CN1500870A - 一种碱性α-淀粉酶、其编码基因及用途 - Google Patents

Abstract

由嗜碱单胞菌(alkalomonas amylolytics)N10(CGMCC NO.0463)总DNA获得碱性α－淀粉酶基因(α－amylase gene)，构建了原核表达质粒，转化大肠杆菌表达α－淀粉酶。通过核苷酸序列和氨基酸序列比较，该酶为一新型α－淀粉酶，其最适反应pH10，最适反应温度50℃，pI为4.9，分子量60000道尔顿。该酶水解直链淀粉，在洗涤、纺织、食品等方面具有重要的应用价值。

Description

一种碱性α-淀粉酶、其编码基因及用途

技术领域

本发明属于酶基因工程和酶工程领域。具体地说，本发明涉及编码淀粉水解嗜碱单胞菌(alkalomonas amylolytics)N10(CGMCC NO.0463)的α-淀粉酶的基因及其该基因的DNA序列，涉及含有该酶基因的重组质粒和表达相应酶的重组菌株。

背景技术

α-淀粉酶(α-amylase，EC3.2.1.1)是一种重要的工业用酶，特别是在食品和洗涤剂工业。碱性淀粉酶最适反应pH高于8.0，与其他酶配合可作为洗涤剂的添加剂、纺织品退浆剂、以及淀粉作粘结剂的粘度调节剂等[Dacosta等，极端环境微生物及其生物技术潜力(Microbiology of extreme environments and its potential forbiotechnology)，p346-366.Elsevier Science Publishers Ltd.，Essex，England)。自从Horikoshi首次报道了嗜碱芽孢杆菌产生碱性淀粉酶之后[Horikoshi，农业生物化学(Agric.Biol.Chem.)35：1783-1791，1971]，相继从不同的微生物中，如芽孢杆菌、假单胞菌、和放线菌等分离了一些碱性淀粉酶[Bajpai等，生物技术和生物工程(Biotechnol.Bioeng.)33：72-78，1989；Ozaki等，日本专利JP9049584；Kim等，应用和环境微生物学(Appl.Environ.Microbiol.)61：3105-3112，1995]。然而有关碱性淀粉酶(特别是液化型碱性淀粉酶)的酶学和分子生物学特性报道的还很少[Igarashi等，应用和环境微生物学(Appl.Environ.Microbiol.)64：3282-3289]。

发明内容

本发明研究证明，淀粉水解嗜碱单胞菌(alkalomonasamylolytics)N10在碱性条件下产生大量碱性α-淀粉酶，该酶特别适于碱性条件下降解直链淀粉。嗜碱芽孢杆菌(alkaliphilicbacterium)N10于2000年6月28日已被保藏在中国微生物菌种保藏委员会普通微生物中心，其保藏号为CGMCC

No.0463.

本发明的目的是提供一种碱性α-淀粉酶的结构基因、该基因的DNA序列如序列表SEQ ID NO.1所示，由该基因的DNA序列所推导的氨基酸序列，如氨基酸序表SEQ ID NO.2所示。本发明的目的是还提供一种碱性α-淀粉酶基因重组表达质粒和重组菌，并提供由该基因构建重组菌，表达碱性α-淀粉酶应用于碱性条件高效降解直链淀粉的方法。

上所述的DNA序列的重组表达质粒有pAMY1和pAMY2。含重组表达质粒的重组菌株，包括大肠杆菌菌株JM109AMY1和大肠杆菌菌株JM109AMY2。

本发明从嗜碱单胞菌N10(CGMCC NO.0463)分离得到α-淀粉酶的基因，它是1761bp的DNA，编码一个由587个氨基酸组成的蛋白质。通过常规方法获得了含有该基因的重组质粒，转化大肠杆菌使重组菌株表达α-淀粉酶。因此本发明同时提供了一种可能性，即通过遗传工程或分子生物学手段，将本发明涉及的酶基因克隆到嗜碱杆菌或其它受体菌，由嗜碱杆菌N10菌株或其它菌株或在其它培养条件产生本发明涉及的α-淀粉酶。

