CN109280673B

CN109280673B - 糖苷水解酶家族7蛋白基因及其编码的蛋白和应用

Info

Publication number: CN109280673B
Application number: CN201811240724.8A
Authority: CN
Inventors: 胡兴; 李洪波; 王晓红
Original assignee: Huaihua University
Current assignee: HUNAN BUSKY PHARMACEUTICAL Co.,Ltd.
Priority date: 2018-10-23
Filing date: 2018-10-23
Publication date: 2021-02-09
Anticipated expiration: 2038-10-23
Also published as: CN109280673A

Abstract

本发明涉及一种糖苷水解酶家族7蛋白基因，所述糖苷水解酶家族7蛋白基因核苷酸序列如SEQ ID No.1所示。还涉及所述基因编码的蛋白，其蛋白质的氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示。本发明设计出一种新的能表达糖苷水解酶家族7蛋白的基因序列，进一步利用pET28载体构建出重组质粒并转化到大肠杆菌表达菌株，实现了表达产物的可溶性表达，得到大量可溶形式的重组糖苷水解酶家族7蛋白；在本发明的表达系统内，重组糖苷水解酶家族7蛋白可按适当的方式折叠，并保持天然构象，所制备出来的蛋白有水解羧甲基纤维素钠产生葡萄糖的酶活性，而且在pH3.5‑5.0的条件具有较好的酶活性，在铜离子存在下，还有一定的激活作用。

Description

糖苷水解酶家族7蛋白基因及其编码的蛋白和应用

技术领域

本发明属于生物基因工程技术领域，涉及糖苷水解酶家族7蛋白基因及其编码的蛋白和应用。

背景技术

纤维素是由葡萄糖以β-1，4糖苷键构成的多糖，是构成植物细胞壁的重要组分，植物通过光合作用，生产地球上最丰富、最廉价的纤维素资源，有资料表明，全世界每年的植物体生成量高达1500亿吨干物质，其中纤维素及半纤维素的总量为850亿吨。由于纤维素具有水不溶性的高结晶构造，其外围又被木质素层包围着，要把它水解成可利用的葡萄糖相当困难，所以到目前为止仍没有得到很好地利用。随着世界人口骤长，为解决日益加剧的食品和能源危机，纤维素资源的利用引起了世界各国的极大关注和高度重视.当前，新能源、新食品资源的开发是世界各国都在着重研究的重大课题。在这类研究中，纤维素科学、纤维素降解机理和纤维素酶的研究成为其研究的主要组成部分，其中又以纤维素酶的研究为重。

纤维素酶属于糖苷水解酶类，是专门催化水解纤维素链中β-1，4-糖苷键的一类酶的总称，是一种高活性生物催化剂，能够分解纤维素产生葡萄糖。根据纤维素酶的结构不同，可把纤维素酶分为两类：纤维素酶复合体和非复合体纤维素酶。纤维素酶复合体是一种超分子结构的多酶蛋白复合体，由多个亚基构成。非复合体纤维素酶由内切糖苷水解酶、外切糖苷水解酶和β-葡聚糖苷酶组成，现已发现的糖苷水解酶分为133个糖苷水解酶家族(GH1～GH133)。非复合体纤维素酶主要由好氧的丝状真菌产生，它们是分解纤维素的最重要的酶源。

而我国的纤维素酶工业制备还处于研究开发阶段，纤维素酶的生产还存在纤维素酶活力较低，生产成本较高，生产周期较长等问题使得纤维素酶的应用受到限制，因此，需要克服纤维素酶大量生产的瓶颈。深入研究纤维素酶的作用机制，加强对纤维素酶的分子生物学研究，特别要充分利用DNA基因重组技术的应用，生产具有高酶活的重组蛋白。纤维素酶系包含内切酶、外切酶和糖苷转移酶3种酶。其中，纤维素内切酶对纤维素的分解起重要作用。目前市售纤维素酶都是各种酶的混合物，很少有利用基因工程手段获得大最高纯度和高活性的纤维素内切酶的相关产品和技术。

