CN103409396A - 一种偏好结合非水溶性木聚糖的碳水化合物结合组件cbmdc3-1及其应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种偏好结合非水溶性木聚糖的碳水化合物结合组件CBMDC3-1及其应用。该蛋白为如下（1）或（2）所示：（1）SEQ ID No.2中自N端起第27-160位氨基酸所示的蛋白；（2）将SEQ ID No.2中自N端起第27-160位氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且具有与非水溶性多糖结合能力的蛋白质。本发明的蛋白及其编码DNA能广泛应用在蛋白质纯化和多糖降解中。
Description
技术领域
本发明涉及一种偏好结合非水溶性木聚糖的碳水化合物结合组件CBMDC3-1及其应用。
背景技术
纤维素酶是水解纤维素链的β-1,4糖苷键的酶的总称，根据它们对纤维素水解方式的不同分为三类：内切－β－1,4－葡聚糖酶（endo-β-1,4-glucanase,EC3.2.1.4）、外切－β－1,4－葡聚糖酶（exo-β-1,4-glucanase,又称为纤维二糖水解酶cellobiohydrolase,EC3.2.1.91）和β－葡萄糖苷酶（β-glucosidase,EC3.2.1.21）。这三种酶协同作用能将纤维素转化成葡萄糖（Lynd L R,Weimer P J,vanZyl W H,and Pretorius I S.2002.Microbial cellulose utilization:fundamentalsand biotechnology.Microbiol.Mol.Biol.Rev.66:506-577.）。大部分纤维素酶由一个或几个催化功能域和一个或多个其它的功能域如碳水化合物结合组件（carbohydrate-binding modules,CBMs）组成，两者间由连接肽连接（ShoseyovO,Shani Z,and Levy I.2006.Carbohydrate binding modules:biochemical propertiesand novel applications.Microbiol.Mol.Biol.Rev.70:283-295.）。
第一个碳水化合物结合组件是1986年在瑞氏木霉（Trichoderma reesei）的纤维二糖水解酶Ⅰ中发现的，最初该结构域被命名为纤维素结合功能域（cellulose-binding domain，CBD），以它能识别和吸附纤维素而命名（Van TilbeurghH,Tomme P,Claeyssens M,Bhikhabhai R,and Pettersson G.1986.Limited proteolysisof the cellobiohydrolase I from Trichoderma reesei.FEBS Lett.204:223–227.）。后来发现该结构域不仅能吸附纤维素，还能识别和吸附植物细胞壁其他的多糖成分，包括几丁质、β-1,3-葡聚糖、β-1,3-1,4-葡聚糖、木聚糖、甘露聚糖等，还有些碳水化合结合组件可以结合不可溶的储存多糖，例如淀粉，所以现在将具有这样性质的结构域命名为碳水化合物结合组件。碳水化合物结合组件不仅在纤维素酶中被发现，在其他的酶类或蛋白中也有发现，如糖基水解酶、酯酶、果胶酶等。
碳水化合物结合组件一般位于酶的氨基端或羧基端，其大小通常大于30个氨基酸及小于250个氨基酸，所以其分子量一般大于4k道尔顿和小于40k道尔顿。根据氨基酸序列相似性，碳水化合物结合组件被划分成不同的家族（families）。根据Cazy服务器（server）(http://afmb.cnrs-mrs.fr/CAZY/)上所列碳水化合物结合组件的最新清单，目前碳水化合物结合组件被分为67个家族。随着新的酶的发现，同时伴随着新的家族的碳水化合物结合组件被发现，一系列未知功能的结构域已经被鉴定为新的碳水化合物结合组件（Bolam D N,Xie H,Pell G,Hogg D，Galbraith G,Henrissat B,andGilbert H J.2004.X4modules represent a new family of carbohydrate-bindingmodules that display novel properties.J.Biol.Chem.279:22953-22963；DvortsovI.A,Lunina N A,Chekanovskaya L A,Schwarz W H,Zverlov V V,and VelikodvorskayaG A.2009.Carbohydrate-binding properties of a separately folding proteinmodule from beta-1,3-glucanase Lic16A of Clostridium thermocellum.Microbiology.155:2442-2449.）。
