CN103003421A

CN103003421A - 与木质素结合降低的碳水化合物结合组件

Info

Publication number: CN103003421A
Application number: CN2011800093994A
Authority: CN
Inventors: 约翰·J·托马舍克; 布赖恩·R·斯克特; 丹尼尔·科尔钦斯基
Original assignee: Iogen Energy Corp
Current assignee: Iogen Energy Corp
Priority date: 2010-02-11
Filing date: 2011-02-11
Publication date: 2013-03-27
Also published as: US20160115464A1; BR112012020804A2; US20120295308A1; CA2788387A1; EP2534246A4; US9885028B2; US9206406B2; WO2011097713A1; EP2534246A1

Abstract

本发明提供了经修饰的第1家族碳水化合物结合组件(carbohydrate binding module，CBM)，其在10、11、12、14、17、21、24、29、31、33和37位中的一个或更多个上包含氨基酸替换，所述位置通过第1家族CBM的氨基酸序列与SEQ ID NO：30的比对来确定，并且与SEQ ID NO：30有约50％至约99.9％的氨基酸序列同一性。还提供了包含经修饰的第1家族CBM的经修饰的糖苷酶、用于表达经修饰的第1家族CBM或经修饰的糖苷酶的基因构建体和遗传修饰微生物。在木质素的存在下，经修饰的第1家族CBM使得经修饰的糖苷酶与木质素的结合降低和/或水解活性增加，其可用于在木质素的存在下水解纤维素或半纤维素的方法。

Description

与木质素结合降低的碳水化合物结合组件

技术领域

本发明涉及经修饰的碳水化合物结合组件(carbohydrate bindingmodule)。更具体地，本发明涉及表现出与木质素结合降低的经修饰的第1家族碳水化合物结合组件。本发明还涉及包含经修饰的第1家族碳水化合物结合组件的经修饰的糖苷酶、包含编码经修饰第1家族碳水化合物结合组件或经修饰糖苷酶的核苷酸序列的基因构建体，以及包含经修饰的第1家族碳水化合物结合组件的经修饰的糖苷酶在木质素的存在下水解纤维素或半纤维素底物的用途。

背景技术

地球上多于50％的有机碳发现于植物的细胞壁中。植物细胞壁主要由以下化合物组成：纤维素、半纤维素和木质素。这些化合物总称为“木质纤维素”，它们是发酵成乙醇或其他高值产品的糖和其他有机分子的潜在来源。

由于纤维素乙醇在环境方面的有利且可持续的性质，将木质纤维素(或木质纤维素类生物质)转化为乙醇已成为新兴能源政策的关键特征。针对纤维素转化开发了数种技术。本文关注的方法是：对木质纤维素类生物质进行增加其对水解酶的敏感性的预处理，然后使预处理过的木质纤维素经酶促水解成糖并且将这些糖发酵成乙醇或其他高值的有机分子(如丁醇)。常用的预处理方法包括稀酸蒸汽爆破(美国专利No.4,461,648)、氨冷冻爆破(AFEX；Holtzapple等，1991)和有机溶剂萃取(美国专利No.4,409,032)。水解和发酵系统可以是分开的(顺次水解和发酵；SHF)或者同时发生的(同时糖化和发酵；SSF)。在所有情况下，半纤维素和纤维素都被分解成可发酵的糖，同时将木质素分离并且可用作固体燃料或其他有机分子的来源。

经预处理的木质纤维素的酶促水解用纤维素酶进行。术语纤维素酶广义上指催化纤维素聚合物中连接单个葡萄糖单元之β-1，4-糖苷键的水解的一类糖苷水解酶(或糖苷酶)。催化机制涉及内切葡聚糖酶(酶学委员会编号E.C.3.2.1.4)、纤维二糖水解酶(E.C.3.2.1.91)和β-葡糖苷酶(E.C.3.2.1.21)的协同作用。内切葡聚糖酶水解纤维素链中部可及的糖苷键，而纤维二糖水解酶从这些链末端逐步释放纤维二糖。β-葡糖苷酶将纤维二糖水解为葡萄糖，并且从而使得纤维二糖水解酶的产物抑制最小化。所述酶共同作为可以水解纤维素底物的系统来运作。

纤维素酶和水解多糖或寡糖的其他糖苷水解酶或糖苷酶通常具有相似的组件结构，其由通过柔性接头肽连接起来的一个或更多个催化结构域和一个或更多个碳水化合物结合组件(CBM)组成。已知许多半纤维素酶(如木聚糖酶(E.C.3.2.1.8)、甘露聚糖酶(E.C.3.2.1.78)和阿拉伯呋喃糖苷酶(E.C.3.2.1.55))具有通过柔性接头连接催化结构域与CBM的相似组件结构。半纤维素酶是催化以下键的水解的酶：半纤维素的木聚糖骨架多糖中的糖苷键，或木聚糖骨架中的木糖单元与骨架所连接的其他糖之间的糖苷键。

催化结构域是催化底物中糖苷键水解的独立结构域。已分离和表征了许多糖苷水解酶催化结构域。催化结构域通常(但不一定总是)是两个结构域中较大的一个。将具有相同的三维结构和催化机制(但不一定具有相同的底物特异性)的糖苷水解酶划分为家族(Davies和Henrissat，1995)。迄今为止，已有超过150个糖苷水解酶(Glycoside Hydrolase，GH)家族。纤维素酶存在于许多GH家族中，包括但不限于第5、6、7、8、9、12、44、45、48、51、61和74家族；在第5、8、10、11和43家族中有木聚糖酶；在第5、26和113家族中有甘露聚糖酶；在第3、43、51、54和62家族中有阿拉伯呋喃糖苷酶；在第1和3家族中有β-葡糖苷酶。

此外，接头肽是伸长且具柔性的结构，其保持催化结构域相对于CBM的空间定向(Shen等，1991；Receveur等，2002；Boisset等，1995)。不论是细菌还是真菌来源，纤维素酶和半纤维素酶中天然接头肽的长度为6至60个氨基酸不等。这些肽的化学性质和氨基酸组成相似(如果不是具体序列相似)，其中在接头肽的氨基酸中，氨基酸丝氨酸、苏氨酸和脯氨酸所占比例大于50％(综述见Gilkes等，1991)。接头还包含几个常见类型的带电残基，它们都带负电(如Glu或Asp)或都带正电(如Lys、Arg或His)。丝氨酸和苏氨酸残基可被O-连接聚糖修饰，在真菌中所述O-连接聚糖主要为甘露糖(

等，1984)。小角x射线或动态光散射的结果表明，接头肽的糖基化有利于较伸长的构象，其改变催化结构域和CBM的相对位置。

碳水化合物结合组件(CBM)通常(但不一定总是)小于催化结构域。CBM的作用是使酶与碳水化合物底物接近并且长时间接触，以及增加底物降解的速率。在参与碳水化合物底物降解的多种酶(包括纤维素酶、半纤维素酶、葡聚糖酶、淀粉酶、葡糖淀粉酶、壳多糖酶等)中发现了CBM。因此，CBM能够识别并结合结晶纤维素、非结晶纤维素、壳多糖、β-1，3-葡聚糖、混合的β-1，3-1，4葡聚糖、木聚糖、甘露聚糖、半乳聚糖和淀粉。

正如催化结构域那样，CBM采用多种结构来控制其底物结合亲和性，从而也可根据其结构与功能关系划分为家族。迄今为止已有59种已知的CBM家族(参见URL cazy.org/fam/acc CDM.html)。在过去的二十年中已进行了许多研究来阐明CBM的功能和结构(Boraston等，2004；Hashimoto 2006和Shoseyov等，2006综述)。

本申请涉及第1家族CBM。这些CBM几乎仅发现于真菌酶中，其包括由以下生产的纤维素酶和半纤维素酶：木霉属(Trichoderma ssp.)、曲霉属(Aspergillus ssp.)、肉座菌属(Hypocrea ssp.)、腐质霉属(Humicolassp.)、脉孢菌属(Neurospora ssp.)、Orpinomyces ssp.、赤霉菌属(Gibberellassp.)、裸胞壳属(Emericella ssp.)、毛壳属(Chaetomium ssp.)、金孢属(Chrysosporium ssp.)、镰刀菌属(Fusarium ssp.)、青霉菌属(Penicilliumssp.)、Magnaporthe ssp.、原毛平革菌属(Phanerochaete ssp.)、栓菌属(Trametes ssp.)、埃杜拉香菇(Lentinula edodes)、Gleophyllum trabeiu、Ophiostoma piliferum、Corpinus cinereus、Geomyces pannorum、罗伦隐球酵母(Cryptococcus laurentii)、出芽短梗霉(Aureobasidium pullulans)、煤油霉菌(Amorphotheca resinae)、白冬孢酵母(Leucosporidium scotti)、雅致小克银汉霉(Cunninghamella elegans)、疏棉状嗜热丝孢菌(Thermomyces lanuginosa)、嗜热侧孢霉(Sporotrichum thermophile)和嗜热毁丝霉(Myceliophthora thermophilum)。

最初第1家族CBM被鉴定为真菌纤维素酶的纤维素结合结构域(或CBD)。第1家族CBM包含约40个氨基酸并且可存在于酶的N端或C端。第1家族CBM具有小的楔形β-夹心结构，具有包含以约10埃的距离间隔开的三个芳香族氨基酸(通常为色氨酸)的平坦结合表面(Kraulis等，1989；Mattinen等，1997)。这些芳香族残基有助于通过与底物表面的范德华接触来与结晶底物(如纤维素和壳多糖)的表面结合(Mattinen等，1997；Reinikainen等，1992，Tormo等，1996)。

经预处理的木质纤维素原料的酶促水解在纤维素乙醇生产中是低效步骤，并且其成本是商业可行性的主要障碍之一。广泛认为提高纤维素酶的酶活性或者增加纤维素酶生产效率可能显著地节约成本。

木质素对纤维素酶系统的负面影响已被大量记载。已证明从硬木(白杨)中移除木质素增加酶促水解的产糖率(Kong等，1992)。相似地，已证明从软木(花旗松)中移除木质素改善纤维素的酶促水解，该作用是由于酶对纤维素的可及性提高(Mooney等，1998)。其他小组已证实从里氏木霉(Trichoderma reesei)纯化的纤维素酶与分离的木质素结合(Chernoglazov等，1988)，并且已推测出酶-木质素相互作用中不同结合结构域的作用(Palonen等，2004)。当将木质素加回到纯纤维素系统中时，观察到里氏木霉纤维素酶与木质素结合并且失活(Escoffier等，1991)。另一研究表明木质素对纤维素酶无任何显著影响(Meunier-Goddik和Penner，1999)。而另外的报道提出，一些半纤维素酶可以抵抗木质素及木质素分解产物，甚至被其活化(Kaya等，2000)。尽管如此，通常公认木质素严重限制纤维素的酶促水解。

已证明从里氏木霉纯化的纤维素酶结合分离的木质素(Chernoglazov等，1988)。进一步的工作表明所有的三个结构域(催化核心、接头和CBM)都结合木质素(Palonen等，2004)。例如，天然状态下仅有催化结构域而无CBM的来自于腐质霉属的Cel7B与木质素完全结合(Berlin等，2005)。相似地，没有CBM的木霉Cel5A核心不结合酶促产生的木质素而结合碱提取的木质素，其程度小于与全长蛋白质的结合(Palonen等，2004)。据报道，CBM参与木质素结合。例如，从木霉Cel7A中去除CBM基本上消除了与碱提取的木质素和通过酶促水解制备的木质素剩余物的结合(Palonen等，2004)。

木质素抗性纤维素酶的缺乏是将纤维素转化为可溶性糖(包括葡萄糖)从而生产乙醇和其他产品进行工业化的巨大障碍。木质素抗性酶的开发必须保留其分解纤维素的活性。已提出多种方法以降低木质素对纤维素酶系统的负面影响。已证明非特异性结合蛋白质(如牛血清白蛋白；BSA)阻止纤维素酶与木质素表面的相互作用(Yang和Wyman，2006，美国公开No.2004/0185542A1、美国公开No.2006/0088922A1、WO05024037A2、A3，WO09429474A1)。其他化学阻断剂和表面活性剂表现出相似的作用(Tu等，2007；美国专利No.7,354,743)。

经修饰的糖苷酶和修饰方法已有广泛描述。在大多数情况下，突变被特异性地针对酶的催化结构域。例如，已报道里氏木霉Cel7A和Cel6A催化结构域的变体具有提高的热稳定性(美国专利No.7,375,197、WO2005/028636、美国公开No.2007/0173431、公开No.2008/167214、WO2006/074005、公开No.2006/0205042、美国专利No.7,348,168、WO2008/025164)。特别地，在第6家族纤维素酶中用脯氨酸替换相当于里氏木霉CelA6第413位的位置上的氨基酸(如，黄孢原毛平革菌(Phanerochaete chrysosporium)Cel6A中的S407P突变)使热稳定性增加(WO 2008/025164)。已证明相当于里氏木霉Cel6A和其他第6家族纤维素酶催化结构域内第103、136、186、365和410位的位置上的突变引起葡萄糖抑制降低(美国公开No.2009/0186381A1)。针对纺织应用，已产生了抵抗蛋白酶和用于洗涤剂之表面活性剂的变体(WO 99/01544、WO 94/07998和美国专利No.6,114,296)。

最近，已报道表现出与木质素相互作用减少或者由木质素引起的失活降低的经修饰纤维素酶。例如，WO2010/012102报道了相当于里氏木霉Cel6A(TrCel6A)和其他第6家族纤维素酶催化结构域中129、322、363、365和410位的位置上的突变使木质素存在下的水解活性增加。相似地，WO2009/149202公开了带有突变的纤维素酶变体，其在相当于红褐肉座菌(Hypocrea jecorina)Cel6A接头肽和催化结构域的63、77、129、147、153、161、194、197、203、237、247、254、281、285、289、294、327、339、344、356、378和382位的位置上移除正电荷或引入负电荷。这种纤维素酶变体表现出与乙醇或热处理的木质素亲和力降低。

仅在很少的情况下，接头肽被鉴定为发挥关键作用或作为修饰目标。对腐质霉的第45家族内切葡聚糖酶的接头肽进行修饰以降低蛋白质水解(WO 94/07998、美国专利No.6,114,296)，对木霉Cel7A的接头肽进行修饰以提高热稳定性(美国专利No.7,375,197)。美国公开No.2010/0221778A1报道，降低接头肽的等电点和/或增加其Ser/Thr比的突变也可增加木质素的存在下的水解活性。

对经修饰的CBM的报道相对较少。在一个例子中，Linder等(1995)证明里氏木霉Cel7A的第1家族CBM中结合表面上酪氨酸残基的突变显著降低其与纤维素的结合，而结合表面上其他高度保守但非芳香族的氨基酸的突变所导致的纤维素结合降低程度较小。在另一个例子中，报道了将楔形结构“尖端”的酪氨酸(相当于TrCel6A-CBM中的Tyr33)替换为组氨酸引起与纤维素的pH依赖性结合(Linder等，1999)。然而，尽管已观察到第1家族CBM与木质素相互作用，但未有开发与木质素结合降低之经修饰的第1家族CBM的报道。

发明概述

本发明涉及经修饰的碳水化合物结合组件。更具体地，本发明涉及表现出与木质素结合降低的经修饰的第1家族碳水化合物结合组件。本发明还涉及包含经修饰的第1家族碳水化合物结合组件的经修饰的糖苷酶、包含编码经修饰第1家族碳水化合物结合组件或经修饰糖苷酶的核苷酸序列的基因构建体，以及包含经修饰的第1家族碳水化合物结合组件的经修饰的糖苷酶在木质素的存在下水解纤维素或半纤维素底物的用途。

本发明提供了经修饰的第1家族碳水化合物结合组件，其与木质素的结合降低，并且不仅能使包含经修饰第1家族碳水化合物结合组件的经修饰糖苷酶对木质素的结合降低，还能使所述酶在木质素的存在下的底物水解活性增加。这种经修饰的糖苷酶还可以更容易地从水解反应结束时存在的任何剩余木质素中回收并再利用。

本发明还涉及经修饰的第1家族碳水化合物结合组件，其在选自10、11、12、14、17、21、24、29、31、33和37的一个或更多个位置上包含氨基酸替换。包含氨基酸替换的一个或更多个位置通过将第1家族碳水化合物结合组件的氨基酸序列与SEQ ID NO：30所示的里氏木霉Cel6A碳水化合物结合组件(TrCel6A-CBM)的氨基酸序列进行比对来确定。本发明的经修饰的第1家族碳水化合物结合组件包含与SEQ ID NO：30约50％至约99.9％相同的氨基酸序列，并且能够与结晶纤维素结合。例如，本发明的经修饰的第1家族碳水化合物结合组件包含与SEQ ID NO：30约60％至约99.9％相同、或与SEQ ID NO：30约75％至约99.9％相同的氨基酸序列。

在一个替代实施方案中，本发明的经修饰的第1家族碳水化合物结合组件包含将选自11、12、14、17、24、29和31的一个或更多个位置上的碱性或电中性氨基酸替换为酸性氨基酸，并且与SEQ ID NO：30有约50％至约99.9％的同一性且具有与结晶纤维素结合的能力。例如，11、12、14、17、24、29和31中的一个或更多个位置上的氨基酸被替换为天冬氨酸。