发明内容

有鉴于此，本发明的目的在于提供一种糖苷水解酶家族7蛋白基因，以及所述基因所编码的蛋白质；进一步还提供一种包含如SEQ ID No.1所示的核苷酸序列的重组载体，以及这种载体所转化的重组菌，进一步该重组菌所表达蛋白质的方法及蛋白纯化方法。

为达到上述目的，本发明提供如下技术方案：

1.糖苷水解酶家族7蛋白基因，所述糖苷水解酶家族7蛋白基因核苷酸序列如SEQID No.1所示。

2.糖苷水解酶家族7蛋白，所述蛋白质的氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示。

3.一种重组载体，由空载体和插入该空载体的目的基因组成，所述目的基因的核苷酸序列如SEQ ID No.1所示。

进一步，所述空载体为pET28载体。

4.一种重组菌，所述重组菌为技术方案3所述载体转化的重组菌，含有如SEQ IDNo.1所示的核苷酸序列。

5.糖苷水解酶家族7蛋白的制备方法，包括以下步骤：

1)将核苷酸序列如SEQ ID No.1所示的基因重组构建到载体中；再转化到大肠杆菌菌株中，得到表达株；

2)将步骤1)表达株在LB液体培养基中培养，并加入0.1～0.5mM的IPTG诱导，发酵完毕，超声破碎，离心取上清，得可溶性重组的糖苷水解酶家族7蛋白。

进一步，还包括蛋白纯化步骤：用镍亲合层析柱对步骤2)得到的上清液进行纯化，先用平衡缓冲液平衡层析柱，再将上清液过柱，用含10-50mM咪唑的pH 8.0缓冲液预洗柱子，然后用含100mM～200mM咪唑的pH 8.0缓冲液溶液将融合蛋白洗脱下来即可。

6.氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示的糖苷水解酶家族7蛋白在制备葡萄糖中的应用。

进一步，所述蛋白质将纤维素分解为葡萄糖的酶制剂中的应用。

本发明的有益效果在于：本发明设计出一种新的能表达糖苷水解酶家族7蛋白的基因序列，进一步利用pET28载体构建出重组质粒并转化到大肠杆菌表达菌株，实现了表达产物的可溶性表达，得到大量可溶形式的重组糖苷水解酶家族7蛋白；在本发明的表达系统内，重组糖苷水解酶家族7蛋白可按适当的方式折叠，并保持天然构象，所制备出来的蛋白有水解羧甲基纤维素钠(CMC-Na)产生葡萄糖的酶活性，而且在pH 3.5-5.0的条件具有较好的酶活性，在铜离子存在下，还有一定的激活作用；本发明还提供一种有效纯化活性重组糖苷水解酶家族7蛋白的方法。

附图说明

为了使本发明的目的、技术方案和有益效果更加清楚，本发明提供如下附图进行说明：

图1为本发明实施例中的pET28/GH7载体构建示意图。

图2为本发明实施例中的pET28/GH7重组载体表达目标蛋白的SDS-PAGE检测结果图。

图3为本发明实施例中的重组糖苷水解酶家族7蛋白纯化前和不同浓度咪唑的缓冲液纯化得到蛋白的SDS-PAGE检测结果图。

图4为本发明实施例中的浓缩的重组糖苷水解酶家族7蛋白的SDS-PAGE检测结果图。

图5为本发明对比例得到的上清液的SDS-PAGE检测结果图。

图6为本发明实施例中pH对重组糖苷水解酶家族7蛋白酶活的影响。

图7为本发明实施例中金属离子对重组糖苷水解酶家族7蛋白酶活的影响。

具体实施方式

下面将结合附图，对本发明的优选实施例进行详细的描述。实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件或按照制造厂商所建议的条件。显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。

