CN109207497B

CN109207497B - 纤维素外切酶基因和编码的蛋白及其应用

Info

Publication number: CN109207497B
Application number: CN201811238622.2A
Authority: CN
Inventors: 李洪波; 胡兴; 王晓红; 米丹; 张赛名
Original assignee: Huaihua University
Current assignee: Huaihua University
Priority date: 2018-10-23
Filing date: 2018-10-23
Publication date: 2023-07-07
Anticipated expiration: 2038-10-23
Also published as: CN109207497A

Abstract

本发明涉及一种纤维素外切酶基因，所述纤维素外切酶基因核苷酸序列如SEQ ID No.1所示；编码氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示的蛋白质，本发明的基因通过pET32载体在目标蛋白的N‑端融合了一个大小为17kDa左右的Trx片段，使其所表达的蛋白以可溶的形式增量表达出来，进一步通过纯化得到活性和纯度都较好的纯蛋白，而且该蛋白在pH4.0下充分显示出能将纤维素分解为葡萄糖的酶活性，也预示着它在制备将纤维素分解为葡萄糖的酶制剂中有更灵活的运用。

Description

纤维素外切酶基因和编码的蛋白及其应用

技术领域

本发明属于生物基因工程技术领域，涉及纤维素外切酶基因和编码的蛋白及其应用。

背景技术

纤维素是自然界中最丰富的天然有机物，占植物界碳含量的50％以上，堪称为世界上总量最大的可再生资源。地球每年都会产生大量的植物纤维素，我国仅农作物秸秆年产量就高达6×10⁸～7×10⁸吨，但这些宝贵的纤维素资源并没有被有效地利用，只有少部分用于造纸、纺织或用作粗饲料、薪柴等，大部分以堆积、烧荒等形式直接倾入环境，造成极大的污染和浪费。如果未被水解为葡萄糖，纤维素是难以得到充分利用的。虽然以酸或高温处理能降解纤维素，但在这种极端条件下由于原料成分的复杂性将产生很多难以接受的副产物并使葡萄糖受到破坏，所以合理地开发与利用纤维素资源对人类生存环境和可持续发展有着举足轻重的影响。

利用微生物及其产生的纤维素酶(cellulase)来分解纤维素是一种有效且无污染的方法。纤维素酶是降解纤维素的高活性生物催化剂，广泛用于饲料、环保、食品、酿酒、纺织、造纸等领域。纤维素酶属于糖苷水解酶类，是专门催化水解纤维素链中β-1，4-糖苷键的一类酶的总称，是一种高活性生物催化剂，能够分解纤维素产生葡萄糖。根据纤维素酶的结构不同，可把纤维素酶分为两类：纤维素酶复合体和非复合体纤维素酶。纤维素酶复合体是一种超分子结构的多酶蛋白复合体，由多个亚基构成。非复合体纤维素酶由内切糖苷水解酶、外切糖苷水解酶和β-葡聚糖苷酶组成；内切葡聚糖酶(endo-1,4-β-D-glucanase)，可以随机切割纤维素链产生不同长度的寡糖和新的末端；外切葡聚糖酶(exo-1,4-β-D-glucanase)，作用于内切葡聚糖酶切割形成的多糖链的末端，产生葡萄糖和纤维二糖；β-葡萄糖苷酶(β-1,4-glucosidase)，水解纤维二糖生成2分子的葡萄糖。

但纤维素酶的工业化生产受到酶效率低、热稳定性差以及成本较高等诸多因素的限制。随着生物技术的发展，利用基因工程手段开发高活性、高产量的纤维素酶资源越来越受到国内外学者的重视。目前，纤维素酶基因的克隆及表达已经取得了很大的进展,但是还有很大的空间值得人们去研究，开发出越来越多的高活性、高产量的纤维素酶。

发明内容

有鉴于此，本发明的目的在于提供一种纤维素外切酶基因，以及所述基因所编码的蛋白质；进一步还提供一种包含如SEQ ID No.1所示的核苷酸序列的重组载体，以及这种载体所转化的重组菌，进一步该重组菌所表达蛋白质的方法及蛋白纯化方法。

