酶切位点(下划线)的PCR引物：
所述的PCR的所用的引物的序列：
上游引物：5′-ATCGAATTCAATCCCATCAACTCGAAC-3′；(下划线的序列表示的是EcoR I酶切位点)
下游引物：5′-CTTAAGCTTTTACGGATGGGCGGTGCC-3′；(下划线的序列表示的是Hind III酶切位点)
所述的PCR的反应体系为：
使用Takara的PCR Amplification Kit试剂盒，以基因组DNA为模板，按照如下反应体系配制PCR反应液：
所述的PCR的反应条件为：
然后按照以下条件进行Touchdown PCR反应：
采用1％琼脂糖凝胶电泳对PCR产物进行检测。
反应完成后，取8μL反应产物进行琼脂糖凝胶电泳检测。由于大肠杆菌表达载体pET-28a(+)可使目的蛋白实现胞内表达，因此在设计PCR引物时按照S1成熟酶蛋白的编码序列进行设计。由图11可见，PCR扩增产物的大小为582bp，与不含信号肽编码序列的S1基因大小相符。将PCR产物回收、连接、转化并送Invitrogen公司进行测序鉴定。测序结果表明所扩增的序列与不含信号肽编码序列的目的基因的序列一模一样。
2、重组质粒的构建
将克隆得到的不含信号肽编码序列的S1基因经HindⅢ和EcoRⅠ双酶切后与采用同样酶切的大肠杆菌表达载体pET-28a(+)连接，得到重组质粒pET-28a-S1。
连接反应体系如下：
16℃水浴中连接过夜后转化感受态细胞(连接反应中基因和质粒的摩尔比为9：1)。
3、E.coli TOP10F′和E.coli BL21Star(DE3)感受态细胞的制备
(a)接种E.coli TOP10F′和E.coli BL21Star(DE3)至LB培养基中，240r/min、37℃培养过夜；
(b)吸取0.1mL菌液至10mL LB培养基中，300r/min、37℃培养至OD600达0.5～0.7；
(c)吸取1mL OD600达0.5～0.7的菌液至1.5mL离心管中，12000r/min离心2min，彻底去除上清；
(d)加入100μL冰预冷的SSCS(一步法快速制备感受态细胞试剂盒，上海生工生物工程公司产品)，轻悬菌体即制成感受态细胞。可立即转化或于-70℃冻存。
4、转化E.coli TOP10F′感受态细胞
(a)10μL连接产物与100μL感受态细胞混匀，冰浴30min；
(b)42℃水浴90秒，冰浴2min；
(c)加入1mL LB培养基，混匀，37℃180r/min温浴1h；
(d)3000r/min离心1min，吸底部沉淀200μL至LB(含选择抗生素Kan，终浓度为50μg/mL)平板，用涂布器涂匀，37℃培养过夜。同时做两个对照：
对照组1:以同体积的无菌双蒸水代替DNA溶液，其它操作与上面相同。
对照组2:以同体积的无菌双蒸水代替DNA溶液，但涂板时只取5μL菌液涂布于不含抗生素的LB平板上。
5、转化子的培养及检测
(a)转化16h后，观察实验组的平板，看是否长出菌落(没有的话就继续培养或者重新做转化)，然后用标记笔在培养皿的背面该菌落处划上圆圈，并标记“1”、“2”等数字，以便识别；
(b)在无菌条件下，向试管中加入5mL LB液体培养基，然后再往其中加入5μL的1000×氨苄青霉素溶液，使其终浓度为100μg/mL。随后在试管上标记“1”、“2”等数字；
(c)利用接种环，小心地将相应数字编号的菌落挑落进相应的试管中，混合均匀；
(d)将试管放入温控摇床，37℃、200rpm振荡培养16～24h；
(e)16h后，观察试管中的LB液体培养基是否变混浊(若无菌生长就继续培养或者重新转化)，在无菌条件下，在两个洁净的EP管中分别加入500μL的菌液和500μL 60％的甘油，混合均匀，并标记相应的数字，然后用封口膜将EP管封好，其中一管用于保留菌种之用，另一管为测序做准备，将两个EP管都放入-80℃贮存，剩余的菌液放入4℃冰箱中保存备用；