下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。

下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。

下述实施例中的％，如无特殊说明，均为质量百分含量。以下实施例中的定量试验，均设置三次重复实验，数据为三次重复实验的平均值或平均值±标准差。

本发明选用大肠杆菌表达菌、载体扩增菌株TOP 10和表达载体pET 28均购自美国Invritrogen公司。

所用培养基配方如下：

1)LB液体培养基：NaCl 10g，蛋白胨10g，酵母提取物5g，蒸馏水1L，高压灭菌，室温保存；

2)LB/Kan平板：NaCl 10g，蛋白胨10g，酵母提取物5g，蒸馏水1L，琼脂粉15g，高压灭菌后，冷却至70℃以下，加入1mL浓度为100mg/ml的卡那霉素(Kan)，充分混均后倒板，4℃避光保存；

3)LB/Kan培养基：NaCl 10g，蛋白胨10g，酵母提取物5g，蒸馏水1L，高压灭菌后，冷却至70℃以下，加入1mLKan(100mg/ml)，充分混均，4℃保存；LB液体培养基：NaCl10g，蛋白胨10g，酵母提取物5g，蒸馏水1L，高压灭菌，室温保存。

4)50×TAE琼脂糖凝胶电泳缓冲液：Tris碱121g，冰乙酸28.6mL，0.5mol/L EDTA(pH8.0)50mL，加蒸馏水定容至500mL，室温保存；

5)50mg/mL卡那霉素保存液：卡那霉素0.5g，加蒸馏水溶解并定容至10mL，分装后于-20℃保存；

6)5×SDS-PAGE上样缓冲液：1M Tris-HCl(pH 6.8)1.25mL，SDS 0.5g，BPB 25mg，甘油2.5mL，加去离子水溶解后定容至5mL，分装(约500μL每份)后于室温保存，使用每份加入25μLβ-巯基乙醇混匀；

7)5×SDS-PAGE电泳缓冲液：Tris 15.1g，甘氨酸94g，SDS 5.0g，加入约800mL去离子水，充分搅拌溶解后定容至1L，室温保存；

8)考马斯亮蓝R-250染色液：考马斯亮蓝R-2500.25g，加入225mL甲醇、46mL的冰乙酸、225mL去离子水并搅拌均匀，滤纸去除颗粒物质后，室温保存；

9)考马斯亮蓝脱色液：冰乙酸50mL，甲醇150mL，去离子水300mL，充分混合后，室温保存。

实施例1

本实施例提供了一种优化的人工合成的糖苷水解酶家族7蛋白基因(GH7)，具体序列如序列表中的SEQ ID NO.1所示，该基因所对应的蛋白质氨基酸序列如序列表中的SEQID NO.2所示。合成的序列在NCBI数据库中无相似度达70％的序列，它是根据大肠杆菌表达的特点，优化并合成优化后的DNA。

将上述优化后的天然基因连接到大肠杆菌表达载体pET28中并获得重组载体，以上经测序验证的重组载体热激转化到大肠杆菌表达菌株的感受态细胞，涂布对应的抗性LB平板，37℃恒温培养箱中培养12小时，筛选转化子，其中pET28/GH7载体构建如图1所示，图1为本发明实施例中的pET28/GH7载体构建示意图。

利用经优化的天然纤维素外切酶基因序列的pET28重组载体为表达载体，其对应的表达菌转化子经0.1-0.5mM的IPTG在18℃下诱导均检测到目标蛋白的表达，其菌体总蛋白SDS-PAGE结果如图2所示，重组糖苷水解酶家族7蛋白分子量为55kDa左右，表达的目标蛋白如箭头所示。

将人工化学合成经优化的成熟糖苷水解酶家族7蛋白基因连接至pUC通用载体得到pUC/GH7，利用BamHI和HindIII双酶切pUC/GH7，将得到的GH7片段再亚克隆至表达载体pET28中，得到重组表达载体pET28/GH7，载体构建如图1所示。主要的载体构建步骤为：