为达到本发明的目的，实现本发明的具体技术步骤如下：从嗜碱杆菌N10(CGMCC NO.0463)中提取总DNA，经限制酶部分水解，得到如序列表SEQ  ID NO.1所示基因具有相同功能的DNA片段，连接到pUC19载体上并转化大肠杆菌JM109，获得含碱性淀粉酶基因的重组质粒pAMY1及重组大肠杆菌菌株JM109AMY1。

从重组质粒pAMY1分离出含淀粉酶基因的DNA片段，再经限制酶水解，获得如序列表SEQ ID NO.1所示基因具有相同功能的小片段DNA，连接到pUC19载体上并转化大肠杆菌JM109，获得含淀粉酶基因的重组质粒pAMY2及重组大肠杆菌JM109AMY2。

在含有淀粉的培养基上，培养该重组菌，菌落周围形成透明圈，证明该重组菌表达α-淀粉酶活性。该蛋白质具有淀粉酶活性，pI为4.9，MW为60kDa，最适pH10，最适温度50℃，可高效水解直链淀粉产生麦芽寡糖。测序表明，该酶结构基因是1761bp的DNA，编码一个由587个氨基酸组成的蛋白质。

上述基因的表达产物，可在碱性条件下，将高分子淀粉降解为低分子麦芽糖系列。

本发明涉及的α-淀粉酶是一新型的碱性α-淀粉酶。通过对本发明涉及的α-淀粉酶基因推导的氨基酸序列比较分析，本发明涉及的α-淀粉酶与其它已报道的α-淀粉酶的氨基酸序列相比，相似性小于40％。应当指出的是，对本发明的碱性α-淀粉酶基因所表达的酶分子的氨基酸进行一个或多个氨基酸替换、插入或缺失所得到的功能类似物也能达到本发明的目的。因而本发明也包括与SEQ NO.2所示的氨基酸序列具有至少有70％的同源性，优选具有至少90％的同源性，但同时具有α-淀粉酶活性的功能类似物。

本发明涉及的α-淀粉酶的性能不同于已知的α-淀粉酶，其最适pH10和碱稳定性，在迄今发现的α-淀粉酶中是最高的。该酶水解直链淀粉，可以在化工、纺织、食品、医药工业中应用。

按照本发明所述，本发明涉及的α-淀粉酶主要特性如下：

(1)嗜碱单胞菌N10(CGMCC NO.0463)或其衍生菌产生。衍生菌是指转化有本发明涉及的DNA片段的重组菌株。

(2)SEQ NO.1的DNA序列编码其氨基酸序列。

(3)具有SEQ NO.2的氨基酸序列组成。

(4)具有耐碱α-淀粉酶活性，pI为4.9，最适pH10.0，最适温度50℃，分子量60000道尔顿。

(5)可高效水解淀粉产生寡糖。

本发明涉及的DNA序列，除了编码本发明涉及的α-淀粉酶的SEQNO.1外，此外还应当包括编码对本发明的碱性α-淀粉酶基因所表达的酶分子的氨基酸进行一个或多个氨基酸替换、插入或缺失所得到的功能类似物也能达到本发明的目的DNA核苷酸序列。因而本发明也包括编码与SEQ NO.2所示的氨基酸序列具有至少有70％的同源性，优选具有至少90％的同源性，但同时具有α-淀粉酶活性的功能类似物的DNA核苷酸序列。

附图说明

为了更好地理解本发明，现通过以下附图作具体描述。

图1.碱性α-淀粉酶基因重组质粒pAMY1构建模式图

图2.碱性α-淀粉酶基因重组质粒pAMY2构建模式图

图3.淀粉酶水解直链淀粉产物的纸层析图谱

具体实施方式

下面通过实施例对本发明进行进一步详细的说明。应该理解的是，所述的实施例仅仅是用于说明而不是限制本发明。

实施例1.

