CN1778907A - 一种β－葡萄糖苷酶及其编码基因与应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种β－葡萄糖苷酶及其编码基因与应用。本发明提供的β－葡萄糖苷酶，是具有下述氨基酸残基序列之一的蛋白质：1)序列表中的SEQ ID №：2；2)将序列表中SEQ ID №：2的氨基酸残基序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且具有β－葡萄糖苷酶活性的蛋白质。本发明的β－葡萄糖苷酶及其编码基因在纤维素的降解中具有广泛的用途。

Description

一种β-葡萄糖苷酶及其编码基因与应用

技术领域

本发明涉及一种β-葡萄糖苷酶及其编码基因与应用。

背景技术

纤维素主要是植物用二氧化碳和水在太阳能作用下通过光合作用合成的地球上最丰富的可再生的生物质(biomass)资源。纤维素是多个葡萄糖残基以β-1，4-糖苷键连接而成的多聚物，其基本重复单位为纤维二糖。天然纤维素的基本结构是由原纤维构成的微纤维束集合而成。原纤维是由15-40根有结晶区和非结晶区构成的纤维素分子长链所组成。纤维素的结晶部分是由纤维素分子进行非常整齐规划地折迭排列形成。在天然纤维素中，木质素和半纤维素形成牢固结合层，紧密地包围纤维素。纤维素酶是能将纤维素转化成葡萄糖的一系列酶的总称，包括三类酶即内切-β-1，4-葡聚糖酶(endo-β-1，4-glucanase，EC 3.2.1.4)、外切葡聚糖酶(exoglucanase，又叫纤维二糖水解酶cellobiohydrolase，EC3.2.1.91)和β-葡萄糖苷酶(β-glucosidase，EC3.2.1.21)，这三种酶协同作用能将纤维素转化成葡萄糖。内切葡聚糖酶作用于纤维素长链分子的内部将长纤维切成短纤维，外切葡聚糖酶作用于纤维素分子的-端，以两个葡萄糖残基为单位进行切割生成纤维二糖，β-葡萄糖苷酶切割纤维二糖生成葡萄糖(Lynd，L.R.，Weimer，P.J.，Willem，H.Z.，Pretorius，I.S.2002.Microbial cellulose utilization：fundamentals and biotechnology.Microbiol.Mol.Biol.Rev.66，506-577.)。葡萄糖可作为重要的工业原料生产酒精、丙酮等化工产品。其中，酒精可以作为汽车和其他工业的燃料取代日益枯竭的石油资源，这对解决世界能源危机、粮食短缺、环境污染等问题以及国家的能源战略、财政税收、农业的可持续发展具有重要意义。

自然界中有多种生物如：细菌、真菌、植物和动物可产生纤维素酶。草食性动物的能量完全来自富含纤维素的植物材料，反刍动物的瘤胃和非反刍动物的盲肠是草食性动物重要的消化器官，里面共生或寄生着的多种微生物，能分泌纤维素酶、半纤维素酶果胶酶等帮助降解植物材料，是纤维素被高效降解的场所。人们对瘤胃微生物和它们的纤维素酶进行了大量的研究(Krause，D.O.，Denman，S.E.，Mackie，R.I.，Morrison，M.Rae，A.L.，Attwood，G.T.，McSweeney，C.S.，2003.Opportunities to improve fiber degradation in the rumen：microbiology，ecology，and genomics.FEMS Microbiol.Rev.27，663-693；Kamra D.N.，2005.Rumenmicrobial ecosystem.Curr.Sci.89，124-135)，而对非反刍草食性动物盲肠中纤维素酶的研究却很少见报道。最近，Abecia等人对兔子盲肠的部分细菌的16S rRNA基因进行了研究，发现兔子盲肠的细菌组成虽然与其他肠道系统有一定的相似性，但却含有从未被人认识的物种(Abecia，L.，Fondevila，M.，Balcells，J.，Edwards，JE.，Newbold，CJ.，McEwan，NR.，2005.Molecular profiling of bacterial speciesin the rabbit caecum.FEMS.Microbiol.Lett.244，111-115)。

