ES2357037T3 - Métodos para degradar materiales lignocelulósicos. - Google Patents
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Abstract
Método para degradar un material lignocelulósico, que comprende: tratar el material lignocelulósico con una cantidad eficaz de una o más enzimas celulolíticas en la presencia de al menos un tensioactivo donde el tensioactivo es un alcohol etoxilado secundario, y donde la presencia del tensioactivo aumenta la degradación del material lignocelulósico en comparación con la ausencia del tensioactivo.
Description
Métodos para degradar materiales
lignocelulósicos.
\global\parskip0.930000\baselineskip
La presente invención se refiere a métodos para
degradar materiales lignocelulósicos.
La mayoría de los carbohidratos en las plantas
están en forma de lignocelulosa, que está compuesta principalmente
de celulosa, hemicelulosa, pectina y lignina. La lignocelulosa se
encuentra, por ejemplo, en los tallos, las hojas, el hollejo, las
cáscaras y las mazorcas de plantas. La hidrólisis de estos polímeros
libera una mezcla de azúcares neutros incluidos glucosa, xilosa,
manosa, galactosa y arabinosa.
La celulosa es un polímero de la glucosa de
azúcar simple unido covalentemente por enlaces
beta-1-4. Muchos microorganismos
producen enzimas que hidrolizan glucanos unidos por beta. Estas
enzimas incluyen endoglucanasas, celobiohidrolasas, glucohidrolasas
y beta-glucosidasas. Las endoglucanasas digieren el
polímero de celulosa en lugares aleatorios, abriéndolo al ataque por
parte de las celobiohidrolasas. Las glucohidrolasas liberan
moléculas de glucosa a partir de los extremos del polímero de
celulosa. Las celobiohidrolasas liberan consecutivamente moléculas
de celobiosa de los extremos del polímero de celulosa. La celobiosa
es un dímero de glucosa hidrosoluble de enlaces
beta-1,4. Las beta-glucosidasas
hidrolizan la celobiosa a glucosa.
Las hemicelulosas son heteropolisacáridos de
cadena corta ramificada que están compuestas por varias hexosas
(glucosa, manosa y galactosa), pentosas (D-xilosa y
L-arabinosa), ácidos urónicos, ácido acético y otros
azúcares menores. Similar a la degradación de celulosa, la
hidrólisis de hemicelulosa requiere acción coordinada de muchas
enzimas, que pueden colocarse en tres categorías generales: las
enzimas endo activas que atacan los enlaces internos dentro de la
cadena polisacárida, las enzimas exo activas que actúan de manera
consecutiva desde el extremo reductor o no reductor de la cadena
polisacárida, y las enzimas accesorias (acetilesterasas y esterasas
que hidrolizan enlaces glucosídicos de lignina).
Los materiales lignocelulósicos, tales como la
madera, el material herbáceo, los residuos agrícolas, la fibra de
maíz, los desechos de papel, pulpa y los residuos de fábrica de
papel, pueden utilizarse para producir etanol. Ningún organismo
natural conocido puede rápidamente y eficazmente metabolizar todos
los polímeros de carbohidrato en la biomasa lignocelulósica en
etanol. La conversión de materias primas lignocelulósicas en etanol
tiene las ventajas de la disponibilidad inmediata de cantidades
grandes de materia prima, la conveniencia de evitar quemar los
materiales o utilizarlos para relleno sanitario y la limpieza del
combustible de etanol. Una vez que la celulosa se convierte en
glucosa, la glucosa es fácilmente fermentada por la levadura en
etanol.
No obstante, un obstáculo para la
comercialización es el coste de las enzimas para convertir el
material lignocelulósico en glucosa y otros azúcares fermentables.
Hay una necesidad en la técnica de mejorar la capacidad de las
enzimas celulolíticas para degradar materiales lignocelulósicos en
productos orgánicos útiles o en productos intermedios a productos
finales útiles.
Ericsson, T. et al., (2002) Enzyme and
Microbial Technology, vol. 31, n.º 3:353-364 divulga
que en la hidrólisis de tensioactivos no iónicos de abeto pretratado
con vapor mejoró la hidrólisis enzimática en un
30-45%.
Es un objeto de la presente invención mejorar la
capacidad de las enzimas celulolíticas para degradar materiales
lignocelulósicos.
La presente invención se refiere a métodos para
degradar un material lignocelulósico, que comprende: tratar el
material lignocelulósico con una cantidad eficaz de una o más
enzimas celulolíticas en presencia de al menos un tensioactivo donde
el tensioactivo es un alcohol etoxilado secundario, donde la
presencia del tensioactivo aumenta la degradación de material
lignocelulósico en comparación con la ausencia del tensioactivo.