为达到上述目的，本发明提供如下技术方案：

1.纤维素外切酶基因，所述纤维素外切酶基因核苷酸序列如SEQ ID No.1所示。

2.一种如核苷酸序列如SEQ ID No.1所编码的蛋白质，所述蛋白质的氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示。

3.一种重组载体，由空载体和插入该空载体的目的基因组成，所述目的基因为如SEQ ID No.1所示的核苷酸序列。

进一步，所述空载体为pET32载体。

5.一种重组菌，所述重组菌包含如SEQ ID No.1所示核苷酸序列的重组载体转化的重组菌。

6.纤维素外切酶的制备方法，包括以下步骤：

1)将核苷酸序列如SEQ ID No.1所示的基因重组构建到载体中；再转化到大肠杆菌菌株中，得到表达株；

2)将步骤1)表达株在LB液体培养基中培养，并加入0.1～0.5mM的IPTG诱导，发酵完毕，超声破碎，离心取上清，得可溶性重组的纤维素外切酶。

进一步，还包括蛋白纯化步骤：用镍亲合层析柱对步骤2)得到的上清液进行纯化，先用平衡缓冲液平衡层析柱，再将上清液过柱，用含10-50mM咪唑的pH 8.0缓冲液预洗柱子，然后用含100mM和200mM咪唑的pH 8.0缓冲液溶液将依次融合蛋白洗脱下来即可。

6.氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示的纤维素外切酶在制备葡萄糖中的应用。

进一步，所述蛋白质将纤维素分解为葡萄糖的酶制剂中的应用。

本发明的有益效果在于：本发明提供一种新的纤维素外切酶的基因，及其编码的纤维素外切酶，本发明的基因通过pET32载体在目标蛋白的N-端融合了一个大小为17kDa左右的Trx片段，使其所表达的蛋白进一步在可表达的基因基础上以可溶的形式增量表达出来，并通过纯化得到活性和纯度都较好的纯蛋白，而且该蛋白在pH4.0下充分显示出能将纤维素分解为葡萄糖的酶活性，也预示着它在制备将纤维素分解为葡萄糖的酶制剂中有更灵活的运用。

附图说明

为了使本发明的目的、技术方案和有益效果更加清楚，本发明提供如下附图进行说明：

图1为本发明实施例中的pET32/CBH载体构建示意图。

图2为本发明实施例中的含有pET32/CBH载体重组载体表达的目标蛋白的SDS-PAGE检测结果图。

图3为本发明实施例中的纤维素外切酶纯化前后的SDS-PAGE检测结果图。

图4为本发明实施例中的浓缩的纤维素外切酶的SDS-PAGE检测结果图。

图5为本发明对比例中表达的目标蛋白的SDS-PAGE检测结果图。

图6为本发明实施例中pH对纤维素外切酶酶活的影响。

图7为本发明实施例中纤维素外切酶酶活的HPLC检测结果图。

具体实施方式

下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。

下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。

下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。

下述实施例中的％，如无特殊说明，均为质量百分含量。以下实施例中的定量试验，均设置三次重复实验，数据为三次重复实验的平均值或平均值±标准差。

本发明选用大肠杆菌表达菌、载体扩增菌株TOP10和表达载体pET32均购自美国Invritrogen公司。

所用培养基配方如下：

1)LB液体培养基：NaCl 10g，蛋白胨10g，酵母提取物5g，蒸馏水1L，高压灭菌，室温保存；

2)LB/Amp平板：NaCl 10g，蛋白胨10g，酵母提取物5g，蒸馏水1L，琼脂粉15g，高压灭菌后，冷却至70℃以下，加入1mL浓度为100mg/ml的氨苄青霉素(Ampicillin)，充分混均后倒板，4℃避光保存；

3)LB/Amp培养基：NaCl 10g，蛋白胨10g，酵母提取物5g，蒸馏水1L，高压灭菌后，冷却至70℃以下，加入1mL Ampicillin(100mg/ml)，充分混均，4℃保存；LB液体培养基：NaCl10g，蛋白胨10g，酵母提取物5g，蒸馏水1L，高压灭菌，室温保存。

