CN100473722C - 一种碱性α-淀粉酶、其编码基因及用途 - Google Patents

Abstract

由嗜碱单胞菌(alkalomonas amylolytics)N10(CGMCC NO.0463)总DNA获得碱性α-淀粉酶基因(α-amylase gene)，构建了原核表达质粒，转化大肠杆菌表达α-淀粉酶。通过核苷酸序列和氨基酸序列比较，该酶为一新型α-淀粉酶，其最适反应pH 10，最适反应温度50℃，pI为4.9，分子量60000道尔顿。该酶水解直链淀粉，在洗涤、纺织、食品等方面具有重要的应用价值。

Description

一种碱性α—淀粉酶、其编码基因及用途

技术领域

本发明属于酶基因工程和酶工程领域。具体地说，本发明涉及编码淀粉水解嗜碱单胞菌(alkalomonas amylolytics)N10(CGMCC NO.0463)的α—淀粉酶的基因及其该基因的DNA序列，涉及含有该酶基因的重组质粒和表达相应酶的重组菌株。

背景技术

α—淀粉酶(α-amylase，EC 3.2.1.1)是一种重要的工业用酶，特别是在食品和洗涤剂工业。碱性淀粉酶最适反应pH高于8.0，与其他酶配合可作为洗涤剂的添加剂、纺织品退浆剂、以及淀粉作粘结剂的粘度调节剂等[Dacosta等，极端环境微生物及其生物技术潜力(Microbiology of extreme environments and its potential forbiotechnology)，p346-366.Elsevier Science Publishers Ltd.，Essex，England)。自从Horikoshi首次报道了嗜碱芽孢杆菌产生碱性淀粉酶之后[Horikoshi，农业生物化学(Agric.Biol.Chem.)35：1783-1791，1971]，相继从不同的微生物中，如芽孢杆菌、假单胞菌、和放线菌等分离了一些碱性淀粉酶[Bajpai等，生物技术和生物工程(Biotechnol.Bioeng.)33：72-78，1989；Ozaki等，日本专利JP9049584；Kim等，应用和环境微生物学(Appl.Environ.Microbiol.)61：3105-3112，1995]。然而有关碱性淀粉酶(特别是液化型碱性淀粉酶)的酶学和分子生物学特性报道的还很少[Igarashi等，应用和环境微生物学(Appl.Environ.Microbiol.)64：3282-3289]。

发明内容

本发明研究证明，淀粉水解嗜碱单胞菌(alkalomonasamylolytics)N10在碱性条件下产生大量碱性α—淀粉酶，该酶特别适于碱性条件下降解直链淀粉。嗜碱芽孢杆菌(alkaliphilicbacterium)N10于2000年6月28日已被保藏在中国微生物菌种保藏委员会普通微生物中心，其保藏号为CGMCCNo.0463.

本发明的目的是提供一种碱性α—淀粉酶的结构基因、该基因的DNA序列如序列表SEQ ID NO.1所示，由该基因的DNA序列所推导的氨基酸序列，如氨基酸序表SEQ ID NO.2所示。本发明的目的是还提供一种碱性α—淀粉酶基因重组表达质粒和重组菌，并提供由该基因构建重组菌，表达碱性α—淀粉酶应用于碱性条件高效降解直链淀粉的方法。

上所述的DNA序列的重组表达质粒有pAMY1和pAMY2。含重组表达质粒的重组菌株，包括大肠杆菌菌株JM109AMY1和大肠杆菌菌株JM109AMY2。

本发明从嗜碱单胞菌N10(CGMCC NO.0463)分离得到α—淀粉酶的基因，它是1761bp的DNA，编码一个由587个氨基酸组成的蛋白质。通过常规方法获得了含有该基因的重组质粒，转化大肠杆菌使重组菌株表达α—淀粉酶。因此本发明同时提供了一种可能性，即通过遗传工程或分子生物学手段，将本发明涉及的酶基因克隆到嗜碱杆菌或其它受体菌，由嗜碱杆菌N10菌株或其它菌株或在其它培养条件产生本发明涉及的α—淀粉酶。

为达到本发明的目的，实现本发明的具体技术步骤如下：从嗜碱杆菌N10(CGMCC NO.0463)中提取总DNA，经限制酶部分水解，得到如序列表SEQ ID NO.1所示基因具有相同功能的DNA片段，连接到pUC19载体上并转化大肠杆菌JM109，获得含碱性淀粉酶基因的重组质粒pAMY1及重组大肠杆菌菌株JM109AMY1。

从重组质粒pAMY1分离出含淀粉酶基因的DNA片段，再经限制酶水解，获得如序列表SEQ ID NO.1所示基因具有相同功能的小片段DNA，连接到pUC19载体上并转化大肠杆菌JM109，获得含淀粉酶基因的重组质粒pAMY2及重组大肠杆菌JM109AMY2。