La presente invención también se refiere a
métodos para producir una sustancia orgánica, que comprende:
(a) sacarificar un material lignocelulósico con
una cantidad eficaz de una o más enzimas celulolíticas en presencia
de al menos un tensioactivo donde el tensioactivo es un alcohol
etoxilado secundario, donde la presencia del tensioactivo aumenta la
degradación de material lignocelulósico en comparación con la
ausencia del tensioactivo;
(b) fermentar el material lignocelulósico
sacarificado del paso (a) con uno o más microorganismos
fermentativos; y
(c) recuperar la sustancia orgánica de la
fermentación.
\global\parskip1.000000\baselineskip
En una forma de realización preferida, la
sustancia orgánica es alcohol.
La Figura 1 muestra un mapa de restricción de
pAILo1.
La Figura 2 muestra un mapa de restricción de
pMJ04.
La Figura 3 muestra un mapa de restricción de
pCaHj527.
La Figura 4 muestra un mapa de restricción de
pMT2188.
La Figura 5 muestra un mapa de restricción de
pCaHj568.
La Figura 6 muestra un mapa de restricción de
pMJ05.
La Figura 7 muestra la secuencia de ADN (SEC ID
n.º: 26) y la secuencia de aminoácidos deducida (SEC ID n.º: 27) de
la secuencia señal de secreción de una
beta-glucosidasa de Aspergillus oryzae.
La Figura 8 muestra la secuencia de ADN (SEC ID
n.º: 30) y la secuencia de aminoácidos deducida (SEC ID n.º: 31) de
la secuencia señal de secreción de una endoglucanasa V de
Humicola insolens.
La Figura 9 muestra un mapa de restricción de
pSMai135.
Las Figuras 10A y 10B muestran la secuencia de
ADN genómico y la secuencia de aminoácidos deducida de una
beta-glucosidasa de Aspergillus fumigatus
(SEC ID n.os: 36 y 37, respectivamente). El péptido señal predicho
es subrayado y los intrones predichos aparecen en cursiva.
La Figura 11 muestra un mapa de restricción de
pBANe10.
La Figura 12 muestra un mapa de restricción de
pAlLo2.
La Figura 13 muestra un mapa de restricción de
pEJG97.
La Figura 14 muestra un mapa de restricción de
pMJ06.
La Figura 15 muestra un mapa de restricción de
pMJ09.
La Figura 16 muestra un mapa de restricción de
pJZHEG1.
La Figura 17 muestra el efecto del Softanol® 90
(0,1 ml/g PCS) en la hidrólisis de PCS (5%) por Celluclast 1,5L a
50ºC.
La Figura 18 muestra el efecto de Lutensol® AT80
(0,1 ml/g PCS) en la hidrólisis de PCS (5%) por Celluclast 1,5L a
50ºC.
La Figura 19 muestra el efecto del Softanol® 90
(0,2 ml/g PCS) en la hidrólisis de PCS (5%) por Celluclast 1,5L a
50ºC.
La Figura 20 muestra el efecto de Softanol® 90
(0,2 ml/g PCS) en la hidrólisis de PCS (5%) por Celluclast 1,5L a
55ºC.
La Figura 21 muestra la dependencia de dosis de
Softanol® 90 para la hidrólisis de PCS (5%) por Celluclast 1,5L (2
mg/g PCS) a 50ºC.
La Figura 22 muestra el efecto de diferentes
productos de Softanol® en la hidrólisis de PCS (5%) por Celluclast
1,5L (2 mg/g PCS) a 50ºC.
La Figura 23 muestra el efecto de Softanol® 90
(0,2 ml/g PCS) en la hidrólisis de PCS (5%) por Celluclast 1,5L (2
mg/g PCS) suplementada con beta-glucosidasa de
Aspergillus oryzae (0,06 mg/g PCS) y caldo libre de célula de
beta-glucosidasa de Aspergillus oryzae de
expresión de Trichoderma reesei (2 mg/g PCS) a 50ºC.
La Figura 24 muestra el efecto de Softanol® 90
(0,1 ml/g PCS) en conversión de 24 horas de PCS molido/lavado con
etanol (1%) por celobiohidrolasa I de Trichoderma reesei
purificada (2-10 mg/g PCS) a
40-65ºC.