碳水化合物结合组件的主要功能是识别和吸附多糖，它通过增加底物表面酶的浓度提高酶对可溶或不可溶底物的活性（Beguin P,and Aubert J P.1994.The biologicaldegradation of cellulose.FEMS Microbiol.Rev.13:25-58;Shoseyov O,Shani Z,andLevy I.2006.Carbohydrate binding modules:biochemical properties and novelapplications.Microbiol.Mol.Biol.Rev.70:283–295.）。另外碳水化合物结合组件还有其他的一些功能，如有些可以破坏底物的结构，使晶体结构变得松散，有利于酶更好的作用底物（Levy I,Shani Z,and Shoseyov O.2002.Modification ofpolysaccharides and plant cell wall by endo-1,4-beta-glucanase andcellulose-binding domains.Biomol.Eng.19:17-30；Giardina T,Gunning A P,JugeN,Faulds C B,Furniss C S,Svensson B,Morris V J,and Williamson G.2001.Bothbinding sites of the starch-binding domain of Aspergillus niger glucoamylaseare essential for inducing a conformational change in amylose.J.Mol.Biol.313:1149-1159.），有些碳水化合物结合组件可以增强酶对温度和pH的稳定性（SunnaA,Gibbs M D,and Bergquist P L.2000.A novel thermostable multidomain1,4-beta-xylanase from Caldibacillus cellulovorans and effect of itsxylan-binding domain on enzyme activity.Microbiology.146:2947-2955.）。近来还发现家族35和37的碳水化合物结合组件还能结合到细菌细胞的表面，介导携带该组件的酶结合到宿主的表面（Montanier C,van Bueren A L,Dumon C,Flint J E,CorreiaM A,Prates J A,Firbank S J,Lewis R J,Grondin G G,Ghinet M G,Gloster T M,HerveC,Knox J P,Talbot B G,Turkenburg J P,Kerovuo J,Brzezinski R,Fontes C M,DaviesG J,Boraston A B,and Gilbert H J.2009.Evidence that family35carbohydratebinding modules display conserved specificity but divergent function.Proc.Natl.Acad.Sci.USA.106:3065-3070;Ezer A,Matalon E,Jindou S,Borovok I,AtamnaN,Yu Z,Morrison M,Bayer EA,and Lamed R.2008.Cell surface enzyme attachment ismediated by family37carbohydrate-binding modules,unique to Ruminococcusalbus.J.Bacteriol.190:8220-8222.）。
自然界大部分的微生物在实验室的条件下是不容易被分离和培养的，一般认为可培养的微生物种类只占自然界中微生物种类的约1％（Amann R I,Ludwig W,andSchleifer K H.1995.Phylogenetic identification and in situ detection ofindividual microbial cells without cultivation.Microbiol.Rev.59:143-169;Cardenas E,and Tiedje J M.2008.New tools for discovering and characterizingmicrobial diversity.Curr.Opin.Biotech.19:544–549.），剩余的约99％的不可培养的微生物中蕴藏着大量的基因资源。