(1)用BamHI和HindIII双酶切重组载体pUC/GH7，获得目的片断GH7，反应体系如下(所用内切酶及缓冲液均购自大连TAKARA公司)：

(2)用BamHI和HindIII双酶切pET28，获得载体片断，反应体系如下(所用内切酶及缓冲液均购自大连TAKARA公司)：

(3)将步骤(1)和(2)得到的目的片断和载体片断用DNA凝胶收回试剂盒回收，该试剂盒购自大连TAKARA公司，具体操作按试剂盒说明书进行。

(4)将步骤(3)回收得到的目的片断和载体用T4DNA连接酶(购自大连TAKARA公司)进行连接反应，目的基因准确插入到表达载体读码框内，反应体系如下：

实施例2

本实施例提供一种糖苷水解酶家族7蛋白的方法，具体包括如下步骤：

S1：将重组载体pET28/GH7转化到大肠杆菌TOP10菌株中，再从TOP10中提取重组载体pET28/GH7；用热激法将重组载体pET28/GH7转入到宿主细胞大肠杆菌表达菌株中，用含有Kan抗性的LB平板筛选得到包含有重组载体pET28/GH7的大肠杆菌表达菌株转化子，重组转化子经PCR进行验证。

S2：可溶性重组糖苷水解酶家族7蛋白的表达与提取：将包含优化后人工合成基因的pET28/GH7载体的大肠杆菌重组转化子在37℃的液体LB培养基中培养至OD₆₀₀为0.4，然后分别加入浓度为0、0.1、0.5mM的IPTG，在18℃诱导24小时，诱导后收集的菌体超声破碎，破碎功率300W，破碎2s，间隙6s，循环90次后，离心取上清液，得到重组糖苷水解酶家族7蛋白，SDS-PAGE结果如图2所示(目标蛋白分子量为55kDa左右)。

S3：重组糖苷水解酶家族7蛋白的纯化：经扩大培养和在18℃下用0.1mM IPTG诱导20-24小时，收集经IPTG诱导表达后的表达菌的菌体，将菌体重悬于50ml的缓冲液A(含20mMNa₂HPO₄，200mM NaCl，10mM咪唑和1mM蛋白酶抑制剂PMSF，pH 8.0)中，然后用超声破碎仪进行破碎，破碎功率300W，破碎2s，间隙6s，循环90次；将破碎后的菌液在4℃下，30000g离心15min；本发明的糖苷水解酶家族7蛋白基因已构建了his标签，将离心所得到的上清液加入到经缓冲液A预平衡的镍亲合层析柱中；用100ml缓冲液B(含20mM Na₂HPO₄，200mM NaCl，10mM咪唑pH 8.0)漂洗蛋白纯化柱子后，分别加入包括浓度为50、100、200和400mM咪唑的缓冲液C(含20mM Na₂HPO₄，200mM NaCl，pH 8.0)，将蛋白洗脱下来，200和400mM咪唑洗脱的蛋白是纯度在90％以上的重组糖苷水解酶家族7蛋白，具体结果如图3所示。

S4：重组糖苷水解酶家族7蛋白的浓缩：将蛋白质样品在pH4.0的20mM NaH₂PO₄和柠檬酸缓冲液下透析，透析结束后，利用截留分子量为15kDa的超滤管进行超滤浓缩即可得到纯度在90％以上的高浓度重组糖苷水解酶家族7蛋白，结果如图4所示。利用胶扫描并结合Bradford法对目标蛋白的浓度进行了检测，表1是100ml经IPTG诱导的菌体中可溶性重组糖苷水解酶家族7蛋白经各纯化步骤的得率与纯度结果。

表1蛋白纯化结果

需要说明的是，在步骤S2得到的上清液中加入SDS-PAGE样品缓冲液，对其可溶蛋白进行分析。在18℃温度下IPTG的浓度为0.1、0.2和0.5mM时，都可以得到可溶性重组糖苷水解酶家族7蛋白。为节约成本，缩短生产周期，我们优选采用诱导温度18℃，0.1mM的IPTG进行诱导表达。

