CN109182360B

CN109182360B - 一种小分子纤维素内切酶基因及其蛋白和应用

Info

Publication number: CN109182360B
Application number: CN201811240264.9A
Authority: CN
Inventors: 李洪波; 胡兴; 江素珍; 张赛名
Original assignee: Huaihua University
Current assignee: HUNAN BUSKY PHARMACEUTICAL Co.,Ltd.
Priority date: 2018-10-23
Filing date: 2018-10-23
Publication date: 2020-06-05
Anticipated expiration: 2038-10-23
Also published as: CN109182360A

Abstract

本发明涉及一种小分子纤维素内切酶基因，所述基因为序列表中SEQ ID NO.1的核苷酸序列所示；或者是与SEQ ID NO.1所示核苷酸序列具有90％以上同源性且编码相同生物学功能蛋白质的序列；或者是能与SEQ ID NO.1所示核苷酸序列杂交且编码相同生物学功能蛋白质的序列。本发明如序列表中SEQ ID NO.1的核苷酸序列可以利用pET32载体和大肠杆菌表达菌株，实现了表达产物与增溶因子Trx的融合，得到大量可溶形式的小分子纤维素内切酶融合蛋白，并通过简单的亲和层析的纯化方法得到高纯度高活性的重组小分子纤维素内切酶，提高纤维素酶的产量和质量，加速纤维素酶的生产和推广应用。

Description

一种小分子纤维素内切酶基因及其蛋白和应用

技术领域

本发明属于生物基因工程技术领域，涉及一种小分子纤维素内切酶基因及其蛋白和应用。

背景技术

纤维素在植物体中的含量最多，约占植物干重的1/2，是自然界数量最大的可再生自然资源，由2000-10000个葡萄糖分子组成的长链大分子。纤维素是自然界中十分丰富的资源，如麻、麦秆、稻草、甘蔗渣等，都是纤维素的丰富来源。地球上每年光合作用可产生大于100亿t的植物干物质，其中一半以上是纤维素和半纤维素。纤维素的聚合度(DP)非常大，约为2000-15000。目前很多学者针对纤维素展开了一系列的研究，目的在于使纤维素能够被人们合理化地利用，为人类社会的可持续发展做贡献。而纤维素的充分利用与纤维素酶的作用息息相关，只有清楚地了解了纤维素酶的作用，才能使纤维素应用于实际所用。

纤维素酶包括多种水解酶，纤维素酶是指能降解纤维素的一类酶的总称。是由多种水解酶组成的复杂酶系，主要来自于真菌和细菌。根据纤维素酶的不同功能，可分为三大类：内切纤维素酶、外切纤维素酶和β-葡萄糖苷酶。还有分解纤维素的其他酶类，如木聚糖酶(Xylase)和果胶酶。纤维素内切酶来自真菌简称EG，来自细菌简称Len，这类酶作用于纤维素内部的非结晶区，随机水解β-1，4-糖苷键，将长链纤维素分子截短，产生大量带非还原性末端的小分子纤维素。葡聚糖内切酶相对分子质量介于23-146KD，如真菌的同工酶EGI为54KD，EGIII约为49.8KD，而纤维粘菌EG有两种菌的内切酶相对分子质量只有6.3KD。

目前，纤维素酶的研究已引起国内外学术界的广泛关注，涉及领域不仅包括饲料行业，还有食品、纺织、生物能源开发等行业。因此，纤维素酶作为一种高效、安全的生物催化剂，它的应用前景是非常广阔的。但是，饲料行业中纤维素酶仍然存在菌种产量低、成本高，易失活，添加量和添加方式不明确等一系列问题。应加强菌种选育和发酵工艺等基础研究工作，以提高其产量和活性，特别是要注意利用DNA基因重组技术的应用，来选育出活性高、产酶量大的菌种。以提高纤维素酶的产量和质量，加速纤维素酶的生产和推广应用，保证其应用效果，创造出更好的经济效益和社会效益。

发明内容

有鉴于此，本发明的目的在于提供一种新小分子纤维素内切酶的基因，目的之二在于提供这种基因所编码的新小分子纤维素内切酶蛋白，以及含有这种基因的重组载体、表达盒、转基因细胞系或重组菌等表达载体，目的之四在于提供一种所述基因编码的新小分子纤维素内切酶的制备方法及其纯化方法。