目前，可在人工条件下分离培养的微生物仅占自然界中所有微生物种类的l％(Amann，R.I.，Ludwig，W.，Schleifer，K.H.，1995.Phylogeneticidentification and in situ detection of individual microbial cells withoutcultivation.Microbiol.Rev.59，143-169.)，就是在研究得比较深入的瘤胃中，仍有85％以上的微生物种类不能培养(Krause，D.O.等，2003)，未培养微生物中蕴藏着大量的基因资源。近年来，对环境样品未培养微生物的研究方法已日趋成熟，其基本原理是直接提取样品的混合基因组DNA，构建宏基因组DNA文库，然后对文库进行筛选，以获得所需要的目的基因(Lorenz，P.，Schleper，C.，2002.Metagenome-achellenging source of enzyme discovery.Journal of Molecular Catalysis B：Enzymetic19-20，13-19.)。人们已经利用构建宏基因组DNA文库的方法，从未培养微生物中获得了多种酶、抗生素和其他活性物质的编码基因(Handelsman，J.，2004.Metagenomics：application of genomics to uncultured microorganisms.Microbiol.Mol.Biol.Rev.68，669-685.)。在未培养微生物纤维素酶方面，Rees等人从湖水和湖床沉积物未培养微生物中克隆到2个纤维素酶基因，Genebank登录号为AJ537595和AJ537596(Rees，H.C.，Grant，S.，Jones，B.，Grant，W.D.，Heaphy.S.，2003.Detecting cellulase and esterase enzyme activities encoded by novelgenes present in environmental DNA libraries.Extremophiles.7，415-421.)。Voget等从土壤未培养微生物中克隆到2个纤维素酶基因gnuB和uvs080(Voget，S.，Leggewie，C.，Uesbeck，A.，Raasch，C.，Jaeger，K.E.，Streit.W.R.，2003.Prospecting for novel biocatalysts in a soil metagenome.Appl.Environ.Microbiol.69，6235-6242.)。Walter等人构建鼠大肠未培养微生物的BAC基因文库，并克隆到一个β-葡萄糖苷酶基因(Walter，J.，Mangold，M.，Tannock，G.W.，2005.Construction，analysis，and beta-glucanase screening of a bacterialartificial chromosome library from the large-bowel microbiota of mice.Appl.Environ.Microbiol.71，2347-2354.)。虽然人们早就知道非反刍草食性动物的盲肠是纤维素被高效降解的场所，但至今未有从盲肠中克隆纤维素酶的报道。

发明内容

本发明的目的是提供一种β-葡萄糖苷酶及其编码基因与应用。

本发明所提供的β-葡萄糖苷酶，名称为Umbgl3B，来源于兔子盲肠未培养微生物，是具有下述氨基酸残基序列之一的蛋白质：

1)序列表中的SEQ ID №：2；

2)将序列表中SEQ ID №：2的氨基酸残基序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且具有β-葡萄糖苷酶活性的蛋白质。

序列表中序列2是由854个氨基酸残基组成的。自N端的第31-305位氨基酸为糖基水解酶家族3C端功能域(glycosyl hydrolase 3C terminal domain)，第545-807位氨基酸为糖基水解酶家族3催化功能域(glycosyl hydrolase 3domain)。Umbgl3B与来源于溶纤维丁酸弧菌H17c的β-葡萄糖苷酶A(Genebank登录号M31120)同源性最高，它们的氨基酸序列相似性为50％、一致性为35％。

所述一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加是指不多于十个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加。

上述β-葡萄糖苷酶的编码基因(umbgl3B)也属于本发明的保护范围。

上述β-葡萄糖苷酶的基因组基因，可具有下述核苷酸序列之一：

1)序列表中SEQ ID №：1的DNA序列；

2)编码序列表中SEQ ID №：2蛋白质序列的多核苷酸；

3)在高严谨条件下可与序列表中SEQ ID №：1限定的DNA序列杂交的核苷酸序列。

上述高严谨条件可为在0.1×SSPE(或0.1×SSC)，0.1％SDS的溶液中，在65℃下杂交并洗膜。

序列表中序列1具有2565个脱氧核苷酸，来源于兔子盲肠未培养微生物的DNA，是β-葡萄糖苷酶基因umbgl3B的完整的开放阅读框(Open Reading Frame，ORF)。

含有本发明基因的表达载体、细胞系及宿主菌均属于本发明的保护范围。

本发明通过构建兔子盲肠未培养微生物的宏基因组DNA文库和对文库克隆的活性筛选，得到了新的β-葡萄糖苷酶基因。可在宿主细胞中大量表达该基因以生产该β-葡萄糖苷酶，用于纤维素的降解。本发明所提供新的β-葡萄糖苷酶及其编码基因在纤维素的降解中具有广泛的用途。

附图说明

图1为从兔子盲肠样品中提取的未培养微生物的混合基因组DNA在建库操作中的凝胶电泳图。

图2为兔子盲肠未培养微生物基因文库克隆质粒BamHI酶切分析图。

图3为兔子盲肠未培养微生物基因文库克隆在七叶苷培养基上的活性筛选图。

图4为β-葡萄糖苷酶活性的克隆质粒pRG2的BamHI酶切带型图。

图5为初筛获得的重组质粒pRG2转化大肠杆菌后得到的转化子图。

图6为umbgl3B基因的PCR扩增产物电泳分析图。

图7为含重组表达质粒pET30RG2的宿主菌的表达活性检测图。

具体实施方式

下述实施例中的实验方法，如无特别说明，均为常规方法。

下述实施例中的百分含量，如无特别说明，均为质量百分含量。

在本发明的实施例中所用到的材料包括：克隆宿主大肠杆菌(Escherichia coli)株系EPI100(购自Epicentre公司)；文库克隆载体为购自Epicentre公司的柯斯质粒载体pWEB∷TNC；购自Epicentre公司的文库制备试剂盒(pWEB∷TNC cosmid cloningkit，目录号WEBC931)；购自Novagen公司的表达载体pET-30a(+)和表达宿主BL21(DE3)pLysS；购自Promega、Stratagene、SIGMA、QIAGEN的多种限制性内切酶、修饰酶等试剂。