近年来从环境样品未培养微生物中提取基因组DNA,然后构建混合基因组DNA文库分离基因已是成熟技术（Lorenz P,and Eck J.2005.Metagenomics and industrial applications.Nat.Rev.Microbiol.3:510-516.）。宏基因组学方法已经被广泛地应用到从各种环境样品的未培养微生物中挖掘新的具有生物催化活性的酶的基因，现在已经从未培养微生物中鉴定了很多新酶的基因，包括编码一些新家族的水解酶类的基因，说明宏基因组学方法是得到新基因的好方法。
反刍动物的瘤胃是自然界中纤维素降解最剧烈的主要场所之一，植物的纤维素类物质是被瘤胃中共生的纤维素降解微生物降解的。瘤胃微生物包括有真菌、细菌、原生动物和古细菌。目前研究认为瘤胃中有85%的微生物是未培养的（Krause D O,DenmanS E,Mackie R I,Morrison M,Rae A L,Attwood G T,and McSweeney C S.2003.Opportunities to improve fiber degradation in the rumen:microbiology,ecology,and genomics.FEMS Microbiol Rev.27:663-693.），可以推测这些未培养微生物中一定含有大量的新基因资源。
目前从未培养微生物中克隆和鉴定的新CBM不多，只是在奶牛粪便的宏基因组中鉴定了一个新的CBM59家族（Li R,Kibblewhite R,Orts WJ and Lee CC.2009.Molecularcloning and characterization of multidomain xylanase from manure library.World J Microbiol Biotechnol.25:2071–2078.）以及从水牛瘤胃内溶物的宏基因组中鉴定了一个具有广泛底物结合能力的新CBM（Duan C J,Liu J L,Wu X,Tang JL,and Feng J X.2010.Novel carbohydrate-binding module identified in aruminal metagenomic endoglucanase.Appl Environ Microbiol.76:4867-4870.）。
发明内容
本发明的目的是提供一种偏好结合非水溶性木聚糖的碳水化合物结合组件CBMDC3-1及其应用。
本发明所提供的一种偏好结合非水溶性木聚糖的碳水化合物结合组件CBMDC3-1由如下（1）或（2）所示：
（1）SEQ ID No.2中自N端起第27-160位氨基酸所示的蛋白；
（2）将SEQ ID No.2中自N端起第27-160位氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且具有与非水溶性多糖结合能力的蛋白质。
上述蛋白的编码基因也属于本发明的保护范围。
上述编码基因为如下中至少一种：
1）SEQ ID No.1中自5’末端起第309位至710位核苷酸所示的DNA分子；
2）在严格条件下与1）限定的DNA分子杂交且编码SEQ ID No.2所示蛋白质的DNA分子；
3）与1）或2）限定的DNA分子具有90％以上的同一性且编码SEQ ID No.2所示蛋白质的DNA分子。
含有上述任一编码基因的重组载体、表达盒、转基因细胞系或重组菌也属于本发明的保护范围。
上述蛋白在作为碳水化合物结合组件中的应用也属于本发明的保护范围。
上述应用中，所述碳水化合物结合组件为结合非水溶性多糖但不结合水溶性多糖的碳水化合物结合组件。
上述蛋白在结合非水溶性多糖中的应用也属于本发明的保护范围。
上述蛋白在制备具有结合非水溶性多糖但不结合水溶性多糖的功能的产品的中的应用也属于本发明的保护范围。
上述蛋白或上述编码基因在多糖降解或蛋白质纯化中的应用也属于本发明的保护范围。
上述应用中，所述非水溶性多糖为非水溶性木聚糖、非水溶性甘露聚糖、地衣多糖或生木薯粉。
所述水溶性多糖为如下中至少一种：羧甲基纤维素、羟乙基纤维素、大麦葡聚糖、甲基纤维素、水溶性桦木木聚糖、昆布多糖、水溶性淀粉、水溶性甘露聚糖、去分支的阿拉伯糖、半乳聚糖、果胶半乳聚糖或普鲁兰多糖。
所述非水溶性木聚糖具体为非水溶性桦木木聚糖或山毛榉木聚糖。
上述应用中，所述结合在pH值为3.5-6.0的条件下进行；所述pH值具体为3.5-4.5，再具体为3.5。
上述应用中，所述结合在非水溶性多糖的浓度为1%-4%的条件下进行。
所述非水溶性多糖的浓度具体可为1%或4%。
实验证明，本发明的蛋白CBMDC3-1具有偏好结合非水溶性木聚糖的性质。该蛋白CBMDC3-1及其编码DNA可广泛应用于多糖降解和蛋白质纯化中。