La Figura 25 muestra el efecto de Softanol® 90
(0,1 ml/g PCS) en conversión de 24 horas de PCS molido/ lavado con
etanol (1%) por celobiohidrolasa I de Trichoderma reesei
purificada (2-10 mg/g PCS) suplementado con 5%
beta-glucosidasa de Aspergillus fumigatus
(0,1-0,5 mg/g PCS) a 40-65ºC.
La Figura 26 muestra el efecto de Softanol® 90
(0,1 ml/g PCS) en conversión de 24 horas de PCS molido/lavado con
etanol (1%) por celobiohidrolasa I de Trichoderma reesei
purificada (2-20 mg/g PCS) suplementado con 20% de
endoglucanasa I de Trichoderma reesei (0,4-4
mg/g PCS) y 5% de beta-glucosidasa de Aspergillus
fumigatus (0,1-1 mg/g PCS) a
40-65ºC.
La Figura 27 muestra el efecto de Softanol® 90
(0,1 ml/g PCS) en conversión de 24 horas de PCS molido/lavado con
etanol (1%) por celobiohidrolasa I de Trichoderma reesei
purificada (2-20 mg/g PCS) suplementado con 20% de
E1cd de Acidothermus cellulolyticus (0,4-4
mg/g PCS) y 5% de beta-glucosidasa de Aspergillus
fumigatus (0,1-1 mg/g PCS) a
40-65ºC.
La Figura 28 muestra el efecto de Softanol®
(0,05-0,2 ml/g celulosa) en hidrólisis de Avicel
(1%) por Celluclast 1,5L (1,25-20 mg/celulosa) a
50ºC.
La presente invención se refiere a métodos para
degradar un material lignocelulósico, que comprende: tratar el
material lignocelulósico con una cantidad eficaz de una o más
enzimas celulolíticas en presencia de al menos un tensioactivo donde
el tensioactivo es un alcohol etoxilado secundario, donde la
presencia del tensioactivo aumenta la degradación de material
lignocelulósico en comparación con la ausencia del tensioactivo.
\vskip1.000000\baselineskip
En los métodos de la presente invención, el
material lignocelulósico puede ser cualquier material que contenga
lignocelulosa. La lignocelulosa generalmente se encuentra, por
ejemplo, en los tallos, las hojas, los hollejos, las cáscaras y las
mazorcas de plantas u hojas, ramas, y madera de árboles. El material
lignocelulósico también puede ser, a título enunciativo y no
limitativo, material herbáceo, residuos agrícolas, residuos de
silvicultura, desperdicios sólidos municipales, desechos de papel y
pulpa y residuos de fábricas de papel.
En una forma de realización preferida, el
material lignocelulósico es forraje de maíz. En otra forma de
realización preferida, el material lignocelulósico es fibra de maíz.
En otra forma de realización preferida, el material lignocelulósico
es la paja de arroz. En otra forma de realización preferida, el
material lignocelulósico es desperdicios del tratamiento del papel y
de la pulpa. En otra forma de realización preferida, el material
lignocelulósico son plantas herbáceas o leñosas.
El material lignocelulósico puede ser utilizado
tal como está o se puede someter a un pretratamiento usando métodos
convencionales conocidos en la técnica. Por ejemplo, las técnicas de
pretratamiento físicas pueden incluir varios tipos de molienda,
irradiación, vaporización/explosión de vapor e hidrotermólisis; las
técnicas de pretratamiento químicas pueden incluir ácido diluido,
solvente orgánico alcalino, amoniaco, dióxido de azufre, dióxido de
carbono e hidrotermólisis con pH controlado; y las técnicas de
pretratamiento biológicas pueden incluir la aplicación de
microorganismos de solubilización de lignina (véase, por ejemplo,
Hsu, T.-A., 1996, Pretreatment of biomass, en Handbook on
Bioethanol: Production and Utilization, Wyman, C. E., ed., Taylor
& Francis, Washington, DC, 179-212; Ghosh, P.,
Singh, A., 1993, Physicochemical and biological treatments for
enzymatic/microbial conversion of lignocellulosic biomass, Adv.
Appl. Microbiol., 39: 295-333; McMillan, J. D.,
1994, Pretreating lignocellulosic biomass: a review, in Enzymatic
Conversion of Biomass for Fuels Production, Himmel, M. E., Baker, J.
O., and Overend, R. P., eds., ACS Symposium Series 566, American
Chemical Society, Washington, DC, chapter 15; Gong, C. S., Cao, N.