为达到上述目的，本发明提供如下技术方案：

1.一种新小分子纤维素内切酶的基因，所述基因至少含有下列核苷酸序列之一的DNA片段：

1)序列表中SEQ ID NO.1的核苷酸序列；

2)与SEQ ID NO.1所示核苷酸序列具有90％以上同源性、且编码相同生物学功能蛋白质的核苷酸序列；

3)与SEQ ID NO.1所示核苷酸序列杂交且编码相同生物学功能蛋白质的核苷酸序列。

进一步，与SEQ ID NO.1所示核苷酸序列具有95％以上同源性、且编码相同生物学功能蛋白质的核苷酸序列；

进一步，与SEQ ID NO.1所示核苷酸序列具有96％以上同源性、且编码相同生物学功能蛋白质的核苷酸序列；

进一步，与SEQ ID NO.1所示核苷酸序列具有97％以上同源性、且编码相同生物学功能蛋白质的核苷酸序列；

进一步，与SEQ ID NO.1所示核苷酸序列杂交条件为：50℃，在7％十二烷基硫酸钠(SDS)、0.5M NaPO4和1mM EDTA的混合溶液中杂交，在50℃，2×SSC，0.1％SDS中漂洗；

还可以杂交条件为50℃，在7％SDS、0.5M NaPO4和1mM EDTA的混合溶液中杂交，在50℃，1×SSC，0.1％SDS中漂洗；

还可以杂交条件为50℃，在7％SDS、0.5M NaPO4和1mM EDTA的混合溶液中杂交，在50℃，0.5×SSC，0.1％SDS中漂洗；

还可以杂交条件为50℃，在7％SDS、0.5M NaPO4和1mM EDTA的混合溶液中杂交，在50℃，0.1×SSC，0.1％SDS中漂洗；

还可以杂交条件为50℃，在7％SDS、0.5M NaPO4和1mM EDTA的混合溶液中杂交，在65℃，0.1×SSC，0.1％SDS中漂洗；

还可以杂交条件为在6×SSC，0.5％SDS的溶液中，65℃下杂交，然后用2×SSC，0.1％SDS和1×SSC，0.1％SDS各洗膜一次。

其中SEQ ID NO.1所示核苷酸序列由678个脱氧核苷酸组成，编码序列表中SEQ IDNO.2所示的氨基酸残基序列的蛋白。

1)序列表中SEQ ID NO.1的核苷酸序列；

以上三种任一种基因编码得到的小分子纤维素内切酶属于本发明的保护范围。

进一步，所述小分子纤维素内切酶为如下(1)或(2)的蛋白：

(1)蛋白的氨基酸序列如序列表中SEQ ID NO.2所示；

(2)序列表中SEQ ID NO.2所示的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代、缺失和/或添加且具有纤维素内切酶活性的由SEQ ID NO.2衍生的蛋白质。

序列表中的SEQ ID NO.2由226个氨基酸残基组成，其编码基因的读码框包含678个核苷酸。

所述一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加是指不多于五十个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加。

3.含有上述基因的重组载体、表达盒、转基因细胞系或重组菌。

进一步，所述的重组载体，由空载体和插入该空载体的目的基因组成，其特征在于，所述目的基因为权利要求1所述的基因。

所述目的基因选自以下三种核苷酸序列中的一种：

1)序列表中SEQ ID NO.1的核苷酸序列；

进一步，所述空载体为pET32载体。

进一步，所述重组载体为将上述基因插入表达载体pET32的BamH I和Hind III酶切位点间，得到表达上述蛋白的重组载体。

4.一种小分子纤维素内切酶的制备方法，包括以下步骤：

a.将上述的基因重组到构建到pET32载体中；再转化到大肠杆菌菌株中，得到表达株；

b.将步骤a表达株在LB液体培养基中培养，并加入0.1～0.5mM的IPTG诱导，发酵完毕，超声破碎，离心取上清，得可溶性重组的小分子纤维素内切酶。

进一步，还包括蛋白纯化步骤：用镍亲合层析柱对步骤2)得到的上清液进行纯化，先用平衡缓冲液平衡层析柱，再将上清液过柱，用含10-50mM咪唑的pH 8.0缓冲液预洗柱子，然后用含100mM～400mM咪唑的pH 8.0缓冲液溶液梯度将融合蛋白洗脱下来即可。