附图说明
图1为DC3-1、rDC3-1、rDC3-1CM及CBMDC3-1的结构序列比较。
图2为重组质粒pET-CBMDC3-1、pET-rDC3-1和pET-rDC3-1CM的PCR电泳图。
图3为纯化的rDC3-1、rDC3-1CM与CBMDC3-1的电泳图。
图4为CBMDC3-1对非水溶性多糖的结合能力的电泳检测结果。
图5为CBMDC3-1对水溶性多糖（大麦葡聚糖）的结合能力的电泳检测结果。
具体实施方式
以下的实施例便于更好地理解本发明，但并不限定本发明。下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的试验材料，如无特殊说明，均为自常规生化试剂商店购买得到的。下述实施例中的%，如无特殊说明，均为质量百分含量。以下实施例中的定量试验，均设置三次重复实验，结果取平均值。
下述实施例中使用的实验材料及其来源如下：
本说明书中所说的“水溶性”均指能溶于水，“非水溶性”均指不能溶于水。
羧甲基纤维素（Carboxymethyl cellulose，CMC）；
结晶纤维素（Avicel）；
几丁质（Chitin）；
地衣多糖（Lichenan）；
大麦葡聚糖（barley-glucan）；
甲基纤维素(methylcellulose)；
羟乙基纤维素（hydroxyethyl cellulose）；
桦木木聚糖（birchwood xylan）；
山毛榉木聚糖（beechwood xylan）；
甘露聚糖（mannan）；
昆布多糖（laminarin）；
以上试剂均购自SIGMA公司。
琼脂糖购自Ameresco公司；
水溶性淀粉购自国药集团化学试剂有限公司；
去分支的阿拉伯糖购自Megazyme公司；
半乳聚糖购自Megazyme公司；
果胶半乳聚糖购自Megazyme公司；
普鲁兰多糖购自Megazyme公司；
半乳聚糖是果胶半乳聚糖经阿拉伯呋喃糖苷酶处理后的产物，分子组成是Gal:Ara:Rha:GalUA=88:2:3:7，而果胶半乳聚糖的分子组成是Gal:Ara:Rha:GalUA=78:9:4:9；
pET-30a(+)购自Novagen公司；
E.coli RosettaTM(DE3)购自Novagen公司。
一、酸膨胀的结晶纤维素按照以下方法制备而成：
（一）将10克结晶纤维素悬浮在85%的H3PO4中，4℃不时搅拌1小时。
（二）将混合物倒入4L冰冷的水中，放置30min。
（三）先用预冷的水洗涤步骤（二）的产物3次，然后用1%的NaHCO3水溶液洗涤3次，再用预冷的水洗涤至酸碱平衡。
（四）将步骤（三）的产物储存在5mM NaN3溶液中，4℃保存。
二、非水溶性桦木木聚糖、非水溶性甘露聚糖和水溶性桦木木聚糖、水溶性甘露聚糖按照以下方法制备而成：
（一）取10g待分离的桦木木聚糖、3g待分离的甘露聚糖分别浸泡在200ml去离子水中，用转子搅拌1h，于4℃，8000rpm离心10min，分别保留上清和沉淀。
（二）用去离子水洗涤沉淀两次，于4℃，8000rpm离心10min，弃上清，取沉淀。
（三）把步骤（一）保留的两种上清和步骤（二）的两种沉淀分别进行低温冷冻干燥后，即制成水溶性和非水溶性的目标多糖，即非水溶性桦木木聚糖(insolublebirch wood xylan)、水溶性桦木木聚糖(soluble birch wood xylan)、非水溶性甘露聚糖(insoluble mannan)和水溶性甘露聚糖(soluble mannan)。
三、生木薯粉按照以下方法制备而成：
木薯原材料从中国广西南宁市本地市场购买得到，粉碎后过80目筛，分装至药品瓶中，密封后送广西南翔环保有限公司辐照中心Co60辐射灭菌，得到生木薯粉。
实施例1、重组质粒的构建和重组蛋白的表达纯化
一、DNA片段的制备
（一）rDC3-1的制备
合成序列表中SEQ ID No.1自5′末端第309位至1790位核苷酸所示的DNA，命名为rDC3-1，长度为1482bp。rDC3-1编码SEQ ID No.2所示多肽自氨基末端第27至520位氨基酸残基所示的多肽（由494个氨基酸残基组成），命名为rDC3-1。rDC3-1的预计分子量为54.56196KDa，等电点pI为4.79。
（二）rDC3-1CM的制备
合成序列表中SEQ ID No.1自5′末端第651位至1790位核苷酸所示的DNA，命名为rDC3-1CM,长度为1140bp。rDC3-1CM编码SEQ ID No.2所示多肽自氨基末端第141至520位氨基酸残基所示的多肽（由380个氨基酸残基组成），命名为rDC3-1CM。rDC3-1CM的预计分子量为42.59759KDa，等电点pI为4.86。
（三）CBMDC3-1的制备