嗜碱菌N10(CGMCC NO.0463)总DNA的提取

采用从中国内蒙查汉淖碱湖分离的嗜碱菌N10，取其新鲜湿菌体20克，悬于10毫升50mMTris缓冲液中(pH8.0)，加入少量溶菌酶和8毫升0.25m MEDTA(pH8.0)，混匀后于37℃放置20min，之后加入2毫升10％SDS，55℃放置5min，分别用等体积酚、氯仿各抽提一次，取最后一次的上清溶液，加入2倍体积乙醇，回收DNA，分别用70％和无水乙醇洗，沉淀溶于0.5毫升TE缓冲液(pH8.0，10mM Tris，1mMEDTA)，加入10mg/ml RNase3μl，37℃保温1小时，分别用等体积酚、氯仿各抽提一次，上清液加入2倍体积乙醇，回收DNA，分别用70％和无水乙醇洗，真空干燥，用去离子水溶解。DNA溶液的紫外分光光度计测定结果为A260/A280＝1.98，A260/A230＝2.18。

碱性淀粉酶基因的克隆和筛选

取前面所述的总DNA溶液10μl(约50μgDNA)，用限制酶Sau3AI部分酶切，经琼脂糖凝胶电泳，电洗脱回收2-10kbDNA片段。与经BamHI酶解并脱磷的质粒pUC19DNA连接，转化感受态大肠杆菌JM109后，涂于含Amp(氨苄青霉素)，IPTG和X-gal的LB固体培养基上。37℃培养16-18小时，挑取白斑于含Amp和淀粉的LB固体培养基，37℃培养18-20小时，能够形成透明圈的菌落，确定为阳性克隆。对阳性菌落用碱法提取重组质粒，用各种限制酶水解重组质粒，根据电泳结果证实有DNA片段插入质粒，其大小约为8.0kb。含该DNA片段的重组质粒称为pAMY1(见图1)，含此重组质粒pAMY1的重组大肠杆菌称为大肠杆菌JM109AMY1。

此重组质粒pAMY1可高频转化大肠杆菌表达碱性淀粉酶活性和抗氨苄性能。将重组质粒中的DNA插入片段用地高辛DNA标记检测试剂盒标记，与嗜碱菌N10的染色体DNA进行Southern blot DNA杂交实验，分别用该片段和大肠杆菌JM109的染色体DNA作为正/负对照，证实重组质粒pAMY1中插入的DNA片段来自嗜碱菌N10的染色体DNA。碱性淀粉酶基因的亚克隆和序列

取10μl的质粒pAMY1中的插入DNA片断在50μl体系中，进行各种限制酶酶解反应，如：AccI、HindIII、PstI、EcoRI、SmaI和XbalI等的单或双酶切反应，37℃保温1.5小时，琼脂糖凝胶电泳纯化回收DNA片段。如前所述方法，将得到的单一或双酶解DNA片段连接到质粒pUC19DNA或pGEM-4Z，形成一系列亚克隆质粒，转化感受态大肠杆菌JM109，相应地获得一系列重组大肠杆菌，培养后测其酶活，结果显示含有SmalI酶切DNA片段的重组大肠杆菌具有淀粉酶活性，该SmaI酶切DNA片段约为3kb。含该DNA片段的重组质粒称为pAMY2(见图2)，含此重组质粒pAMY2的重组大肠杆菌称为大肠杆菌JM109AMY2。采用Sanger双脱氧法对此DNA片段进行了测序。测序结果显示，SmaI酶切DNA片段全长2874bp，含有一个长1761bp的开放阅读框架(ORF)，由ATG起始密码子开始，到TGA终止密码子结尾。该完整的ORF编码一个由587个氨基酸组成的蛋白质。属α-淀粉酶家族，最高相似性同B.licheniformis的α-淀粉酶基因(36％)。