进一步，还包括在pH值为6.0～6.5的条件下透析，将透析后的物质超滤浓缩。

根据上述的制备蛋白的方法制备得到的纯化后的蛋白也属于本发明的保护范围。

5.上述技术方案1所述基因、技术方案2或4所述蛋白、技术方案3所述重组载体、表达盒、转基因细胞系或重组菌在生物燃料乙醇的生产、食品、饲养和/或印染领域中的应用。

本发明的有益效果在于：本发明通过改造和测试大量的核苷酸序列发明出如序列表中SEQ ID NO.1的核苷酸序列可以利用pET32载体和大肠杆菌表达菌株，实现了表达产物与增溶因子Trx的融合，并实现了一种小分子纤维素内切酶大量的可溶性表达；进一步简单的通过亲和纯化，即可得到纯度高于95％且浓度较高的活性蛋白。通过本发明所提供的蛋白制备方法得到的小分子纤维素内切酶具有分解纤维素产生葡萄糖的能力。

本发明的附加方面和优点将在下面的描述中部分给出，部分将从下面的描述中变得明显，或通过本发明的实践了解到。

附图说明

为了使本发明的目的、技术方案和有益效果更加清楚，本发明提供如下附图进行说明：

图1为本发明实施例中的pET32/EG载体构建示意图。

图2为本发明实施例中pET32/EG重组载体表达的目标蛋白的SDS-PAGE检测结果图。

图3为本发明实施例中的纯化前后蛋白的SDS-PAGE检测结果图。

图4为本发明实施例中的浓缩后重组蛋白的SDS-PAGE检测结果图。

图5为本发明对比例中的表达总蛋白的SDS-PAGE检测结果图。

图6为本发明实施例中pH对小分子纤维素酶酶活的影响。

图7为本发明实施例中温度对小分子纤维素酶酶活的影响。

具体实施方式

下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件或按照制造厂商所建议的条件。实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。实施例中的％，如无特殊说明，均为质量百分含量。以下实施例中的定量试验，均设置三次重复实验，数据为三次重复实验的平均值或平均值±标准差。

本发明选用大肠杆菌表达菌、载体扩增菌株TOP10和表达载体pET32均购自美国Invritrogen公司。

所用培养基配方如下：

1)LB液体培养基：NaCl 10g，蛋白胨10g，酵母提取物5g，蒸馏水1L，高压灭菌，室温保存；

2)LB/Amp平板：NaCl 10g，蛋白胨10g，酵母提取物5g，蒸馏水1L，琼脂粉15g，高压灭菌后，冷却至70℃以下，加入1mL浓度为100mg/ml的氨苄青霉素(Ampicillin)，充分混均后倒板，4℃避光保存；

3)LB/Amp培养基：NaCl 10g，蛋白胨10g，酵母提取物5g，蒸馏水1L，高压灭菌后，冷却至70℃以下，加入1mL Ampicillin(100mg/ml)，充分混均，4℃保存；LB液体培养基：NaCl10g，蛋白胨10g，酵母提取物5g，蒸馏水1L，高压灭菌，室温保存。

4)50×TAE琼脂糖凝胶电泳缓冲液：Tris碱121g，冰乙酸28.6mL，0.5mol/L EDTA(pH8.0)50mL，加蒸馏水定容至500mL，室温保存；

5)50mg/mL氨苄青霉素保存液：氨苄青霉素0.5g，加蒸馏水溶解并定容至10mL，分装后于-20℃保存；

6)5×SDS-PAGE上样缓冲液：1M Tris-HCl(pH 6.8)1.25mL，SDS 0.5g，BPB 25mg，甘油2.5mL，加去离子水溶解后定容至5mL，分装(约500μL每份)后于室温保存，使用每份加入25μLβ-巯基乙醇混匀；