4)50×TAE琼脂糖凝胶电泳缓冲液：Tris碱121g，冰乙酸28.6mL，0.5mol/L EDTA(pH8.0)50mL，加蒸馏水定容至500mL，室温保存；

5)50mg/mL氨苄青霉素保存液：氨苄青霉素0.5g，加蒸馏水溶解并定容至10mL，分装后于-20℃保存；

6)5×SDS-PAGE上样缓冲液：1M Tris-HCl(pH 6.8)1.25mL，SDS 0.5g，BPB 25mg，甘油2.5mL，加去离子水溶解后定容至5mL，分装(约500μL每份)后于室温保存，使用每份加入25μLβ-巯基乙醇混匀；

7)5×SDS-PAGE电泳缓冲液：Tris 15.1g，甘氨酸94g，SDS 5.0g，加入约800mL去离子水，充分搅拌溶解后定容至1L，室温保存；

8)考马斯亮蓝R-250染色液：考马斯亮蓝R-2500.25g，加入225mL甲醇、46mL的冰乙酸、225mL去离子水并搅拌均匀，滤纸去除颗粒物质后，室温保存；

9)考马斯亮蓝脱色液：冰乙酸50mL，甲醇150mL，去离子水300mL，充分混合后，室温保存。

实施例1

本实施例提供了一种优化的人工合成的纤维素外切酶基因(CBH)，具体核苷酸序列如序列表中的SEQ ID No.1所示，该基因所对应的蛋白质氨基酸序列如序列表中的SEQID No.2所示。在NCBI数据库中无相似度达70％的序列，它是根据大肠杆菌表达的特点如密码子的偏好性、防止出现复杂的DNA结构以免影响转录效率、保证合理的GC含量、选择合适的酶切位点、理想的表达标签及终止信号等特点人工优化并合成的众多序列中的一种DNA序列。本发明所述的序列及与本序列高度同源的DNA序列在大肠杆菌中均有较其它序列更高的可溶性目标蛋白的表达。

将上述优化合成的纤维素外切酶基因连接到大肠杆菌表达载体pET32中并获得重组载体，以上经测序验证的重组载体热激转化到大肠杆菌表达菌株的感受态细胞，涂布对应的抗性LB平板，37℃恒温培养箱中培养12小时，筛选转化子，其中pET32/CBH载体构建如图1所示，图1为本发明实施例中的pET32/CBH载体构建示意图。

利用经优化的天然纤维素外切酶基因序列的pET32重组载体为表达载体，其对应的表达菌转化子经0.1-0.5mM的IPTG在18℃下诱导均检测到目标蛋白的表达，其菌体总蛋白SDS-PAGE结果如图2所示，纤维素外切酶蛋白分子量为56kDa左右，pET32载体在目标蛋白的N-端融合了一个大小为17kDa左右的Trx片段，本发明纤维素外切酶大小为73kDa左右，表达的目标蛋白如箭头所示。

S1：优化基因、构建原核表达载体及转化：人工合成SEQ ID No.1基因，连接至pUC通用载体得到pUC/CBH，利用BamHI和HindIII双酶切pUC/CBH，将得到的CBH片段再亚克隆至表达载体pET28中，得到重组表达载体pET32/CBH，载体构建如图1所示。主要的载体构建步骤如下：

(1)用BamH I和Hind III双酶切重组载体pUC/CBH，获得目的片断CBH，反应体系如下(所用内切酶及缓冲液均购自大连TAKARA公司)：

(2)用BamH I和Hind III双酶切pET32，获得载体片断，反应体系如下(所用内切酶及缓冲液均购自大连TAKARA公司)：

(3)将步骤(1)和(2)得到的目的片断和载体片断用DNA凝胶收回试剂盒回收，该试剂盒购自大连TAKARA公司，具体操作按试剂盒说明书进行。

(4)将步骤(3)回收得到的目的片断和载体用T4DNA连接酶(购自大连TAKARA公司)进行连接反应，目的基因准确插入到表达载体读码框内，反应体系如下：

将重组载体pET32/CBH转化到大肠杆菌TOP10菌株中，再从TOP10中提取重组载体pET32/CBH；用热激法将重组载体pET32/CBH转入到宿主细胞大肠杆菌表达菌株中，用含有Amp抗性的LB平板筛选得到包含有重组载体pET32/CBH的大肠杆菌表达菌株转化子。