J., Du, J., y Tsao, G. T., 1999, Ethanol production from renewable
resources, in Advances in Biochemical Engineering/Biotechnology,
Scheper, T., ed., Springer-Verlag Berlin Heidelberg,
Alemania, 65: 207-241; Olsson, L., y
Hahn-Hagerdal, B., 1996, Fermentation of
lignocellulosic hydrolysates for ethanol production, Enz. Microb.
Tech, 18: 312-331; y Vallander, L., y Eriksson,
K.-E. L., 1990, Production of ethanol from lignocellulosic
materials: State of the art, Adv. Biochem. Engl. Biotechnol., 42:
63-95).
\vskip1.000000\baselineskip
En los métodos de la presente invención, el
tensioactivo es un alcohol etoxilado secundario. El tensioactivo se
añade exógenamente.
Un tensioactivo de alcohol etoxilado secundario
tiene la fórmula
C_{11-15}H_{23-31}O(CH_{2}CH_{2}O)_{x}
H, donde x es el grado de etoxilación. El grado de etoxilación puede
ser de 3 como mínimo a 50 como mínimo. En una forma de realización
preferida, el alcohol etoxilado secundario es
alquiloxipolietilenoxietanol 50 (x=5). En otra forma de realización
preferida, el alcohol etoxilado secundario es
alquiloxipolietilenoxietanol 90 (x=9). En otra forma de realización
preferida, el alcohol etoxilado secundario es
alquiloxipolietilenoxietanol 120 (x=12). En otra forma de
realización preferida, el alcohol etoxilado secundario es
alquiloxipolietilenoxietanol 200 (x=20). Ejemplos de tensioactivos
de alcohol etoxilado secundarios disponibles comercialmente
incluyen, de manera enunciativa y no limitativa, SOFTANOL^{TM} 50,
SOFTANOL^{TM} 90, SOFTANOL^{TM} 120, y SOFTANOL^{TM} 200,
obtenible de INEOS Oxide, Zwijndrecht, Bélgica.
En la tabla 1 se muestra un resumen de los
tensioactivos mencionados más arriba.
En los métodos de la presente invención, la
enzima celulolítica puede ser cualquier enzima implicada en la
degradación de lignocelulosa a glucosa, xilosa, manosa, galactosa y
arabinosa. La enzima celulolítica puede ser una preparación
enzimática de varios componentes, por ejemplo, celulasa, una
preparación enzimática monocomponente, por ejemplo, endoglucanasa,
celobiohidrolasa, glucohidrolasa, beta-glucosidasa,
o una combinación de enzimas monocomponentes y de varios
componentes. Las enzimas celulolíticas pueden tener actividad, es
decir, hidrolizar celulosa, en el rango de pH ácido, neutro o
alcalino.
La enzima celulolítica puede ser de origen
bacteriano o fúngico, que puede ser obtenible o aislada y
purificada de microorganismos que se conocen por ser capaces de
producir enzimas celulolíticas de, por ejemplo, especies
Humicola, Coprinus, Thielavia, Fusarium, Myceliophthora,
Acremonium, Cephalosporium, Scytalidium, Penicillium o
Aspergillus (véase, por ejemplo, EP 458162), especialmente
aquellos producidos por una cepa seleccionada de la especie
Humicola insolens (reclasificado como Scytalidium
thermophilum, véase, por ejemplo, patente estadounidense n.º
4.435.307), Coprinus cinereus, Fusarium oxysporum, Myceliophthora
thermophila, Meripilus giganteus, Thielavia terrestris, Acremonium
sp., Acremonium persicinum, Acremonium acremonium, Acremonium
brachypenium, Acremonium dichromosporum, Acremonium obclavatum,
Acremonium pinkertoniae, Acremonium roseogriseum, Acremonium
incoloratum y Acremonium furatum; preferiblemente de
especies de las especies Humicola insolens DSM 1800,
Fusarium oxysporum DSM 2672, Myceliophthora
thermophila CBS 117.65, Cephalosporium sp.
RYM-202, Acremonium sp. CBS 478.94,
Acremonium sp. CBS 265.95, Acremonium persicinum CBS
169.65, Acremonium acremonium AHU 9519, Cephalosporium
sp. CBS 535.71, Acremonium brachypenium CBS 866.73,
Acremonium dichromosporum CBS 683.73, Acremonium
obclavatum CBS 311.74, Acremonium pinkertoniae CBS
157.70, Acremonium roseogriseum CBS 134.56, Acremonium
incoloratum CBS 146.62 y Acremonium furatum CBS 299.70H.