此外，本发明的经修饰的第1家族碳水化合物结合组件包含选自10、21、33和37的一个或更多个位置上的氨基酸替换，并且与SEQ ID NO：30有约50％至约99.9％的同一性且具有与结晶纤维素结合的能力。例如，将第10位上氨基酸替换为丝氨酸，将第21位的氨基酸替换为芳香族氨基酸如酪氨酸，将第33位的氨基酸替换为天冬酰胺，将第37位的氨基酸替换为芳香族氨基酸如酪氨酸。

本发明还涉及包含由一个或更多个接头肽功能性连接的一个或更多个催化结构域和一个或更多个碳水化合物结合组件的经修饰的糖苷酶，所述一个或更多个碳水化合物结合组件中至少一个是以上限定的经修饰的第1家族碳水化合物结合组件。经修饰的糖苷酶相对于亲本糖苷酶表现出在木质素的存在下水解活性的增加和/或木质素结合的减少，所述亲本糖苷酶包含经由相同的一个或更多个接头肽连接的衍生出所述经修饰的碳水化合物结合组件的亲本第1家族碳水化合物结合组件、相同的一个或更多个催化结构域和相同的一个或更多个碳水化合物结合组件。

本发明经修饰的糖苷酶中的一个或更多个催化结构域可以是纤维素酶催化结构域、半纤维素酶催化结构域、β-葡糖苷酶催化结构域和辅助成分催化结构域。本发明经修饰的糖苷酶中的一个或更多个催化结构域可以是野生型催化结构域或相对于野生型催化结构域包含氨基酸替换、插入或缺失的经修饰催化结构域。

本发明经修饰的糖苷酶中的一个或更多个催化结构域可以是第5、6、7、8、9、12、44、45、48、51、61和74家族糖苷水解酶的纤维素酶催化结构域。例如，纤维素酶催化结构域可包含里氏木霉Cel7A第1-436位氨基酸(SEQ ID NO：124)、里氏木霉Cel6A第83-447位氨基酸(SEQ IDNO：1)、特异腐质霉(Humicola insolens)Avi2第97-460位氨基酸(SEQID NO：2)、黄孢原毛平革菌Cel6A第81-440位氨基酸(SEQ ID NO：3)。例如，纤维素酶催化结构域可以包含具有一个或更多个氨基酸替换的里氏木霉Cel6A第83-447位氨基酸(TrCel6A，SEQ ID NO：1)，所述氨基酸替换选自Y103H、Y103K、Y103R、Y103A、Y103V、Y103L、Y103P、K129E、L136V、L136I、S186K、S186T、S186Y、Q204K、G2131D、A322D、Q363E、G365D、G365E、G365Q、G365S、R410A、R410F、R410L、R410Q、R410S和S413P。

本发明经修饰的糖苷酶中的一个或更多个催化结构域还可以是第5、8、10、11、26、43、51、54、62或113家族糖苷水解酶的半纤维素酶催化结构域，第1或3家族糖苷水解酶的β-葡糖苷酶催化结构域，或者是辅助成分催化结构域如膨胀因子(swollenin)、CIP或扩展蛋白(expansin)催化结构域。例如，β-葡糖苷酶催化结构域可以是具有一个或更多个氨基酸替换的SEQ ID No：100的里氏木霉Cel3A，所述氨基酸替换选自V43X、V66X、S72X、V101X、T235X、N248X、F260X、N369X、A386X和I543X。

本发明经修饰的糖苷酶中，除经修饰的第1家族碳水化合物结合组件外的一个或更多个碳水化合物结合组件可以是野生型碳水化合物结合组件，或者是相对于野生型催化结构域包含氨基酸替换、插入或缺失的经修饰碳水化合物结合组件。相似地，本发明经修饰的糖苷酶中的一个或更多个接头肽可以是野生型接头肽，或者是相对于野生型接头肽包含氨基酸替换、插入或缺失的经修饰接头肽。例如，一个或更多个接头肽可以是约6至约60个氨基酸长的经修饰接头肽，其中至少50％的氨基酸为脯氨酸、丝氨酸或苏氨酸，而且所述接头肽包含一个或更多个氨基酸替换、插入或缺失，以使得与衍生出经修饰接头肽的亲本接头肽相比，其计算等电点减小和/或酪氨酸∶丝氨酸比例增加。这种经修饰接头肽使得经修饰的糖苷酶与包含亲本接头肽的亲本糖苷酶相比，在木质素的存在下水解活性增加和/或木质素结合降低。

经修饰的第1家族碳水化合物结合组件、催化结构域、其他碳水化合物结合组件或接头肽中的任一个或全部都可以来源于一种或更多种真菌糖苷酶，产生所述真菌糖苷酶的生物包括但不限于木霉属、曲霉属、肉座菌属、腐质霉属、脉孢菌属、Orpinomyces ssp.、赤霉菌属、裸胞壳属、毛壳属、金孢属、镰刀菌属、青霉菌属、Magnaporthe ssp.、原毛平革菌属、栓菌属、埃杜拉香菇、Gleophyllum trabeiu、Ophiostoma piliferum、Corpinus cinereus、Geomyces pannorum、罗伦隐球酵母、出芽短梗霉、煤油霉菌、白冬孢酵母、雅致小克银汉霉、疏棉状嗜热丝孢菌、嗜热毁丝霉和嗜热侧孢霉。

本发明还涉及包含编码上述经修饰第1家族碳水化合物结合组件或经修饰糖苷酶的核苷酸序列的基因构建体，并且涉及包含用于表达和分泌第1家族碳水化合物结合组件或经修饰糖苷酶的基因构建体的遗传修饰微生物。所述遗传修饰微生物可以是细菌、酵母菌或丝状真菌，如链霉菌属(Streptomyces)、酵母属(Saccharomyces)、毕赤酵母属(Pichia)、汉逊酵母属(Hansenula)、肉座菌属(Hypocrea)、木霉属(Trichoderma)、曲霉属(Aspergillus)、镰刀菌属(Fusarium)、脉孢菌属(Neurospora)、金孢霉属(Chrysoporium)或毁丝霉属(Myceliophthora)。

本发明还涉及生产上述经修饰的第1家族碳水化合物结合组件或经修饰的糖苷酶的方法，其包括以下步骤：在诱导经修饰的第1家族碳水化合物结合组件或经修饰的糖苷酶表达和分泌的条件下，对包含编码经修饰第1家族碳水化合物结合组件或经修饰糖苷酶的基因构建体的遗传修饰微生物进行培养，以及从培养基中回收经修饰的第1家族碳水化合物结合组件或经修饰的糖苷酶。生产上述经修饰的第1家族碳水化合物结合组件或经修饰的糖苷酶的方法可包括用编码经修饰纤维素酶的基因构建体转化宿主细胞的步骤。

本发明还涉及将纤维素或半纤维素底物水解成糖的方法，其包括使底物与上述经修饰的糖苷酶接触。在该方法的一个实施方案中，纤维素或半纤维素底物可以是预处理过的木质纤维素底物。在该方法的另一个实施方案中，经修饰的糖苷酶与亲本糖苷酶相比表现出从该方法所得回收率的改善，所述亲本糖苷酶包含相同的一个或更多个催化结构域、一个或更多个接头肽和一个或更多个碳水化合物结合组件，其中一个或更多个碳水化合物结合组件中的至少一个是衍生出经修饰糖苷酶中的经修饰第1家族碳水化合物结合组件的亲本第1家族碳水化合物结合组件。

将纤维素或半纤维素底物水解成糖的方法可以以连续、半连续或分批补料方法进行。此外，将纤维素或半纤维素底物水解成糖的方法后可进行糖到醇或糖醇的微生物发酵。

附图说明

图1是从里氏木霉中纯化的纤维素酶成分的SDS-PAGE和Western印迹分析。图A示出SDS-PAGE后经纯化的Cel7A、Cel6A、Cel7B和Cel5A的考马斯亮蓝染色。平行分析木霉纤维素酶混合物以进行比较。图B示出在SDS-PAGE分离和电转移到PVDF膜之后，这些样品的成分特异性Western印迹(在每个印迹图的左下角或右下角标明)。

图2示出木质素对含有和不含有CBM的里氏木霉Cel7A(Cel7A和Cel7A核心(Cel7Acore))的作用。图A示出50℃在木质素的存在下里氏木霉Cel7A蛋白质和Cel7A活性的损失，图B示出50℃在木质素的存在下，Cel7Acore蛋白质和Cel7Acore活性的损失。将Cel7A和木瓜蛋白酶处理过的Cel7A(Cel7ACore)与酸提取的木质素一起孵育长达96小时。在整个实验中的不同时间点取样测量上清液(不含木质素)中的Cel7A和Cel7ACore蛋白质浓度。还在木质素浆液中测量了剩余Cel7A和Cel7ACore对预处理过的小麦秸秆随时间的活性。

图3示出将里氏木霉Cel7A的CBM添加到里氏木霉Cel3A中增加Cel3A的木质素结合和与木质素相关的失活。50℃下，将Cel3A(图A)和Cel3A-CBM(图B)与酸提取的木质素一起孵育长达96小时。在整个实验中的不同时间点取样测量各自上清液(不含木质素)中这些蛋白质的浓度。还在它们各自的木质素浆液中测量其随时间的剩余活性。

图4示出木质素对含有和不含有CBM的里氏木霉Cel6A(Cel6A和Cel6Acore)的作用。图A示出30℃在木质素的存在下，Cel6A蛋白质和Cel6A活性的损失，图B示出30℃在木质素的存在下，Cel6ACore蛋白质和Cel6ACore活性的损失。30℃下，将Cel6A(图A)和用木瓜蛋白酶处理产生的Cel6ACore(图B)与酸提取的木质素一起孵育长达96小时。随时间测量各自的上清液中这些蛋白质的浓度以及它们对预处理过的小麦秸秆的剩余活性。

图5绘出分别指导从重组酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)中表达和分泌天然和经修饰HiAvi2和PcCel6A的质粒载体YEp352/PGK91-1-α_ss-NKE-HiAvi2(图A)和YEp352/PGK91-1-α_ss-NKE-PcCel6A-S407P(图B)。

图6绘出指导从重组酿酒酵母中表达和分泌亲本和经修饰的TrCel6A的质粒载体YEp352/PGK91-1ΔNheI-α_ss-TrCel6A-S413P。

图7包括两个散点图。图A是实施例10b中描述的高通量测定中，经BSA处理的木质素的存在下的酶活性(+BSA活性)相对于未处理木质素的存在下的酶活性(-BSA活性)的散点图。数据涉及对以下滤液的筛选：包含亲本和经修饰HiAvi2纤维素酶的微孔板培养物(实施例9)的滤液，或空载体转化体的滤液。图B是实施例10c中描述的高通量测定中，经BSA处理的木质素的存在下的酶活性(+BSA)相对于未处理木质素的存在下的酶活性(-BSA活性)的散点图。数据涉及对以下滤液的筛选：包含亲本(PcCel6A-S407P)和经修饰PcCel6A纤维素酶的微孔板培养物(实施例9)的滤液，或空载体转化体的滤液。

图8示出实施例10a中描述的高通量测定中，经BSA处理的木质素的存在下的酶活性(+BSA活性)相对于未处理的木质素的存在下的酶活性(-BSA活性)的散点图。数据涉及对以下滤液的筛选：包含亲本(TrCel6A-S413P)和经修饰TrCel6A纤维素酶的微孔板培养物(实施例9)的滤液，或者空载体转化体的滤液。

图9绘出指导从重组里氏木霉表达和分泌天然和经修饰TrCel7A糖苷酶的载体pTrCel7A-pyr4-TV。

图10绘出来自TrCel6A、HiAvi2和PcCel6A-S407P易错PCR文库的两类经修饰糖苷酶(即木质素抗性“命中(hits)”和非选择性但具活性的糖苷酶)中CBM结构域内氨基酸替换的分布。将氨基酸改变分为引入正电荷的那些变化(即将中性氨基酸转化为碱性氨基酸，如His、Lys或Arg)或引入负电荷的那些变化(即将中性氨基酸转化为Glu或Asp)。

图11证明通过移除或封闭原位木质素，从预处理过的木质纤维素中回收的野生型TrCel7A糖苷酶增加。将具有增加水平的TrCel3A β-葡糖苷酶的里氏木霉纤维素酶混合物与预处理过的小麦秸秆(WS)、经次氯酸盐漂白预处理的小麦秸秆(bWS)和用牛血清白蛋白预孵育以封闭木质素的预处理过的小麦秸秆(BSA-WS)一起孵育。在整个水解时程中收集样品上清液并且测定葡萄糖和TrCel7A的浓度。在转化率为0.98时，与WS对照相比，涉及bWS和BSA-WS的反应中上清液中存在更多的TrCel7A。

图12示出TrCel7A(PCB entry 1az6)中第1家族CBM的结构，以及根据TrCel7A(PDB entry 1az6)中第1家族CBM的结构计算的TrCel6A、HiAvi2和PcCel6A中CBM的结构。β-折叠结构显示为带。相当于在TrCel7A CBM中观察到的参与纤维素结合之氨基酸的氨基酸用灰色棍结构绘出，而与木质素相互作用的那些氨基酸用黑色球棍结构示出。与木质素和纤维素相互作用的残基也用黑色球棍结构示出。

图13示出从ProSite URL expasy.ch/cgi-bin/aligner？psa＝PS00562&color-1&maxinsert＝10&linelen＝0中获得的34种第1家族CBM的Clustal W比对。

图14示出图13中CBM序列对之间的氨基酸序列同一性。

图15示出TrCel6A、HiAvi2、PcCel6A和TrCel7A中第1家族CBM的比对。使用实施例4的方法发现的在木质素结合降低的经修饰第1家族CBM中被替换的氨基酸用粗体表示。

图16示出如实施例4中所述，在与木质素一起孵育24小时之后，亲本(WT)和经修饰PcCel6A糖苷酶的相对剩余活性。

图17示出如实施例4中所述测定的亲本(WT)和经修饰TrCel6A糖苷酶的相对木质素解离常数(K_L)。

图18示出如实施例4中所述测定的亲本(WT)和经修饰TrCel7A糖苷酶的相对木质素解离常数(K_L)。

发明详述

本发明涉及经修饰的碳水化合物结合组件。更具体地，本发明涉及表现出与木质素结合降低的经修饰的第1家族碳水化合物结合组件。本发明还涉及包含经修饰的第1家族碳水化合物结合组件的经修饰的糖苷酶、包含编码经修饰第1家族碳水化合物结合组件或经修饰糖苷酶的核苷酸序列的基因构建体、以及包含经修饰的第1家族碳水化合物结合组件的经修饰的糖苷酶在木质素的存在下水解纤维素或半纤维素底物的用途。

本发明提供了经修饰的第1家族碳水化合物结合组件，其与木质素的结合降低，并且不仅能使包含经修饰第1家族碳水化合物结合组件的经修饰糖苷酶对木质素的结合降低，还能使所述酶在木质素的存在下的底物水解活性增加。

以下描述是只是通过举例的方式描述本发明的一个优选实施方案，而不限制实施本发明所必需的特征的组合。提供的标题并非意在限制本发明的多个实施方案。术语如“包含”、“包括”、“含有”并非意于限制。此外，除非另有说明，不使用数量词时包括复数的情况，并且“或”是指“和/或”。除非本文中另有限定，本文中所使用的所有技术和科学术语的含义与本领域普通技术人员通常理解的相同。

第1家族碳水化合物结合组件

碳水化合物结合组件或CBM是糖苷水解酶和识别并结合多糖的其他蛋白质的非催化结构域。CBM常常发现于含有降解不可溶多糖的糖苷水解酶的真菌和细菌蛋白中。但是，在不包含糖苷水解酶结构域但是参与不可溶多糖(如纤维素)降解的蛋白质中也鉴定到CBM。这些包括但不限于Cip1(Foreman等，2003)和膨胀因子(Saloheimo等，2002)。根据氨基酸序列相似性将CBM划分成家族；目前有59个CBM家族(http://www.cazy.org/Carbohydrate-Binding-Modules.html)。在这些CBM中，已证明不同成员识别结晶纤维素、非结晶纤维素、壳多糖、β-葡聚糖、木聚糖、甘露聚糖、半乳聚糖和淀粉。有时将与纤维素结合的CBM称为术语“纤维素结合结构域”或“CBD”。第1家族CBM对于结晶纤维素具有高结合亲和力，而其他家族的CBM对于非晶纤维素或单链多糖具有高结合亲和力(Boraston等，1004)。

正如Shoseyov等(2006)归纳的，已研究了CBM的碳水化合物结合活性以用于许多应用。例如，已证明分离的CBM在纤维素纤维的非水解性破坏和纤维性质的改变中发挥作用。此外，CBM已用于生物技术应用中，其作为亲和标签用于重组的融合蛋白的生物特异性亲和纯化，或用于使通常不包含CBM的酶靶向天然纤维(例如使氧化酶靶向织物表面)。CBM还用作表征纤维表面或检测植物细胞壁中的多糖的分析工具。已开发CBM二聚体作为新的纤维素交联蛋白，已证实其有效增强纸的机械性质或改变其表面性质。最后，当在转基因植物中表达时，已证明CBM增加纤维素生物合成和/或生长的速率。

在真菌中，CBM是同源的并且是第1家族CBM(CBM1)的成员。里氏木霉纤维素酶、半纤维素酶和相关蛋白质中的CBM序列见表1。四个半胱氨酸是高度保守的并且形成两个二硫键。三个芳香族氨基酸(色氨酸、酪氨酸或苯丙氨酸)也是保守的，它们形成平面并且经由范德华相互作用与纤维素聚合物的葡萄糖单元直接相互作用。第1家族CBM对结晶纤维素有高结合亲和力。