实施例1、β-葡萄糖苷酶Umbgl3B及其编码基因的获得

一、兔子盲肠未培养微生物宏基因组文库的构建

从市场购买成年家兔，畏草饲养20天，让纤维素降解菌在盲肠中得到富集。取20g兔子盲肠内容物，悬浮在100ml的0.18M磷酸钾缓冲液(pH7.2)中，充分混匀后在Beckman Coulter Avanti J-E离心机JA-10转头上用800g离心力离心10分钟，弃去上清液，沉淀物用100ml的上述缓冲液充分震荡、悬浮，再用同样的离心机、转头用8000g离心力离心15分钟收集沉淀物中的微生物细胞。

将收集到的菌体充分悬浮在适量TE(10mM Tris/HCl，pH8.0，lmM EDTA，μH8.0)溶液中，加入溶菌酶(20mg/ml，溶于TE溶液)至终浓度2mg/ml，在37℃下作用30分钟。然后加入蛋白酶K至终浓度0.1mg/ml，在50℃下作用30分钟。再加入SDS至终浓度1.0％，在80℃下作用10分钟。冷却至室温后加入菌体裂解溶液一半体积的7.5M的醋酸铵溶液以沉淀细胞碎屑，充分混匀后13000g离心15分钟，收集上清液，加入两倍体积的无水乙醇，充分混匀后即见DNA絮状沉淀析出，挑出DNA絮状沉淀，用70％乙醇洗2次DNA，干燥后将DNA溶于500μlTE溶液即得DNA粗提物。

将DNA粗提物加到含有Sephadex G200和2％PVPP的层析柱(200mm×10mm)上，用TE缓冲液洗脱，按每组分1ml收集洗脱液，每一组分加入100μl的3M醋酸钠溶液(pH4.8)及1ml异丙醇沉淀DNA。把沉淀的DNA合并，溶于TE中得到纯化的DNA溶液，然后用电洗脱法回收30kb以上的DNA。得到的DNA的电泳图如图1中泳道2、3所示。图1中泳道1为λDNA(48.5kb)；泳道2为粗提总DNA；泳道3为经柱子纯化和电透析回收的DNA片段；泳道4为经末端补平和低熔点胶回收的DNA片段。

按试剂盒(购自Epicentre公司的文库制备试剂盒pWEB∷TNC cosmid cloningkit，目录号WEBC931)的说明构建基因文库，将上述回收后DNA进行末端修补以产生平末端的DNA片段与试剂盒中已处理好的同样具平末端的pWEB∷TNC载体(试剂盒提供)连接，用λ噬菌体蛋白(试剂盒提供)包装连接产物，用包装产物侵染宿主菌EPI100(试剂盒提供)。具体方法如下：

依次在冰上向新的灭过菌的微量离心管中加入：6μl 10×末端修补缓冲液(330mMTris-醋酸[pH7.8]，660mM醋酸钾，100mM醋酸镁，5mM DTT)，6μl 2.5mM dNTP混合物(每种2.5mM)，6μl 10mM ATP，40μl回收的30kb以上的DNA(0.2μg/μl)，2μl末端修补酶混合物(T₄DNA聚合酶和T₄多聚核苷酸激酶)。25℃下放置45分钟进行补平反应，再转移到70℃水浴锅放置10分钟以终止酶反应，用1.0％低熔点琼脂糖凝胶回收补平后的30kb-50kb的DNA片段，回收后的片段凝胶图如图1中泳道4所示。为了使回收片段与文库制备试剂盒中已处理好的具平头末端的载体在T₄DNA连接酶的作用下连接起来，依次在冰上向一个新的灭过菌的微量离心管中加入：12μl无菌水，2μl 10倍快速连接缓冲液(10×Fast-Link Ligation Buffer，购自Epicentre公司的文库制备试剂盒pWEB∷TNC cosmid cloning kit(目录号WEBC931)的一个组分)，1μl 10mM ATP，1μl pWEB∷TNC载体(0.5μg)，3μl低熔点琼脂糖凝胶回收的25kb-45kb的DNA(0.1μg/μl)，1μl快速连接DNA连接酶(Fast-LinkDNA Ligase，2单位/μl，购自Epicentre公司的文库制备试剂盒pWEB∷TNC cosmidcloning kit(目录号WEBC931)的一个组分))，混匀后在25℃下放置2个小时，再在70℃放置10分钟以终止酶反应。