Las enzimas celulolíticas también pueden ser obtenidas a partir de
Trichoderma (particularmente Trichoderma viride,
Trichoderma reesei y Trichoderma koningii),
Bacillus alcalofílico (véase, por ejemplo, la patente
estadounidense n.º 3.844.890 y EP 458162) y Streptomyces
(véase, por ejemplo, EP 458162).
Las enzimas celulolíticas usadas en los métodos
de la presente invención se pueden producir por fermentación de las
cepas microbianas mencionadas anteriormente en un medio nutritivo
con fuentes de nitrógeno y carbono y sales inorgánicas adecuadas,
usando procedimientos conocidos en la técnica (véase, por ejemplo,
Bennett, J.W. y LaSure, L. (eds.), More Gene Manipulations in Fungi,
Academic Press, CA, 1991). Los medios adecuados se encuentran
disponibles de proveedores comerciales o se pueden preparar según
composiciones publicadas (p. ej., en catálogos de American Type
Culture Collection). Los rangos de temperatura y otras condiciones
adecuadas para el crecimiento y la producción de celulasa se conocen
en la técnica (véase, por ejemplo, Bailey, J.E., y Ollis, D.F.,
Biochemical Engineering Fundamentals, McGraw-Hill
Book Company, NY, 1986).
La fermentación puede ser cualquier método de
cultivo de una célula que dé como resultado la expresión o el
aislamiento de una enzima celulolítica. Puede entenderse, entonces,
que la fermentación comprende el cultivo en matraz de agitación, la
fermentación a escala grande o pequeña (incluidas, fermentaciones
continuas, de lote, en flujo discontinuo o en estado sólido) en
laboratorio o fermentos industriales realizados en un medio adecuado
y bajo condiciones que permitan que la celulasa sea expresada o
aislada.
Las enzimas celulolíticas resultantes producidas
por los métodos anteriormente descritos pueden ser recuperadas del
medio de fermentación por procedimientos convencionales incluidos, a
título enunciativo y no limitativo, centrifugado, filtración, secado
por pulverización, evaporación o precipitación. La enzima recuperada
luego puede ser purificada adicionalmente por una variedad de
procedimientos cromatográficos, por ejemplo, cromatografía de
intercambio iónico, cromatografía de filtración en gel,
cromatografía de afinidad, o similar.
La celulasa hidroliza carboximetilcelulosa
(CMC), disminuyendo así la viscosidad de la mezcla de incubación. La
reducción resultante en la viscosidad se puede determinar por un
viscosímetro de vibración (p. ej., MIVI 3000 de Sofraser, Francia).
La determinación de la actividad de la celulasa, medida en función
de la unidad de viscosidad de celulasa (CEVU), cuantifica la
cantidad de actividad catalítica presente en una muestra midiendo la
capacidad de la muestra de reducir la viscosidad de una solución de
carboximetilcelulosa (CMC). El ensayo se realiza a 40ºC en tampón
fosfato 0,1 M pH 9,0 durante 30 minutos con CMC como sustrato (33,3
g/L carboximetilcelulosa Hercules 7 LFD) y una concentración
enzimática de aproximadamente 3,3-4,2 CEVU/ml. La
actividad CEVU se calcula en relación a un estándar de enzima
declarado, tal como Celluzyme^{TM} Standard
17-1194 (obtenido de Novozymes A/S, Bagsværd,
Dinamarca).
Ejemplos de celulasas adecuados para el uso en
la presente invención incluyen, por ejemplo, CELLUCLAST^{TM}
(disponible de Novozymes A/S) y NOVOZYM^{TM} 188 (disponible de
Novozymes A/S). Otras preparaciones disponibles comercialmente que
comprenden celulasa que pueden ser usadas incluyen CELLUZYME^{TM},
CEREFLO^{TM} y ULTRAFLO^{TM} (Novozymes A/S), LAMINEX^{TM} y
SPEZYME^{TM} CP (Genencor Int.) y ROHAMENT^{TM} 7069 W (Röhm
GmbH). Las enzimas de celulasa se agregan en cantidades eficaces
desde aproximadamente 0,001% a aproximadamente 5,0% en peso de
sólidos, más preferiblemente de aproximadamente 0,025% a
aproximadamente 4,0% en peso de sólidos, y de forma más preferible,
de aproximadamente 0,005% a aproximadamente 2,0% en peso de
sólidos.