第1家族CBM在本文中被定义为根据CAZy系统(参见http://www.cazy.org/Carbohydrate-Binding-Modules.html作为参考)划分为第1家族CBM的任何蛋白质序列。第1家族CBM可与SEQ ID NO：30所示里氏木霉Cel6A(也称作纤维二糖水解酶II或CBH2)CBM的氨基酸序列有约50％的氨基酸序列同一性。例如，第1家族CBM可与SEQ ID NO：30所提供的里氏木霉TrCel6A有约50％、60％、70％、80％、90％或95％的氨基酸同一性。本领域技术人员公认给定CBM的氨基酸序列可通过添加、缺失或替换一个或更多个氨基酸进行修饰并且仍被认为是CBM。

当CBM位于分泌的糖苷酶的N端时，本领域技术人员公认当给CBM的氨基酸编号时，不考虑构成分泌信号肽的氨基酸。本文中，第1家族CBM中氨基酸的编号从相当于TrCel6A(SEQ ID NO：1)中第一个谷氨酰胺(Q)的位置上开始。

表1：里氏木霉蛋白质中第1家族CBM的序列

如图13所示，第1家族纤维结合域中的一级氨基酸序列高度保守。目前已知的34种真菌来源第1家族CBM氨基酸序列的多重比对表明，大多数天然第1家族CBM与包含TrCel6A第1家族CBM的3-39位氨基酸有约45％至约100％的氨基酸序列同一性，并且与至少一个其他第1家族CBM有约40％至约95％的氨基酸序列同一性(图14)。

使用人工比对或本领域技术人员已知的任何序列比对算法，可以容易地通过比对两种序列的氨基酸来确定序列同一性。图13和14中分别示出的比对和同一性计算使用在BioEdit软件版本7.0.9.0(2007年6月27日)中提供的具有缺省设置的ClustalW多重比对工具来确定。本领域技术人员已知的其他比对算法包括但不限于BLAST算法(BLAST和BLAST 2.0；Altschul等，1997和1990)、Smith&Waterman(1981)公开的算法、Needleman&Wunsch(1970)的同源比对算法、Pearson&Lipman(1988)的\搜索相似性方法、计算机执行的这些算法(在Wisconsin GeneticsSoftware Package，Genetics Computer Group，575Science Dr.，Madison，Wis.中的GAP、BESTFIT、FASTA和TFASTA)，或者人工比对和目测。

“经修饰的第1家族碳水化合物结合组件”或“经修饰的第1家族CBM”意指结合结晶纤维素并且在选自10、11、12、14、17、21、24、29、31、33和37的一个或更多个位置上包含氨基酸替换的第1家族CBM，所述位置通过将第1家族碳水化合物结合组件的氨基酸序列与SEQ IDNO：30中所示里氏木霉Cel6A碳水化合物结合组件的氨基酸序列进行比对来确定。本文中所用的经修饰的第1家族CBM不包括天然CBM。

正如本领域技术人员已知的，蛋白质(如CBM)与其配体或底物(如纤维素)的结合可以通过建立结合等温线进行定量。在这些实验中，添加到包含恒量底物或配体的溶液或悬液中的蛋白质的吸收率会随着所添加蛋白质量的增加而增加，直至底物被蛋白质饱和为止。在Linder等(1995和1999)、Mattinen等(1997)和Reinikainen等(1992)中描述了使用结合等温线来评价和定量第1家族CBM与纤维素结合的方法。可以使用Nidetzky等(1994)的方法或者使用实施例4和14中提供的方法评价和定量包含亲本或经修饰的第1家族CBM的糖苷酶与纤维素底物的结合。

例如，经修饰的第1家族CBM可以在选自11、12、14、17、24、29和31的一个或更多个位置上包含将碱性或电中性氨基酸替换为酸性氨基酸的替换。本文中所限定的“碱性氨基酸”是指组氨酸、赖氨酸或精氨酸中的任何一种，“酸性氨基酸”是指天冬氨酸或谷氨酸中的任何一种，“电中性氨基酸”是指不是碱性或酸性氨基酸的任何一种氨基酸。

经修饰的第1家族CBM还在选自10、21、33和37的一个或更多个位置上包含氨基酸替换。例如，将第10位的氨基酸替换为丝氨酸，将第21位的氨基酸替换为芳香族氨基酸如酪氨酸，将第33位的氨基酸替换为天冬酰胺，将第37位的氨基酸替换为芳香族氨基酸如酪氨酸。

经修饰的第1家族碳水化合物结合组件的氨基酸序列与SEQ ID NO：30有约50％至约99.9％或其间任何量的氨基酸序列同一性。例如，经修饰的第1家族CBM的氨基酸序列可以与SEQ ID NO：30有约50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％或99.9％的氨基酸序列同一性。“野生型”或“天然”第1家族CBM是指在自然界发现的没有任何氨基酸替换、插入或缺失的第1家族CBM。

应理解的是，经修饰的第1家族CBM可来源于野生型第1家族CBM或已包含另外的氨基酸替换的第1家族CBM。

本发明的经修饰的第1家族CBM由核酸序列编码，该核酸序列可以使用遗传物质或期望的经修饰第1家族CBM或相应亲本第1家族CBM特有的核酸或氨基酸序列信息生成。正如本领域技术人员所已知的，使用改变氨基酸序列的一种或更多种分子生物学技术，这种遗传物质或序列信息可以用于生成编码期望的经修饰第1家族CBM的核酸序列，所述分子生物学技术包括但不限于定点诱变、盒式诱变、随机诱变、合成寡核苷酸构建体、克隆、亚克隆、PCR扩增、体外合成和本领域技术人员已知的其他基因工程技术。应理解的是，经修饰第1家族可来源于任何亲本第1家族CBM，即其可来源于天然或“野生型”第1家族CBM或已包含另外的氨基酸替换的第1家族CBM。

例如，经修饰的第1家族CBM可表现出与木质素结合的降低。在另一个实施方案中，经修饰的第1家族碳水化合物结合组件可以使糖苷酶与木质素的结合降低或者木质素存在下的底物水解活性增加，所述糖苷酶包含由一个或更多个接头肽连接的经修饰的第1家族碳水化合物结合组件、一个或更多个催化结构域和一个或更多个碳水化合物结合组件。

为了本发明的目的，“亲本第1家族CBM”或“亲本第1家族碳水化合物结合组件”是不包含经修饰第1家族CBM中的氨基酸替换的第1家族CBM。因此，亲本第1家族CBM可以是在另外的位置包含通过基因工程或其他技术引入的氨基酸替换且能够与纤维素结合的第1家族CBM。亲本第1家族CBM还可以是野生型第1家族CBM。或者，在生产经修饰的第1家族CBM之后，随后经修饰的第1家族CBM可进一步被修饰为包含另外的氨基酸替换。

经修饰的糖苷酶

本文所用的糖苷酶包含一个或更多个催化结构域和一个或更多个碳水化合物结合组件(CBM)，它们由定位在结构域之间的一个或更多个接头肽连接。一个或更多个催化结构域、一个或更多个CBM和一个或更多个接头肽彼此可以是同源的(即属于自然界中分离的同一种糖苷酶)，或者与至少一个其他结构域是异源的(即从相同或不同生物来源的两种或更多种不同的天然糖苷酶中分离)。一个或更多个催化结构域、一个或更多个CBM和一个或更多个接头肽的氨基酸序列可以是“天然的”或“野生型”(即与自然界中产生的未经修饰的糖苷酶中所发现的一样)，或者它们可以通过修饰其氨基酸序列“来源”于的天然或野生型糖苷酶。术语“糖苷酶”可以与术语“糖苷水解酶”互换使用。

糖苷酶可包含另外的功能结构域(如黏结蛋白、对接素(dockerin)或纤连蛋白样(Fn3)结构域)并且仍然被认为是糖苷酶。

可从其分离或衍生一个或更多个催化结构域、一个或更多个CBM和一个或更多个接头肽的糖苷酶的实例包括来自于多种微生物的糖苷酶，所述微生物如木霉属、曲霉属、肉座菌属、腐质霉属、脉孢菌属、Orpinomycesssp.、赤霉菌属、裸胞壳属、毛壳属、金孢属、镰刀菌属、青霉菌属、Magnaporthe ssp.、原毛平革菌属、栓菌属、埃杜拉香菇、Gleophyllumtrabeiu、Ophiostoma piliferum、Corpinus cinereus、Geomyces pannorum、罗伦隐球酵母、出芽短梗霉、煤油霉菌、白冬孢酵母、雅致小克银汉霉、疏棉状嗜热丝孢菌、嗜热侧孢霉或嗜热毁丝霉。本发明的实施不限于可从其得到一个或更多个催化结构域、一个或更多个CBM和一个或更多个接头肽的糖苷酶。

本文所用的“经修饰的糖苷酶”是包含一个或更多个催化结构域、一个或更多个CBM和一个或更多个接头肽的糖苷酶，其中一个或更多个CBM中的至少一个是在选自10、11、12、14、17、21、24、29、31、33和37的一个或更多个位置上包含氨基酸替换的经修饰的第1家族CBM并且表现为结合结晶纤维素且与SEQ ID NO：30有约50％至约99.9％同一性。一个或更多个催化结构域可以是野生型或经修饰的催化结构域，一个或更多个接头肽可以是野生型或经修饰的接头肽。本文所用术语“经修饰的糖苷酶”不包括天然糖苷酶。

本文所用“亲本糖苷酶”是除至少一个或更多个CBM是衍生出经修饰糖苷酶中的经修饰第1家族CBM的亲本第1家族CBM之外，包含与经修饰的糖苷酶相同的一个或更多个催化结构域、一个或更多个CBM和一个或更多个接头肽的糖苷酶。此外，除亲本糖苷酶中的亲本第1家族CBM在选自10、11、12、14、17、21、24、29、31、33和37的一个或更多个位置上不包含氨基酸替换之外，其与经修饰的糖苷酶中的经修饰的第1家族CBM相同。本领域技术人员公认的是，相对于天然催化结构域、CBM或接头肽，一个或更多个催化结构域、一个或更多个CBM、亲本第1家族CBM和一个或更多个接头肽可以包含氨基酸替换、插入或缺失，前提是这些氨基酸替换也存在于经修饰的糖苷酶中。

在本发明的经修饰的糖苷酶中，一个或更多个催化结构域可以是纤维素酶催化结构域、半纤维素酶催化结构域、β-葡糖苷酶催化结构域或辅助蛋白催化结构域。

“纤维素酶催化结构域”被定义为能够切割纤维素聚合物中的β-1，4-糖苷键的任何结构域。纤维素酶催化结构域可以是内切葡聚糖酶(EC3.2.1.4)，其切割纤维素聚合物中的内部β-1，4-糖苷键以降低聚合物的聚合度和/或释放寡糖。纤维素酶催化结构域还可以是外切葡聚糖酶或纤维二糖水解酶(EC 3.2.1.91)，其从纤维素聚合物的末端释放小的寡糖，主要是纤维二糖。纤维素聚合物可以是天然纤维素，如由植物或藻类或其他生物产生的纤维素，并且可以是纯的或者是植物生物质中的几种成分之一，其也包含木质素和半纤维素。纤维素聚合物还可以是纤维素衍生物，如羧甲基纤维素或羟乙基纤维素。纤维素酶催化结构域可以是第5、6、7、8、9、12、44、45、48、51、61和74家族GH的成员。例如，纤维素酶催化结构域可包含里氏木霉Cel7A第1-436位氨基酸(SEQ ID NO：124)、里氏木霉Cel6A的83-447位氨基酸(SEQ ID NO：1)、特异腐质霉Avi2的97-460位氨基酸(SEQ ID NO：2)，或黄孢原毛平革菌Cel6A的81-440位氨基酸(SEQ ID NO：3)。例如，纤维素酶催化结构域可包含用一个或更多个氨基酸替换的里氏木霉Cel6A的83-447位氨基酸(SEQ ID NO：1)，其中一个或更多个氨基酸替换选自Y103H、Y103K、Y103R、Y103A、Y103V、Y103L、Y103P、K129E L136V、L136I、S186K、S186T、S186Y、Q204K、G231D、A322D、Q363E、G365D、G365E、G365Q、G365S、R410A、R410F、R410L、R410Q和R410S。

“半纤维素酶催化结构域”被定义为能够切割半纤维素聚合物中的β-1，4-糖苷键的任何结构域。例如，半纤维素酶催化结构域可以是木聚糖酶(E.C.3.2.1.8)、β-甘露聚糖酶(E.C.3.2.1.78)或阿拉伯呋喃糖苷酶(E.C.3.2.1.55)。或者，半纤维素酶催化结构域可以是第5、8、10、11、26、43、51、54、62或113家族糖苷水解酶的成员。

“β-葡糖苷酶”催化结构域被定义为能够从小的β-1，4-连接寡糖(如纤维二糖)产生葡萄糖的任何结构域。β-葡糖苷酶(E.C.3.2.1.21)可以是第1或3家族糖苷水解酶的成员。例如，β-葡糖苷酶催化结构域可以是具有选自V43X、V66X、S72X、V101X、T235X、N248X、F260X、N369X、A386X和I543X的一个或更多个氨基酸替换的里氏木霉Cel3A(SEQ IDNO：100)，它使得TrCel3A β-葡糖苷酶的稳定性和/或催化效率提高(美国公开No.2010/0093040A1和美国公开No.2010/0304438A1)。

最后，“辅助蛋白催化结构域”包括与纤维素相互作用以利于纤维素水解的蛋白质，其包括但不限于Cip1、Cip2、膨胀因子和扩展蛋白。辅助蛋白催化结构域还包含有助于水解木质纤维素的其他蛋白质，如乙酰木聚糖酯酶(E.C.3.1.1.72)、阿魏酸酯酶(E.C.3.1.1.73)和纤维二糖脱氢酶(E.C.1.1.99.18)。

本领域技术人员公认的是，给定催化结构域的氨基酸序列可以通过插入、缺失或替换一个或更多个氨基酸进行修饰并且仍然被认为是纤维素酶催化结构域。

CBM和催化结构域常常通过接头肽分隔开。术语“接头肽”应理解为位于两个功能结构域之间并且包含约6至约60个氨基酸的氨基酸段。可以使用如Bae等(2008)和Suyama等(2003)描述的模型从氨基酸序列信息中鉴定接头肽。Gilkes等(1991)介绍了该定义中涵盖的多种纤维素酶以及其他细菌和真菌蛋白质的接头序列。相对于非接头序列，接头肽通常是碱性肽，特别是富含丝氨酸、苏氨酸和脯氨酸。如Gilkes等(1991)的表I中所示，在细菌和真菌糖苷水解酶(木聚糖酶、内切葡聚糖酶、外切葡聚糖酶)的全部接头肽序列中，脯氨酸、丝氨酸和苏氨酸占氨基酸的50％以上。为了本文中限定的目的，接头肽可被定义为天然的、发现于催化结构域与CBM、两个催化结构域、两个CBM之间或另一个功能域与催化结构域或CBM之间的约6至约60个氨基酸的段，其中至少50％为脯氨酸、丝氨酸或苏氨酸。在接头肽中，脯氨酸、丝氨酸和苏氨酸可以占氨基酸的50％、60％、70％、80％、90％或100％((脯氨酸+苏氨酸+丝氨酸数)/接头中的氨基酸数×100％)。本领域技术人员公认的是，给定接头的氨基酸序列可以通过插入、缺失或替换一个或更多个氨基酸进行修饰并且仍然被认为是接头肽。

除以上定义的经修饰的第1家族CBM之外，经修饰的糖苷酶可包含另外的CBM。这些另外的CBM可来源于使用CAZy系统(参见http://www.cazy.org/Carbohydrate-Binding-Modules.html)确定的59个CBM家族中的任一个。

最后，经修饰的糖苷酶可包含其他结构域，包括但不限于纤连蛋白样(Fn3)结构域、黏结蛋白、对接素或其他碳水化合物(例如淀粉酶、葡糖淀粉酶、壳多糖酶等)活性结构域。

测量木质素结合

上述亲本或经修饰的第1家族CBM或者亲本和经修饰的糖苷酶与木质素的结合程度可以通过下述过程测定：将CBM或糖苷酶与纯化的木质素一起预孵育一段时间，然后使用本领域技术人员已知的测定方法测量溶液和/或木质素-蛋白质浆液中的剩余蛋白质浓度和/或酶活性。图16中示出包含第6家族纤维素酶催化结构域和亲本或经修饰第1家族CBM的亲本和经修饰糖苷酶在与木质素一起孵育24小时之后的相对剩余活性。

如果纯化的木质素不可溶，那么通过离心或过滤可以很容易地将蛋白质-木质素复合物从包含未结合蛋白质的溶液主体中分离出来。可以通过酸提取、碱提取、有机溶剂提取或用水解酶酶促消化木质纤维素来从木质纤维素原料(下面描述的)中纯化木质素。对亲本和经修饰的第1家族CBM或糖苷酶的相对结合的测定不依赖于木质素纯化方法、木质素来源或用于检测溶液中蛋白质的测定方法。实施例4中提供了测量亲本和经修饰第1家族CBM，以及亲本和经修饰糖苷酶的相对结合的方法。

亲本和经修饰的第1家族CBM或亲本和经修饰的糖苷酶与木质素的相对结合可以这样测定：如实施例4中所述，计算经修饰的第1家族CBM或糖苷酶的木质素解离常数(K_L)，然后除以对亲本CBM或糖苷酶计算的木质素解离常数(K_L)。图17和18中示出包含第6或7家族纤维素酶催化结构域的经修饰糖苷酶的相对K_L值。