为了将连接反应产物用λ包装蛋白包装，将在冰上刚刚溶化的λ包装提取物(购自Epicentre公司的文库制备试剂盒pWEB∷TNC cosmid cloning kit(目录号WEBC931)的一个组分)25μl立即转移到一个新的灭过菌的微量离心管中并快速置于冰上，再往其中加入10μl连接反应产物，充分混匀后置于30℃90分钟后，再往其中加入25μl溶化的λ包装提取物(购自Epicentre公司的文库制备试剂盒pWEB∷TNC cosmidcloning kit(目录号WEBC931)的一个组分)，充分混匀后置于30℃90分钟，向其中加入500μl噬菌体稀释缓冲液(10mM Tris-HCl[pH 8.3]，100mM NaCl，10mM MgCl₂)，再将该560μl包装反应产物加入到5.6mL的OD₆₀₀＝1.0的宿主大肠杆菌EPI 100培养液(培养基为LB[每升含胰蛋白胨(Oxoid)，10g；酵母浸出粉(Difco)，3g；NaCl，3g；pH7.0]+10mM MgSO₄)中，25℃下放置20分钟让上述得到的包装的λ噬菌体吸附和侵染宿主细胞E.coli EPI100，在含氨苄青霉素(100μg/mL)的LA平板(上述LB培养基加上1.5％的琼脂粉)上筛选转化子。结果共获得约32500个转化子，任意提取14个克隆的质粒DNA，限制性内切酶BamHI酶切后用0.7％琼脂糖凝胶进行电泳分析，结果所有质粒除都有一个5.8kb的载体片段外，都含有插入片段，且没有发现有两个质粒具有相同的酶切带型，酶切结果如图2所示，其中泳道1为λDNA用EcoRI酶切片段(片段大小从大到小依次为：21.2kb，7.4kb，5.8kb，5.6kb，4.9kb，3.5kb)；泳道2为1kb ladder(片段大小从大到小依次为：10.0kb，8.0kb，6.0kb，5.0kb，4.0kb，3.5kb，3.0kb，2.5kb，2.0kb，1.5kb)；其它泳道分别为使用限制性内切酶BamHI酶切的14个文库克隆质粒。结果表明文库含有非常随机的插入DNA片段，插入片段最大的为42.9kb，最小的为27.0kb，平均大小为35.1kb。文库的总容量为1.14×10⁹bp，文库的质量相当好。

二、从宏基因组文库中筛选表达β-葡萄糖苷酶活性的克隆

用平板影印法将文库原始平板上的克隆(每平板约200个菌落左右)影印到含氨苄青霉素(100μg/mL)、0.1％七叶苷(esculin hydrate)和0.2％柠檬酸铁铵(ferricammonium citrate)的活性LA平板上，将平板置于37℃培养箱培养24小时后，菌落周围出现黑色水解圈的为表达β-葡萄糖苷酶活性的阳性克隆，其中一个阳性克隆黑色水解圈如图3所示。将其中一个阳性克隆，进一步提取质粒DNA并将其命名为pRG2，用限制性内切酶BamHI完全酶切pRG2后，进行电泳分析，结果如图4所示，表明pRG2除有一个5.8kb的载体片段外，还有另外4条BanHI片段，大小约为18kb、8.5kb、1.7kb和1.2kb，说明pRG2含有29.4kb的插入片段，图4中，泳道1为λ用EcoRI酶切后的片段(片段大小从大到小依次为：21.2kb，7.4kb，5.8kb，5.6kb，4.9kb，3.5kb)；泳道2为1kb ladder(片段大小从大到小依次为：10.0kb，8.0kb，6.0kb，5.0kb，4.0kb，3.5kb，3.0kb，2.5kb，2.0kb，1.5kb)；泳道3为pRG2用BamHI酶切的片段。用pRG2质粒DNA和空载体pWEB∷TNC分别转化E.coliEPI100，在活性LA平板上验证转化子，部分结果如图5所示，结果所有空载体pWEB∷TNC的转化子都没有水解圈，所有pRG2的转化子周围都有黑色水解圈，从而证明重组质粒pRG2的插入片段上确实含有葡萄糖苷酶基因，图5中，pRG2的转化子有β-葡萄糖苷酶活性(右)，而含空载体pWEB∷TNC的大肠杆菌没有β-葡萄糖苷酶活性(左)。

为了测定重组质粒pRG2上纤维素酶基因的DNA序列，采用亚克隆的方法对pRG2上的β-葡萄糖苷酶基因进行定位。先用限制性BamHI酶切pRG2，把酶切的产物抽提沉淀，然后使用T₄DNA ligase(购自Promega公司)连接，连接产物转化E.coliEPI100，在含氨苄青霉素(100μg/mL)、0.1％七叶苷和0.2％柠檬酸铁铵的活性LA平板上筛选菌落周围有水解圈的转化子，结果表明含有8.5kb的BamHI酶切外源DNA片段的转化子菌落周围有水解圈，把含有该8.5kb外源片段的质粒命名为pRG2a。然后用EcoRI酶切pRG2a，得到4.5kb、2.2kb和1.8kb的三条EcoRI片段，按上述方法把酶切的产物连接、转化E.coli EPI100、筛选有活性的转化子。提取活性转化子的质粒，进行EcoRI酶切分析，结果发现活性质粒最少含有1.8kb和2.2kb的两条EcoRI片段，把该质粒命名为pRG2b。把两条EcoRI片段分别克隆到载体pGEM-3Zf(+)(购自Promega公司)上，寄送大连宝生物工程公司采用双脱氧核苷酸法对该基因进行双向双链测序。