实施例2

重组淀粉酶的纯化和特性

重组菌E.coli JM109AMY2的菌体悬于10mM甘氨酸缓冲液(pH10)中，利用超声波破碎细胞，离心上清液为重组α-淀粉酶的粗酶液。此上清酶液经DEAE-Sephadex A-25离子交换柱层析，羟基磷灰石吸附柱层析和PAGE制备电泳等步骤进行纯化，得到的酶制剂在SDS-PAGE上显示一条带。利用已知的蛋白质化学标准方法测定此重组α-淀粉酶的基本特性。用SDS-PAGE测得的重组酶的分子量为60000道尔顿，与理论上推算的分子量(66000道尔顿)相似；用PAGEIEF测得的重组酶的等电点pI为4.9；重组酶反应的最适pH为10，最适温度为50℃。与嗜碱菌N10发酵产生的淀粉酶特性一致。

实施例3

重组淀粉酶水解淀粉进行寡糖转化

1.0L反应器中装0.45L 2％的可溶性淀粉溶液(用pH10，0.1M的甘氨酸-NaOH缓冲液配制)，加0.05L酶液，升温至40℃保温12小时。反应混合液经过Sephadex G-10柱脱盐，浓缩，在新华滤纸上层析，结果显示所得产物为葡萄糖、麦芽糖和其它低聚糖(图3)。