经修饰的糖苷酶因木质素而失活的减少可以这样测定：在存在和不存在木质素的情况下，测量底物(如偶氮键葡聚糖或纤维素)的降解，然后得到木质素存在时的活性与木质素不存在时的活性之比。这种水解反应中存在的木质素可以是不溶底物的一部分(如预处理过的木质纤维素中)，或者是以可溶或不可溶形式分离。如果木质素被分离或纯化，那么木质素对经修饰或亲本糖苷酶的失活通过测量等价水解反应的活性来测定，其中反应之一包含足够量的木质素以降低糖苷酶活性。或者，通过包被非特异性蛋白质(如牛血清白蛋白(BSA))、表面活性剂或其他化学品将分离的木质素处理灭活能力降低，它们可以以与未处理木质素相同的量加入到对照反应中。如果木质素是不可溶底物的一部分，那么木质素对经修饰或亲本糖苷酶的失活这样测定：得到对漂白底物(从其中移除木质素，例如，通过氧化剂如二氧化氯)的糖苷酶活性与对包含木质素之未漂白底物的糖苷酶活性的比例。与亲本糖苷酶相比，经修饰的糖苷酶因木质素而失活的降低表现出更高的活性比(未处理的分离的木质素：无木质素或处理的木质素)。实施例10中提供了在存在木质素酶的情况下，分别包含亲本和经修饰第1家族CBM的亲本和经修饰糖苷酶的相对活性的测量方法。

有几种本领域技术人员已知的测量经修饰和亲本糖苷酶的底物水解活性的测定法。例如，纤维素或半纤维素的水解可以通过测量还原糖的酶依赖性释放来监测，还原糖在随后进行的本领域技术人员已知的化学或化学酶促测定(如二硝基水杨酸(DNS)反应)中定量。多糖的水解还可以通过色谱方法来监测，该色谱方法对通过酶作用释放的可溶性单糖、二糖和寡糖进行分离和定量。此外，可以将可溶性比色底物掺入琼脂培养基中，在该培养基中培养表达并分泌亲本或经修饰纤维素酶的宿主微生物。在这种琼脂板测定中，纤维素酶的活性通过在表达和分泌活性纤维素酶的单个微生物菌落周围的有色或无色环来检测。然而应理解的是，本发明的实施并不限于评价经修饰糖苷酶的活性的方法。

在木质素浆液中预孵育之后，可以测定第1家族CBM的存在和不存在对纤维素酶催化结构域(例如第7家族和第6家族催化结构域)或第3家族β-葡糖苷酶催化结构域的蛋白质稳定性和底物水解活性的影响。图2、3和4的数据表明，第1家族CBM的存在大大增加了水解反应中木质素对溶液中蛋白质的截留，但是对其附接的催化结构域的水解活性影响很小。此外，图11表明带有野生型第1家族CBM的Cel7A从其中底物不含木质素或者木质素被非特异性蛋白质“封闭”的水解反应中更易回收。

在存在未处理木质素(-BSA)和经处理木质素(+BSA)的情况下，通过实施例10所述的亲本与经修饰糖苷酶的对比研究来测定包含亲本或经修饰第1家族CBM的亲本和经修饰糖苷酶的纤维素水解活性。结果示于下表2中。包含第1家族CBM的所有经修饰的糖苷酶均表现出木质素结合至少20％的降低(K_L高出20％)，和/或在存在未处理木质素的情况下的活性与存在BSA处理之木质素的情况下的活性之比高出11％(±BSA活性比增加10％)。

表2：包含经修饰的第1家族CBM并且在木质素的存在下表现出增强的水解活性(相对于亲本糖苷酶)的经修饰糖苷酶

编码经修饰的第1家族碳水化合物结合组件或经修饰的糖苷酶的基因构建体

本发明还涉及包含多核苷酸序列的基因构建体，所述多核苷酸序列编码与调控性多核苷酸序列有效连接的经修饰的第1家族碳水化合物结合组件或经修饰的糖苷酶，所述调控性多核苷酸序列指导从宿主微生物中表达和分泌经修饰的第1家族碳水化合物结合组件或经修饰的糖苷酶。“调控性多核苷酸序列”是指启动子和编码分泌信号肽的多核苷酸序列。调控性多核苷酸序列可以来源于在工业发酵条件下在宿主微生物中高度表达和分泌的基因。例如，调控序列可来源于里氏木霉纤维素酶或半纤维素酶基因中的任一种或更多种。

如本领域技术人员普遍已知的，基因构建体还可包含选择标记基因以使得能够分离用构建体转化的遗传修饰微生物。选择标记基因可赋予宿主生物对抗生素的抗性或在缺乏特定营养物的培养基上生长的能力，否则宿主生物不能在这些条件下生长。本发明不受限于选择标记基因的选择，并且本领域技术人员可以容易地确定合适的基因。例如，选择标记基因可以赋予对潮霉素、腐草霉素、卡那霉素、遗传霉素或G418的抗性，从而弥补宿主微生物中trp、arg、leu、pyr4、pyr、ura3、ura5、his或ade基因之一的缺陷，或者赋予在以乙酰胺作为唯一氮源时生长的能力。

基因构建体还可包含另外的多核苷酸序列，例如，转录终止子、编码肽标签的多核苷酸、将多种多核苷酸序列连接在一起的合成序列、复制起点等。本发明的实施不受限于这些另外的多核苷酸序列中任一种或更多种的存在。

生产经修饰的第1家族碳水化合物结合组件或经修饰的糖苷酶的遗传修饰微生物

经修饰的第1家族碳水化合物结合组件或经修饰的糖苷酶可以由遗传修饰微生物表达和分泌，所述遗传修饰微生物通过用编码经修饰第1家族碳水化合物结合组件或经修饰糖苷酶的基因构建体转化宿主微生物来得到。宿主微生物可以是细菌(如大肠杆菌(Escherichia coli)或变铅青链霉菌(Streptomyces lividans))、酵母(如酵母属、毕赤酵母或汉逊酵母)，或丝状真菌(木霉、肉座菌、曲霉、镰刀菌、腐质霉、金孢霉、毁丝霉、孢子丝菌(Sporotrichum)、梭孢壳菌(Thielavia)或脉孢菌)。在一个最优选实施方案中，宿主微生物是里氏木霉的工业菌株。

通过微生物转化领域技术人员已知的任意方法可将基因构建体引入到宿主微生物中，所述微生物转化包括但不限于用CaCl₂处理细胞、电穿孔、基因枪轰击(biolistic bombardment)、PEG介导的原生质体融合(例如White等，WO 2005/093072)。在选择表达经修饰的纤维素酶的重组真菌株之后，可以在诱导经修饰纤维素酶表达的条件下，在浸没式液体发酵中培养选择的重组菌株。

生产经修饰的第1家族碳水化合物结合组件或经修饰的糖苷酶

通过包含编码经修饰第1家族碳水化合物结合组件或经修饰糖苷酶的基因构建体的遗传修饰微生物，可在发酵过程中生产本发明的经修饰第1家族碳水化合物结合组件或经修饰糖苷酶，例如在浸没式液体培养发酵中。

微生物(包括木霉和相关丝状真菌)的浸没式液体发酵通常以分批、补料分批或连续过程进行。在分批过程中，除用于需氧过程的氧气之外，在运行开始时将所有必需材料放置于反应器中并且使发酵进行直至完成，此时收集产物。用于生产本发明的经修饰第1家族碳水化合物结合组件或经修饰糖苷酶的分批过程可以在摇瓶或生物反应器中进行。

在补料分批过程中，在不移除培养物流体的情况下连续地或顺序地向培养物中投入一种或更多种培养基成分。在连续过程中，以等体积速率提供新鲜的培养基并且移除培养物流体以使培养物维持稳定的生长速率。

本领域技术人员已知发酵培养基包含碳源、氮源和另外的营养物、维生素和矿物质，可以将它们添加到发酵培养基中以提高宿主细胞的生长和酶生产。这些另外的培养基成分可以在将宿主细胞接种在培养物上之前、同时或之后加入。

对于本发明的经修饰的第1家族碳水化合物结合组件或经修饰的糖苷酶的生产过程，碳源可以包含诱导经修饰第1家族碳水化合物结合组件或经修饰糖苷酶从遗传修饰微生物的基因构建体中表达的碳水化合物。例如，如果遗传修饰微生物是木霉菌株，那么碳源可以包含以下中的一种或更多种：纤维素、纤维二糖、槐糖，以及已知在木霉中诱导纤维素酶和β-葡糖苷酶表达的相关寡糖或多糖。

在分批发酵的情况下，碳源可以在接种之前或与之同时添加到发酵培养基中。在补料分批或连续运行的情况下，还可以在发酵期间连续地或间歇地提供碳源。例如，当遗传修饰的微生物是木霉菌株时，碳的加料速率为每小时约0.2至2.5g碳/L培养物或其间任意值。

本发明的经修饰第1家族碳水化合物结合组件或经修饰糖苷酶的生产过程可以在约20℃至约50℃或其间任意温度下进行，例如约25℃至约37℃或其间任意温度，或者从20、22、25、26、27、28、29、30、32、35、37、40、45或50℃或其间任意温度。

本发明的经修饰第1家族碳水化合物结合组件或经修饰的糖苷酶的生产过程可以在3.0至6.5或其间任意pH下进行，例如pH约3.5至5.5或其间任意pH，例如pH约3.0、3.2、3.4、3.5、3.7、3.8、4.0、4.1、4.2、4.3、4.4、4.5、4.6、4.7、4.8、4.9、5.0、5.2、5.4、5.5、5.7、5.8、6.0、6.2、6.5或其间任意pH。

发酵之后，包含经修饰的第1家族碳水化合物结合组件或经修饰的糖苷酶的发酵培养液可直接使用，或者可以将经修饰的第1家族碳水化合物结合组件或经修饰的糖苷酶与真菌细胞分离，例如通过过滤或离心。低分子量溶质(如发酵培养基中未消耗的成分)可以通过超滤移除。例如可以通过蒸发、沉淀、沉降或过滤来浓缩经修饰的第1家族碳水化合物结合组件或经修饰的糖苷酶。可以添加化学品如甘油、蔗糖、山梨醇等以稳定纤维素酶。可以向纤维素酶中添加另外的化学品如苯甲酸钠或山梨酸钾以防止微生物污染物生长。

使用经修饰的糖苷酶水解纤维素或半纤维素

本发明经修饰的糖苷酶用于在还包含木质素的水解反应中酶促水解纤维素或半纤维素。例如，本发明的经修饰的糖苷酶用于酶促水解预处理过的木质纤维素底物，例如在从木质纤维素中生产可发酵糖、糖醇或燃料醇的工业过程中，或者在酶促水解纸浆中。本发明的经修饰的糖苷酶可以是酶混合物中的一部分，所述酶混合物包含另外的纤维素酶、半纤维素酶、葡糖苷酶和已知改变纤维素结构的非水解蛋白质，如膨胀因子和扩展蛋白。

术语“酶促水解”是指糖苷酶或混合物(包括含有本发明经修饰的糖苷酶的混合物)作用于多糖以将其全部或部分转化为可溶性糖的过程。

本发明经修饰的糖苷酶用于酶促水解“预处理过的木质纤维素底物”。预处理过的木质纤维素底物是植物来源的材料，该材料在预处理之前包含20％至90％的纤维素(干重)、更优选约30％至90％的纤维素、甚至更优选40％至90％的纤维素，例如20、22、24、26、28、30、32、34、36、38、40、42、44、46、48、50、55、60、65、70、75、80、85、90％或其间的任意值％，以及至少10％的木质素(干重)，更通常至少12％(干重)，并且该材料已经经过物理和/或化学处理以使纤维更加易于接近和/或更易于被纤维分解酶作用。

预处理之后，木质纤维素原料可包含更高水平的纤维素。例如，如果采用酸预处理，那么半纤维素成分被水解，增加了纤维素的相对水平。在这种情况下，预处理过的原料可包含大于约20％的纤维素和大于约12％的木质素。在一个实施方案中，预处理过的木质纤维素原料包含大于约20％的纤维素和大于约10％的木质素。

可用于本发明的木质纤维素原料包括但不限于：农业剩余物，如玉米秸秆、小麦秸秆、大麦秸秆、稻秸秆、燕麦秸秆、油菜秸秆和大豆秸秆；纤维处理剩余物，如玉米纤维、甜菜渣、纸浆厂粉末和废渣或甘蔗渣；林业剩余物，如杨木、其他硬木、软木和锯末；草，如柳枝稷草、芒草、大米草和草芦；或使用后的废纸产物。

首先可以通过以下方法使木质纤维素原料减小尺寸，所述方法包括但不限于粉碎、研磨、搅动、脱皮(shedding)、压缩/膨胀或其他类型的机械作用。通过机械作用使尺寸减小可以通过适于该目的的任何类型的设备进行，例如但不限于锤式粉碎机。

预处理过程的非限制性实例包括用以下对木质纤维素原料进行化学处理：硫酸或亚硫酸或其他酸，氨、石灰、氢氧化铵或其他碱，乙醇、丁醇或其他有机溶剂，或加压水(参见美国专利No.4,461,648、5,916,780、6,090,595、6,043,392、4,600,590)。

可以进行预处理以将存在于木质纤维素原料中的半纤维素或其部分水解为单体糖，例如木糖、阿拉伯糖、甘露糖、半乳糖或其组合。优选地，进行预处理以使半纤维素几乎完全水解并且少量纤维素转化为葡萄糖。在预处理期间，通常用含水浆液中约0.02％(w/w)至约2％(w/w)或其间任意值的酸浓度来处理木质纤维素原料。所述酸可以是但不限于盐酸、硝酸或硫酸。例如，预处理期间使用的酸为硫酸。

进行原料的酸预处理的一种方法是使用美国专利No.4,461,648中给出的处理条件进行蒸气爆破。预处理原料浆液的另一种方法涉及连续预处理，即将木质纤维素原料连续地泵过反应器。连续酸预处理为本领域技术人员所熟知，例如参见美国专利No.5,536,325；WO 2006/128304和美国专利No.4,237,226。可以根据需要使用本领域已知的其他技术，例如美国专利No.4,556,430中公开的方法。

如上所述，可以用碱进行预处理。与酸预处理相比，用碱预处理不水解原料中的半纤维素成分，而是碱与半纤维素上存在的酸性基团反应打开底物的表面。加入碱还可以改变纤维素的晶体结构使其更易于水解。可用于预处理的碱的实例包括氨、氢氧化铵、氢氧化钾和氢氧化钠。优选地，不用不溶于水的碱(如石灰和氢氧化镁)进行预处理。

合适的碱预处理的一个实例是氨冷冻爆破、氨纤维爆破或氨纤维膨胀(“AFEX(Ammonia Fiber Expansion)”方法)。根据该方法，在压力容器中使木质纤维素原料与氨或氢氧化铵接触足够长的时间，以使氨或氢氧化铵改变纤维素纤维的晶体结构。然后迅速降低压力，使氨闪蒸或沸腾并且使纤维素纤维结构爆裂。(参见美国专利No.5,171,592、5,037,663、4,600,590、6,106,888、4,356,196、5,939,544、6,176,176、5,037,663和5,171,592)。然后可以根据已知方法回收闪蒸的氨。

正如本领域技术人员所熟知的，在预处理之后但在酶促水解之前，可通过下述几个步骤中的任何一个对预处理过的木质纤维素原料进行加工，例如在酶促水解之前用水稀释、用水洗涤、缓冲、过滤或离心，或这些处理的组合。

之后对预处理过的木质纤维素进行酶促水解。术语“酶促水解”是指纤维素酶作用于纤维素使其全部或部分转化为可溶性糖的过程。可溶性糖是指包括水溶性己糖单体和多至六个单体单元的寡聚物，它们来源于预处理过的木质纤维素原料的纤维素部分。可溶性糖的实例包括但不限于葡萄糖、纤维二糖、纤维糊精或其混合物。可溶性糖可以主要是纤维二糖和葡萄糖。可溶性糖可以主要是葡萄糖。

使用纤维素酶混合物的酶促水解可以是分批水解、连续水解或其组合。水解可以是搅动的、不混合的或其组合。

酶促水解优选在约30至约75℃或其间任意温度下进行，例如30、35、40、45、50、55、60、65、70、75℃或其间任意温度，以及在约3.5至约7.5或其间任意pH下进行，例如3.5、4.0、4.5、5.0、5.5、6.0、6.5、7.0、7.5的pH或其间任意pH。在水解开始之前，水解反应器中纤维素的最初浓度优选为约0.5％(w/w)至约15％(w/w)或其间任意量，例如0.5、1、2、4、6、8、10、12、14、15％或其间任意量。所有的主要纤维素酶的组合剂量可以是每克纤维素中约0.001至约100mg蛋白质或其间任意量，例如每克纤维素中0.001、0.01、0.1、1、5、10、15、20、25、30、40、50、60、70、80、90、100mg蛋白质或其间任意量。水解可以在约0.5小时至约200小时或其间任意时间内进行，例如，水解可以进行2小时至100小时或其间任意时间，或者它可以进行0.5、1、2、5、7、10、12、14、15、20、25、30、35、40、45、50、55、60、65、70、75、80、85、90、95、100、120、140、160、180、200或其间任意时间。应理解，反应条件并非意在以任何方式限制本发明并且可以根据本领域技术人员的需要进行调整。