(f)利用菌液PCR的方法进行检测。
模板用1μL菌液代替，用上游引物EcoR I和下游引物Hind III进行PCR反应，再将PCR反应产物进行1％琼脂糖凝胶电泳分析，将阳性克隆菌株经鉴定后甘油保存，送公司进行测序。
6、重组质粒的中量制备
使用Omega Plasmid Mini Kit质粒提取试剂盒，制备重组质粒，步骤如下：
(a)挑取抗性平板上的重组菌落至50mL LB(含选择抗生素Kan，终浓度为50μg/mL)液体培养基中，200r/min、37℃培养过夜。
(b)将1～5mL培养液12000r/min离心3min，弃上清，收集菌体。
(c)将菌体加入250μL冰预冷的裂解液Ⅰ中，剧烈振荡，将细胞完全打散；
(d)加入250μL裂解液Ⅱ，轻柔反复颠倒数次(切勿涡旋振荡)后，室温静置2min；
(e)加入350μL裂解液Ⅲ，盖紧管口，立即颠倒数次，直至出现白色絮状沉淀；
(f)微量离心机12000r/min、4℃冷冻高速离心5min，上清液移至另一离心管中；
(g)将离心管置入离心机，12000r/min、室温离心10min；上清转入一支新管中；
(h)将试剂盒中的Akibaiin Column安置于Collection Tube中；
(i)将离心管中的上清液转移至Akibaiin Column中，注意别吸入沉淀，12000r/min离心1min，弃去滤液；
(j)加入500μL HB Buffer至Akibaiin Column中，12000r/min离心1min，弃去滤液；
(k)加入700μL的DNA Wash buffer，然后10000rpm离心1min，弃去滤液；
(l)重复加入700μL的DNA Wash buffer，然后10000rpm离心1min，弃去滤液；
(m)再用12000rpm离心2min以除尽剩余的Wash buffer；
(n)将Akibaiin Column放入一个洁净的EP管中，然后在Akibaiin Column膜的中央处加入30～50μL的Elution Buffer，室温放置2min，10000rpm离心1min将重组质粒pET-28a-S1抽提下来。采用1％琼脂糖凝胶电泳对质粒回收产物进行检测。
7、E.coli BL21Star(DE3)的转化
(a)将从重组E.coli TOP10F′中提取的质粒100μg与100μL感受态细胞混匀，冰浴30min。42℃水浴90秒，冰浴2min。
(b)加入1mL LB培养基，混匀，37℃、180r/min温浴1h。
(c)3000r/min离心1min，吸底部沉淀200μL至LB(含选择抗生素Kan，终浓度为50μg/mL)平板，用涂布器涂匀，37℃培养过夜。
经过筛选后得到可以高效表达的重组大肠杆菌菌株E.coli BL21Star(DE3)-S1。从E.coliBL21Star(DE3)-S1菌株中提取质粒为模板，用上游引物EcoR I和下游引物Hind III进行PCR反应，将PCR产物回收、连接、转化并送Invitrogen公司进行测序鉴定。测序结果表明重组质粒所携带的基因序列与不含信号肽编码序列的目的基因的序列一模一样。可见，pET-28a-S1重组质粒已经成功转入E.coli BL21Star(DE3)。
8、重组大肠杆菌E.coli BL21Star(DE3)的诱导表达
(a)将筛选得到的阳性菌株E.coli BL21Star(DE3)-S1接种到装有5mL LB培养基中培养过夜。
(b)取过夜培养菌液100μL接种到装有20mL LB培养基的250mL摇瓶中培养。
(c)待OD值达到0.6时加入终浓度为1mM的IPTG(异丙基-β-D-硫代半乳糖苷)进行诱导。
(d)于37℃诱导30小时后进行取样的。取1mL发酵液离心，去除上清液加入100μL pH8.8Tris-HCl缓冲液，重悬后液氮反复冻融使细胞破碎，10000r/min高速离心2min后取上清液，进行SDS-聚丙烯酰胺凝胶(SDS-PAGE)电泳(见图12泳道2)。