合成序列表中SEQ ID No.1自5’末端第309位至710位核苷酸所示DNA，命名为CBMDC3-1,长度为402bp。CBMDC3-1编码SEQ ID No.2所示多肽自氨基末端第27-160位氨基酸所示多肽，该多肽由134个氨基酸残基组成，命名为CBMDC3-1。CBMDC3-1的预计分子量为14.08266KDa，等电点pI为4.49。
（四）DC3-1、rDC3-1、rDC3-1CM与CBMDC3-1的比较
DC3-1、rDC3-1、rDC3-1CM与CBMDC3-1的结构示意图见图1。图1中，SP为信号肽，X为未知功能域，GH5为一个属于糖基水解酶家族5的催化结构域。
DC3-1的氨基酸序列如SEQ ID No.2所示。
二、重组质粒的构建和鉴定
（一）pET-rDC3-1的构建
1、以rDC3-1为模板，用引物1和引物2组成的引物对，上游和下游分别引入NdeI和XhoI酶切位点（引物序列中带下划线的序列为酶切位点），进行PCR扩增，得到PCR产物甲。
引物1：5’-GGTCCATATGACGCCGGTGCAGAATGCCGC-3’
引物2：5’-GTACCTCGAGCAGATAAGGCTTCAAGATAGCATCCTTGG-3’
2、用限制性内切酶NdeI和XhoI双酶切PCR产物甲，回收基因片段。
3、用限制性内切酶NdeI和XhoI双酶切质粒pET-30a(+)，回收载体骨架。
4、将步骤2的基因片段和步骤3的载体骨架连接，得到重组质粒。将重组质粒进行测序验证，结果表明得到了pET-rDC3-1（骨架为pET-30a(+)，在NdeI和XhoI酶切位点之间插入了rDC3-1序列）。
（二）pET-rDC3-1CM的构建
1、以rDC3-1CM为模板，用引物3和引物4组成的引物对，上游和下游分别引入NdeI和XhoI酶切位点（引物序列中带下划线的序列为酶切位点），进行PCR扩增，得到PCR产物乙。
引物3：5’-GGTCCATATGCCGGGAAGCTGGGAGGATGC-3’
引物4：5’-GTACCTCGAGAGATAAGGCTTCAAGATAGCATCCTTGG-3’
2、用限制性内切酶NdeI和XhoI双酶切PCR产物乙，回收基因片段。
3、用限制性内切酶NdeI和XhoI双酶切质粒pET-30a(+)，回收载体骨架。
4、将步骤2的基因片段和步骤3的载体骨架连接，得到重组质粒；将重组质粒进行测序验证，结果表明得到了pET-rDC3-1CM（骨架为pET-30a(+)，在NdeI和XhoI酶切位点之间插入了rDC3-1CM序列）。
（三）pET-CBMDC3-1的构建
1、以CBMDC3-1为模板，用引物5和引物6组成的引物对，上游和下游分别引入EcoRI和XhoI酶切位点（引物序列中带下划线的序列为酶切位点），进行PCR扩增，得到PCR产物丙。
引物5：5’-GGTCGAATTCACGCCGGTGCAGAATGCCGC-3’
引物6：5’-GTACCTCGAGCAGGTTCCAGCCCGTCCCCAT-3’
2、用限制性内切酶EcoRI和XhoI双酶切PCR产物丙，回收基因片段。
3、用限制性内切酶EcoRI和XhoI双酶切质粒pET-30a(+)，回收载体骨架。
4、将步骤2的基因片段和步骤3的载体骨架连接，得到重组质粒；将重组质粒进行测序验证，结果表明得到了pET-CBMDC3-1（骨架为pET-30a(+)，在EcoRI和XhoI酶切位点之间插入了CBMDC3-1序列）。
（四）重组质粒的鉴定
提取pET-rDC3-1、pET-rDC3-1CM和pET-CBMDC3-13个重组质粒，然后分别用引物1和2、引物3和4及引物5和6进行PCR扩增验证是否连上外源片段及片段大小是否正确。
电泳结果如图2所示，泳道1为1kb ladder(片段大小从上到下依次为：10.0kb，8.0kb，6.0kb，5.0kb，4.0kb，3.5kb，3.0kb,2.5kb,2.0kb,1.5kb，1kb，0.75kb，0.5kb,0.25kb)；泳道2-4的样品依次为pET-CBMDC3-1、pET-rDC3-1和pET-rDC3-1CM的PCR扩增产物，大小分别约为400bp、1.5kb和1kb，与预计的大小条带一致。将重组质粒进行测序，发现都含有预计的目的片段。
pET-rDC3-1、pET-rDC3-1CM和pET-CBMDC3-1中，起始密码子和终止密码子由载体pET-30a(+)提供。表达产物的N端有一个由表达载体提供的His标签（6×His Tag），用于以后的目标蛋白的纯化。
三、重组蛋白的表达和纯化
（一）制备重组菌
用pET-rDC3-1转化E.coli RosettaTM(DE3)，得到重组菌RosettaTM(DE3)/pET-rDC3-1。用pET-rDC3-1CM转化E.coli RosettaTM(DE3)，得到重组菌RosettaTM(DE3)/pET-rDC3-1CM。用pET-CBMDC3-1转化E.coli RosettaTM(DE3)，得到重组菌RosettaTM(DE3)/pET-CBMDC3-1。