酶促水解通常在水解反应器中进行。在将底物加入到水解反应器之前、期间或之后，将酶混合物加入到预处理过的木质纤维素原料(也称作“底物”)中。

优选地，经修饰的糖苷酶在一个或更多个浸没式液体培养发酵中产生，并且可以通过过滤、离心或本领域技术人员所熟知的其他方法在发酵结束时与细胞分离。然后在使用前可以将不含细胞但包含纤维素酶的级分浓缩(例如，通过超滤)、保存和/或稳定化。或者，经修饰的糖苷酶不与细胞分离，而与细胞一起加入到酶促水解中。

实施例

实施例1：里氏木霉Cel7A、Cel7A催化结构域、Cel6A和Cel6A催化结构域的制备

在如本领域技术人员已知的诱导产生纤维素酶的条件下，在浸没式液体发酵中培养里氏木霉菌株。木霉蛋白的粗混合物由细胞分泌入发酵液中。通过含有Harborlite滤垫的玻璃微纤维滤器进行过滤从发酵液中除去真菌细胞。如Bhikhabhai等(1984)所述，采用DEAE-Sepharose柱通过阴离子交换色谱从粗滤液中分离Cel7A和Cel6A。然后通过如Piyachomkwan等(1997，1998)所报道的对氨基苯基-1-硫代-β-D-纤维二糖苷亲和色谱进一步纯化Cel7A和Cel6A。将这些组分用搅拌超滤池(Amicon)和10kDa NMWL聚醚砜膜浓缩并将缓冲液置换为50mM柠檬酸钠(pH 5.0)。

为了表明每种组分的制备未污染初始纤维素酶，使用兔的组分特异性多克隆抗血清通过Western印迹来分析经纯化的Cel7A和Cel6A(图1，图B)。通过10％SDS-PAGE分离蛋白质并使用BioRad的MiniTrans-

Cell以100V 1小时转移至聚偏二氟乙烯(PVDF)膜。采用Birkett等(1985)的方法进行Western印迹。组分特异性多克隆抗血清是采用合成肽生产的，该合成肽的序列基于如本领域技术人员已知的里氏木霉Cel7A、Cel6A、Cel7B和Cel5A的一级氨基酸序列。

这些实施例表明所采用的纯化方法产生了基本上纯的Cel7A、Cel6A、Cel7B和Cel5A。这也表明这些抗血清对这些初始纤维素酶组分的每一种的特异性。

通过用蛋白酶木瓜蛋白酶孵育经纯化的全长蛋白质来制备里氏木霉TrCel7A和Cel6A的催化结构域。木瓜蛋白酶在接头肽内切割纤维素酶，将CBM与催化(核心)结构域分离。该方法为本领域技术人员所知，并且已用于研究CBM和催化结构域在例如底物结合和催化中的作用(Nidetsky等，2004；Herner等，1999)。用木瓜蛋白酶处理纤维素酶使其分子质量减小。因此，通过SDS-PAGE来监测Cel7A和Cel6A的木瓜蛋白酶处理以确保全长蛋白的完全消化。如上所述，分别将Cel7A和Cel6A的木瓜蛋白酶处理产物(称为Cel7A核心和Cel6A核心)纯化，浓缩并置换缓冲液。

使用Bradford等(1976)的方法来化学测定蛋白质浓度。

实施例2：Cel3A和Cel3A-CBM的制备

在如本领域技术人员已知的诱导产生纤维素酶的条件下，在浸没式液体发酵中培养美国公开No.2009/0209009A1所述的过表达Cel3A(SEQ IDNO：100)或Cel3A-CBM(SEQ ID NO：101)的里氏木霉菌株。木霉蛋白的粗混合物由细胞分泌入发酵液中。通过含有Harborlite滤垫的玻璃微纤维滤器进行过滤从发酵液中除去真菌细胞。通过阴离子交换色谱和阳离子交换色谱将Cel3A和Cel3A-CBM从其各自的培养滤液中分离。

用5mM磷酸钠(pH 7.2)平衡DEAE-Sepharose柱。将含有Cel3A或Cel3A-CBM的木霉培养滤液调节至pH 7.2并以10mL/分钟施加到柱中。用4倍柱体积的平衡缓冲液洗涤柱，然后用4倍柱体积的含有0.5MNaCl的5mM磷酸钠(pH 7.2)洗脱结合的蛋白质。测定柱级分对纤维二糖的活性。在起初装入DEAE柱的样品中，多于95％的对纤维二糖的总活性包含于流穿峰(flow-though peak)中。将这些级分合并并且通过阳离子交换色谱分离。在5mM乙酸钠(pH 5.5)中平衡SP-Sepharose柱。将来自阴离子交换色谱的流穿合并物(flow-though pool)调节至pH5.5并稀释至传导率≤0.6mS。装柱后，用线性梯度的5-50mM乙酸钠(pH5.5)洗脱Cel3A或Cel3A-CBM。将经纯化的Cel3A和Cel3A-CBM用搅拌超滤池(Amicon)和10kDa NMWL聚醚砜膜浓缩并将缓冲液置换为50mM柠檬酸钠(pH 5.0)。使用Bradford等(1976)的方法来化学测定蛋白质浓度。

实施例3：木质素的制备

采用美国专利No.4,461,648所述的方法预处理小麦秸秆。预处理之后，加入浓度为0.5％的苯甲酸钠作为防腐剂。然后使用布氏漏斗和滤纸用6倍体积的温热(～35℃)自来水洗涤经预处理的材料。

伴随搅拌，将经预处理的小麦秸秆样品(湿重167g；30％固体；60％纤维素)加入1L烧瓶中的625ml 82％H₂SO₄中，然后盖紧并在50℃下振荡孵育4小时。使用布氏漏斗和玻璃纤维滤器将剩余固体过滤至潮湿，重悬于1L水中并用NaOH将pH调节至4.5。将固体过滤并用～8L的水洗涤。在本文中，将被确定为含有小于1％(干重)纤维素的固体称为“木质素”。

木质素的牛血清白蛋白(BSA)处理这样进行：在50℃下，将含有0.1％苯甲酸钠的50mM柠檬酸盐缓冲液(pH 5)中振荡孵育浓度为30g/L的等量(w/w)木质素和BSA 5天。过滤固体并用约8L水洗涤。

实施例4：对木质素的存在下经纯化的纤维素组分的失活进行表征

在加盖玻璃烧瓶中的总体积为1.2mL的50mM柠檬酸盐缓冲液(pH5.0)中，用未处理的木质素(29mg)孵育实施例1、2和12中制备的经纯化的催化结构域或完整糖苷酶(包含由接头肽连接的催化结构域和CBM)(0.06mg)。孵育在30℃或50℃下通过定轨振荡完成。在测试条件下，在不存在木质素时，溶液中的蛋白质基本上稳定长达96小时。以0小时到最多96小时的时间范围从每个烧瓶中收集0.2mL样品。离心每个样品以分离木质素并在4℃下储存。

在该时间范围结束时，用Bradford法测量每个时间进程样品的上清中的蛋白质浓度。然后短暂混合样品以重悬沉淀，并将包含可溶与不可溶两种物质的0.05mL浆液加入每孔含有3个玻璃珠的微量滴定板中。向含有Cel7A、Cel7A核心、Cel6A和Cel6A核心以及木质素的微量滴定孔中，将0.02mL不含Cel7A和Cel6A纤维二糖水解酶之木霉纤维素酶的稀释制剂(1μg总蛋白)加入微量滴定板的每个孔中，以补充纤维二糖水解酶活性。再向微量滴定板孔中加入经纯化的木霉Cel3A(1.4μg)以补充纤维素水解活性。最后，向每个孔中加入0.2mL脱木质素的纤维素(0.25％纤维素)浆液。对于含有TrCel3A或TrCel3A-CBM和木质素的微量滴定板孔，向微量滴定板的每个孔中加入0.02mL木霉纤维素酶的稀释制剂(1μg总蛋白)以补充Cel3A活性。最后，向每个孔中加入0.2mL脱木质素的纤维素(0.25％纤维素)浆液。将测定板在50℃下定轨振荡孵育2小时。然后将该板以710×g离心2分钟，并按照Trinder等(1969)所述测量葡萄糖浓度。

将葡萄糖浓度转化成酶活性，将其表示为每mg蛋白质每小时产生的葡萄糖mg数。用整个时间进程测量的活性除以t＝0小时(在加入木质素之前)时测量的活性以计算在整个时间进程中每种酶的相对剩余活性。为了分析结果，认为相对剩余活性的测量值代表木质素浆液中相对的剩余活性酶浓度。类似地，对于每个反应，用整个时间进程测量的蛋白质浓度除以t＝0小时时的蛋白质浓度以计算相对剩余蛋白质浓度。

为了对有和没有CBM时里氏木霉纤维素酶组分的木质素结合和失活进行表征，使用等式1将相对剩余蛋白质和/或相对剩余活性对时间数据建模。在该等式中，E代表游离酶，L代表木质素，EL代表可逆的酶-木质素复合物，EL＊代表不可逆的酶-木质素复合物。K_L代表在稳态下的[E][L]/[EL]，而k_L是速度常数，其描述可逆的酶-木质素复合物向不可逆的酶-木质素复合物转化的速度。将每个时间的上清液中的相对剩余蛋白质拟合到方程式1中的参数E，而将浆液中的相对剩余活性拟合到参数E+EL的和。

使用Microsoft Excel中的4阶Runge-Kutta spreadsheet完成建模。通过改变K_L和k_L拟合涉及一种组分的每个实验的数据。通过如本领域技术人员已知的最小二乘法完成误差最小化。

等式1

图2中示出50℃下Cel7A和Cel7A核心的木质素失活曲线。在0.5小时内，上清液中失去约55％的Cel7A(图A，实心圆)。在该时间内，木质素浆液中仅失去约10％的总Cel7A活性(图A，空心正方形)。在其余的整个时间进程中，上清液中Cel7A浓度保持基本恒定，而浆液中Cel7活性缓慢降低。这提示在该实验中，Cel7A迅速地被木质素以保护其活性的方式结合，因为用结晶纤维素孵育这些样品导致比Cel7A蛋白高得多的相对剩余Cel7A活性。没有观察到Cel7A核心蛋白的这种快速丢失(图B，实心圆)，提示里氏木霉Cel7A迅速地通过其CBM与木质素相结合。

图3中示出不具有CBM的里氏木霉Cel3A和Cel3A-CBM(在C-末端与里氏木霉Cel7A第1家族CBM连接的里氏木霉Cel3A)的木质素失活曲线。上清液中Cel3A蛋白的丢失(图A，实心圆)与浆液中的活性丢失(图A，空心正方形)以类似的速度发生。与Cel3A相比，Cel3A-CBM蛋白(图3，图B，实心圆)和活性(图B，闭合正方形)降低地快得多。在0.5小时内，约70％Cel3A-CBM活性从上清液中丢失，而约95％的Cel3A-CBM活性从浆液中丢失。这些结果表明Cel3A-CBM比Cel3A快得多地结合木质素，并且进一步提示该情况下Cel7A的第1家族CBM参与木质素的结合。

在30℃下的木质素失活试验中，对里氏木霉Cel6A和Cel6A催化结构域(Cel6A核心)得到了类似的结果。在0.5小时内，上清液中Cel6A的浓度降低了约60％(图4，图A，实心圆)，而Cel6A活性(空心正方形)降低了约14％。在该试验的剩余时间中，上清液中Cel6A浓度的任何其他变化都是可以忽略的，而Cel6A活性缓慢降低。如对Cel7A核心所观察到的，在整个时间进程中，Cel6A核心蛋白浓度(图B，实心圆)与浆液中Cel6A核心活性(空心正方形)平行地缓慢降低，提示里氏木霉Cel6A通过其CBM迅速地与木质素相结合。

此外，与不包含CBM的糖苷酶(Cel7A核心和Cel6A核心)相比，包含CBM的糖苷酶的K_L值低得多，这表明CBM的存在显著增加了里氏木霉Cel7A、Cel6A和Cel3A酶的结合亲和力(表3)。

表3：CBM对经分离的纤维素酶组分与木质素结合的影响

酶	相对K_L
		Cel7A	1.0
Cel7Acore	62.5
		Cel3A	1.0
Cel3A-CBM	0.2
		Cel6A	1.0
Cel6Acore	40.5

实施例5：表达TrCel7A(SEQ ID NO：124)的载体的构建

将载体构建为表达和分泌亲本的和经修饰的TrCel7A糖苷酶并且靶向宿主里氏木霉菌株基因组的天然cel7a位置。用pUC19载体(Fermentas，#SD0061)作为骨架构建载体。为了便于靶向，将从里氏木霉基因组DNA扩增的邻近天然Trcel7a基因5’和3’端的序列插入转化载体中，从而使其位于表达和选择盒的侧翼。将完整的粗糙脉孢菌(N.crassa)pyr4(乳清酸核苷-5’-单磷酸脱羧酶)基因(GenBank#AL669988.1，65346-66992位)用作选择盒。表达盒包含来自天然里氏木霉cel7a基因的以下序列：启动子(PCel7A)、分泌信号(Cel7A ss)和成熟蛋白编码序列(Cel7A)。这些序列彼此有效连接并与天然里氏木霉cel6a基因(TCel6a)的转录终止子连接。如表4所示，可以从DOE Joint Genomics Institute的完整里氏木霉基因组序列(版本2)获得存在于最终的转化载体的全部木霉序列。

图9示出全pTRCel7A-pyr4-TV载体的图谱。

表4：存在于转化载体中的木霉序列的来源

序列信息见URL：genome.jgi-psf.org/Trire2/Trere2.home.html

实施例6：表达HiAvi2(SEQ ID NO：2)和PcCel6A-S407P(SEQ ID NO：5)的载体的构建

载体YEp352/PGK91-1-α_ss-NKE的构建

酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)菌株YDR483W BY4742[14317](MATαhis3Δ1leu2Δ0lys2Δ0ura3Δ0Δkre2)得自ATCC(cat#4014317)。特异腐质霉和黄孢原毛平革菌菌株得自

(分别为#22082^TM和#201542^TM)。大肠杆菌(Escherichia coli)菌株DH5α(F-φ80lacZΔM15Δ(lacZYA-argF)U169recA1 endA1 hdR17(r_k ^-，m_k ⁺)phoA supE44 thi-1gyrA96 relA1λ^-)得自Invitrogen(cat#18265-017)。

通过将引物AT046与AT047一起退火来制备包含NheI、KpnI和EcoRI限制性位置的DNA适体。将该适体插入包含pgk1启动子、α交配因子分泌信号和pgk1终止子序列的基于YEp的质粒(YEp352/PGK91-1α_ss)以得到质粒YEp352/PGK91-1/α_ssNKE。具体地，将作为NheI/EcoRI片段的接头插入位于α交配因子分泌信号下游和pgk1终止子上游的NheI和EcoRI位置。引物序列如下所示：

AT046 5’CTA GCT GAT CAC TGA GGT ACC G(SEQ ID NO：88)

AT047 5’AAT TCG GTA CCT CAG TGA TCA G(SEQ ID NO：89)

YEp352/PGK91-1-α_ss-NKE-HiAvi2载体的构建

将冻干的特异腐质霉重悬于300μL无菌水中，并将50μL涂布在Emerson YPSS pH 7琼脂平板(0.4％酵母提取物、0.1％K₂HPO₄、0.05％MgSO₄·7H₂O、1.5％葡萄糖、1.5％琼脂)上。将琼脂平板在45℃下孵育6天，然后将孢子接种于Novo培养基(按照Barbesgaard USP#4,435,307)中：在100mL生长期培养基(2.4％CSL、2.4％葡萄糖、0.5％大豆油，pH调节至5.5，0.5％CaCO₃)中于37℃下孵育48小时。然后将6mL预培养物转移入100mL生产期培养基(0.25％NH₄NO₃、0.56％KH₂PO₄、0.44％K₂HPO₄、0.075％MgSO₄·7H₂O、2％Sigmacell，pH调节至7，0.25％CaCO₃)中，并在孵育培养物多至4天后收获生物质。然后，使用50mg生物质，用Absolutely

Miniprep试剂盒(Stratagene)根据制造商的方法分离总RNA。使用

II逆转录酶(Invitrogen)根据制造商的方法从总RNA产生总cDNA。使用以下引物(其在基因上游引入NheI位置并在HiAvi2编码区下游引入KpnI和EcoRI位置)从cDNA扩增编码HiAvi2的多核苷酸：

5’HiAvi2-cDNA 5’CTA TTG CTA GCT GTG CCC CGA CTT GGG GCC AGTGC(SEQ ID NO：90)

3’HiAvi2-cDNA 5’CTA TTG AAT TCG GTA CCT CAG AAC GGC GGA TTGGCA TTA CGA AG(SEQ ID NO：91)

通过TA克隆根据制造商的建议将PCR扩增子克隆入

-TEasy载体中。用NheI和KpnI消化该载体并将释放的HiAvi2与用NheI和KpnI消化的YEp352/PGK91-1/α_ss-NKE载体连接。将连接混合物转化入DH5α化学感受态大肠杆菌细胞中，分离质粒并测序，以确认序列和克隆位置完整性。将所得载体称为YEp352/PGK91-1-αss-NKE-HiAvi2(图5A)。在基因上游引入NheI位置将成熟蛋白的前两个氨基酸分别改变为丙氨酸和丝氨酸。因此，SEQ ID NO：2中所示的亲本HiAvi2糖苷酶是HiAvi2-Q1A-N2S。