用软件DNAStar(DNASTAR公司，版本5)对测得的序列进行拼接，用NCBI(NationalCenter for Biotechnology Information，http：//www.ncbi.nlm.nih.gov)上的软件ORF finder在拼接好的序列上找到一个完整的编码β-葡萄糖苷酶的开放读码框，即序列表中SEQ ID №：1的DNA序列，该基因被命名为umbgl3B。

β-葡萄糖苷酶基因umbgl3B编码一个含854个氨基酸的蛋白质Umbgl3B，用DNAStar软件预测该蛋白质的理论分子量大小为92713.83道尔顿，等电点pI为4.31。

用SMART(http：//smart.embl-heidelberg.de)分析了β-葡萄糖苷酶Umbgl3B的组件结构。该蛋白质由854个氨基酸组成，自N端的第31-305位氨基酸为糖基水解酶家族3C端功能域(glycosyl hydrolase 3C terminal domain)，第545-807位氨基酸为糖基水解酶家族3催化功能域(glycosyl hydrolase 3domain)。和Umbgl3B同源性最高的是来源于溶纤维丁酸弧菌H17c的β-葡萄糖苷酶A(Genbank登录号M31120)，它们的氨基酸序列相似性为50％、一致性为35％。

实施例2、umbgl3B的表达

1、umbgl3B的开放阅读框(open reading frame，ORF)及蛋白质结构预测

用NCBI(http：//www.ncbi.nlm.nih.gov)上的软件ORF finder在已测序并拼接好的序列上找到一个完整的编码β-葡萄糖苷酶的开放读码框(序列表中的SEQ ID№：1)，命名为umbgl3B。该读码框全长2565bp，编码一个含854个氨基酸的属于糖基水解酶家族3的β-葡萄糖苷酶。用SMART(http：//smart.embl-heidelberg.de)分析该酶的蛋白质结构组件，结果表明该酶含有糖基水解酶家族3C端功能域和糖基水解酶家族3催化功能域，不含信号肽或跨膜功能域。

2、umbgl3B基因的PCR扩增

为了在pET系统中表达umbgl3B，需扩增umbgl3B基因除了起始密码子和终止密码子以外的全部序列。设计以下引物，在正向引物RG2F1和反向引物RG2R1的5’端的分别加上NdeI和BamHI酶切位点(RG2F1和RG2R1中带下划线的字母)。

RG2F 1：5’-GAC CATATGCGTTCTTTGGCGGGGGAGTG-3’

RG2R 1：5’-GCT GGATCCCAGGCTTCCGTGTCGCACAAAACC-3’

用质粒pRG2b作模板，以RG2F1和RG2R1为正、反向引物作PCR扩增反应。反应体系为：模板：l0ng，1μl正向引物(10pmol/μl)，1μl反向引物(10pmol/μl)，dNTP：0.25mM，pfu buffer 2.5μl，pfu polymerase：0.4unit(购自MBI公司)，加ddH₂O至25μl。PCR反应程序为：第一阶段预变性95℃，5min；第二阶段变性95℃，30sec；退火45℃，30sec；延伸72℃，3min，共30个循环。第三阶段延伸，72℃延伸10分钟。PCR反应特异地扩增出一条2579bp的DNA片段，结果如图6。其中泳道1为1kb ladder(片段大小从大到小依次为：10.0kb，8.0kb，6.0kb，5.0kb，4.0kb，3.5kb，3.0kb，2.5kb，2.0kb，1.5kb)；泳道2为PCR扩增出的一条2579bp的DNA片段。

3.重组表达质粒的构建

PCR产物用电洗脱法回收后经NdeI和BamHI分别酶切，然后再用电洗脱法回收双酶切后的约2.5kb的DNA片段。载体pET-30a(+)(购自Novagen公司)同样经NdeI和BamHI分别酶切，用电洗脱法回收5.4kb的DNA片段。用T₄DNA连接酶将上述的PCR片段和载体片段相连，用连接产物转化克隆宿主E.coli EPI100。提取转化子的质粒，用NdeI和BamHI酶切分析，选择具有5.4kb和2.5kb两条片段的重组表达质粒(命名为pET30RG2)转化表达宿主BL21(DE3)pLysS(购自Novagen公司)。