实施例2

本实施例提供一种纤维素外切酶的方法，具体包括如下步骤：

S2：可溶性纤维素外切酶融合蛋白的表达与提取：将包含有重组载体pET32/CBH的大肠杆菌表达菌株转化子在37℃的液体LB培养基中培养至OD₆₀₀为0.6，然后分别加入浓度为0和0.1mM的IPTG，在18℃诱导24小时，诱导后收集的菌体超声破碎，破碎功率300W，破碎2s，间隙6s，循环90次后，离心取上清液，得到重组的可溶性融合蛋白纤维素外切酶，SDS-PAGE结果如图2所示(其中—代表未加IPTG诱导，+代表加入了0.1mM的IPTG进行诱导)。

S3：纤维素外切酶融合蛋白的纯化：经扩大培养和在18℃下用0.1mM IPTG诱导20-24小时，收集经IPTG诱导表达后的表达菌的菌体，将菌体重悬于30ml的缓冲液A(含20mMNa₂HPO₄，200mM NaCl，10mM咪唑和1mM蛋白酶抑制剂PMSF，pH 8.0)中，然后用超声破碎仪进行破碎，破碎功率300W，破碎2s，间隙6s，循环90次；将破碎后的菌液在4℃下，30000g离心15min；将离心所得到的上清液加入到经缓冲液A预平衡的镍亲合层析柱中；用100ml缓冲液B(含20mM Na₂HPO₄，200mMNaCl，10mM咪唑pH 8.0)漂洗蛋白纯化柱子后，分别加入包括浓度为50、100、200和400mM咪唑的缓冲液C(含20mM Na₂HPO₄，200mM NaCl，pH 8.0)，将蛋白洗脱下来，200mM咪唑洗脱的蛋白是纯度在95％以上的纤维素外切酶融合蛋白具体结果如图3所示。

S4：纤维素外切酶融合蛋白的浓缩：将蛋白质样品在pH4.0的Na₂HPO₄和柠檬酸缓冲液下透析，透析结束后，利用截留分子量为15kDa的超滤管进行超滤浓缩即可得到纯度在95％以上的高浓度重组纤维素外切酶蛋白，结果如图4所示。利用胶扫描并结合Bradford法对目标蛋白的浓度进行了检测，表1是100ml经IPTG诱导的菌体中可溶性纤维素外切酶融合蛋白经各纯化步骤的得率与纯度结果。

表1蛋白纯化结果

或者将蛋白液在分子截留量为15kd的透析袋中用分子量大于10000的PEG包埋浓缩。

或者将将蛋白液进行冷冻干燥浓缩。

需要说明的是，在步骤S2得到的上清液中加入SDS-PAGE样品缓冲液，对其可溶蛋白进行分析。在18℃温度下IPTG的浓度为0.1、0.2和0.5mM时，都可以得到可溶性纤维素外切酶融合蛋白。为节约成本，缩短生产周期，本发明优选采用诱导温度18℃，0.1mM的IPTG进行诱导表达。

对比例

茯苓的形成是由茯苓菌丝体在适宜的条件下寄生于已死松木上，不断分解松木中的营养，并将菌化后的多余物质积聚迅速膨大，形成的营养贮藏器官和休眠器官即为菌核，俗称松茯苓。木材纤维素含量为40％～50％。因此，茯苓菌丝中极可能存在高活性的分泌型纤维素酶。利用转录组技术对茯苓的纤维素酶分解酶的表达谱进行分析发现该高丰度表达的外切酶新基因。利用转录组得到的数据，设计引物，经RT-PCR扩增目标基因并连接至克隆载体，扩增的目标基因序列如序列表中SEQ ID NO.3所示，将茯苓纤维素外切酶新基因用BamH I和Hind III双酶切，并连接到同样经BamH I和Hind III双酶切的pET32表达载体。重组载体经热激转化到大肠杆菌表达菌株的感受态细胞，涂布对应的抗性LB平板，37℃恒温培养箱中培养12小时，筛选转化子。将包含优化前基因的pET32/CBH载体的大肠杆菌重组转化子在37℃的液体LB培养基中培养至OD600为0.4，然后分别加入浓度为0、0.1、0.2、0.5mM的IPTG，在18℃诱导24小时，诱导后收集的菌体超声破碎，破碎功率300W，破碎2s，间隙6s，循环90次后，离心取上清液，未得到重组可溶性纤维素外切酶蛋白，SDS-PAGE结果如图5所示。该对比例结果说明，只有人工优化后的茯苓纤维素外切酶基因才能在大肠杆菌中实现可溶性的表达。