取1mL发酵液离心，取上清液，并将上清液用3000道尔顿超滤浓缩膜进行浓缩10倍，得到浓缩液，进行SDS-聚丙烯酰胺凝胶(SDS-PAGE)电泳(见图12泳道1)。
9、SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳
以Sambrook等的实验方法为基础，分离胶、浓缩胶浓度分别为12％和5％，电极缓冲液为pH 8.3Tris-Gly缓冲液，考马斯亮蓝染色。
(a)聚丙烯酰胺凝胶的配制
分离胶的配制：
浓缩胶的配制：
(b)将分离胶上的水倒去，加入上述混合液，立即将梳子插入玻璃板间，完全聚合需15～30min；
样品处理：将样品加入等量的2×Loading buffer，100℃加热3～5min，煮沸完毕后，立即放入到冰浴或者冷水中，使其冷却。然后12000rpm离心10min，取上清作分析；
(c)上样：将15μL样品加入到孔道中，并在其中一个孔道中加入5μL的预染蛋白Marker；
(d)电泳：在电泳槽中加入电泳缓冲液，连接电源，负极在上，正极在下，电泳时，浓缩胶电压80V，分离胶电压120V，电泳至溴酚兰行至电泳槽下端停止；
(e)染色：将胶从玻璃板中取出，考马斯亮兰染色液染色，室温4～6h；
(f)脱色：将胶从染色液中取出，放入脱色液中，多次脱色至蛋白带清晰。
SDS-PAGE电泳结果如图12所示，可见到分子量约为27KD的明显条带，表明Micrococcussp.S1碱性木聚糖酶基因在大肠杆菌中得到高效表达。但在培养液中测不到木聚糖酶酶活，表明表达产物以无活性的包涵体存在。
上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。

Claims (10)

1.一种碱性木聚糖酶S1，其特征在于：其氨基酸序列如SEQ ID No：2所示。
2.编码权利要求1所述的碱性木聚糖酶S1的基因，其特征在于：所述的基因的核苷酸序列如SEQ ID No：1所示。
3.一种含有权利要求2所述的基因的表达载体，其特征在于：所述的含有权利要求2所述的基因是将权利要求2中的基因中信号肽编码序列去掉，得到的不含信号肽编码序列的S1基因。
4.根据权利要求3所述的表达载体，其特征在于：所述的表达载体为适于在大肠杆菌中表达的载体。
5.根据权利要求4所述的表达载体，其特征在于：权利要求2所述的基因去掉信号肽编码序列后被插入至pET-28a(+)载体中。
6.根据权利要求5所述的表达载体，其特征在于：权利要求2所述的基因去掉信号肽编码序列后被插入至pET-28a(+)载体中的EcoR I和Hind III酶切位点之间。
7.一种表达碱性木聚糖酶S1的菌株，其特征在于：是将权利要求2所述的基因去掉信号肽编码序列后的核苷酸序列构建成载体后转染到大肠杆菌(Escherichia coli)BL21 Star(DE3)得到。
8.根据权利要求7所述的表达碱性木聚糖酶S1的菌株，其特征在于：所述的载体为权利要求3～6任一项所述的表达载体。
9.根据权利要求7或8所述的表达碱性木聚糖酶S1的菌株，其特征在于包括如下步骤：
用PCR方法从嗜碱微球菌(Micrococcus sp.)S1的基因组DNA中克隆出权利要求2所述的基因去掉信号肽编码序列后的酶基因全长，将其插入到原核表达载体pET-28a(+)中，得到重组质粒pET-28a-S1，并转化大肠杆菌E.coli BL21Star(DE3)菌株；经过筛选后得到表达所述的碱性木聚糖酶S1的重组大肠杆菌菌株E.coli BL21 Star(DE3)-S1。
10.权利要求1所述的碱性木聚糖酶S1在造纸工业中的应用。
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