（二）重组蛋白的表达
分别培养三种重组菌并诱导重组蛋白表达，得到rDC3-1粗酶液、rDC3-1CM粗酶液和CBMDC3-1粗酶液。具体步骤如下：
1、培养和诱导表达
将重组菌分别接种到10ml含有34μg/ml氯霉素与25μg/ml卡那霉素的LB培养液中，37℃、200rpm培养过夜；取5ml过夜培养物接种到100ml含有34μg/ml氯霉素与25μg/ml卡那霉素的LB培养液中，37℃、200rpm培养至OD600为0.6时，加入IPTG至终浓度为1mM，28℃，200rpm继续培养5个小时，5000g离心，收集菌体。
2、制备粗酶液
将收集的菌体加入平衡/洗涤缓冲液（50mM NaH2PO4,300mM NaCl,pH7.0），悬浮菌体，置冰上30分钟。用超声波破碎细胞，400W作用40次，每次作用时间10s，每次作用间隔12s。12000g离心20分钟，收集上清即为粗酶液，分别记作rDC3-1粗酶液、rDC3-1CM粗酶液和CBMDC3-1粗酶液。
（三）重组蛋白的纯化
分别将rDC3-1粗酶液、rDC3-1CM粗酶液和CBMDC3-1粗酶液用Clotech公司的TALONMetal Affinity Resins试剂盒(方法参照试剂盒说明书)进行纯化，得到rDC3-1酶液、rDC3-1CM酶液和CBMDC3-1酶液。具体步骤如下：
1、将试剂盒中TALON树脂完全悬浮，快速吸取1ml的树脂到一个灭菌的50ml的离心管中，离心（700g，2分钟）沉淀树脂，小心取出上清丢弃。
2、在树脂中加10ml的平衡/洗涤缓冲液，轻轻混匀，平衡树脂，离心（700g，2分钟）沉淀树脂，取出上清丢弃。
3、重复步骤2。
4、将粗酶液加入树脂中，在室温轻轻摇动20分钟，使带有多组氨酸标签的目标蛋白和树脂结合，然后离心（700g，5分钟）。
5、仔细取出上清，尽可能不搅动树脂，再加入20ml平衡/洗涤缓冲液于树脂中，轻轻搅动混匀，在室温摇动10分钟后，离心（700g，5分钟），取出上清丢弃。
6、重复步骤5。
7、加1ml的平衡/洗涤缓冲液于树脂中，悬浮树脂，将树脂混合液转移到2ml的柱子中（加底盖），静置让树脂沉淀下来。去掉底盖，让缓冲液流出来，确定在树脂中没有气泡。
8、用2ml的平衡/洗涤缓冲液洗3次。
9、加5ml的洗脱液（50mM NaH2PO4,300mM NaCl,250mM咪唑pH7.0）到柱子中，分管（500μl/管）收集洗脱液（酶液）。将各管收集液都进行SDS-PAGE检测目标蛋白纯度，选择目标蛋白在SDS-PAGE上是单条带纯的作为纯化酶液。
纯化得到的rDC3-1酶液、rDC3-1CM酶液和CBMDC3-1酶液的电泳图见图3。
图3中：1为蛋白质分子量标准（marker）；2为TALON树脂纯化的rDC3-1，大小为54kD；3为TALON树脂纯化的rDC3-1CM，大小为42kD；4为TALON树脂纯化的CBMDC3-1，大小为20kD（CBMDC3-1大小为14kD，翻译时在氨基端带有载体编码的52个氨基酸，大小为6kD，总计为20kD）。经TALON树脂纯化后重组蛋白均已达到SDS-PAGE单条带纯，且条带大小与预期一致。His标签的大小为6个连续的组氨酸，大小为0.6875kD。
实施例2、rDC3-1、rDC3-1CM和CBMDC3-1对多糖的吸附
本实施例中各酶活均按照如下方法检测：
酶活(U)定义为：每分钟催化产生相当于1μmol葡萄糖的还原糖所需的酶量为1个U。
比活力的定义：每μmol蛋白质所含的酶活力（U/μmol）。
采用DNS法检测酶活，具体步骤如下：取10μl待测样品液，加入200μl含1％CMC（羧甲基纤维素）的0.1M柠檬酸-0.2M磷酸氢二钠缓冲液中（pH4.5），50℃反应10分钟，反应结束后加入1ml DNS试剂和290μl双蒸水，置于沸水中水浴5分钟，室温冷却，用酶标仪测A540。根据葡萄糖标准曲线，计算得到酶活。
其中，DNS试剂按照如下方法配制：1、称取10克NaOH用400ml ddH2O溶解；2、称取10克二硝基水杨酸、2克苯酚、0.5克无水亚硫酸钠、200克四水酒石酸钾钠，将其溶解于300ml ddH2O中；3、两种溶液混合，用ddH2O定容到1升，避光保存。
其中，葡萄糖标准曲线的绘制如下：
取9只薄壁试管，按表1配制标准品。混匀后在沸水中反应5分钟，室温冷却，用酶标仪测A540。
表1葡萄糖标准品的配方
用实施例1纯化后的rDC3-1酶液、rDC3-1CM酶液和CBMDC3-1酶液进行以下实验。
一、rDC3-1和rDC3-1CM对非水溶性桦木木聚糖的结合
（一）底物浓度和混合时间对结合的影响
1、分别取2U rDC3-1和rDC3-1CM加入200μl含不同浓度（质量百分比含量为0%，0.5%，1%、2%或4%）的非水溶性桦木木聚糖的pH4.5的0.1M柠檬酸―0.2M磷酸氢二钠缓冲液中，置于冰上1小时或5小时（每隔15分钟轻轻震荡混匀）。