7)5×SDS-PAGE电泳缓冲液：Tris 15.1g，甘氨酸94g，SDS 5.0g，加入约800mL去离子水，充分搅拌溶解后定容至1L，室温保存；

8)考马斯亮蓝R-250染色液：考马斯亮蓝R-250 0.25g，加入225mL甲醇、46mL的冰乙酸、225mL去离子水并搅拌均匀，滤纸去除颗粒物质后，室温保存；

9)考马斯亮蓝脱色液：冰乙酸50mL，甲醇150mL，去离子水300mL，充分混合后，室温保存。

实施例1

本实施例提供了一种优化的小分子纤维素内切酶基因(EG)，具体核苷酸序列如序列表中的SEQ ID NO：1所示，该基因所对应的蛋白质氨基酸序列如序列表中的SEQ ID NO：2所示。合成的序列在NCBI数据库中无相似度达70％的序列，它是根据大肠杆菌表达的特点，优化并合成优化后的DNA。

将上述优化后的基因连接到大肠杆菌表达载体pET32中并获得重组载体，以上经测序验证的重组载体热激转化到大肠杆菌表达菌株的感受态细胞，涂布对应的抗性LB平板，37℃恒温培养箱中培养12小时，筛选转化子，其中pET32/EG载体构建如图1所示，图1为本发明实施例中的pET32/EG载体构建示意图。

利用经优化的天然纤维素内切酶基因序列的pET32重组载体为表达载体，其对应的表达菌转化子经0.1-0.5mM的IPTG在18℃下诱导均检测到目标蛋白的表达，其菌体总蛋白SDS-PAGE结果如图2所示，小分子纤维素内切酶蛋白分子量为26kDa左右，pET32载体在目标蛋白的N-端融合了一个大小为17kDa左右的Trx片段，小分子纤维素内切酶大小为43kDa左右，表达的目标蛋白如箭头所示。

S1：优化基因、构建原核表达载体及转化：将如SEQ ID NO：1所示核苷酸序列化学合成，连接至pUC通用载体得到pUC/EG，利用BamH I和Hind III双酶切pUC/EG，将得到的EG片段再亚克隆至表达载体pET32中，得到重组表达载体pET32/EG，载体构建如图1所示。主要的载体构建步骤如下：

(1)用BamH I和Hind III双酶切重组载体pUC/EG，获得目的片断EG，反应体系如下(所用内切酶及缓冲液均购自大连TAKARA公司)：

(2)用BamH I和Hind III双酶切pET32，获得载体片断，反应体系如下(所用内切酶及缓冲液均购自大连TAKARA公司)：

(3)将步骤(1)和(2)得到的目的片断和载体片断用DNA凝胶收回试剂盒回收，该试剂盒购自大连TAKARA公司，具体操作按试剂盒说明书进行。

(4)将步骤(3)回收得到的目的片断和载体用T4DNA连接酶(购自大连TAKARA公司)进行连接反应，目的基因准确插入到表达载体读码框内，反应体系如下：

将以上得到的重组载体pET32/EG转化到大肠杆菌TOP10菌株中，再从TOP10中提取重组载体pET32/EG；用热激法将重组载体pET32/EG转入到宿主细胞大肠杆菌表达菌株中，用含有Amp抗性的LB平板筛选得到包含有重组载体pET32/EG的大肠杆菌表达菌株转化子。

S2：可溶性小分子纤维素内切酶融合蛋白的表达与提取：将步骤S1筛选得到包含有重组载体pET32/EG的大肠杆菌表达菌株转化子在37℃的液体LB培养基中培养至OD600为0.6，然后分别加入或不加入IPTG，在18℃诱导24小时，诱导后收集的菌体超声破碎，破碎功率300W，破碎2s，间隙6s，循环90次后，离心取上清液，得到重组的可溶性融合蛋白小分子纤维素内切酶，SDS-PAGE结果如图2所示。