Como se ha mencionado anteriormente, las enzimas
celulolíticas usadas en los métodos de la presente invención pueden
ser preparaciones monocomponentes, es decir, un componente
esencialmente libre de otros componentes de celulasa. El único
componente puede ser un componente recombinante, es decir, producido
por clonación de una secuencia de ADN que codifica el único
componente y célula posterior transformada con la secuencia de ADN y
expresada en un huésped (véase, por ejemplo, WO 91/17243 y WO
91/17244). Otros ejemplos de enzimas celulolíticas monocomponentes
incluyen, de modo enunciativo y no limitativo, los descritos en JP
07203960-A y WO-9206209. El huésped
es preferiblemente un huésped heterólogo (la enzima es externa al
huésped), pero el huésped, bajo ciertas condiciones, también puede
ser un huésped homólogo (la enzima es nativa al huésped). Las
enzimas celulolíticas monocomponentes también pueden ser preparadas
purificando tal enzima de un medio de fermentación.
Ejemplos de enzimas celulolíticas
monocomponentes útiles en la práctica de los métodos de la presente
invención incluyen, de modo enunciativo y no limitativo,
endoglucanasa, celobiohidrolasa, glucohidrolasa y
beta-glucosidasa.
El término "endoglucanasa" es definido aquí
como una
endo-1,4-(1,3,1,4)-beta-D-glucan
4-glucanohidrolasa (E.C. n.º 3.2.1.4), que cataliza
la endohidrólisis de uniones
1,4-beta-D-glicosídicas
en celulosa, derivados de celulosa (tal como carboximetilcelulosa e
hidroxietil celulosa), liquenina, enlaces beta-1,4
en beta-1,3 glucanos mezclados tales como
beta-D-glucanos de cereal o
xiloglucanos, y otro material vegetal que contenga componentes
celulósicos. Para objetivos de la presente invención, la actividad
de la endoglucanasa es determinada usando la hidrólisis de
carboximetilcelulosa (CMC) según el procedimiento de Ghose, 1987,
Pure and Appl. Chem. 59. 257-268.
Las
exo-1,4-beta-D-glucanasas
incluyen tanto celobiohidrolasas como glucohidrolasas.
El término "celobiohidrolasa" es definido
aquí como una
1,4-beta-D-glucan
celobiohidrolasa (E.C. 3.2.1.91), que cataliza la hidrólisis de
enlaces
1,4-beta-D-glucosídicos
en celulosa, celooligosacáridos, o cualquier polímero que contenga
glucosa con enlace beta-1, que libere celobiosa a
partir de los extremos reductores o no reductores de la cadena. Para
objetivos de la presente invención, la actividad de la
celobiohidrolasa se determina según los procedimientos descritos por
Lever et al., 1972, Anal. Biochem. 47:
273-279 y por van Tilbeurgh et al., 1982,
FEBS Letters, 149: 152-156; van Tilbeurgh y
Claeyssens, 1985, FEBS Letters, 187: 283-288. En la
presente invención, se empleó el método de Lever et al. para
analizar la hidrólisis de la celulosa en forraje de maíz, mientras
que el método de van Tilbeurgh et al. se utilizó para
determinar la actividad de celobiohidrolasa en un derivado de
disacárido fluorescente.
\global\parskip0.870000\baselineskip
El término "glucohidrolasa" es definido
aquí como una
1,4-beta-D-glucano
glucohidrolasa (E.C. 3.2.1.74), que cataliza la hidrólisis de
uniones 1,4 (enlaces O-glicosílicos) en
1,4-beta-D-glucanos
para eliminar unidades de glucosa sucesivas. Para objetivos de la
presente invención, la actividad de la exoglucanasa se determina
según el procedimiento descrito por Himmel et al., 1986, J.
Biol. Chem. 261: 12948-12955.
El término
"beta-glucosidasa" es definido aquí como una
beta-D-glucósido glucohidrolasa
(E.C. 3.2.1.21), que cataliza la hidrólisis de residuos de
beta-D-glucosa no reductores
terminales con la liberación de
beta-D-glucosa. Para objetivos de la
presente invención, la actividad de la
beta-glucosidasa se determina según el procedimiento
básico descrito por Venturi et al., 2002, J. Basic Microbiol.
42: 55-66, excepto que se hayan empleado condiciones
diferentes según se describe en este caso. Una unidad de actividad
de beta-glucosidasa es definida como 1,0 \mumol de
p-nitrofenol producido por minuto a 50ºC, pH 5 de 4
mM
p-nitrofenil-beta-D-glucopiranósido
como sustrato en 100 mM de citrato sódico, 0,01% de
Tween-20.
\vskip1.000000\baselineskip
Los métodos de la presente invención se pueden
utilizar para procesar un material lignocelulósico para muchos
productos orgánicos útiles, productos químicos y combustibles.