2、10000g离心10分钟，小心将上清液移取到一个新的EP管。
3、每个EP管分别取10μl上清液在pH4.5缓冲液中最适反应温度50℃下测定酶活。
以非水溶性桦木木聚糖质量百分含量为0%为对照，目的是去除酶在测试条件下的沉淀反应,对照条件下的酶活代表多肽（rDC3-1或rDC3-1CM）总量，上清液的酶活力代表未结合到非水溶性桦木木聚糖的多肽（rDC3-1或rDC3-1CM）量。对照的酶活减去上清液的酶活代表结合到非水溶性桦木木聚糖的多肽（rDC3-1或rDC3-1CM）量。因此，根据上清的酶活和对照的酶活可以确定在各个浓度的非水溶性桦木木聚糖条件下，与非水溶性桦木木聚糖结合的多肽占总多肽的比例。结果见表2。
表2显示，rDC3-1能够与非水溶性桦木木聚糖结合，它的结合能力与非水溶性桦木木聚糖的浓度和混合的时间成正比，非水溶性桦木木聚糖浓度越高及混合时间越长，rDC3-1与非水溶性桦木木聚糖结合的越多。而rDC3-1CM在设定条件下都几乎不能结合到非水溶性桦木木聚糖上。这说明rDC3-1含有一个碳水化合物结合组件，而且该碳水化合物结合组件位于rDC3-1的氨基末端，推测为CBMDC3-1。
（二）pH对rDC3-1与非水溶性桦木木聚糖结合的影响
1、取2U rDC3-1加入200μl含1%的非水溶性桦木木聚糖的不同pH值（3.0、3.5、4.0、4.5、5.0、5.5或6.0）的0.1M柠檬酸―0.2M磷酸氢二钠缓冲液中，置于冰上1小时（每隔15分钟轻轻震荡混匀）；
2、10000g离心10分钟，小心将上清液移取到一个新的EP管；
3、每个EP管分别取10μl上清液在pH4.5缓冲液中50℃反应温度下测定酶活。结果见表2。
表2结果显示，rDC3-1在pH为3.0时无结合非水溶性桦木木聚糖的能力，pH3.5的条件下与非水溶性桦木木聚糖结合达到90%以上，而pH的升高会影响rDC3-1与非水溶性桦木木聚糖的结合，pH为5.0及以上时，rDC3-1的结合活性显著下降至20%以下。
表2rDC3-1和rDC3-1CM与非水溶性桦木木聚糖的结合特性
a如果没有特别标明，缓冲液pH为4.5；UD是没有检测到；-代表没有进行测试
二、CBMDC3-1对多糖的吸附
（一）CBMDC3-1对非水溶性多糖的结合
分别检测CBMDC3-1对如下几种非水溶性多糖的结合能力：非水溶性桦木木聚糖、山毛榉木聚糖、非水溶性甘露聚糖、结晶纤维素、酸膨胀的结晶纤维素、几丁质、地衣多糖、琼脂糖和生木薯粉。
1、取30μg CBMDC3-1加入200μl含1%或4%非水溶性多糖的pH3.5的0.1M柠檬酸―0.2M磷酸氢二钠缓冲液中，置于冰上1小时（每隔15分钟轻轻震荡混匀）；
2、10000g离心10分钟；
3、小心将步骤2离心得到的上清液，命名为上清1，移取到一个新的EP管（此部分为未与底物结合的部分CBMDC3-1）；
4、将步骤2离心得到的沉淀加入1ml pH3.5的0.1M柠檬酸―0.2M磷酸氢二钠缓冲液，混匀，10000g离心10分钟，弃上清；
5、重复步骤4一次；
6、向步骤5得到的沉淀中加入100μl含2%SDS水溶液，混匀后37℃水浴30分钟，10000g离心10分钟，得上清液，命名为上清2，移取到一个新的EP管（此部分为与底物结合的CBMDC3-1）。
分别将步骤3得到的上清液1和步骤6得到的上清液2进行SDS-PAGE，结果见图4。
图4中：CK：起始加入的CBMDC3-1；A组：非水溶性桦木木聚糖+CBMDC3-1；B组：山毛榉木聚糖+CBMDC3-1；C组：非水溶性甘露聚糖+CBMDC3-1；D组：地衣多糖+CBMDC3-1；E组：结晶纤维素+CBMDC3-1；F组：酸膨胀的结晶纤维素+CBMDC3-1；G组：琼脂糖+CBMDC3-1；H组：几丁质+CBMDC3-1；I组：生木薯粉+CBMDC3-1。
1：上清液2（与底物结合的蛋白）；2：上清液1（未与底物结合的蛋白）。
Ⅰ：底物浓度为1%；Ⅱ：底物浓度为4%。
图4Ⅰ的结果显示在底物浓度为1%的情况下，CBMDC3-1能结合非水溶性桦木木聚糖、山毛榉木聚糖和生木薯粉。图4Ⅱ的结果显示在底物浓度为4%时，CBMDC3-1除了能结合非水溶性桦木木聚糖、山毛榉木聚糖和生木薯粉外，还能结合非水溶性甘露聚糖和地衣多糖。CBMDC3-1对结晶纤维素、酸膨胀的结晶纤维素、琼脂糖及几丁质在底物低浓度1%和高浓度4%的条件下，均没有明显的结合能力（泳道中显示的微弱的CBMDC3-1条带，是非特异性结合的结果）。
（二）CBMDC3-1对水溶性多糖的结合