对比例

茯苓的形成是由茯苓菌丝体在适宜的条件下寄生于已死松木上，不断分解松木中的营养，并将菌化后的多余物质积聚迅速膨大，形成的营养贮藏器官和休眠器官即为菌核，俗称松茯苓。木材的主要成分是纤维素、半纤维素和木素，其中，木材纤维素含量为40％～50％。因此，茯苓菌丝中极可能存在高活性的分泌型纤维素酶。利用转录组技术对茯苓的纤维素酶分解酶的表达谱进行分析发现该新的酶基因。利用转录组得到的数据，设计引物，经RT-PCR扩增目标基因并连接至克隆载体，扩增的目标基因序列如序列表中SEQ ID NO.3所示，将该天然的茯苓糖苷水解酶家族7蛋白基因用BamHI和HindIII双酶切，并连接到同样经BamH I和HindIII双酶切的pET28表达载体。重组载体经热激转化到大肠杆菌表达菌株的感受态细胞，涂布对应的抗性LB平板，37℃恒温培养箱中培养12小时，筛选转化子。将包含优化前基因的pET28/GH7载体的大肠杆菌重组转化子在37℃的液体LB培养基中培养至OD₆₀₀为0.4，然后分别加入浓度为0、0.1、0.2、0.5mM的IPTG，在18℃诱导24小时，诱导后收集的菌体超声破碎，破碎功率300W，破碎2s，间隙6s，循环90次后，离心取上清液，未得到可溶性重组糖苷水解酶家族7蛋白，SDS-PAGE结果如图5所示，由图5可知天然的茯苓糖苷水解酶家族7蛋白基因并不能直接翻译为糖苷水解酶。该对比例结果说明，只有人工优化后的重组糖苷水解酶家族7蛋白基因才能在大肠杆菌中实现可溶性的表达。

实施例3

(1)本发明采用葡萄糖己糖激酶(HK)法测定糖苷水解酶家族7蛋白水解羧甲基纤维素钠(CMC-Na)产生葡萄糖的能力，己糖激酶在有ATP存在下催化葡萄糖(D-Glucose)使其磷酸化生成葡萄糖-6磷酸(G-6-P)，G-6-P和辅酶NAD在葡萄糖-6-磷酸脱氢酶的作用下生成NADH和6-磷酸葡萄糖酸，可通过分光光度法测定NADH在340nm波长下的吸光度变化，定量检测样品中葡萄糖的浓度，具体步骤和结果如下：将2μl浓度为1mg/mL的纯化的Trx-GH7加入到98μl含1％的CMC-Na的磷酸二氢钠与柠檬酸缓冲液中(pH＝4)，40℃下反应1小时；取反应后的样品10μl、2μl的浓度为10mmol/LNAD与ATP的混合液，补加水至总体积为95μl，室温下反应5min后，加入5μl浓度为2μmol/L的葡萄糖-6-磷酸脱氢酶，室温下反应3min后，于340nm测定吸光值。同时，以葡萄糖标准品制作标准曲线，所得的标准曲线方程为：Y＝0.0086X-0.0138，相关系统r＝0.9995，标准品的检测结果表如表2示。

表2标准品的检测结果

(2)根据(1)的方法，分别利用pH3-8的磷酸盐缓冲液，对酶活进行了检测。在不同pH值下，相对活力如图6所示，从图中可以看出，该酶的最适pH为4左右。表3为不同pH值下相对酶活检测结果。

表3相对酶活

同样，根据(1)的方法，检测了不同金属离子(终浓度为1μmol/l)对酶活的影响，结果如图7所示，从图可知，该酶在有铜离子存在的情况下可以增强酶的活力。表4为不同金属离子下的相对酶活检测结果。

表4不同金属离子相对酶活

金属离子种类	CoCl<sub>2</sub>	ZnCl<sub>2</sub>	Na<sub>2</sub>MoO<sub>4</sub>	MnSO<sub>4</sub>	CuSo<sub>4</sub>	CaCl<sub>2</sub>	PBS
								相对酶活(％)	103	102	94	101	113	101	100