在含有淀粉的培养基上，培养该重组菌，菌落周围形成透明圈，证明该重组菌表达α—淀粉酶活性。该蛋白质具有淀粉酶活性，pI为4.9，MW为60kDa，最适pH10，最适温度50℃，可高效水解直链淀粉产生麦芽寡糖。测序表明，该酶结构基因是1761bp的DNA，编码一个由587个氨基酸组成的蛋白质。

上述基因的表达产物，可在碱性条件下，将高分子淀粉降解为低分子麦芽糖系列。

本发明涉及的α—淀粉酶是一新型的碱性α—淀粉酶。通过对本发明涉及的α—淀粉酶基因推导的氨基酸序列比较分析，本发明涉及的α—淀粉酶与其它已报道的α—淀粉酶的氨基酸序列相比，相似性小于40％。应当指出的是，对本发明的碱性α—淀粉酶基因所表达的酶分子的氨基酸进行一个或多个氨基酸替换、插入或缺失所得到的功能类似物也能达到本发明的目的。因而本发明也包括与SEQ NO.2所示的氨基酸序列具有至少有70％的同源性，优选具有至少90％的同源性，但同时具有α—淀粉酶活性的功能类似物。

本发明涉及的α—淀粉酶的性能不同于已知的α—淀粉酶，其最适pH10和碱稳定性，在迄今发现的α—淀粉酶中是最高的。该酶水解直链淀粉，可以在化工、纺织、食品、医药工业中应用。

按照本发明所述，本发明涉及的α—淀粉酶主要特性如下：

(1)嗜碱单胞菌N10(CGMCC NO.0463)或其衍生菌产生。衍生菌是指转化有本发明涉及的DNA片段的重组菌株。

(2)SEQ NO.1的DNA序列编码其氨基酸序列。

(3)具有SEQ NO.2的氨基酸序列组成。

(4)具有耐碱α—淀粉酶活性，pI为4.9，最适pH10.0，最适温度50℃，分子量60000道尔顿。

(5)可高效水解淀粉产生寡糖。

本发明涉及的DNA序列，除了编码本发明涉及的α—淀粉酶的SEQNO.1外，此外还应当包括编码对本发明的碱性α—淀粉酶基因所表达的酶分子的氨基酸进行一个或多个氨基酸替换、插入或缺失所得到的功能类似物也能达到本发明的目的DNA核苷酸序列。因而本发明也包括编码与SEQ NO.2所示的氨基酸序列具有至少有70％的同源性，优选具有至少90％的同源性，但同时具有α—淀粉酶活性的功能类似物的DNA核苷酸序列。

附图说明

为了更好地理解本发明，现通过以下附图作具体描述。

图1.碱性α—淀粉酶基因重组质粒pAMY1构建模式图

图2.碱性α—淀粉酶基因重组质粒pAMY2构建模式图

图3.淀粉酶水解直链淀粉产物的纸层析图谱

具体实施方式

下面通过实施例对本发明进行进一步详细的说明。应该理解的是，所述的实施例仅仅是用于说明而不是限制本发明。

实施例1.

嗜碱菌N10(CGMCC NO.0463)总DNA的提取

采用从中国内蒙查汉淖碱湖分离的嗜碱菌N10，取其新鲜湿菌体20克，悬于10毫升50mMTris缓冲液中(pH8.0)，加入少量溶菌酶和8毫升0.25m MEDTA(pH8.0)，混匀后于37℃放置20min，之后加入2毫升10％SDS，55℃放置5min，分别用等体积酚、氯仿各抽提一次，取最后一次的上清溶液，加入2倍体积乙醇，回收DNA，分别用70％和无水乙醇洗，沉淀溶于0.5毫升TE缓冲液(pH8.0，10mM Tris，1mMEDTA)，加入10mg/ml RNase3μl，37℃保温1小时，分别用等体积酚、氯仿各抽提一次，上清液加入2倍体积乙醇，回收DNA，分别用70％和无水乙醇洗，真空干燥，用去离子水溶解。DNA溶液的紫外分光光度计测定结果为A260/A280＝1.98，A260/A230＝2.18。

碱性淀粉酶基因的克隆和筛选

取前面所述的总DNA溶液10μl(约50μgDNA)，用限制酶Sau3AI部分酶切，经琼脂糖凝胶电泳，电洗脱回收2-10kbDNA片段。与经BamHI酶解并脱磷的质粒pUC19DNA连接，转化感受态大肠杆菌JM109后，涂于含Amp(氨苄青霉素)，IPTG和X-gal的LB固体培养基上。37℃培养16-18小时，挑取白斑于含Amp和淀粉的LB固体培养基，37℃培养18-20小时，能够形成透明圈的菌落，确定为阳性克隆。对阳性菌落用碱法提取重组质粒，用各种限制酶水解重组质粒，根据电泳结果证实有DNA片段插入质粒，其大小约为8.0kb。含该DNA片段的重组质粒称为pAMY1(见图1)，含此重组质粒pAMY1的重组大肠杆菌称为大肠杆菌JM109AMY1。