Además del etanol, algunos productos químicos de productos básicos y
especializados que se pueden producir a partir de lignocelulosa
incluyen xilosa, acetona, acetato, glicina, lisina, ácidos orgánicos
(p. ej., ácido láctico), 1,3-propanodiol,
butanodiol, glicerol, etilenglicol, furfúrico,
polihidroxialcanoatos, ácido cis, cis-mucónico y
pienso (Lynd, L. R., Wyman, C. E., and Gemgross, T. U., 1999,
Biocommodity engineering, Biotechnol. Prog., 15:
777-793; Philippidis, G. P., 1996, Cellulose
bioconversion technology, en Handbook on Bioethanol: Production and
Utilization, Wyman, C. E., ed., Taylor & Francis, Washington,
DC, 179-212; y Ryu, D. D. Y., y Mandels, M., 1980,
Cellulases: biosynthesis and applications, Enz. Microb. Technol., 2:
91-102). Los beneficios de la coproducción potencial
se extienden más allá de la síntesis de productos orgánicos
múltiples o de carbohidrato fermentable. Los residuos ricos en
lignina restantes después del tratamiento biológico se pueden
convertir en productos químicos derivados de lignina, o ser usados
para la producción de energía.
Métodos convencionales usados para procesar el
material lignocelulósico conforme a los métodos de la presente
invención son bien entendidos por los expertos en la técnica. Los
métodos de la presente invención pueden ser implementados usando
cualquier aparato de tratamiento de biomasa convencional configurado
para funcionar conforme a la invención.
Tal aparato puede incluir un reactor discontinuo
agitado, un reactor de flujo continuo agitado con ultrafiltración,
un reactor continuo de columna de flujo pistón (Gusakov, A. V., y
Sinitsyn, A.P., 1985, Kinetics of the enzymatic hydrolysis of
cellulose: 1. A mathematical model for a batch reactor process, Enz.
Microb. Technol., 7: 346-352), un reactor de
fricción (Ryu, S. K., y Lee, J. M., 1983, Bioconversion of waste
cellulose by using an attrition bioreactor, Biotechnol. Bioeng., 25:
53-65), o un reactor con agitación intensiva
inducida por un campo electromagnético (Gusakov, A. V., Sinitsyn, A.
P., Davydkin, I. Y., Davydkin, V. Y., Protas, O. V., 1996,
Enhancement of enzymatic cellulose hydrolysis using a novel type of
bioreactor with intensive stirring induced by electromagnetic field,
Appl. Biochem. Biotechnol., 56: 141-153).
Los métodos convencionales incluyen, de modo
enunciativo y no limitativo, sacarificación, fermentación,
hidrólisis separada y fermentación (SHF), sacarificación y
fermentación simultáneas (SSF), sacarificación y cofermentación
simultáneas (SSCF), hidrólisis híbrida y fermentación (HHF) y
conversión directa microbiana (DMC).
SHF usa pasos de procesos separados para primero
hidrolizar enzimáticamente la celulosa en glucosa y luego fermentar
la glucosa en etanol. En SSF, la hidrólisis enzimática de la
celulosa y la fermentación de la glucosa a etanol se combina en un
paso (Philippidis, G. P., 1996, Cellulose bioconversion technology,
in Handbook on Bioethanol: Production and Utilization, Wyman, C. E.,
ed., Taylor & Francis, Washington, DC, 179-212).
SSCF incluye la cofermentación de azúcares múltiples (Sheehan, J.,
and Himmel, M., 1999, Enzymes, energy and the environment: A
strategic perspective on the U.S. Department of Energy's research
and development activities for bioethanol, Biotechnol. Prog., 15:
817-827). HHF incluye dos pasos separados realizados
en el mismo reactor pero a temperaturas diferentes, es decir,
sacarificación enzimática de alta temperatura seguida de SSF a una
temperatura inferior a la que la cepa de la fermentación puede
tolerar. DMC combina los tres procesos (producción de celulasa,
hidrólisis de celulosa y fermentación) en un paso (Lynd, L. R.,
Weimer, P. J., van Zyl, W. H., y Pretorius, I. S., 2002, Microbial
cellulose utilization: Fundamentals and biotechnology, Microbiol.
Mol. Biol. Reviews, 66: 506-577).