重组表达质粒pET30RG2所编码的蛋白是在Umbgl3B的C末端增加了6个组氨酸标记的融合蛋白，其分子量为95.36KDa，等电点pI为4.46。

5.umbgl3B基因在大肠杆菌中的表达

把含有重组表达质粒pET30RG2的表达宿主BL21(DE3)pLysS接种在含有0.1％七叶苷、0.2％柠檬酸铁铵、34μg/mL氯霉素和25μg/ml卡那霉素活性LA平板上，同时接种只含空载体pET-30a(+)的宿主菌BL21(DE3)pLysS作为对照，37℃培养12小时后，两种菌落上分别点加10μl 1.0mM的IPTG，诱导外源蛋白的表达。继续在37℃下培养6小时，菌体经氯仿熏蒸破壁后再经37℃培养1小时，可以看到含有重组表达质粒的宿主菌落周围有黑色水解圈，而对照菌落周围无水解圈，结果见附图7：含有重组表达质粒pET30RG2的表达宿主BL21(DE3)pLysS有β-葡萄糖苷酶活性(右)，而含空载体pET-30a(+)的大肠杆菌BL21(DE3)pLysS没有β-葡萄糖苷酶活性(左)。说明umbgl3B基因在E.coli中已经表达出了具有β-葡萄糖苷酶活性的蛋白质产物。