(3)根据(1)的方法，同样检测对比例得到的上清液，并未检测出其具有分解羧甲基纤维素钠产生葡萄糖的酶活性。

因此，根据以上结果，本发明所制备的新的糖苷水解酶家族7蛋白是一种能分解羧甲基纤维素钠产生葡萄糖的、最适pH为4左右，铜离子有激活作用的重组茯苓纤维素外切酶。

最后说明的是，以上优选实施例仅用以说明本发明的技术方案而非限制，尽管通过上述优选实施例已经对本发明进行了详细的描述，但本领域技术人员应当理解，可以在形式上和细节上对其作出各种各样的改变，而不偏离本发明权利要求书所限定的范围。

序列表

<110> 怀化学院

<120> 糖苷水解酶家族7蛋白基因及其编码的蛋白和应用

<160> 3

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 1524

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 1

cagcaagctg gaactcaaac tgccgaaaac cacccacagt tgtcctctca gaagtgtact 60

gccggtggtt cttgtacttc tgcttccacc tccgttgtct tggattccaa ctggcgttgg 120

gttcacacta cctccggtta caccaactgc tacactggta acacttggga tgcctccatc 180

tgttccgacc ctgtcacttg tgctcagaac tgtgcccttg atggtgctga ttacgccgga 240

acttacggaa tcaccacctc tggtgacgcc ttgactttga agttcgtcac cggttccaac 300

gtcggttcca gagtctactt gatggaggac gaaactaatt accaattgtt caagttgatg 360

aaccaagagt tcacctttga cgtcgacgtc tccaatttgc catgtggatt gaacggtgcc 420

gtctacttcg ttcagatgga tcaggacgga ggttcttcca agtttccaaa taacaaggcc 480

ggtgccaagt ttggtactgg ttactgcgac tcccagtgcc ctcaagatat taagtttatt 540

aacggagagg ctaacattgt taactggacc gcctccgctg gtgacgccaa ctctggtact 600

ggttctttcg gtacttgctg tcaggagatg gatatctggg aggctaactc catttccgct 660

gcttataccc cacacccttg taccgtcact gagcagacta gatgctctgg ttccgattgt 720

ggtcagggtt ccgacagata caacggaatc tgcgacccag atggttgcga cttcaattct 780

ttcagaatgg gaaataccga gttttatggt aaaggtttga ctgttgacac ttctcagaag 840

ttcactattg tcactcaatt tatctccgac gacggtactg ctgacggtaa cttggccgaa 900

atcagaagat tctacgttca aaatggtaaa gttatcccaa actccgtcgt tcagattacc 960

ggtatcgacc cagtcaactc catcaccgag gacttctgca ctcagcaaaa aactgttttc 1020

ggagataaca ataactttgc tgccaagggt ggattgcagc agatgggtga ggctgttaag 1080

aacggaatgg tcttggcctt gtccttgtgg gacgattacg ctgcccagat gttgtggttg 1140

gactccgact acccaactac tgccgaccct tctaagccag gtgttgccag aggtacctgt 1200

ccaactactt ctggtgtccc ttcccaggtt gagggtcaag agggttcctc ttccgttatt 1260

tactctaaca ttaaattcgg tgatttgaac tccactttca ccggtacttt gaccaaccca 1320

tcctctcctg cttccccacc tgttacttct tccccatctc agccatccca atccactcaa 1380

ccatcccaac cagctcaacc ttcccagcca gctggaactg ctgctcaatg ggctcagtgt 1440

ggtggtatgg gattcactgg acctaccgtc tgtgcttctc cttttacctg tcacgttttg 1500

aacccttact actctcaatg ttac 1524

<210> 2

<211> 482

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 2

Gln Gln Ala Gly Thr Gln Thr Ala Glu Asn His Pro Gln Leu Ser Ser

1 5 10 15