实施例3

(1)本发明采用葡萄糖己糖激酶(HK)法测定纤维素外切酶水解羧甲基纤维素钠(CMC-Na)产生葡萄糖的能力，己糖激酶在有ATP存在下催化葡萄糖(D-Glucose)使其磷酸化生成葡萄糖-6磷酸(G-6-P)，G-6-P和辅酶NAD在葡萄糖-6-磷酸脱氢酶的作用下生成NADH和6-磷酸葡萄糖酸，可通过分光光度法测定NADH在340nm波长下的吸光度变化，定量检测样品中葡萄糖的浓度，具体步骤和结果如下：将2μl浓度为1mg/mL的纯化的纤维素外切酶加入到98μl含1％的CMC-Na的磷酸二氢钠与柠檬酸缓冲液中(pH＝4)，40℃下反应1小时；取反应后的样品10μl、2μl的浓度为10mmol/L NAD与ATP的混合液，补加水至总体积为95μl,室温下反应5min后，加入5μl浓度为2μmol/L的葡萄糖-6-磷酸脱氢酶，室温下反应3min后，于340nm测定吸光值。同时，以葡萄糖标准品制作标准曲线。所得的标准曲线方程为：Y＝0.0089X-0.0004，相关系统r＝0.9994，标准品的检测结果表如表2示。

表2标准品的检测结果

标准品浓度(ng/mL)	0	4	8	12	16	20	24
								OD₄₀₀	0	0.035	0.071	0.110	0.138	0.181	0.214

(2)根据(1)的方法，分别利用pH3-8的磷酸盐缓冲液，对酶活进行了检测。在不同pH值下，相对活力如图6所示，从图中可以看出，该酶的最适pH为4左右。表3为不同pH条件下相对酶活检测结果。

表3不同pH值相对酶活

pH	3	3.5	4	4.5	5
						相对酶活(％)	78	88	100	72	49

(3)酶活的HPLC检测，将纯化的纤维素外切酶100μg加到pH为4的含1％的羧甲基纤维素钠溶液中，40℃下反应1小时；反应结束后，将样品用0.45μm微孔滤膜过滤至样品瓶，供液相色谱分析。液相的方法如下：色谱柱：Aglient氨基柱，250×4.6mm，5μm；流动相：乙腈：水＝70：30(体积比)，流速：1.0mL/min，进样量：10uL，柱温：35℃，检测器：示差折光检测器。HPLC结果如图7所示，其中上图a为CMC-Na在不加该重组茯苓纤维素外切酶的情况下未检测到葡萄糖峰，而下图b中加入外切酶反应1小时后，检测到了明显的葡萄糖峰，说明该外切酶的确具有水解纤维素产生葡萄糖的能力。CMC-Na在不加该重组纤维素外切酶的情况下未检测到葡萄糖峰，当CMC-Na中加入本发明制备的纤维素外切酶反应4小时后，检测到了明显的葡萄糖峰，该峰的保留时间为5.538分钟，葡萄糖浓度约为95ng/μL，说明该外切酶的确具有水解纤维素产生葡萄糖的能力。