载体YEp352/PGK91-1-α_ss-NKE-PcCel6A-S407P的构建

将冻干的黄孢原毛平革菌重悬于300μL无菌水中，并将50μL涂布在PDA平板上。将该平板在24℃下孵育4天。将黄孢原毛平革菌孢子接种于PDA平板上的玻璃纸圈上，并在24℃下4-6天之后收获生物质。然后，使用50mg生物量，用Absolutely

Miniprep试剂盒(Stratagene)根据制造商的方法分离总RNA。使用

II逆转录酶(Invitrogen)根据制造商的方法从总RNA产生总cDNA。使用以下引物(其在基因上游引入NheI位置并在PcCel6A编码区下游引入KpnI和EcoRI位置)从cDNA扩增编码PcCel6A的多核苷酸：

5’PcCel6A-cDNA 5’CTA TTG CTA GCT CGG AGT GGG GAC AGT GCG GTGGC(SEQ ID NO：92)

3’PcCel6A-cDNA 5’CTA TTG AAT TCG GTA CCC TAC AGC GGC GGG TTGGCA GCA GAA AC(SEQ ID NO：93)

通过TA克隆，根据制造商的建议将PCR扩增子克隆入-TEasy载体中，产生质粒pGEM-PcCel6A。然后，从其中扩增PcCel6A的编码序列以引入突变S407P。为此，使用诱变引物NM088和反向引物VH099进行大引物PCR(megaprimer PCR)。分离所得PCR产物并用作反向引物与正向引物VH098一起生成最终的突变构建体。引物序列在下面列出：

VH098 5’GGT ATC TTT GGA TAA AAG GGC TAG CTC GGA GTG GGGACA G(SEQ ID NO：94)

VH099 5’GGA GAT CGA ATT CGG TAC CTA CAG CGG CGG GTT GG(SEQID NO：95)

NM088 5’CCC CGC TAC GAC CCT ACT TGT TCT CTG(SEQ ID NO：96)

用NheI和KpnI消化PcCel6A-S407P扩增子然后与用NheI和KpnI消化的YEp352/PGK91-1/α_ss-NKE载体连接。将连接混合物转化入化学感受态大肠杆菌DH5α细胞中，分离质粒并测序，以确认序列和克隆位置完整性。将所得载体称为YEp352/PGK91-1-αss-NKE-PcCel6A-S407P(图5B)。在PcCel6A编码区上游引入NheI位置将成熟蛋白的前两个氨基酸分别改变为丙氨酸和丝氨酸。因此，SEQ ID NO：5所示的亲本糖苷酶PcCel6A-S407P是PcCel6A-Q1A-A2S-S407P。

实施例7：表达TrCel6A-S413P(SEQ ID NO：4)的载体的构建

为了便于使用NheI和KpnI限制酶进行克隆，使用DNA聚合酶I大(Klenow)片段将YEp352/PGK91-1载体第1936位上的特有NheI位置平末端化，以产生YEp352/PGK91-

ΔNheI。使用引物5’NheCel6A和3’BglKpnCel6A，通过PCR从载体YEpFLA

ΔKpn10-S413P(美国专利No.7,785,854)中扩增TrCel6A-S413P基因。平行地，使用引物(5’BglAlphaSS和3’NheAlphaSS)通过PCR从YEpFLAG-1载体(Sigma)中扩增酵母α因子前导序列，以在扩增子的5’端引入BglII位置并在3’端引入NheI位置。

通过BglII/NheI消化分离酵母α因子前导序列并且用TrCel6A-S413P基因(通过NheI/BglII消化分离)和YEp352/PGK91-

ΔNheI载体(通过BglII消化分离)进行三段连接(three-piece ligation)。采用Gietz，R.D.和Woods，R.A.(2002)所述的方法，将所得载体YEp352/PGK91-ΔNheI-_ss-TrCel6A-S413P(图6)转化入酵母菌株BY4742中。引物序列在下面列出：

5’BglAlphaSS： 5’ACC AAA AGA TCT ATG AGA TTT CCT TCA ATT(SEQ ID NO：103)

3’NheAlphaSS： 5’TGA GCA GCT AGC CCT TTT ATC CAA AGA TAC(SEQ ID NO：104)

5’NheCel6A： 5’AAA AGG GCT AGC TGC TCA AGC GTC TGG GGC(SEQ ID NO：105)

3’BglKpnCel6A： 5’GAG CTC AGA TCT GGT ACC TTA CAG GAA CGA TGG GTT(SEQ ID NO：106)

实施例8：易错PCR文库的产生

使用

II随机诱变试剂盒(

)中所包含的II DNA聚合酶产生随机诱变文库。为了产生HiAvi2文库，使用58ng作为模板的YEp352/PGK91-1/α_ssNKE-HiAvi2与引物YalphaN21和3’PGK-term进行20个扩增循环的PCR。为了产生PcCel6A-S407P 文库，使用57ng 作为模板的YEp352/PGK91-1/α_ssNKE-PcCel6A-S407P 与引物YalphaN21和3’PGK-term进行30个扩增循环的PCR。用NheI和KpnI消化YEp352/PGK91-1/α_ssNKE载体并纯化。使用该载体片段和每个最终扩增子同时转化并通过体内重组克隆入酵母菌株YDR483W BY4742[14317]中(Butler等，2003)。

YalphaN21 5’AGC ACA AAT AAC GGG TTA TTG(SEQ ID NO：97)

3’PGK-term 5’GCA ACA CCT GGC AAT TCC TTA CC(SEQ ID NO：98)

实施例9：从微孔板培养物中表达和分离亲本的和经修饰的TrCel6A、HiAvi2和PcCel6A纤维素酶

本实施例描述了来自酿酒酵母的TrCel6A、HiAvi2和PcCel6A以及经修饰的TrCel6A、HiAvi2和PcCel6A纤维素酶的选择和表达，以用于高通量筛选测定。

在30℃下，将酿酒酵母转化子在含有合成完全培养基(SC：2％琼脂w/v、0.17％酵母氮源w/v、0.078％尿嘧啶缺失补充剂w/v、2％葡萄糖w/v、2％酪蛋白氨基酸w/v、0.5％硫酸铵w/v，pH 5.5)的平板上培养4天。通过将菌落转移到含有0.12％偶氮-大麦-β-葡聚糖(Megazyme)的合成完全培养基平板来制备复制平板，并在30℃下孵育过夜。

选择在50℃下孵育6小时之后显示清晰可见晕圈的菌落，通过牙签接种到含有一个玻璃珠的96孔微孔板中的0.15mL合成完全培养基(SC：0.17％酵母氮源w/v、0.078％尿嘧啶缺失补剂w/v、2％葡萄糖w/v，2％酪蛋白氨基酸w/v、0.5％硫酸铵w/v)进行液体培养基预培养。将预培养物在30℃下培养过夜(16小时至18小时)，同时定轨振荡至稳定期。对于表达培养物接种，使用25μL预培养物接种含有一个玻璃珠的深孔微孔板中的1mL SC培养基。将表达培养物在30℃下培养3天同时进行定轨振荡和湿度控制。以710×g将板离心5分钟以沉淀细胞，并将上清液吸出以进行筛选测定。通过向剩余预培养物中添加甘油至终浓度为20％来制备储存液并在-80℃下保存。

实施例10：包含经修饰的第1家族CBM的经修饰的糖苷酶的高通量筛选a.TrCel6A-S413P文库的筛选

该实施例描述了经修饰的TrCel6A糖苷酶的筛选，以鉴定已被克隆入酿酒酵母中的与亲本TrCel6A-S413P相比，对由木质素引起的失活具有抗性的糖苷酶。

在0.25mL柠檬酸盐缓冲的(50mM；pH 5)反应体系中，用木质素(1.6％w/v)预孵育等分试样(0.15mL)的酵母上清液。用经BSA预处理的木质素(1.6％w/v)预孵育每种经修饰糖苷酶的等量的等分试样上清液。预孵育在50℃下在每孔包含一个玻璃珠的96孔微孔板中伴随定轨振荡(NB Innova 44)进行5.5小时。每个96孔微孔板中含有六个亲本TrCel6A-S413P对照用于比较。预处理之后，将微孔板以2800×g离心5分钟并吸出上清液以进行剩余活性测定。

在100μL柠檬酸盐缓冲的(50mM；pH 5)反应体系中用0.5％β-葡聚糖孵育上清液(0.05mL)。在PCR板中于50℃下进行剩余活性测定，对于用木质素预孵育的样品进行16小时，而对于经BSA处理的木质素预孵育的样品进行3小时。将范围为3mg/mL至0.05mg/mL的葡萄糖标准曲线样品置于PCR板的第一列。孵育之后，向所有孔中加入0.08mL DNS试剂并将该板煮10分钟。将等分试样(0.15mL)转移到微孔板中并在560nm处测吸光度。通过使用葡萄糖标准曲线将A₅₆₀值转化为还原当量并除以适当的孵育时间(16小时或3小时)以得到mg/mL/h来确定剩余酶活性。对所有经修饰的TrCel6A糖苷酶和亲本TrCel6A-S413P糖苷酶对照，通过用未经处理的木质素存在下的剩余酶活性除以经BSA处理的木质素存在下的剩余酶活性来计算活性比。将每种经修饰的TrCel6A糖苷酶的活性比与特定微孔板上的6个亲本TrCel6A-S413P糖苷酶对照的平均值进行比较，并使用t-检验以95％置信水平选择阳性样品(比例增加的那些)。在微量培养中再次生产所有阳性的经修饰的TrCel6A糖苷酶并重新筛选以降低假阳性的数量。图8中示出来自一个筛选板的数据样本。

DNS试剂包含：

b.HiAvi2基因文库的筛选

该实施例描述了经修饰的HiAvi2糖苷酶的筛选，以鉴定已克隆入酿酒酵母中的与亲本HiAvi2相比，对由木质素引起的失活具有抗性的糖苷酶。

在0.25mL柠檬酸盐缓冲的(50mM；pH 5)反应体系中用木质素(0.4％w/v)预孵育等分试样(0.15mL)的酵母上清液。用BSA预处理的木质素(0.4％w/v)预孵育来自每种经修饰纤维素酶的等量等分试样的上清液。预孵育在50℃下在每孔含有一个玻璃珠的96孔微孔板中伴随定轨振荡(NB Innova 44)进行1小时。每个96孔微孔板中含有六个亲本HiAvi2对照用于比较。预处理之后，以2800×g将微孔板离心5分钟并吸出上清液以进行剩余活性测定。

在100μL柠檬酸盐缓冲的(50mM；pH 7)反应体系中用0.5％β-葡聚糖孵育上清液(0.05mL)。在PCR板中于65℃下进行剩余活性测定，对于用木质素预孵育的样品进行16小时，而对于经BSA处理的木质素预孵育的样品进行3小时。将范围为3mg/mL至0.05mg/mL的葡萄糖标准曲线样品置于PCR板的第一列。孵育之后，向所有孔中加入0.08mL DNS试剂并将该板煮10分钟。将等分试样(0.15mL)转移到微孔板中并在560nm处测吸光度。通过使用葡萄糖标准曲线将A₅₆₀值转化为还原当量并除以适当的孵育时间(16小时或3小时)以得到mg/mL/h来确定剩余酶活性。对于所有经修饰的HiAvi2糖苷酶和亲本HiAvi2糖苷酶对照，通过用在未经处理的木质素存在下的剩余酶活性除以经BSA处理的木质素存在下的剩余酶活性来计算的活性比。将每种经修饰的HiAvi2糖苷酶的活性比与特定微孔板上的6个亲本HiAvi2糖苷酶对照的平均值进行比较，使用t-检验以95％置信水平选择阳性样品(比例增加的那些)。在微量培养中再次生产所有阳性的经修饰的HiAvi2糖苷酶，并重新筛选以降低假阳性的数量。图7A中示出来自一个筛选板的数据样本。

c.PcCel6A-S407P基因文库的筛选

该实施例描述了经修饰的PcCel6A糖苷酶的筛选，以鉴定已被克隆入酿酒酵母中的与亲本PcCel6A-S407P相比，对由木质素引起的失活具有抗性的糖苷酶。

在0.25mL柠檬酸盐缓冲的(50mM；DH 5)反应体系中用木质素(0.4％w/v)预孵育等分试样(0.15mL)的酵母上清液。用经BSA预处理的木质素(0.4％w/v)预孵育来自每种经修饰糖苷酶的等量的等分试样上清液。预孵育在50℃下在包含一个玻璃珠的96孔微孔板中伴随定轨振荡(NB Innova 44)进行2小时。每个96孔微孔板中含有六个亲本PcCel6A-S407P对照用于比较。预处理之后，以2800×g将微孔板离心5分钟并吸出上清液以进行剩余活性测定。

在100μL柠檬酸盐缓冲的(50mM；pH 5)反应体系中用0.5％β-葡聚糖孵育上清液(0.05mL)。在PCR板中于50℃下进行剩余活性测定，对于用木质素预孵育的样品进行16小时，对于经BSA处理的木质素预孵育的样品进行3小时。将范围为3mg/mL至0.05mg/mL的葡萄糖标准曲线样品置于PCR板的第一列。孵育之后，向所有孔中加入0.08mL DNS试剂并将该板煮10分钟。将等分试样(0.15mL)转移到微孔板中并在560nm处测吸光度。通过使用葡萄糖标准曲线将A₅₆₀值转化为还原当量并除以适当的孵育时间(16小时或3小时)以得到mg/mL/h来确定剩余酶活性。对于所有经修饰的PcCel6A糖苷酶和亲本PcCel6A-S407P对照，通过用未经处理的木质素存在下的剩余酶活性除以经BSA处理的木质素存在下的剩余酶活性来计算活性比。将每种经修饰PcCel6A糖苷酶的活性比与特定微孔板上的6个亲本PcCel6A-S407P对照的平均值进行比较，使用t-检验以95％置信水平选择阳性样品(比例增加的那些)。在微量培养中再次生产所有阳性的经修饰的PcCel6A糖苷酶，并重新筛选以降低假阳性的数量。图7B中示出来自一个筛选板的数据样本。

实施例11：EP-PCR文库的数据分析

将具有木质素抗性的糖苷酶变体与活性糖苷酶变体的随机群体中CBM中氨基酸电荷的变化进行比较。从所有三个文库(TrCel6A-S413P、HiAvi2和PcCel6A-S407P)中，随机挑取经BSA预处理的木质素孵育之后对β-葡聚糖表现出活性的几种变体并测序。从所述随机的活性变体的群体中发现5个电荷变化突变：4个中性氨基酸变为带正电荷的氨基酸，1个中性氨基酸变为带负电荷的氨基酸。就木质素抗性变体的群体而言，不考虑亲本糖苷酶，有16个电荷变化突变：2个中性氨基酸变为带正电荷的氨基酸，14个中性氨基酸变为带负电荷的氨基酸(图10)。使用以下等式，在两个群体之间观察到中性到正电荷的电荷变化与中性到带负电荷的电荷变化之间存在显著差异(P＝0.0035)：

这些结果支持在CBM表面引入酸性氨基酸导致经修饰的第1家族CBM对木质素的结合降低。

实施例12：经修饰的TrCel6A糖苷酶的构建

采用涉及大引物合成然后进行大引物PCR的两步PCR法，用Yep352/PGK91-1-α_ss-Cel6A-S413P作为模板，将附加突变引入TrCel6A-S413P(SEQ ID NO：4)的第1家族CBM中(表5)。修饰内部引物以将期望的氨基酸替换引入TrCel6A-S413P构建体。采用外部的质粒引物(YalphaN21和3’PGK-term)扩增终产物。采用

SV Gel和PCR Clean-up系统纯化大引物和终产物。

表5：通过PCRα产生经修饰的TrCel6A酶

将PCR终产物用NheI+KpnI消化并连接入用NheI+KpnI线性化的载体Yep352/PGK91-1-α_ss-Cel6A-S413P。将连接混合物转化入化学感受态DH5α大肠杆菌细胞中，提取质粒并测序。

5’YalphaN21 5’-AGCACAAATAACGGGTTATTG-3’(SEQ ID NO：97)

3’PGK-term 5’-GCAACACCTGGCAATTCCTTACC-3’(SEQ ID NO：98)

5’DKX01 5’-GAATTGGTCGGATCCGACTTGCTGTGCTTC-3’(SEQ ID NO：106)

3’DKX02 5’-AGCAAGTCGGATCCGACCAATTCTGGCC-3’(SEQ ID NO：107)

5’DK269 5’-GCACATGCGTCGACTCCAACGAC-3’(SEQ ID NO：108)

3’DK270 5’-GTCGTTGGAGTCGACGCATGTGC-3’(SEQ ID NO：109)

5’DK273 5’-CGTCTACTCCACCGACTATTACT-3’(SEQ ID NO：110)

3’DK274 5’-AGTAATAGTCGGTGGAGTAGACG-3’(SEQ ID NO：111)

实施例13：经修饰的TrCel7A糖苷酶的构建

采用涉及大引物合成然后进行大引物PCR的两步PCR法，用pTrCel7A-pyr4-TV作为模板，将附加突变引入里氏木霉Cel7A(SEQ IDNO：124)(表6)。修饰内部引物以将期望的氨基酸替换引入TrCel7A构建体。使用外部的质粒引物(FT016和AC413)扩增终产物。采用

SV Gel和PCR Clean-Up系统纯化大引物和终产物。

表6：通过PCR产生经修饰的TrCel7A酶

将PCR终产物用MluI+KpnI消化并连接入用MluI+KpnI线性化的载体pTrCel7A-pyr4-TV中。将连接混合物转化入化学感受态DH5α大肠杆菌细胞中，提取质粒并测序。