实施例2

本实施例提供一种制备小分子纤维素内切酶的方法，具体包括如下步骤：

1)融合蛋白小分子纤维素内切酶的纯化：将步骤S1筛选得到包含有重组载体pET32/EG的大肠杆菌表达菌株转化子在37℃的液体LB培养基中经扩大培养(100毫升)至OD₆₀₀为0.6，并在18℃下用0.1mM IPTG诱导20-24小时，收集经IPTG诱导表达后的表达菌的菌体，将菌体重悬于40ml的缓冲液A(含20mM Na₂HPO₄，200mM NaCl，10mM咪唑和1mM蛋白酶抑制剂PMSF，pH 8.0)中，然后用超声破碎仪进行破碎，破碎功率300W，破碎2s，间隙6s，循环90次；将破碎后的菌液在4℃下，30000g离心15min；将离心所得到的上清液加入到经缓冲液A预平衡的镍亲合层析柱中；用100ml缓冲液B(含20mM Na₂HPO₄，200mM NaCl，10mM咪唑pH8.0)漂洗蛋白纯化柱子后，分别加入包括浓度为50、100、200和400mM咪唑的缓冲液C(含20mM Na₂HPO₄，200mM NaCl，pH 8.0)，将蛋白洗脱下来，200mM咪唑洗脱的蛋白是纯度在95％以上的小分子纤维素内切酶，具体结果如图3所示。

S4：融合蛋白小分子纤维素内切酶的浓缩：将蛋白质样品在pH4.0的20mM NaH₂PO₄和柠檬酸缓冲液下透析，透析结束后，利用截留分子量是15kDa的超滤管进行超滤浓缩即可得到纯度在95％以上的高浓度重组小分子纤维素内切酶，结果如图4所示。利用胶扫描并结合Bradford法对目标蛋白的浓度进行了检测，表1是100ml经IPTG诱导的菌体中可溶性纤维素外切酶融合蛋白经各纯化步骤的得率与纯度结果。

表1蛋白纯化结果

需要说明的是，在步骤S2得到的上清液中加入SDS-PAGE样品缓冲液，对其可溶蛋白进行分析。在18℃温度下IPTG的浓度为0.1和0.5mM时，可以得到可溶性Trx-纤维素内切酶融合蛋白。为节约成本，缩短生产周期，我们优选采用诱导温度18℃，0.1mM的IPTG进行诱导表达。

对比例

利用转录组得到的数据，设计引物，经RT-PCR扩增目标基因并连接至克隆载体，扩增的目标基因序列如序列表中SEQ ID NO.3所示，将该天然的茯苓纤维素内切酶新基因用BamHI和Hind III双酶切，并连接到同样经BamH I和Hind III双酶切的pET32表达载体。重组载体经热激转化到大肠杆菌表达菌株的感受态细胞，涂布对应的抗性LB平板，37℃恒温培养箱中培养12小时，筛选转化子。将包含优化前基因的pET32/EG载体的大肠杆菌重组转化子在37℃的液体LB培养基中培养至OD600为0.4，然后分别加入浓度为0、0.1、0.2、0.5mM的IPTG，在18℃诱导24小时，诱导后收集的菌体超声破碎，破碎功率300W，破碎2s，间隙6s，循环90次后，离心取上清液，未得到重组可溶性纤维素内切酶蛋白，SDS-PAGE结果如图5所示。该对比例结果说明，只有本发明所提供的小分子纤维素内切酶基因才能在大肠杆菌中实现可溶性的表达。

实施例3

(1)本发明采用葡萄糖己糖激酶(HK)法测定小分子纤维素内切酶水解羧甲基纤维素钠(CMC-Na)产生葡萄糖的能力，己糖激酶在有ATP存在下催化葡萄糖(D-Glucose)使其磷酸化生成葡萄糖-6磷酸(G-6-P)，G-6-P和辅酶NAD在葡萄糖-6-磷酸脱氢酶的作用下生成NADH和6-磷酸葡萄糖酸，可通过分光光度法测定NADH在340nm波长下的吸光度变化，定量检测样品中葡萄糖的浓度，具体步骤和结果如下：将2μl浓度为1mg/mL的纯化的Trx-EG加入到98μl含1％的CMC-Na的磷酸二氢钠与柠檬酸缓冲液中(pH＝4)，40℃下反应1小时；取反应后的样品10μl、2μl的浓度为10mmol/L NAD与ATP的混合液，补加水至总体积为95μl，室温下反应5min后，加入5μl浓度为2μmol/L的葡萄糖-6-磷酸脱氢酶，室温下反应3min后，于340nm测定吸光值。同时，以葡萄糖标准品制作标准曲线。所得的标准曲线方程为：Y＝0.0086X-0.0003，相关系统r＝0.9994，标准品的检测结果表如表2示。