Gln Lys Cys Thr Ala Gly Gly Ser Cys Thr Ser Ala Ser Thr Ser Val

20 25 30

Val Leu Asp Ser Asn Trp Arg Trp Val His Thr Thr Ser Gly Tyr Thr

35 40 45

Asn Cys Tyr Thr Gly Asn Thr Trp Asp Ala Ser Ile Cys Ser Asp Pro

50 55 60

Val Thr Cys Ala Gln Asn Cys Ala Leu Asp Gly Ala Asp Tyr Ala Gly

65 70 75 80

Thr Tyr Gly Ile Thr Thr Ser Gly Asp Ala Leu Thr Leu Lys Phe Val

85 90 95

Thr Gly Ser Asn Val Gly Ser Arg Val Tyr Leu Met Glu Asp Glu Thr

100 105 110

Asn Tyr Gln Leu Phe Lys Leu Met Asn Gln Glu Phe Thr Phe Asp Val

115 120 125

Asp Val Ser Asn Leu Pro Cys Gly Leu Asn Gly Ala Val Tyr Phe Val

130 135 140

Gln Met Asp Gln Asp Gly Gly Ser Ser Lys Phe Pro Asn Asn Lys Ala

145 150 155 160

Gly Ala Lys Phe Gly Thr Gly Tyr Cys Asp Ser Gln Cys Pro Gln Asp

165 170 175

Ile Lys Phe Ile Asn Gly Glu Ala Asn Ile Val Asn Trp Thr Ala Ser

180 185 190

Ala Gly Asp Ala Asn Ser Gly Thr Gly Ser Phe Gly Thr Cys Cys Gln

195 200 205

Glu Met Asp Ile Trp Glu Ala Asn Ser Ile Ser Ala Ala Tyr Thr Pro

210 215 220

His Pro Cys Thr Val Thr Glu Gln Thr Arg Cys Ser Gly Ser Asp Cys

225 230 235 240

Gly Gln Gly Ser Asp Arg Tyr Asn Gly Ile Cys Asp Pro Asp Gly Cys

245 250 255

Asp Phe Asn Ser Phe Arg Met Gly Asn Thr Glu Phe Tyr Gly Lys Gly

260 265 270

Leu Thr Val Asp Thr Ser Gln Lys Phe Thr Ile Val Thr Gln Phe Ile

275 280 285

Ser Asp Asp Gly Thr Ala Asp Gly Asn Leu Ala Glu Ile Arg Arg Phe

290 295 300

Tyr Val Gln Asn Gly Lys Val Ile Pro Asn Ser Val Val Gln Ile Thr

305 310 315 320

Gly Ile Asp Pro Val Asn Ser Ile Thr Glu Asp Phe Cys Thr Gln Gln

325 330 335

Lys Thr Val Phe Gly Asp Asn Asn Asn Phe Ala Ala Lys Gly Gly Leu

340 345 350

Gln Gln Met Gly Glu Ala Val Lys Asn Gly Met Val Leu Ala Leu Ser

355 360 365

Leu Trp Asp Asp Tyr Ala Ala Gln Met Leu Trp Leu Asp Ser Asp Tyr

370 375 380

Pro Thr Thr Ala Asp Pro Ser Lys Pro Gly Val Ala Arg Gly Thr Cys

385 390 395 400

Pro Thr Thr Ser Gly Val Pro Ser Gln Val Glu Gly Gln Glu Gly Ser

405 410 415

Ser Ser Val Ile Tyr Ser Asn Ile Lys Phe Gly Asp Leu Asn Ser Thr

420 425 430

Phe Thr Gly Thr Leu Thr Asn Pro Ser Ser Pro Ala Ser Pro Pro Val

435 440 445

Thr Ser Ser Pro Ser Gln Pro Ser Gln Ser Thr Gln Pro Ser Gln Pro

450 455 460

Ala Gln Pro Ser Gln Pro Ala Gly Thr Ala Ala Gln Trp Ala Gln Cys

465 470 475 480

Gly Gly

<210> 3

<211> 1524

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 3