因此，根据以上结果，本发明所制备的新的茯苓纤维素外切酶是一种能分解羧甲基纤维素钠产生葡萄糖的、最适pH为4左右的重组茯苓纤维素外切酶。

在本说明书的描述中，参考术语“一个实施例”、“一些实施例”、“示例”、“具体示例”、或“一些示例”等的描述意指结合该实施例或示例描述的具体特征、结构、材料或者特点包含于本发明的至少一个实施例或示例中。在本说明书中，对上述术语的示意性表述不必须针对的是相同的实施例或示例。而且，描述的具体特征、结构、材料或者特点可以在任一个或多个实施例或示例中以合适的方式结合。此外，在不相互矛盾的情况下，本领域的技术人员可以将本说明书中描述的不同实施例或示例以及不同实施例或示例的特征进行结合和组合。

尽管上面已经示出和描述了本发明的实施例，可以理解的是，上述实施例是示例性的，不能理解为对本发明的限制，本领域的普通技术人员在本发明的范围内可以对上述实施例进行变化、修改、替换和变型，而并不使相应技术方案的本质脱离本发明各实施例技术方案的范围，其均应涵盖在本发明的权利要求和说明书的范围当中。最后说明的是，以上优选实施例仅用以说明本发明的技术方案而非限制，尽管通过上述优选实施例已经对本发明进行了详细的描述，但本领域技术人员应当理解，可以在形式上和细节上对其作出各种各样的改变，而不偏离本发明权利要求书所限定的范围。