表2标准品的检测结果

标准品浓度(ng/mL)	0	4	8	12	16	20	24
								OD<sub>400</sub>	0	0.038	0.076	0.115	0.147	0.184	0.266

(2)根据(1)的方法，分别利用pH 3，pH3.5，pH4，pH4.5，pH5的磷酸盐缓冲液，对酶活进行了检测。在不同pH值下，相对活力(以酶活最高时的pH下酶活为100％，其它情况下的相对酶活是测得该pH条件下产生的葡萄糖总量与酶活力最高pH条件下产生的葡萄糖总量的比值)如图6所示，从图中可以看出，该酶的最适pH为4.5左右。表3为相对酶活检测结果。

表3不同pH值下相对酶活

pH	3	3.5	4	4.5	5
						相对酶活(％)	76	87	94	100	52

(3)根据(1)的方法，分别利用4的磷酸盐缓冲液，对不同温度下的酶活进行了检测。酶活检测的结果如图7所示，从图中可以看出，该酶的最适温度为45℃左右。表4为不同温度下相对酶活检测结果(设定酶活最高时的温度下的相对酶活为100％，其它情况下的相对酶活是测得该温度条件下产生的葡萄糖总量与酶活力最高的温度下产生的葡萄糖总量的比值)。

表4不同温度下相对酶活

温度(℃)	40	45	50	55	60
						相对酶活(％)	86	100	89	80	71

因此，根据以上结果，本发明所制备的新的茯苓纤维素内切酶是一种能分解羧甲基纤维素钠产生葡萄糖的、最适pH为4.5左右、最适温度为45℃左右的小分子重组茯苓纤维素内切酶重组蛋白。

最后说明的是，以上优选实施例仅用以说明本发明的技术方案而非限制，尽管通过上述优选实施例已经对本发明进行了详细的描述，但本领域技术人员应当理解，可以在形式上和细节上对其作出各种各样的改变，而不偏离本发明权利要求书所限定的范围。