此重组质粒pAMY1可高频转化大肠杆菌表达碱性淀粉酶活性和抗氨苄性能。将重组质粒中的DNA插入片段用地高辛DNA标记检测试剂盒标记，与嗜碱菌N10的染色体DNA进行Southern blot DNA杂交实验，分别用该片段和大肠杆菌JM109的染色体DNA作为正/负对照，证实重组质粒pAMY1中插入的DNA片段来自嗜碱菌N10的染色体DNA。

碱性淀粉酶基因的亚克隆和序列

取10μl的质粒pAMY1中的插入DNA片断在50μl体系中，进行各种限制酶酶解反应，如：AccI、HindIII、PstI、EcoRI、SmaI和XbalI等的单或双酶切反应，37℃保温1.5小时，琼脂糖凝胶电泳纯化回收DNA片段。如前所述方法，将得到的单一或双酶解DNA片段连接到质粒pUC19DNA或pGEM-4Z，形成一系列亚克隆质粒，转化感受态大肠杆菌JM109，相应地获得一系列重组大肠杆菌，培养后测其酶活，结果显示含有SmalI酶切DNA片段的重组大肠杆菌具有淀粉酶活性，该SmaI酶切DNA片段约为3kb。含该DNA片段的重组质粒称为pAMY2(见图2)，含此重组质粒pAMY2的重组大肠杆菌称为大肠杆菌JM109AMY2。采用Sanger双脱氧法对此DNA片段进行了测序。测序结果显示，SmaI酶切DNA片段全长2874bp，含有一个长1761bp的开放阅读框架(ORF)，由ATG起始密码子开始，到TGA终止密码子结尾。该完整的ORF编码一个由587个氨基酸组成的蛋白质。属α-淀粉酶家族，最高相似性同B.licheniformis的α-淀粉酶基因(36％).

实施例2

重组淀粉酶的纯化和特性

重组菌E.coli JM109AMY2的菌体悬于10mM甘氨酸缓冲液(pH10)中，利用超声波破碎细胞，离心上清液为重组α—淀粉酶的粗酶液。此上清酶液经DEAE—Sephadex A—25离子交换柱层析，羟基磷灰石吸附柱层析和PAGE制备电泳等步骤进行纯化，得到的酶制剂在SDS—PAGE上显示一条带。利用已知的蛋白质化学标准方法测定此重组α—淀粉酶的基本特性。用SDS—PAGE测得的重组酶的分子量为60000道尔顿，与理论上推算的分子量(66000道尔顿)相似；用PAGEIEF测得的重组酶的等电点pI为4.9；重组酶反应的最适pH为10，最适温度为50℃。与嗜碱菌N10发酵产生的淀粉酶特性一致。

实施例3

重组淀粉酶水解淀粉进行寡糖转化

1.0L反应器中装0.45L 2％的可溶性淀粉溶液(用pH10，0.1M的甘氨酸—NaOH缓冲液配制)，加0.05L酶液，升温至40℃保温12小时。反应混合液经过Sephadex G-10柱脱盐，浓缩，在新华滤纸上层析，结果显示所得产物为葡萄糖、麦芽糖和其它低聚糖(图3)。

序列表

<110>  中国科学院微生物研究所

<120>  一种碱性α-淀粉酶、其编码基因及应用

<130>  IM021105

<160>  2

<170>  Patentln version 3.1

<210>  1

<211>  1767

<212>  DNA

<213>  Alkaliphilic bacterium sp.N10

<400>  1

<210>  2

<211>  587

<212>  PRT

<213>  Alkaliphilic bacterium sp.N10

<400>  2

Claims (7)

1.一种来源于嗜碱单胞菌(Alkalomonas amylolytics)N10的碱性α-淀粉酶，它的氨基酸序列如SEQ NO.2所示，其中所述嗜碱单胞菌N10的保藏号为CGMCC NO.0463。

2.一种编码权利要求1所述的碱性α-淀粉酶的基因，它的核苷酸序列如SEQ NO.1所示。

3.一种含有权利要求2所述的基因的重组质粒，该重组质粒是pAMY1，pAMY1的质粒图谱如附图1所示。

4.一种含有与权利要求2所述的基因具有相同功能的小片段DNA的重组质粒，该重组质粒是pAMY2，pAMY2的质粒图谱如附图2所示。

5.一种含有权利要求3或4所述重组质粒的原核重组菌。

6.一种制备碱性α-淀粉酶的方法，包括：

1)构建权利要求5所述的重组菌；

2)通过微生物发酵1)中的重组菌制备碱性α-淀粉酶。

7.根据权利要求6的方法制备的α-淀粉酶在化工、纺织、食品、医药工业方面的应用。

Images