序列表

<110> 怀化学院

<120> 纤维素外切酶基因和编码的蛋白及其应用

<160> 3

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 1524

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 1

cagcaagctg gaactcaaac tgccgaaaac cacccacagt tgtcctctca gaagtgtact 60

gccggtggtt cttgtacttc tgcttccacc tccgttgtct tggattccaa ctggcgttgg 120

gttcacacta cctccggtta caccaactgc tacactggta acacttggga tgcctccatc 180

tgttccgacc ctgtcacttg tgctcagaac tgtgcccttg atggtgctga ttacgccgga 240

acttacggaa tcaccacctc tggtgacgcc ttgactttga agttcgtcac cggttccaac 300

gtcggttcca gagtctactt gatggaggac gaaactaatt accaattgtt caagttgatg 360

aaccaagagt tcacctttga cgtcgacgtc tccaatttgc catgtggatt gaacggtgcc 420

gtctacttcg ttcagatgga tcaggacgga ggttcttcca agtttccaaa taacaaggcc 480

ggtgccaagt ttggtactgg ttactgcgac tcccagtgcc ctcaagatat taagtttatt 540

aacggagagg ctaacattgt taactggacc gcctccgctg gtgacgccaa ctctggtact 600

ggttctttcg gtacttgctg tcaggagatg gatatctggg aggctaactc catttccgct 660

gcttataccc cacacccttg taccgtcact gagcagacta gatgctctgg ttccgattgt 720

ggtcagggtt ccgacagata caacggaatc tgcgacccag atggttgcga cttcaattct 780

ttcagaatgg gaaataccga gttttatggt aaaggtttga ctgttgacac ttctcagaag 840

ttcactattg tcactcaatt tatctccgac gacggtactg ctgacggtaa cttggccgaa 900

atcagaagat tctacgttca aaatggtaaa gttatcccaa actccgtcgt tcagattacc 960

ggtatcgacc cagtcaactc catcaccgag gacttctgca ctcagcaaaa aactgttttc 1020

ggagataaca ataactttgc tgccaagggt ggattgcagc agatgggtga ggctgttaag 1080

aacggaatgg tcttggcctt gtccttgtgg gacgattacg ctgcccagat gttgtggttg 1140

gactccgact acccaactac tgccgaccct tctaagccag gtgttgccag aggtacctgt 1200

ccaactactt ctggtgtccc ttcccaggtt gagggtcaag agggttcctc ttccgttatt 1260

tactctaaca ttaaattcgg tgatttgaac tccactttca ccggtacttt gaccaaccca 1320

tcctctcctg cttccccacc tgttacttct tccccatctc agccatccca atccactcaa 1380

ccatcccaac cagctcaacc ttcccagcca gctggaactg ctgctcaatg ggctcagtgt 1440

ggtggtatgg gattcactgg acctaccgtc tgtgcttctc cttttacctg tcacgttttg 1500

aacccttact actctcaatg ttac 1524

<210> 2

<211> 508

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 2

Gln Gln Ala Gly Thr Gln Thr Ala Glu Asn His Pro Gln Leu Ser Ser

1 5 10 15

Gln Lys Cys Thr Ala Gly Gly Ser Cys Thr Ser Ala Ser Thr Ser Val

20 25 30

Val Leu Asp Ser Asn Trp Arg Trp Val His Thr Thr Ser Gly Tyr Thr

35 40 45

Asn Cys Tyr Thr Gly Asn Thr Trp Asp Ala Ser Ile Cys Ser Asp Pro

50 55 60

Val Thr Cys Ala Gln Asn Cys Ala Leu Asp Gly Ala Asp Tyr Ala Gly

65 70 75 80

Thr Tyr Gly Ile Thr Thr Ser Gly Asp Ala Leu Thr Leu Lys Phe Val

85 90 95

Thr Gly Ser Asn Val Gly Ser Arg Val Tyr Leu Met Glu Asp Glu Thr

100 105 110

Asn Tyr Gln Leu Phe Lys Leu Met Asn Gln Glu Phe Thr Phe Asp Val

115 120 125

Asp Val Ser Asn Leu Pro Cys Gly Leu Asn Gly Ala Val Tyr Phe Val

130 135 140

Gln Met Asp Gln Asp Gly Gly Ser Ser Lys Phe Pro Asn Asn Lys Ala

145 150 155 160

Gly Ala Lys Phe Gly Thr Gly Tyr Cys Asp Ser Gln Cys Pro Gln Asp

165 170 175

Ile Lys Phe Ile Asn Gly Glu Ala Asn Ile Val Asn Trp Thr Ala Ser

180 185 190

Ala Gly Asp Ala Asn Ser Gly Thr Gly Ser Phe Gly Thr Cys Cys Gln

195 200 205

Glu Met Asp Ile Trp Glu Ala Asn Ser Ile Ser Ala Ala Tyr Thr Pro

210 215 220

His Pro Cys Thr Val Thr Glu Gln Thr Arg Cys Ser Gly Ser Asp Cys

225 230 235 240

Gly Gln Gly Ser Asp Arg Tyr Asn Gly Ile Cys Asp Pro Asp Gly Cys

245 250 255

Asp Phe Asn Ser Phe Arg Met Gly Asn Thr Glu Phe Tyr Gly Lys Gly

260 265 270