                        序列表

<110>中国科学院微生物研究所

<120>一种碱性α-淀粉酶、其编码基因及应用

<130>IM021105

<160>2

<170>PatentIn version 3.1

<210>1

<211>1767

<212>DNA

<213>Alkaliphilic bacterium sp.N10

<400>1

atgcaaaaaa cagccaaaac ttccatctgg cagaggatgc gccacagcgc cattgcctta    60

tccgcactca gcttatcctt tggcctgcag gccagcgagt tgccgcaaat cccgccgcag    120

cagatcaaca acaccatgta tcaggcgttt tactgggatg cctacccagg cctttgggcc    180

aatttaccgg ccatggcggc ccctttggcc gagcgcggca ttacctcgat gtggctgcct    240

ccagccgcca agggtatgaa tggtactttc agtgtcggtt acgatgtgta cgatttctgg    300

gatctgggcg agttttacca aaaaggcacc accgcaaccc gctatggcag tcgccagcag    360

ctgcagcaag cgctggctgc actggaccaa ctgggtattc aggcctattt tgatgtggtg    420

tttaatcacc gcatgggcgc cgatgcacag gagcacatcc ccggttttgg tctggcctgg    480

accgagtacc atctgcaagg tcggcaggca cattataccc agcaaaattg gggctacttg    540

tggcacgact tcgactggga ctggaccgcg tttaatggct ccgacaatca gctctacccc    600

ggcaaatggt ggggcaatac cttccacttt ccttacctga tgggcgagga tgtcgattac    660

aaccgctttg aagtgcagca ggaaatgaaa gcctggggtg agtggatcat caaccacgtt    720

ggctttagcg gctttcggat ggatgccatt gcccatgtcg ataccgactt tacccgcgac    780

tggatcaatc atgtgcagtg ggctaccagc gaagacgtgt tctttgtggc ggaagcctgg    840

gtcagtgata tcaacggtta tctggatgcc gtcaatacgc cgcacttacg cgccttcgac    900

tttaatctgc gcgaagattt  tgtcgcctta agtagtggca gcaaagatat gcgttggtgg   960

ggtggtctgg tcaatagcca gcaccgcgat cgagcggtca cttttgtcga taaccacgat   1020

accagccggg ctggtaatcc ttatggcatg ccgcaggtga tcaactacaa gaaccaggcc   1080

tacgcttaca ttctgctgcg tgagcatggg gtgcccaccg tgtttgcccg cgattacgac   1140

gagtttggta tggcagcaac gctggataaa ctgattgaag cgcgccgtta ctttgcttat   1200

ggccccggcc atgaatactc cggcaatacc gaggcggtct atgcttatgt gcgggaaggg   1260

ttaagtaatg tacccggcac aggactagtg atgctgatgt cgggtcgtaa ctggggtggc   1320

cagcagtctt ttagcatcaa cagccaccag gccaatacca ccttctatga ttacaccggc   1380

aatgtcgctg gcacggtgac caccaatgcg cagggttatg gcagcttccc ggtcaatatg   1440

acggaaagta ccggttggtc agtctgggta ccacaatcca gtggtggtcc gcagccggga   1500

tccattaccc tgcggatgac caaggatgtt ggttatggct attcgttgtt ctttaccggc   1560

agcagcccgg atctcaccaa ctggggtgct ggtattgaag gcacctggac cagtggccat   1620

gtgtgggaag tgaccatccc ggatccgggc aactttgaat ggaaaacccg caaaggccca   1680

accggtggca gtggtcagga ctgggaaagt ggcggcaacc acaaccagaa caatttgcat   1740

cccagtttta atggtggctt ttgatag                                       1767

<210>2

<211>587

<212>PRT

<213>Alkaliphilic bacterium sp. N10

<400>2

Met Gln Lys Thr Ala Lys Thr Ser Ile Trp Gln Arg Met Arg His Ser

1               5                   10                  15

Ala Ile Ala Leu Ser Ala Leu Ser Leu Ser Phe Gly Leu Gln Ala Ser

            20                  25                  30

Glu Leu Pro Gln Ile Pro Pro Gln Gln Ile Asn Asn Thr Met Tyr Gln

        35                  40                  45

Ala Phe Tyr Trp Asp Ala Tyr Pro Gly Leu Trp Ala Asn Leu Pro Ala

    50                  55                  60

Met Ala Ala Pro Leu Ala Glu Arg Gly Ile Thr Ser Met Trp Leu Pro

65                  70                  75                  80

Pro Ala Ala Lys Gly Met Asn Gly Thr Phe Ser Val Gly Tyr Asp Val

                85                  90                  95

Tyr Asp Phe Trp Asp Leu Gly Glu Phe Tyr Gln Lys Gly Thr Thr Ala

            100                 105                 110

Thr Arg Tyr Gly Ser Arg Gln Gln Leu Gln Gln Ala Leu Ala Ala Leu

        115                 120                 125

Asp Gln Leu Gly Ile Gln Ala Tyr Phe Asp Val Val Phe Asn His Arg

    130                 135                 140

Met Gly Ala Asp Ala Gln Glu His Ile Pro Gly Phe Gly Leu Ala Trp

145                 150                 155                 160

Thr Glu Tyr His Leu Gln Gly Arg Gln Ala His Tyr Thr Gln Gln Asn

                165                 170                 175