cagcaagctg gaactcaaac tgccgaaaac cacccacagt tgtcctctca gaagtgtact 60

gccggtggtt cttgtacttc tgcttccacc tccgttgtct tggattccaa ctggcgttgg 120

gttcacacta cctccggtta caccaactgc tacactggta acacttggga tgcctccatc 180

tgttccgacc ctgtcacttg tgctcagaac tgtgcccttg atggtgctga ttacgccgga 240

acttacggaa tcaccacctc tggtgacgcc ttgactttga agttcgtcac cggttccaac 300

gtcggttcca gagtctactt gatggaggac gaaactaatt accaattgtt caagttgatg 360

aaccaagagt tcacctttga cgtcgacgtc tccaatttgc catgtggatt gaacggtgcc 420

gtctacttcg ttcagatgga tcaggacgga ggttcttcca agtttccaaa taacaaggcc 480

ggtgccaagt ttggtactgg ttactgcgac tcccagtgcc ctcaagatat taagtttatt 540

aacggagagg ctaacattgt taactggacc gcctccgctg gtgacgccaa ctctggtact 600

ggttctttcg gtacttgctg tcaggagatg gatatctggg aggctaactc catttccgct 660

gcttataccc cacacccttg taccgtcact gagcagacta gatgctctgg ttccgattgt 720

ggtcagggtt ccgacagata caacggaatc tgcgacccag atggttgcga cttcaattct 780

ttcagaatgg gaaataccga gttttatggt aaaggtttga ctgttgacac ttctcagaag 840

ttcactattg tcactcaatt tatctccgac gacggtactg ctgacggtaa cttggccgaa 900

atcagaagat tctacgttca aaatggtaaa gttatcccaa actccgtcgt tcagattacc 960

ggtatcgacc cagtcaactc catcaccgag gacttctgca ctcagcaaaa aactgttttc 1020

ggagataaca ataactttgc tgccaagggt ggattgcagc agatgggtga ggctgttaag 1080

aacggaatgg tcttggcctt gtccttgtgg gacgattacg ctgcccagat gttgtggttg 1140

gactccgact acccaactac tgccgaccct tctaagccag gtgttgccag aggtacctgt 1200

ccaactactt ctggtgtccc ttcccaggtt gagggtcaag agggttcctc ttccgttatt 1260

tactctaaca ttaaattcgg tgatttgaac tccactttca ccggtacttt gaccaaccca 1320

tcctctcctg cttccccacc tgttacttct tccccatctc agccatccca atccactcaa 1380

ccatcccaac cagctcaacc ttcccagcca gctggaactg ctgctcaatg ggctcagtgt 1440

ggtggtatgg gattcactgg acctaccgtc tgtgcttctc cttttacctg tcacgttttg 1500

aacccttact actctcaatg ttac 1524

Claims

1.糖苷水解酶家族7蛋白基因，其特征在于：所述糖苷水解酶家族7蛋白基因核苷酸序列如SEQ ID No.1所示。

2.一种如权利要求1所述的糖苷水解酶家族7蛋白基因编码的蛋白质，其特征在于：所述蛋白质的氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示。

3.一种重组载体，由空载体和插入该空载体的目的基因组成，其特征在于，所述目的基因为权利要求1所述的糖苷水解酶家族7蛋白基因。

4.根据权利要求3所述的重组载体，其特征在于，所述空载体为pET 28载体。

5.一种重组菌，其特征在于：所述重组菌为权利要求3所述的重组载体转化的重组菌。

6.根据权利要求2所述蛋白质的制备方法，其特征在于：包括以下步骤：

1)将权利要求1所述的基因重组构建到载体中；再转化到大肠杆菌菌株中，得到表达株；

7.根据权利要求6所述的制备方法，其特征在于，还包括蛋白纯化步骤：用镍亲合层析柱对步骤2)得到的上清液进行纯化，先用平衡缓冲液平衡层析柱，再将上清液过柱，用含10-50mM咪唑的pH 8.0缓冲液预洗柱子，然后用含100mM～200mM咪唑的pH 8.0缓冲液溶液将融合蛋白洗脱下来即可。

8.根据权利要求2所述的蛋白质在制备葡萄糖中的应用。

9.根据权利要求8所述的应用，其特征在于，所述蛋白质将纤维素分解为葡萄糖的应用。