                           序列表

<160>2

<210>1

<211>2565

<212>DNA

<213>未知

<220>

<223>

<400>1

atggagaagt attttgcatc cacctctgat gaaatcaccg cgacggaaac agcccatgga     60

aatctttccc gttctttggc gggggagtgt gtcgttcttt tagagaacaa cggcgcgctg    120

ccgatcccgc ctgacggaag gatagcgctg tttggcaatg gcgcccgaaa caccgtcaaa    180

ggcggtacgg gttcgggcga cgtgaacacg cgcaccaata tcaccatcga gcagggcctt    240

attgaggctg gctataccat cgtcaccact gattggcttg accgtaatca aaagatctac    300

gacgatgccc gacgctacta tatcgaagag tatcttcccc aaaaggctgc tgaagatggc    360

atccccgagt ttttggtcgc cttcaatgag ccgtttttgg gcgtcgaccc cttggagatc    420

accgaggacg acatttccga cacccatacc gacacggcta tctatgtgat ttcccgcaat    480

tccggcgaag ggagcgaccg tcgcaacgtg cgtggcgact atcagctatt cgaacaggaa    540

cgggaatcca ttgaagtgct ggcccacagc ttttcaaagc ttatcgtggt tttgaacgtg    600

ggcggcgtta tcgacatgag tgaactgaag gccatccatg ggatcgatgc cattttgctc    660

atgagccagc tgggcaatat cagcgggcag gttttggccg acgtgctgtc gggcaaggtg    720

aacccttcgg gcaagctgac cgacacctgg gcgaaaagct atagcgatta tccctcgtcg    780

gcgacgtttt catctaatga cggcgacgtg aacgacgagt actacaccga gggcattttc    840

gtcgggtatc gctacttcga cacctttggc gtcgagccca tctatccttt cggctatggc    900

aagtcttaca ccacgttcga cattctgctc gatggggcgg aactggtcga cttgatcggc    960

gtcaaggtga acgtgaccgt ggtcaacacc ggaagcgtag ccggcaaaga ggtcgtgcag   1020

gtgtactatt cggcaccggc gggaaagctc cccaagcctt atcaggaact cataaccttc   1080

gctaaaaccg acgaattgga acccggtcaa agccagaaac tggaactgtt cttcgatgcc   1140

cgcgatatgg cttcttactg cgaagaatgc gcttcgtggg tgcttgagcc cggcgattac    1200

tacatccgtg tgggtgctca ttcccgcgcc acctatgtag ccgccgtcat cacgctggat    1260

gaaaaggcga agacggccca gctcaagaac ctgtttgcgc tcgatgagcc gatggatgaa    1320

atcaagcgtc cggctgctac cttagaagcg attcccgaag aagtgcccca gctgttcttg    1380

aaggcagccg atattccctg cgagactgcc gaatatcagg gtgttcgcac cgaactttcc    1440

accgacgcag ccgcagacct gaccgttgac gacatcaagg cgggcaacgc cagtgttgaa    1500

gacttggtgg cccagctcac cgtggaagag ctcgccgatt attgcgtcgg taccctgcgt    1560

gccgagggtg gctctatcgt gggcaatgct tcccataccg taccgggagc tgcgggcgat    1620

acgtcttccg tctgcaagga aagccgcggt atcaagaatc tggtgctggc cgatggcccc    1680

gccggattgc gcttgcaacc ggtattcaag accgatttgg aaggcaatct gcttcccggc    1740

ggtgccatac tgggcgattc ctatgaacct ttcgacccgg cgctggatga ctccaattct    1800

attacctatt accagtattg caccgctatc cccatcggct gggctctggc ccaagcttgg    1860

aacccggctt tgctcgagca ggtgggctcc atggtaggcg aggaaatggt gcagttcggc    1920

gttgacattt ggttggctcc cgccttgaac atccatcgca acccgctttg cgggcgcaat    1980

ttcgaatact attccgaaga tccgctggtg ggaggccttg cggctgcggc tatcacgcgg    2040

ggcgtccaaa gccatgaggg caagggcacc tgcatcaagc atttcgccgt caacaaccaa    2100

gaaaacaatc ggtatttcac gaattcccat atcagtgagc gggctatgcg cgaaatctat    2160

tgcaaaggct tcgagatcgc catcaagcag agccaacctc tttcgatcat gaccagctat    2220

aacctgatca acggcacgca cacggcaaat tatcacgacc tgcttcaggg cgtggcgcgc    2280

gatgagtgcg ggttcgccgg attcatcatg accgactggt tcacgtctca ggaccaacct    2340

gcatttaccg gtggctccac caagtatccc atcagcgctt cgaccggctg cgtttacgcc    2400

ggcaacgaca atcagcagcc cggctgcttg aagaacgtca ccgacctcat tgaagccgtt    2460

gaaagcgggg aagagaagga tggatttacc atcaccaaag ccgacctgca attctgcgcg    2520

gctaacgtca ttcgcatagc ggttttgtgc gacacggaag cctga                    2565

<210>2

<211>854

<212>PRT

<213>未知

<220>

<223>

<400>2

Met Glu Lys Tyr Phe Ala Ser Thr Ser Asp Glu Ile Thr Ala Thr Glu

1               5                   10                  15

Thr Ala His Gly Asn Leu Ser Arg Ser Leu Ala Gly Glu Cys Val Val

            20                  25                  30

Leu Leu Glu Asn Asn Gly Ala Leu Pro Ile Pro Pro Asp Gly Arg Ile

        35                  40                  45

Ala Leu Phe Gly Asn Gly Ala Arg Asn Thr Val Lys Gly Gly Thr Gly

    50                  55                  60

Ser Gly Asp Val Asn Thr Arg Thr Asn Ile Thr Ile Glu Gln Gly Leu

65                  70                  75                  80

Ile Glu Ala Gly Tyr Thr Ile Val Thr Thr Asp Trp Leu Asp Arg Asn

                85                  90                  95

Gln Lys Ile Tyr Asp Asp Ala Arg Arg Tyr Tyr Ile Glu Glu Tyr Leu

            100                 105                 110

Pro Gln Lys Ala Ala Glu Asp Gly Ile Pro Glu Phe Leu Val Ala Phe

        115                 120                 125

Asn Glu Pro Phe Leu Gly Val Asp Pro Leu Glu Ile Thr Glu Asp Asp

    130                 135                 140

Ile Ser Asp Thr His Thr Asp Thr Ala Ile Tyr Val Ile Ser Arg Asn

145                 150                 155                 160

Ser Gly Glu Gly Ser Asp Arg Arg Asn Val Arg Gly Asp Tyr Gln Leu

                165                 170                 175

Phe Glu Gln Glu Arg Glu Ser Ile Glu Val Leu Ala His Ser Phe Ser

            180                 185                 190

Lys Leu Ile Val Val Leu Asn Val Gly Gly Val Ile Asp Met Ser Glu

        195                 200                 205

Leu Lys Ala Ile His Gly Ile Asp Ala Ile Leu Leu Met Ser Gln Leu

    210                 215                 220

Gly Asn Ile Ser Gly Gln Val Leu Ala Asp Val Leu Ser Gly Lys Val

225                 230                 235                 240

Asn Pro Ser Gly Lys Leu Thr Asp Thr Trp Ala Lys Ser Tyr Ser Asp