分别检测CBMDC3-1对如下几种水溶性多糖的结合能力：羧甲基纤维素、羟乙基纤维素、大麦葡聚糖、甲基纤维素、水溶性桦木木聚糖、昆布多糖（laminarin）、水溶性淀粉、水溶性甘露聚糖、去分支的阿拉伯糖（Debranched Arabinan form Sugar Beet)、半乳聚糖（Galactan from Potato)、果胶半乳聚糖（Pectic Galactan from Potato)、普鲁兰多糖。
通过天然聚丙烯酰胺凝胶电泳（native-PAGE）测试CBMDC3-1对水溶性多糖的结合能力。
1、配制两种PAGE胶，浓缩胶和分离胶分别是5%和10%的丙烯酰胺，其中一种胶的分离胶和浓缩胶中都加入终浓度为0.1%的水溶性多糖，另一种胶的浓缩胶和分离胶均不加水溶性多糖作为对比。配胶所用的溶液均不加SDS，其它条件同普通蛋白电泳。
2、取7.5μg的CBMDC3-1、小牛血清蛋白（阴性对照）及CBMC5614-1（正对照），4℃电泳3小时。
CBMDC3-1对大麦葡聚糖的结合能力的电泳检测结果如图5所示。
图5中，CK：凝胶中未添加大麦葡聚糖；Barley glucan：凝胶中添加了0.1%的大麦葡聚糖；1：CBMC5614-1为正对照（已被证明能结合大麦葡聚糖，参考文献Duan et al.Novel carbohydrate-binding module identified in a ruminal metagenomicendoglucanase.Appl Environ Microbiol.2010.76:4867-70.）；2：BSA（小牛血清蛋白）为负对照；3：CBMDC3-1。
图5表明，正对照CBMC5614-1在含大麦葡聚糖与未添加大麦葡聚糖的凝胶中的电泳距离有显著差别，正对照CBMC5614-1在含有多糖的胶中的电泳由于结合被明显阻滞。而阴性对照小牛血清蛋白在含大麦葡聚糖和未添加大麦葡聚糖的凝胶中电泳距离无变化，同样CBMDC3-1在含大麦葡聚糖与未添加大麦葡聚糖的凝胶中的电泳距离无明显差别，说明CBMDC3-1对大麦葡聚糖无结合功能。
经过实验证明，CBMDC3-1对上述的任一种水溶性多糖均无结合功能。
转入空载体pET-30a(+)的重组菌E.coli RosettaTM(DE3)，IPTG诱导蛋白表达及纯化得到对照蛋白液，进行上述的多糖结合能力实验，结果显示该蛋白液均不能与水溶性多糖和非水溶性多糖结合。
Claims (10)
1.一种蛋白，为如下（1）或（2）所示：
（1）SEQ ID No.2中自N端起第27-160位氨基酸所示的蛋白；
（2）将SEQ ID No.2中自N端起第27-160位氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且具有与非水溶性多糖结合能力的蛋白质。
2.权利要求1所述蛋白的编码基因。
3.根据权利要求2所述的编码基因，其特征在于：所述编码基因为如下中至少一种：
1）SEQ ID No.1中自5’末端起第309位至710位核苷酸所示的DNA分子；
2）在严格条件下与1）限定的DNA分子杂交且编码权利要求1所述蛋白质的DNA分子；
3）与1）或2）限定的DNA分子具有90％以上的同一性且编码权利要求1所述蛋白质的DNA分子。
4.含有权利要求2或3所述编码基因的重组载体、表达盒、转基因细胞系或重组菌。
5.权利要求1所述蛋白在作为碳水化合物结合组件中的应用。
6.根据权利要求5所述的应用，其特征在于：所述碳水化合物结合组件为结合非水溶性多糖但不结合水溶性多糖的碳水化合物结合组件。
7.权利要求1所述蛋白在结合非水溶性多糖中的应用；
或，权利要求1所述蛋白在制备具有结合非水溶性多糖但不结合水溶性多糖的功能的产品的中的应用；
或，权利要求1所述蛋白或权利要求2或3所述编码基因在多糖降解或蛋白质纯化中的应用。
8.根据权利要求5-7任一所述的应用，其特征在于：所述非水溶性多糖为非水溶性木聚糖、非水溶性甘露聚糖、地衣多糖或生木薯粉；
所述水溶性多糖为如下中至少一种：羧甲基纤维素、羟乙基纤维素、大麦葡聚糖、甲基纤维素、水溶性桦木木聚糖、昆布多糖、水溶性淀粉、水溶性甘露聚糖、去分支的阿拉伯糖、半乳聚糖、果胶半乳聚糖或普鲁兰多糖；
所述非水溶性木聚糖具体为非水溶性桦木木聚糖或山毛榉木聚糖。
9.根据权利要求5-8任一所述的应用，其特征在于：所述结合在pH值为3.5-6.0的条件下进行；所述pH值具体为3.5-4.5，再具体为3.5。
10.根据权利要求5-9任一所述的应用，其特征在于：所述结合在非水溶性多糖的浓度为1%-4%的条件下进行。
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| 陈春岚等: "木聚糖酶基因umxyn10B 的克隆与表达研究", 《江西农业大学学报》, vol. 31, no. 4, 31 August 2009 (2009-08-31), pages 711 - 716 * |
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