5’FT016 5’-GCCTGCACTCTCCAATCG-3’(SEQ ID NO：112)

3’AC413 5’-GTTGCTCATTTGCGGTCTAC-3’(SEQ ID NO：113)

5’DK297 5’-TACGGCCAGTCTGGCGGTATTGGCTACAG-3’(SEQ ID NO：114)

3’DK298 5’-AATACCGCCAGACTGGCCGTAGTGAGAC-3’(SEQ ID NO：115)

5’DK299 5’-GGCCAGTGCTGCGGTATTGGC-3’(SEQ ID NO：116)

3’DK300 5’-CAATACCGCAGCACTGGCCGT-3’(SEQ ID NO：117)

5’DK301 5’-AGTGCGGCGACATTGGCTACAGCGGCC-3’(SEQ ID NO：118)

3’DK302 5’-GTAGCCAATGTCGCCGCACTGGCCGT-3’(SEQ ID NO：119)

5’DK315 5’-CACGGTCTATGCCAGCGGCACAACTT-3’(SEQ ID NO：120)

3’DK316 5’-GCCGCTGGCATAGACCGTGGGGCCG-3’(SEQ ID NO：121)

5’DK345 5’-TACTACTCTCAGTACCTGTAAGGTACC-3’(SEQ ID NO：122)

3’DK346 5’-GGTACCTTACAGGTACTGAGAGTAGTA-3’(SEQ ID NO：123)

实施例14：测量从水解剩余物中的纤维素酶回收率

采用蒸汽爆破预处理的小麦秸秆(如美国专利No.4,461,648所述制备)和过表达TrCel3A的来自里氏木霉菌株的纤维素酶混合物(如美国专利No.6,015,703所述)来完成纤维素水解实验。在整个水解时间进程中取得水解浆液样品并且离心以将上清液与固体分离。采用葡萄糖氧化酶-辣根过氧化酶偶联酶测定(Trinder等，1969)来测量上清液中的葡萄糖浓度。通过如美国专利No.7,785,854所述的ELISA来测量上清液中Cel7A的浓度。将葡萄糖浓度转化成纤维素转化率(Fractional CelluloseConversion)单位，并将Cel7A蛋白或活性转化成初始Cel7A分数单位(Cel7A回收率(Fractional Cel7A Recovery))

紧随在向这些底物中加入酶之后，仅约10％的总Cel7A保留在上清液中(图11)。伴随着转化率从约0增加至约0.60，上清液中Cel7A的浓度缓慢增加。随着BSA-WS的转化增加到0.60以上，上清液中Cel7A浓度逐渐增加，直至纤维素转化达到约99％时上清液中76％的总Cel7A被回收。从bWS水解的上清液中回收的Cel7A的分数浓度从约91％纤维素转化开始显著地增加，导致纤维素转化达到99％时总Cel7A的总回收为约89％。相比之下，在纤维素转化为相同水平(99％)时，来自水解预处理的小麦秸秆的Cel7A回收为约48％。这些实验表明，移除或封闭原位木质素显著地增加了从包含经预处理木质纤维素的水解反应中回收的纤维素酶(如TrCel7A)。

实施例15：在大规模酿酒酵母培养中表达和纯化经修饰的Cel6A糖苷酶

用10mL经转化酿酒酵母的过夜培养物(由从琼脂平板上新挑取的细胞培养而成)接种500mL无菌YDP培养基(10g/L酵母提取物、20g/L蛋白胨和20g/L葡萄糖)。随后将500mL培养物在30℃下定轨振荡孵育96小时。

孵育之后，将每个培养物的培养液以16700×g离心10分钟并弃去沉淀(含酵母细胞)。将上清液pH值调节至5.0，然后冷却至4℃，保持1小时。冷却之后，加入625g(NH₄)₂SO₄使酵母上清液的饱和度为93％。在4℃下持续搅拌2小时的时间以使得产生沉淀。以16700×g离心15分钟后，弃去上清液。

通过加入20mL 50mM柠檬酸盐(pH 5.0)重悬沉淀。一旦沉淀被重悬，就加入80mL 0.1M乙酸钠、200mM葡萄糖和1mM葡萄糖酸内酯(pH 5.0)。在轻柔搅拌的同时将样品在4℃下孵育30分钟。然后将每个样品以710×g离心3分钟，以沉淀任何不溶性物质。用移液管小心移出上清液以防止沉淀混入，并保存。通过如(Piyachomkwan等，1997)所述的APTC亲和色谱纯化每个样品中的Cel6A纤维素酶。将纯化的Cel6A纤维素酶的缓冲液置换为50mM柠檬酸盐(pH 5.0)，并使用Centricon(Millipore)离心浓缩器和5kDa NMWL聚醚砜膜进行浓缩。通过Bradford法来测量蛋白质浓度。通过SDS-PAGE来分离经纯化的亲本和经修饰的Cel6A糖苷酶样品，并通过考马斯亮蓝染色进行观察以确认每个制剂基本上纯并且不含核心化的酶。

实施例16：表征木质素存在下酿酒酵母表达的经修饰Cel6A糖苷酶的失活

以类似于实施例4所述的方法测试纯化的亲本和经修饰的TrCel6A和PcCel6A。各试验中使用的蛋白质和木质素的质量分别为0.08mg和28mg。这些试验中的总反应体积为2mL，并且在24小时的过程中获取样品。

以类似于实施例4所述的方法建立TrCel6A木质素失活曲线。用与每种经修饰的TrCel6A糖苷酶相关的K_L除以与亲本TrCel6A-S413P糖苷酶相关的K_L以计算相对K_L。图17中示出经修饰的TrCel6A糖苷酶的相对K_L值。包含具有G17D、N29D或N31T替换之经修饰第1家族CBM的经修饰TrCel6A-S413P糖苷酶变体均表现出对木质素的结合降低(由比亲本TrCel6A-S413P糖苷酶高出1.3倍至1.7倍的K_L证明)。

为了分析经修饰的PcCel6A糖苷酶，采用无模型法鉴定相对于亲本PcCel6A-S407P糖苷酶在木质素存在下失活较少的经修饰的糖苷酶。仅在加入木质素之前(t＝0小时)和加入酶之后24小时(t＝24小时)的木质素浆液中测量剩余PcCel6A活性。用孵育24小时之后木质素浆液中测量的PcCel6A活性除以t＝0小时时测量的酶活性，以计算每种酶的剩余活性率(fractional residual activity)。然后用每种经修饰的PcCel6A糖苷酶的剩余活性率除以亲本PcCel6A-S407P的剩余活性率以计算24小时时的相对剩余活性。图16中示出亲本和四个经修饰的PcCel6A糖苷酶的相对剩余活性。对每个亲本或经修饰的PcCel6A糖苷酶进行四个独立重复试验来完成这些测定。误差线代表每种经修饰的PcCel6A糖苷酶的这些试验的标准误差。在相当于SEQ ID NO：30的12、14和24位(PcCel6A-S407P-G10D、PcCel6A-S407P-G12D和PcCel6A-S407P-G22D)的位置上包含突变的经修饰糖苷酶的相对剩余活性显著地高于(高出1.9倍至2.9倍)亲本糖苷酶PcCel6A-S407P糖苷酶的相对剩余活性，提示经修饰糖苷酶的第1家族CBM中的突变引起更高的对木质素结合和/或木质素失活的抗性。

实施例17：经修饰的TrCel7A糖苷酶的表达

a.宿主里氏木霉菌株的构建

使用尿苷营养缺陷型里氏木霉菌株P297J(P297Jaux4)表达经修饰的TrCel6A和TrCel7A纤维素酶。如WO2010/0096931A1所述，该菌株包含cel7a，cel7b和cel6a基因的断裂并且不能产生TrCel7A，TrCel7B和TrCel6A纤维素酶。

b.里氏木霉原生质体的PEG转化

将5×10⁶个P297Jaux4的孢子铺在补充有5mM尿苷的马铃薯葡萄糖琼脂上的无菌玻璃纸上，并在30℃下孵育20小时以便于孢子萌发和菌丝体生长。将带有菌丝体的玻璃纸盘转移到10mL原生质体化溶液中，该溶液在含0.6M硫酸铵的pH为6.5的50mM磷酸钾缓冲液(缓冲液P)中含有7.5g/L崩溃酶和4g/L β-葡聚糖酶(InterSpex Products Inc.，目录号分别为0465-1和0439-2)。将菌丝体垫以60rpm振荡消化5小时。通过经无菌No.30MIRACLOTH^TM过滤将原生质体与未消化的菌丝体分离，并收集入无菌的50mL圆底离心管中，通过在室温下以1000g-1500g离心10分钟进行回收。用5mL缓冲液P洗涤原生质体，并在室温下以1000g-1500g再次离心10分钟。将原生质体重悬于1mL STC缓冲液(1.2M山梨醇、10mM CaCl₂、10mM Tris-HCL，pH 7.5)中。为进行转化，将0.1mL重悬的原生质体与10μg载体p TrCel7A-pyr4-TV DNA(或与实施例13所述构建的编码经修饰TrCel7A糖苷酶的载体类似的载体)以及25μLPEG溶液(25％PEG3350、50mM CaCl₂、10mM Tris-HCl，pH7.5)合并。在冰水浴中孵育30分钟之后，添加1mL PEG溶液并将混合物在室温下孵育5分钟。用2mL STC缓冲液稀释转化混合物，并将全部混合物加入冷却至约47℃的50mL熔融MMSS琼脂培养基中(见下文)，分成两份，倒在MMSS琼脂上。将平板在30℃下孵育直到可见菌落生长。将转化体转移至含有MM琼脂的单个平板上并使其形成孢子。收集孢子并以高稀释度铺在MM琼脂上，以分离同核体转化体，然后将同核体转化体铺在PDA上，使其生长并充分形成孢子，以接种如下所述的筛选培养物：

基本培养基(MM)琼脂包含：

＊MMSS琼脂含有与MM琼脂相同的组分加上1.2M山梨醇、6.6g/LYNB(来自DIFCO目录号291940的具有或不具有氨基酸的酵母氮源)和1.92g/L氨基酸(来自Sigma目录号Y1501-20G的-Ura DO补充剂)。

c.在里氏木霉微量培养物中生产经修饰的糖苷酶

选择表达每种经修饰TrCel7A糖苷酶的5个随机独立转化体组用于在24孔微量培养中预筛选。将木霉的单个菌落转移至PDA平板用于培养每种培养物。孢子形成对于均匀接种微量培养物是必需的，其用于测试培养物产生纤维素酶的能力。培养基包含：

＊微量元素溶液包含5g/L FeSO₄＊7H₂0；1.6g/L MnSO₄＊H₂0；1.4g/Ll ZnSO₄＊7H₂0。＊＊葡萄糖、Solka floc、乳糖、纤维二糖、槐糖、玉米糖浆或Avicel。碳源可作为pH 2至7的水溶液下分开灭菌，并在最开始时或在发酵过程中加入其余的培养基中。

将单个转化体在上述培养基中于24孔微孔板中的1mL培养物中培养。初始pH为5.5，并在接种前将培养基于121℃下高压蒸汽灭菌30分钟。对于天然和转化的细胞，从PDA平板中分离孢子，悬于水中，并用每mL10⁴-10⁶个孢子接种每份培养物。将培养物在30℃的温度下以250rpm振荡6天。通过以12000rpm离心，从含有分泌蛋白的滤液中分离生物质。使用Bio-Rad蛋白质测定(目录号500-0001)测定蛋白质浓度。

通过ELISA测定微量培养滤液中TrCel7A的相对丰度(按总分泌蛋白质的重量计)。将培养上清液和纯化的组分标准品在pH7.2的磷酸盐缓冲盐水(PBS)中稀释成0.01-10μg/mL，并在4℃下于微量滴定板(CostarEIA#9018)中孵育过夜。用含有0.1％Tween-20的PBS(PBS/Tween)洗涤这些板，并在含有1％牛血清白蛋白的PBS(PBS/BSA)中于室温下孵育1小时。用PBS/Tween洗涤被封闭的微量滴定孔。在PBS/BSA中稀释TrCel7A特异性兔多克隆抗血清，加入不同的微量滴定板中并在室温下孵育2小时。洗涤板并用与辣根过氧化物酶偶联的山羊抗兔抗体(Sigma#A6154)(在PBS/BSA中稀释为1/2000)在室温下孵育1小时。洗涤后，向每个板中加入四甲基联苯胺并在室温下孵育30分钟。在360nm处测每个孔的吸光度并用TrCel7A标准曲线转化成蛋白质浓度。

实施例18：经修饰的TrCel7A糖苷酶的表征

于30℃下，将表达每种经修饰的TrCel7A糖苷酶且在微量培养滤液中表现出最高的TrCel7A表达水平(如实施例17所述)的各一种转化体在振荡烧瓶中的50mL微量培养培养基中培养6天，同时以250rpm振荡。收集上清液并如实施例4所述评价经修饰的TrCel7A糖苷酶的木质素失活。在相当于SEQ ID NO：30的10、11、12、14、21和37位(TrCel7A-C469S、TrCel7A-G470C、TrCel7A-G471D、TrCel7A-C480Y和TrCel7A-C496Y)的位置上包含突变的经修饰TrCel7A糖苷酶的相对木质素解离常数(相对K_L)显著地高于(高出1.8倍至3.2倍)亲本糖苷酶TrCel7A糖苷酶的相对木质素解离常数，提示经修饰糖苷酶的第1家族CBM中的突变引起更高的对木质素结合和/或木质素失活的抗性。

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权利要求书(按照条约第19条的修改)

1.经修饰的第1家族碳水化合物结合组件，其在选自11、12、17、24和29的一个或更多个位置上包含替换为酸性氨基酸的氨基酸替换，所述位置通过比对第1家族碳水化合物结合组件的氨基酸序列与SEQ IDNO：1第1至38位氨基酸所示里氏木霉(Trichoderma reesei)Cel6A碳水化合物结合组件的氨基酸序列来确定，其中所述经修饰的第1家族碳水化合物结合包含与SEQ ID NO：1第1至38位氨基酸具有约60％至约99.9％同一性的氨基酸序列，而且与结晶纤维素结合且相对于衍生出它的亲本第1家族CBM显示出与木质素结合降低。

2.权利要求1所述的经修饰的第1家族碳水化合物结合组件，其中所述酸性氨基酸是天冬氨酸。

3.经修饰的第1家族碳水化合物结合组件，其包含选自以下的一个或更多个位置氨基酸替换：将第10位替换为丝氨酸，将第21位替换为芳族氨基酸，将第33位替换为天冬酰胺，以及将第37位替换为芳族氨基酸，所述位置通过比对第1家族碳水化合物结合组件的氨基酸序列与SEQ IDNO：1第1至38位氨基酸所示里氏木霉Cel6A碳水化合物结合组件的氨基酸序列来确定，其中所述经修饰的第1家族碳水化合物结合包含与SEQID NO：1第1至38位氨基酸具有约60％至约99.9％同一性的氨基酸序列，而且与结晶纤维素结合且相对于衍生出它的亲本第1家族CBM显示出与木质素结合降低。

4.权利要求3所述的经修饰的第1家族碳水化合物结合组件，其中将所述第21位上的氨基酸替换为酪氨酸，以及将所述第37位上的氨基酸替换为酪氨酸。

5.权利要求1至4中任一项所述的经修饰的第1家族碳水化合物结合组件，其中所述经修饰的第1家族碳水化合物结合组件的氨基酸序列与SEQ ID NO：30具有约75％至约99.9％同一性。

6.权利要求1至5中任一项所述的经修饰的第1家族碳水化合物结合组件，其中所述经修饰的第1家族碳水化合物结合组件使糖苷酶对木质素的结合降低，所述糖苷酶包含由一个或更多个接头肽连接的所述经修饰的第1家族碳水化合物结合组件、一个或更多个催化结构域和一个或更多个碳水化合物结合组件。

7.经修饰的糖苷酶，其包含一个或更多个催化结构域和一个或更多个碳水化合物结合组件，其中

(a)所述一个或更多个催化结构域和一个或更多个碳水化合物结合组件通过一个或更多个接头肽功能性连接；以及

(b)所述一个或更多个碳水化合物结合组件中的至少一个是权利要求1至6中任一项所述的经修饰的第1家族碳水化合物结合组件，

与亲本糖苷酶相比，所述经修饰的糖苷酶显示出木质素存在下的水解活性升高和/或对木质素的结合降低，所述亲本糖苷酶包含由相同的一个或更多个接头肽连接的衍生出所述经修饰的碳水化合物结合组件的亲本第1家族碳水化合物结合组件、相同的一个或更多个催化结构域和相同的一个或更多个碳水化合物结合组件。

8.权利要求7所述的经修饰的糖苷酶，其中所述一个或更多个催化结构域选自纤维素酶催化结构域、半纤维素酶催化结构域、β-葡糖苷酶催化结构域和辅助成分催化结构域。

9.权利要求8所述的经修饰的糖苷酶，其中所述纤维素酶催化结构域是第5、6、7、8、9、12、44、45、48、51、61或74家族糖苷水解酶的成员；所述半纤维素酶催化结构域是第5、8、10、11、26、43、51、54、62或113家族糖苷水解酶的成员，所述β-葡糖苷酶催化结构域是第1或3家族糖苷水解酶的成员；以及所述辅助成分催化结构域是膨胀因子、CIP或扩展蛋白催化结构域。