Trp Gly Tyr Leu Trp His Asp Phe Asp Trp Asp Trp Thr Ala Phe Asn

            180                 185                 190

Gly Ser Asp Asn Gln Leu Tyr Pro Gly Lys Trp Trp Gly Asn Thr Phe

        195                 200                 205

His Phe Pro Tyr Leu Met Gly Glu Asp Val Asp Tyr Asn Arg Phe Glu

    210                 215                 220

Val Gln Gln Glu Met Lys Ala Trp Gly Glu Trp Ile Ile Asn His Val

225                 230                 235                 240

Gly Phe Ser Gly Phe Arg Met Asp Ala Ile Ala His Val Asp Thr Asp

                245                 250                 255

Phe Thr Arg Asp Trp Ile Asn His Val Gln Trp Ala Thr Ser Glu Asp

            260                 265                 270

Val Phe Phe Val Ala Glu Ala Trp Val Ser Asp Ile Asn Gly Tyr Leu

        275                 280                 285

Asp Ala Val Asn Thr Pro His Leu Arg Ala Phe Asp Phe Asn Leu Arg

    290                 295                 300

Glu Asp Phe Val Ala Leu Ser Ser Gly Ser Lys Asp Met Arg Trp Trp

305                 310                 315                 320

Gly Gly Leu Val Asn Ser Gln His Arg Asp Arg Ala Val Thr Phe Val

                325                 330                 335

Asp Asn His Asp Thr Ser Arg Ala Gly Asn Pro Tyr Gly Met Pro Gln

            340                 345                 350

Val Ile Asn Tyr Lys Asn Gln Ala Tyr Ala Tyr Ile Leu Leu Arg Glu

        355                 360                 365

His Gly Val Pro Thr Val Phe Ala Arg Asp Tyr Asp Glu Phe Gly Met

    370                 375                 380

Ala Ala Thr Leu Asp Lys Leu Ile Glu Ala Arg Arg Tyr Phe Ala Tyr

385                 390                 395                 400

Gly Pro Gly His Glu Tyr Ser Gly Asn Thr Glu Ala Val Tyr Ala Tyr

                405                 410                 415

Val Arg Glu Gly Leu Ser Asn Val Pro GIy Thr Gly Leu Val Met Leu

            420                 425                 430

Met Ser Gly Arg Asn Trp Gly Gly Gln Gln Ser Phe Ser Ile Asn Ser

        435                 440                 445

His Gln Ala Asn Thr Thr Phe Tyr Asp Tyr Thr Gly Asn Val Ala Gly

    450                 455                 460

Thr Val Thr Thr Asn Ala Gln Gly Tyr Gly Ser Phe Pro Val Asn Met

465                 470                 475                 480

Thr Glu Ser Thr Gly Trp Ser Val Trp Val Pro Gln Ser Ser Gly Gly

                485                 490                 495

Pro Gln Pro Gly Ser Ile Thr Leu Arg Met Thr Lys Asp Val Gly Tyr

            500                 505                 510

Gly Tyr Ser Leu Phe Phe Thr Gly Ser Ser Pro Asp Leu Thr Asn Trp

        515                 520                 525

Gly Ala Gly Ile Glu Gly Thr Trp Thr Ser Gly His Val Trp Glu Val

    530                 535                 540

Thr Ile Pro Asp Pro Gly Asn Phe Glu Trp Lys Thr Arg Lys Gly Pro

545                 550                 555                 560

Thr Gly Gly Ser Gly Gln Asp Trp Glu Ser Gly Gly Asn His Asn Gln

                565                 570                 575

Asn Asn Leu His Pro Ser Phe Asn Gly Gly Phe

            580                 585

Claims (11)

1.一种来源于嗜碱单胞菌(alkalomonas amylolytics)N10(CGMCCNO.0463)的碱性α-淀粉酶或其功能类似物，其氨基酸序列与SEQ NO.2所示的氨基酸序列具有至少有70％的同源性。

2.根据权利要求1所述的酶或其功能类似物，其氨基酸序列与SEQNO.2所示的氨基酸序列具有至少有90％的同源性。

3.根据权利要求1所述的酶或其功能类似物，它具有SEQ NO.2所示的氨基酸序列。

4.一种编码权利要求1至3中任意一项所述的碱性α-淀粉酶或其功能类似物的基因。

5.根据权利要求4所述的基因，它具有SEQ NO.1所示的核苷酸序列。

6.一种含有权利要求5所述的核苷酸序列的重组质粒，是pAMY1。

7.一种含有与权利要求5所述的核苷酸序列具有相同功能的小片段DNA的重组质粒，是pAMY2。

8.一种含有权利要求4或5所述的碱性α-淀粉酶或其功能类似物的基因的表达载体。

9.一种含有权利要求6或7所述表达载体的原核重组菌。

10.一种含有权利要求6或7所述表达载体的重组大肠杆菌JM109AMY1或重组大肠杆菌JM109AMY2。

11.一种制备碱性α-淀粉酶的方法步骤和用途，包括：

1)按照权利要求9所述的重组菌；

2)按照权利要求9所述的重组菌是一种含重组质粒pAMY1的重组大肠杆菌JM109AMY1，或是一种含重组质粒pAMY2的重组大肠杆菌JM109AMY2；

3)重组菌通过微生物发酵和酶工程制备碱性α-淀粉酶；

4)通过该方法得到的碱性α-淀粉酶在化工、纺织、食品、医药工业方面应用。

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