序列表

<110> 怀化学院

<120> 一种小分子纤维素内切酶基因及其蛋白和应用

<160> 3

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 678

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 1

catttcacca tgcagtatct gtggattaat ggtgttgatc agggtctgaa taccgatctg 60

cgtgttccgc ctagcaataa tccggttacc gatgttacca gcaccgatct gacctgtaat 120

gttaatggtc tgagcggtgc cggtgttagc accgcaacca ttccggcagg cgcaaccgtt 180

acctttgaat ggcatcagca tgcacagcgt accggtgaag atgcaattag cggtggtcat 240

aaaggtccgg ttcaggttta tgttgcaaaa gcaccgagca ccgcagcaga atttgatggt 300

cagggtcctg tttggaccaa aatctatagc agcggtctgc tgaatccgca gacacaagaa 360

tgggcaaccg atgttgttaa tgcaaccaat ggtaaacata gcgttacaat tccggcaagc 420

ctgcctgccg gtgaatatct gctgcgtgca gaaattattg cactgcatgt tgcacagagc 480

tatccgggtg cacagtttta tatcggttgt gcacaggcaa aaattaccgg tggtggtagc 540

gcaaatccgc ctaaaattag cctgccaggc gattatcagg gtagcgatcc gggtattacc 600

gtgaacattt ataacaatct gcagagctat accgcacctg gtggtccggt ttggagcggt 660

catcaccatc accatcac 678

<210> 2

<211> 226

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 2

His Phe Thr Met Gln Tyr Leu Trp Ile Asn Gly Val Asp Gln Gly Leu

1 5 10 15

Asn Thr Asp Leu Arg Val Pro Pro Ser Asn Asn Pro Val Thr Asp Val

20 25 30

Thr Ser Thr Asp Leu Thr Cys Asn Val Asn Gly Leu Ser Gly Ala Gly

35 40 45

Val Ser Thr Ala Thr Ile Pro Ala Gly Ala Thr Val Thr Phe Glu Trp

50 55 60

His Gln His Ala Gln Arg Thr Gly Glu Asp Ala Ile Ser Gly Gly His

65 70 75 80

Lys Gly Pro Val Gln Val Tyr Val Ala Lys Ala Pro Ser Thr Ala Ala

85 90 95

Glu Phe Asp Gly Gln Gly Pro Val Trp Thr Lys Ile Tyr Ser Ser Gly

100 105 110

Leu Leu Asn Pro Gln Thr Gln Glu Trp Ala Thr Asp Val Val Asn Ala

115 120 125

Thr Asn Gly Lys His Ser Val Thr Ile Pro Ala Ser Leu Pro Ala Gly

130 135 140

Glu Tyr Leu Leu Arg Ala Glu Ile Ile Ala Leu His Val Ala Gln Ser

145 150 155 160

Tyr Pro Gly Ala Gln Phe Tyr Ile Gly Cys Ala Gln Ala Lys Ile Thr

165 170 175

Gly Gly Gly Ser Ala Asn Pro Pro Lys Ile Ser Leu Pro Gly Asp Tyr

180 185 190

Gln Gly Ser Asp Pro Gly Ile Thr Val Asn Ile Tyr Asn Asn Leu Gln

195 200 205

Ser Tyr Thr Ala Pro Gly Gly Pro Val Trp Ser Gly His His His His

210 215 220

His His

225

<210> 3

<211> 660

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 3

cactttacta tgcagtacct ctggataaat ggcgttgacc aaggtctgaa caccgacctc 60

cgtgtcccgc ccagcaacaa ccctgtcacg gacgtaacgt ctacggacct cacctgcaac 120

gtcaacggcc tttcgggtgc tggtgtcagc actgctacca tccctgccgg tgccaccgtc 180

actttcgaat ggcaccagca cgctcagcgt accggcgaag atgccatctc cggtggacac 240

aagggtcctg ttcaggtcta tgttgcgaaa gcaccgtcga ctgcggcgga gttcgatggt 300

cagggccctg tctggaccaa gatctactcg tctggtctgc tcaacccaca gacacaggag 360

tgggccactg acgttgtcaa cgccacaaac ggaaagcaca gcgtgacgat cccggcttcg 420

ctgcccgctg gcgagtacct gcttcgcgcg gagatcatcg ctcttcacgt tgcccagtca 480

taccctggcg ctcaattcta cattggctgt gctcaagcca agatcaccgg tggtggtagt 540

gctaacccac cgaagatctc ccttccagga gactaccagg gtagcgaccc cggcatcact 600

gtcaacatct acaacaacct ccagagctac actgctcccg gtggccccgt ctggtctggg 660

Claims

1.一种小分子纤维素内切酶基因，其特征在于，所述基因的序列为序列表中SEQ IDNO.1的核苷酸序列。

2.根据权利要求1所述的基因编码得到的小分子纤维素内切酶。

3.根据权利要求2所述的小分子纤维素内切酶，其特征在于：所述小分子纤维素内切酶的氨基酸序列如序列表中SEQ ID NO.2所示。

4.含有权利要求1所述基因的重组载体、表达盒、转基因细胞系或重组菌。

5.根据权利要求4所述的重组载体，由空载体和插入该空载体的目的基因组成，其特征在于，所述目的基因为权利要求1所述的基因。

6.根据权利要求5所述的重组载体，其特征在于，所述空载体为pET32载体。

7.一种权利要求2或3所述的小分子纤维素内切酶的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：

a.将权利要求1所述的基因重组到构建到pET32载体中；再转化到大肠杆菌菌株中，得到表达株；

8.根据权利要求7所述的制备方法，其特征在于，还包括蛋白纯化步骤：用镍亲合层析柱对步骤b得到的上清液进行纯化，先用平衡缓冲液平衡层析柱，再将上清液过柱，用含10-50mM咪唑的pH 8.0缓冲液预洗柱子，然后用含100mM～400mM咪唑的pH 8.0缓冲液溶液梯度将融合蛋白洗脱下来即可。

9.根据权利要求7或8所述制备方法得到的蛋白。

10.权利要求1所述基因、权利要求2、3或9所述蛋白、权利要求4所述重组载体、表达盒、转基因细胞系或重组菌在生物燃料乙醇的生产、食品、饲养和/或印染领域中的应用。