                245                 250                 255

Tyr Pro Ser Ser Ala Thr Phe Ser Ser Asn Asp Gly Asp Val Asn Asp

            260                 265                 270

Glu Tyr Tyr Thr Glu Gly Ile Phe Val Gly Tyr Arg Tyr Phe Asp Thr

        275                 280                 285

Phe Gly Val Glu Pro Ile Tyr Pro Phe Gly Tyr Gly Lys Ser Tyr Thr

    290                 295                 300

Thr Phe Asp Ile Leu Leu Asp Gly Ala Glu Leu Val Asp Leu Ile Gly

305                 310                 315                 320

Val Lys Val Asn Val Thr Val Val Asn Thr Gly Ser Val Ala Gly Lys

                325                 330                 335

Glu Val Val Gln Val Tyr Tyr Ser Ala Pro Ala Gly Lys Leu Pro Lys

            340                 345                 350

Pro Tyr Gln Glu Leu Ile Thr Phe Ala Lys Thr Asp Glu Leu Glu Pro

        355                 360                 365

Gly Gln Ser Gln Lys Leu Glu Leu Phe Phe Asp Ala Arg Asp Met Ala

    370                 375                 380

Ser Tyr Cys Glu Glu Cys Ala Ser Trp Val Leu Glu Pro Gly Asp Tyr

385                 390                 395                 400

Tyr Ile Arg Val Gly Ala His Ser Arg Ala Thr Tyr Val Ala Ala Val

                405                 410                 415

Ile Thr Leu Asp Glu Lys Ala Lys Thr Ala Gln Leu Lys Asn Leu Phe

            420                 425                 430

Ala Leu Asp Glu Pro Met Asp Glu Ile Lys Arg Pro Ala Ala Thr Leu

        435                 440                 445

Glu Ala Ile Pro Glu Glu Val Pro Gln Leu Phe Leu Lys Ala Ala Asp

    450                 455                 460

Ile Pro Cys Glu Thr Ala Glu Tyr Gln Gly Val Arg Thr Glu Leu Ser

465                 470                 475                 480

Thr Asp Ala Ala Ala Asp Leu Thr Val Asp AspIle Lys Ala Gly Asn

                485                 490                 495

Ala Ser Val Glu Asp Leu Val Ala Gln Leu Thr Val Glu Glu Leu Ala

            500                 505                 510

Asp Tyr Cys Val Gly Thr Leu Arg Ala Glu Gly Gly Ser Ile Val Gly

        515                 520                 525

Asn Ala Ser His Thr Val Pro Gly Ala Ala Gly Asp Thr Ser Ser Val

    530                 535                 540

Cys Lys Glu Ser Arg Gly Ile Lys Asn Leu Val Leu Ala Asp Gly Pro

545                 550                 555                 560

Ala Gly Leu Arg Leu Gln Pro Val Phe Lys Thr Asp Leu Glu Gly Asn

                565                 570                 575

Leu Leu Pro Gly Gly Ala Ile Leu Gly Asp Ser Tyr Glu Pro Phe Asp

            580                 585                 590

Pro Ala Leu Asp Asp Ser Asn Ser Ile Thr Tyr Tyr Gln Tyr Cys Thr

        595                 600                 605

Ala Ile Pro Ile Gly Trp Ala Leu Ala Gln Ala Trp Asn Pro Ala Leu

    610                 615                 620

Leu Glu Gln Val Gly Ser Met Val Gly Glu Glu Met Val Gln Phe Gly

625                 630                 635                 640

Val Asp Ile Trp Leu Ala Pro Ala Leu Asn Ile His Arg Asn Pro Leu

                645                 650                 655

Cys Gly Arg Asn Phe Glu Tyr Tyr Ser Glu Asp Pro Leu Val Gly Gly

            660                 665                 670

Leu Ala Ala Ala Ala Ile Thr Arg Gly Val Gln Ser His Glu Gly Lys

        675                 680                 685

Gly Thr Cys Ile Lys His Phe Ala Val Asn Asn Gln Glu Asn Asn Arg

    690                 695                 700

Tyr Phe Thr Asn Ser His Ile Ser Glu Arg Ala Met Arg Glu Ile Tyr

705                 710                 715                 720

Cys Lys Gly Phe Glu Ile Ala Ile Lys Gln Ser Gln Pro Leu Ser Ile

                725                 730                 735

Met Thr Ser Tyr Asn Leu Ile Asn Gly Thr His Thr Ala Asn Tyr His

            740                 745                 750

Asp Leu Leu Gln Gly Val Ala Arg Asp Glu Cys Gly Phe Ala Gly Phe

        755                 760                 765

Ile Met Thr Asp Trp Phe Thr Ser Gln Asp Gln Pro Ala Phe Thr Gly

    770                 775                 780

Gly Ser Thr Lys Tyr Pro Ile Ser Ala Ser Thr Gly Cys Val Tyr Ala

785                 790                 795                 800

Gly Asn Asp Asn Gln Gln Pro Gly Cys Leu Lys Asn Val Thr Asp Leu

                805                 810                 815

Ile Glu Ala Val Glu Ser Gly Glu Glu Lys Asp Gly Phe Thr Ile Thr

            820                 825                 830

Lys Ala Asp Leu Gln Phe Cys Ala Ala Asn Val Ile Arg Ile Ala Val

        835                 840                 845

Leu Cys Asp Thr Glu Ala

    850

Claims (9)

1、一种β-葡萄糖苷酶，是具有下述氨基酸残基序列之一的蛋白质：

1)序列表中的SEQ ID №：2；

2)将序列表中SEQ ID №：2的氨基酸残基序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且具有β-葡萄糖苷酶活性的蛋白质。

2、根据权利要求1所述的β-葡萄糖苷酶，其特征在于：所述β-葡萄糖苷酶具有序列表中序列2的氨基酸残基序列。

3、权利要求1或2所述的β-葡萄糖苷酶的编码基因。

4、根据权利要求3所述的编码基因，其特征在于：所述β-葡萄糖苷酶的编码基因具有下述核苷酸序列之-：

1)序列表中SEQ ID №：1的DNA序列；

2)编码序列表中SEQ ID №：2蛋白质序列的多核苷酸；

3)在高严谨条件下可与序列表中SEQ ID №：1限定的DNA序列杂交的核苷酸序列。

5、含有权利要求3或4所述的β-葡萄糖苷酶编码基因的表达载体。

6、含有权利要求3或4所述的β-葡萄糖苷酶编码基因的细胞系。

7、含有权利要求3或4所述的β-葡萄糖苷酶编码基因的宿主菌。

8、权利要求1或2所述的β-葡萄糖苷酶在纤维素降解中的应用。

9、权利要求3或4所述的β-葡萄糖苷酶编码基因在纤维素降解中的应用。

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