Leu Thr Val Asp Thr Ser Gln Lys Phe Thr Ile Val Thr Gln Phe Ile

275 280 285

Ser Asp Asp Gly Thr Ala Asp Gly Asn Leu Ala Glu Ile Arg Arg Phe

290 295 300

Tyr Val Gln Asn Gly Lys Val Ile Pro Asn Ser Val Val Gln Ile Thr

305 310 315 320

Gly Ile Asp Pro Val Asn Ser Ile Thr Glu Asp Phe Cys Thr Gln Gln

325 330 335

Lys Thr Val Phe Gly Asp Asn Asn Asn Phe Ala Ala Lys Gly Gly Leu

340 345 350

Gln Gln Met Gly Glu Ala Val Lys Asn Gly Met Val Leu Ala Leu Ser

355 360 365

Leu Trp Asp Asp Tyr Ala Ala Gln Met Leu Trp Leu Asp Ser Asp Tyr

370 375 380

Pro Thr Thr Ala Asp Pro Ser Lys Pro Gly Val Ala Arg Gly Thr Cys

385 390 395 400

Pro Thr Thr Ser Gly Val Pro Ser Gln Val Glu Gly Gln Glu Gly Ser

405 410 415

Ser Ser Val Ile Tyr Ser Asn Ile Lys Phe Gly Asp Leu Asn Ser Thr

420 425 430

Phe Thr Gly Thr Leu Thr Asn Pro Ser Ser Pro Ala Ser Pro Pro Val

435 440 445

Thr Ser Ser Pro Ser Gln Pro Ser Gln Ser Thr Gln Pro Ser Gln Pro

450 455 460

Ala Gln Pro Ser Gln Pro Ala Gly Thr Ala Ala Gln Trp Ala Gln Cys

465 470 475 480

Gly Gly Met Gly Phe Thr Gly Pro Thr Val Cys Ala Ser Pro Phe Thr

485 490 495

Cys His Val Leu Asn Pro Tyr Tyr Ser Gln Cys Tyr

500 505

<210> 3

<211> 1524

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 3

caacaggccg gcacgcagac cgctgagaac caccctcagc tgtcatccca aaagtgtact 60

gctggtggta gctgcacctc cgcctccacc agtgttgtgc tcgactccaa ctggcgttgg 120

gtccacacca cttccggtta cactaactgc tacactggaa acacgtggga tgcctccatc 180

tgctctgacc cagttacctg tgcccagaac tgtgccctcg atggcgctga ctatgccggc 240

acttacggta tcaccaccag tggcgacgct cttactctca agtttgtgac gggctccaac 300

gtcggctctc gtgtctacct catggaggac gagaccaact accagctgtt caagctcatg 360

aaccaggagt tcactttcga cgtcgacgtc tccaacctcc cctgcggtct taacggtgct 420

gtttacttcg tccagatgga tcaggacggt ggtagctcca agttccccaa caacaaggct 480

ggagccaagt tcggtaccgg ttactgtgac tctcagtgcc ctcaggacat caagttcatc 540

aacggagagg ccaacatcgt caactggact gcctctgctg gagatgctaa ctccggtact 600

ggttctttcg gtacttgctg ccaggagatg gacatctggg aggccaactc catctccgct 660

gcctacaccc ctcacccttg cacggtcact gagcagaccc gctgctctgg ctctgactgt 720

ggacagggca gcgaccgcta caacggtatc tgcgaccccg atggctgtga cttcaactcc 780

ttccgcatgg gtaacaccga gttctacggc aagggcctta ccgttgacac tagccagaag 840

ttcaccatcg tcacccagtt catctctgac gacggcactg ctgacggaaa cctcgccgaa 900

attcgtcgct tctacgtcca aaacggcaag gttatcccta acagcgttgt tcagatcact 960

ggcatcgacc ctgtcaactc catcactgag gacttctgca ctcaacaaaa gaccgtgttc 1020

ggcgacaaca acaacttcgc cgctaagggt ggcctccagc agatgggtga ggctgtcaag 1080

aacggaatgg tcctcgctct ttcgctctgg gacgactacg ccgctcagat gctctggctc 1140

gactccgact accccaccac cgctgacccg tccaagcccg gtgttgctcg tggtacctgc 1200

cccaccacct ccggtgtccc cagccaagtc gagggtcagg aaggcagctc gtccgtcatc 1260

tactcgaaca tcaagttcgg tgacctcaac tcgactttca ccggcaccct caccaacccc 1320

agcagcccag ctagcccacc cgtcaccagc tctccctcgc agccatccca gtctactcag 1380

ccttctcagc ccgctcaacc ctcccagccg gctggtaccg ctgctcagtg ggctcagtgt 1440

ggtggtatgg gcttcaccgg cccaaccgtc tgcgcaagtc ccttcacttg ccacgtcctc 1500

aacccctact actctcagtg ctac 1524

Claims

1.一种重组载体，由空载体和插入该空载体的目的基因组成，其特征在于，所述目的基因为SEQ ID No.1所示的基因，所述空载体为pET32载体。

2.一种重组菌，其特征在于：所述重组菌为权利要求1所述的重组载体转化的重组菌。

3.一种纤维素外切酶的制备方法，其特征在于：包括以下步骤：

1)将权利要求1中所述的基因重组构建到pET32载体中；再转化到大肠杆菌菌株中，得到表达株；

4.根据权利要求3所述的制备方法，其特征在于，还包括蛋白纯化步骤：用镍亲合层析柱对步骤2)得到的上清液进行纯化，先用平衡缓冲液平衡层析柱，再将上清液过柱，用含10-50mM咪唑的pH 8.0缓冲液预洗柱子，然后用含100mM～200mM咪唑的pH 8.0缓冲液溶液将融合蛋白洗脱下来即可。