10.权利要求9所述的经修饰的糖苷酶，其中所述纤维素酶催化结构域是第6或7家族糖苷水解酶的成员。

11.权利要求10所述的经修饰的糖苷酶，其中所述纤维素酶催化结构域包含SEQ ID NO：1(里氏木霉Cel6A)第83-447位氨基酸、SEQ IDNO：124(里氏木霉Cel7A)第1-436位氨基酸、SEQ ID NO：2(特异腐质霉(Humicola insolens)Avi2)第97-460位氨基酸，或SEQ ID No：3(黄孢原毛平革菌(Phanerochaete chrysosporium)Cel6A)第81-440位氨基酸。

12.权利要求11所述的经修饰的糖苷酶，其中所述纤维素酶催化结构域是包含选自以下的一个或更多个氨基酸替换的SEQ ID NO：1(里氏木霉Cel6A)第83-447位氨基酸：Y103H、Y103K、Y103R、Y103A、Y103V、Y103L、Y103P、K129E、L136V、L136I、S186K、S186T、S186Y、Q204K、G2131D、A322D、Q363E、G365D、G365E、G365Q、G365S、R410A、R410F、R410L、R410Q和R410S。

13.权利要求8所述的经修饰的糖苷酶，其中所述β-葡糖苷酶催化结构域是包含选自以下的一个或更多个氨基酸替换的SEQ ID No：100的里氏木霉Cel3A：V43X、V66X、S72X、V101X、T235X、N248X、F260X、N369X、A386X和I543X。

14.权利要求8所述的经修饰的糖苷酶，其中所述一个或更多个催化结构域来自真菌糖苷酶。

15.权利要求14所述的经修饰的糖苷酶，其中所述真菌糖苷酶来自木霉属(Trichoderma ssp.)、曲霉属(Aspergillus ssp.)、肉座菌属(Hypocreassp.)、腐质霉属(Humicola ssp.)、脉孢菌属(Neurospora ssp.)、Orpinomycesssp.、赤霉菌属(Gibberella ssp.)、裸胞壳属(Emericella ssp.)、毛壳属(Chaetomium ssp.)、金孢属(Chrysosporium ssp.)、镰刀菌属(Fusariumssp.)、青霉菌属(Penicillium ssp.)、Magnaporthe ssp.、原毛平革菌属(Phanerochaete ssp.)、栓菌属(Trametes ssp.)、埃杜拉香菇(Lentinulaedodes)、Gleophyllum trabeiu、Ophiostoma piliferum、Corpinus cinereus、Geomyces pannorum、罗伦隐球酵母(Cryptococcus laurentii)、出芽短梗霉(Aureobasidium pullulans)、煤油霉菌(Amorphotheca resinae)、白冬孢酵母(Leucosporidium scotti)、雅致小克银汉霉(Cunninghamellaelegans)、疏棉状嗜热丝孢菌(Thermomyces lanuginosa)、嗜热毁丝霉(Myceliophthora thermophilum)或嗜热侧孢霉(Sporotrichumthermophile)。

16.权利要求15所述的经修饰的糖苷酶，其中所述真菌糖苷酶来自里氏木霉。

17.权利要求7所述的经修饰的糖苷酶，其中所述一个或更多个接头肽是约6至约60个氨基酸长的经修饰的接头肽，并且其中至少约50％的氨基酸是脯氨酸、丝氨酸或苏氨酸，所述经修饰的接头肽相对于衍生出所述经修饰的接头肽的亲本接头肽包含一个或更多个导致以下结果的氨基酸替换、插入或缺失，

(a)所述接头肽的计算等电点降低；或

(b)所述接头肽中苏氨酸∶丝氨酸的比例增加；或

(c)(a)和(b)二者；

所述经修饰的接头肽使所述经修饰的糖苷酶与亲本糖苷酶相比，木质素存在下的水解活性升高和/或对木质素的结合降低，所述亲本糖苷酶包含位于相同纤维素酶催化结构域与碳水化合物结合组件之间的所述亲本接头。

18.基因构建体，其包含编码权利要求1至6中任一项所述之经修饰的第1家族碳水化合物结合组件的核酸序列。

19.基因构建体，其包含编码权利要求7至17中任一项所述之经修饰的糖苷酶的核酸序列。

20.分离的经遗传修饰的微生物，其包含权利要求18所述的基因构建体。

21.分离的经遗传修饰的微生物，其包含权利要求19所述的基因构建体。

22.权利要求21或22所述的分离的经遗传修饰的微生物，其中所述微生物是细菌、酵母或丝状真菌物种。

23.权利要求22所述的分离的经遗传修饰的微生物，其中所述微生物是链霉菌属(Streptomyces)、酵母属(Saccharomyces)、毕赤酵母属(Pichia)、汉逊酵母属(Hansenula)、肉座菌属(Hypocrea)、木霉属(Trichoderma)、曲霉属(Aspergillus)、镰刀菌属(Fusarium)、金孢霉属(Chysoporium)或毁丝霉属(Myceliophthora)的物种。

24.用于产生权利要求1至6中任一项所述的经修饰的第1家族碳水化合物结合组件的方法，其包括以下步骤：在诱导所述经修饰的第1家族碳水化合物结合组件的表达和分泌的条件下，培养权利要求20所述的经遗传修饰的微生物，并且从培养基中回收所述经修饰的第1家族碳水化合物结合组件。

25.用于产生权利要求7至17中任一项所述的经修饰的糖苷酶的方法，其包括以下步骤：在诱导所述经修饰的糖苷酶的表达和分泌的条件下，培养权利要求21所述的经遗传修饰的微生物，并且从培养基中回收所述经修饰的糖苷酶。

26.用于将纤维素或半纤维素底物水解成糖的方法，其包括在木质素存在下使所述底物接触权利要求7至17中任一项所述的经修饰的糖苷酶。

27.权利要求26所述的方法，其中所述纤维素或半纤维素底物是经预处理的木质纤维素底物。

28.权利要求26或27所述的方法，其中所述经修饰的糖苷酶与亲本糖苷酶相比在所述方法中显示出提高的回收率，所述亲本糖苷酶包含相同的一个或更多个催化结构域、一个或更多个接头肽和一个或更多个碳水化合物结合组件，其中所述一个或更多个碳水化合物结合组件中至少一个是衍生出所述经修饰的糖苷酶中的所述经修饰的第1家族碳水化合物结合组件的亲本第1家族碳水化合物结合组件。

29.权利要求28所述的方法，其中所述方法以连续、半连续或补料分批方法进行。

30.权利要求26所述的方法，其还包括糖到醇或糖醇的微生物发酵。

Claims

1.经修饰的第1家族碳水化合物结合组件，其在选自10、11、12、14、17、21、24、29、31、33和37的一个或更多个位置上包含氨基酸替换，所述位置通过比对第1家族碳水化合物结合组件的氨基酸序列与SEQID NO：30所示里氏木霉(Trichoderma reesei)Cel6A碳水化合物结合组件的氨基酸序列来确定，其中所述经修饰的第1家族碳水化合物结合组件显示出与结晶纤维素结合并且包含与SEQ ID NO：30具有约50％至约99.9％同一性的氨基酸序列。

2.经修饰的第1家族碳水化合物结合组件，其在选自11、12、14、17、24、29和31的一个或更多个位置上包含替换为酸性氨基酸的氨基酸替换，所述位置通过比对第1家族碳水化合物结合组件的氨基酸序列与SEQ ID NO：30所示里氏木霉Cel6A碳水化合物结合组件的氨基酸序列来确定，其中所述经修饰的第1家族碳水化合物结合组件显示出与结晶纤维素结合并且包含与SEQ ID NO：30具有约50％至约99.9％同一性的氨基酸序列。

3.权利要求2所述的经修饰的第1家族碳水化合物结合组件，其中所述酸性氨基酸是天冬氨酸。

4.经修饰的第1家族碳水化合物结合组件，其在选自10、21、33和37的一个或更多个位置上包含氨基酸替换，所述位置通过比对第1家族碳水化合物结合组件的氨基酸序列与SEQ ID NO：30所示里氏木霉Cel6A碳水化合物结合组件的氨基酸序列来确定，其中所述经修饰的第1家族碳水化合物结合组件显示出与结晶纤维素结合并且包含与SEQ IDNO：30具有约50％至约99.9％同一性的氨基酸序列。

5.权利要求4所述的经修饰的第1家族碳水化合物结合组件，其中将所述第10位上的氨基酸替换为丝氨酸，将所述第21位上的氨基酸替换为芳族氨基酸，将所述第33位上的氨基酸替换为天冬酰胺，以及将所述第37位上的氨基酸替换为芳族酸性氨基酸。

6.权利要求5所述的经修饰的第1家族碳水化合物结合组件，其中将所述第21位上的氨基酸替换为酪氨酸，以及将所述第37位上的氨基酸替换为酪氨酸。

7.权利要求1至6中任一项所述的经修饰的第1家族碳水化合物结合组件，其中所述经修饰的第1家族碳水化合物结合组件的氨基酸序列与SEQ ID NO：30具有约60％至约99.9％同一性。

8.权利要求1至6中任一项所述的经修饰的第1家族碳水化合物结合组件，其中所述经修饰的第1家族碳水化合物结合组件的氨基酸序列与SEQ ID NO：30具有约75％至约99.9％同一性。

9.权利要求1至8中任一项所述的经修饰的第1家族碳水化合物结合组件，其中所述经修饰的第1家族碳水化合物结合组件显示出对木质素的结合降低。

10.权利要求1至9中任一项所述的经修饰的第1家族碳水化合物结合组件，其中所述经修饰的第1家族碳水化合物结合组件使糖苷酶对木质素的结合降低，所述糖苷酶包含由一个或更多个接头肽连接的所述经修饰的第1家族碳水化合物结合组件、一个或更多个催化结构域和一个或更多个碳水化合物结合组件。

11.经修饰的糖苷酶，其包含一个或更多个催化结构域和一个或更多个碳水化合物结合组件，其中

(b)所述一个或更多个碳水化合物结合组件中的至少一个是权利要求1至8中任一项所述的经修饰的第1家族碳水化合物结合组件，

12.权利要求11所述的经修饰的糖苷酶，其中所述一个或更多个催化结构域选自纤维素酶催化结构域、半纤维素酶催化结构域、β-葡糖苷酶催化结构域和辅助成分催化结构域。

13.权利要求12所述的经修饰的糖苷酶，其中所述纤维素酶催化结构域是第5、6、7、8、9、12、44、45、48、51、61和74家族糖苷水解酶的成员；所述半纤维素酶催化结构域是第5、8、10、11、26、43、51、54、62或113家族糖苷水解酶的成员，所述β-葡糖苷酶催化结构域是第1或3家族糖苷水解酶的成员；以及所述辅助成分催化结构域是膨胀因子、CIP或扩展蛋白催化结构域。

14.权利要求13所述的经修饰的糖苷酶，其中所述纤维素酶催化结构域是第6或7家族糖苷水解酶的成员。

15.权利要求14所述的经修饰的糖苷酶，其中所述纤维素酶催化结构域包含SEQ ID NO：1(里氏木霉Cel6A)第83-447位氨基酸、SEQ IDNO：124(里氏木霉Cel7A)第1-436位氨基酸、SEQ ID NO：2(特异腐质霉(Humicola insolens)Avi2)第97-460位氨基酸，或SEQ ID No：3(黄孢原毛平革菌(Phanerochaete chrysosporium)Cel6A)第81-440位氨基酸。

16.权利要求15所述的经修饰的糖苷酶，其中所述纤维素酶催化结构域包含含有选自以下的一个或更多个氨基酸替换的SEQ ID NO：1(里氏木霉Cel6A)第83-447位氨基酸：Y103H、Y103K、Y103R、Y103A、Y103V、Y103L、Y103P、K129E、L136V、L136I、S186K、S186T、S186Y、Q204K、G2131D、A322D、Q363E、G365D、G365E、G365Q、G365S、R410A、R410F、R410L、R410Q和R410S。

17.权利要求12所述的经修饰的糖苷酶，其中所述β-葡糖苷酶催化结构域是包含选自以下的一个或更多个氨基酸替换的SEQ ID No：100的里氏木霉Cel3A：V43X、V66X、S72X、V101X、T235X、N248X、F260X、N369X、A386X和I543X。

18.权利要求12所述的经修饰的糖苷酶，其中所述一个或更多个催化结构域来自真菌糖苷酶。

19.权利要求18所述的经修饰的糖苷酶，其中所述真菌糖苷酶来自木霉属(Trichoderma ssp.)、曲霉属(Aspergillus ssp.)、肉座菌属(Hypocreassp.)、腐质霉属(Humicola ssp.)、脉孢菌属(Neurospora ssp.)、Orpinomycesssp.、赤霉菌属(Gibberella ssp.)、裸胞壳属(Emericella ssp.)、毛壳属(Chaetomium ssp.)、金孢属(Chrysosporium ssp.)、镰刀菌属(Fusariumssp.)、青霉菌属(Penicillium ssp.)、Magnaporthe ssp.、原毛平革菌属(Phanerochaete ssp.)、栓菌属(Trametes ssp.)、埃杜拉香菇(Lentinulaedodes)、Gleophyllum trabeiu、Ophiostoma piliferum、Corpinus cinereus、Geomyces pannorum、罗伦隐球酵母(Cryptococcus laurentii)、出芽短梗霉(Aureobasidium pullulans)、煤油霉菌(Amorphotheca resinae)、白冬孢酵母(Leucosporidium scotti)、雅致小克银汉霉(Cunninghamellaelegans)、疏棉状嗜热丝孢菌(Thermomyces lanuginosa)、嗜热毁丝霉(Myceliophthora thermophilum)或嗜热侧孢霉(Sporotrichumthermophile)。

20.权利要求19所述的经修饰的糖苷酶，其中所述真菌糖苷酶来自里氏木霉。

21.权利要求11至20中任一项所述的经修饰的糖苷酶，其中所述一个或更多个催化结构域是野生型催化结构域，或相对于野生型催化结构域包含氨基酸替换、插入或缺失的经修饰的催化结构域。

22.权利要求11至20中任一项所述的经修饰的糖苷酶，其中除所述经修饰的第1家族碳水化合物结合组件之外的所述一个或更多个碳水化合物结合组件是野生型碳水化合物结合组件，或相对于野生型催化结构域包含氨基酸替换、插入或缺失的经修饰的碳水化合物结合组件。

23.权利要求11至20中任一项所述的经修饰的糖苷酶，其中所述一个或更多个接头肽是野生型接头肽，或相对于野生型催化结构域包含氨基酸替换、插入或缺失的经修饰的接头肽。

24.权利要求23所述的经修饰的糖苷酶，其中所述一个或更多个接头肽是约6至约60个氨基酸长的经修饰的接头肽，并且其中至少约50％的氨基酸是脯氨酸、丝氨酸或苏氨酸，所述经修饰的接头肽相对于衍生出所述经修饰的接头肽的亲本接头肽包含一个或更多个导致以下结果的氨基酸替换、插入或缺失，

(a)所述接头肽的计算等电点降低；或

(b)所述接头肽中苏氨酸：丝氨酸的比例增加；或

(c)(a)和(b)二者；

25.基因构建体，其包含编码权利要求1至10中任一项所述之经修饰的第1家族碳水化合物结合组件的核酸序列。

26.基因构建体，其包含编码权利要求11至24中任一项所述之经修饰的糖苷酶的核酸序列。

27.分离的经遗传修饰的微生物，其包含权利要求23所述的基因构建体。

28.分离的经遗传修饰的微生物，其包含权利要求24所述的基因构建体。

29.权利要求27或28所述的分离的经遗传修饰的微生物，其中所述微生物是细菌、酵母或丝状真菌物种。

30.权利要求29所述的分离的经遗传修饰的微生物，其中所述微生物是链霉菌属(Streptomyces)、酵母属(Saccharomyces)、毕赤酵母属(Pichia)、汉逊酵母属(Hansenula)、肉座菌属(Hypocrea)、木霉属(Trichoderma)、曲霉属(Aspergillus)、镰刀菌属(Fusarium)、金孢霉属(Chysoporium)或毁丝霉属(Myceliophthora)的物种。

31.用于产生权利要求1至10中任一项所述的经修饰的第1家族碳水化合物结合组件的方法，其包括以下步骤：在诱导所述经修饰的第1家族碳水化合物结合组件的表达和分泌的条件下，培养权利要求27所述的经遗传修饰的微生物，并且从培养基中回收所述经修饰的第1家族碳水化合物结合组件。

32.用于产生权利要求11至24中任一项所述的经修饰的糖苷酶的方法，其包括以下步骤：在诱导所述经修饰的糖苷酶的表达和分泌的条件下，培养权利要求28所述的经遗传修饰的微生物，并且从培养基中回收所述经修饰的糖苷酶。

33.用于将纤维素或半纤维素底物水解成糖的方法，其包括在木质素存在下使所述底物接触权利要求11至24中任一项所述的经修饰的糖苷酶。

34.权利要求33所述的方法，其中所述纤维素或半纤维素底物是经预处理的木质纤维素底物。

35.权利要求33或34所述的方法，其中所述经修饰的糖苷酶与亲本糖苷酶相比在所述方法中显示出提高的回收率，所述亲本糖苷酶包含相同的一个或更多个催化结构域、一个或更多个接头肽和一个或更多个碳水化合物结合组件，其中所述一个或更多个碳水化合物结合组件中至少一个是衍生出所述经修饰的糖苷酶中的所述经修饰的第1家族碳水化合物结合组件的亲本第1家族碳水化合物结合组件。

36.权利要求35所述的方法，其中所述方法以连续、半连续或补料分批方法进行。

37.权利要求33所述的方法，其还包括糖到醇或糖醇的微生物发酵。