"Fermentación" o "proceso de
fermentación" se refiere a cualquier proceso de fermentación o
cualquier proceso que comprenda un paso de fermentación. Un proceso
de fermentación incluye, sin limitación, procesos de fermentación
usados para producir productos de fermentación incluidos alcoholes
(p. ej., arabinitol, butanol, etanol, glicerol, metanol,
1,3-propanodiol, sorbitol y xilitol); ácidos
orgánicos (p. ej., ácido acético, ácido acetónico, ácido adípico,
ácido ascórbico, ácido cítrico, ácido
2,5-diqueto-D-glucónico,
ácido fórmico, ácido fumárico, ácido glucárico, ácido glucónico,
ácido glucurónico, ácido glutárico, ácido
3-hidroxipropiónico, ácido itacónico, ácido láctico,
ácido málico, ácido malónico, ácido oxálico, ácido propiónico, ácido
succínico y ácido xilónico); cetonas (p. ej., acetona); aminoácidos
(p. ej., ácido aspártico, ácido glutámico, glicina, lisina, serina y
treonina); gases (p. ej., metano, hidrógeno (H_{2}), dióxido de
carbono (CO_{2}), y monóxido de carbono (CO)). Los procesos de
fermentación también incluyen procesos de fermentación usados en la
industria alcohólica consumible (p. ej., cerveza y vino), industria
láctea (p. ej., productos lácteos fermentados), industria del cuero
e industria del tabaco.
\global\parskip1.000000\baselineskip
La presente invención también se refiere a
métodos para producir una sustancia orgánica, que comprende: (a)
sacarificar un material lignocelulósico con una cantidad eficaz de
una o más enzimas celulolíticas en presencia de un tensioactivo como
mínimo donde el tensioactivo es un alcohol etoxilado secundario,
donde la presencia del tensioactivo aumenta la degradación de
material lignocelulósico en comparación con la ausencia del
tensioactivo; (b) fermentar el material lignocelulósico sacarificado
de paso (a) con uno o más microorganismos fermentativos; y (c)
recuperar la sustancia orgánica de la fermentación.
La sustancia orgánica puede ser cualquier
sustancia derivada de la fermentación. En una forma de realización
preferida, la sustancia orgánica es un alcohol. Se entenderá que el
término "alcohol" comprende una sustancia orgánica que contiene
una o más fracciones de hidróxilo. En una forma de realización más
preferida, el alcohol es arabinitol. En otra forma de realización
más preferida, el alcohol es butanol. En otra forma de realización
más preferida, el alcohol es etanol. En otra forma de realización
más preferida, el alcohol es glicerol. En otra forma de realización
más preferida, el alcohol es metanol. En otra forma de realización
más preferida, el alcohol es 1,3-propanodiol. En
otra forma de realización más preferida, el alcohol es sorbitol. En
otra forma de realización más preferida, el alcohol es xilitol.
Véase, por ejemplo, Gong, C. S., Cao, N. J., Du, J., y Tsao, G. T.,
1999, Ethanol production from renewable resources, in Advances in
Biochemical Engineering/Biotechnology, Scheper, T., ed.,
Springer-Verlag Berlin Heidelberg, Germany, 65:
207-241; Silveira, M. M., and Jonas, R., 2002, The
biotechnological production of sorbitol, Appl. Microbiol.
Biotechnol. 59: 400-408; Nigam, P., y Singh, D.,
1995, Processes for fermentative production of xylitol - a sugar
substitute, Process Biochemistry, 30 (2): 117-124;
Ezeji, T. C., Qureshi, N. and Blaschek, H. P., 2003, Production of
acetone, butanol and ethanol by Clostridium beijerinckii BA101 and
in situ recovery by gas stripping, World Journal of
Microbiology and Biotechnology 19 (6): 595-603.
En otra forma de realización preferida, la
sustancia orgánica es un ácido orgánico. En otra forma de
realización más preferida, el ácido orgánico es ácido acético. En
otra forma de realización más preferida, el ácido orgánico es ácido
acetónico. En otra forma de realización más preferida, el ácido
orgánico es ácido adípico. En otra forma de realización más
preferida, el ácido orgánico es ácido ascórbico. En otra forma de
realización más preferida, el ácido orgánico es ácido cítrico. En
otra forma de realización más preferida, el ácido orgánico es ácido
2,5-diqueto-D-glucónico.
En otra forma de realización más preferida, el ácido orgánico es
ácido fórmico. En otra forma de realización más preferida, el ácido
orgánico es ácido fumárico. En otra forma de realización más
preferida, el ácido orgánico es ácido glucárico. En otra forma de
realización más preferida, el ácido orgánico es ácido glucónico. En
otra forma de realización más preferida, el ácido orgánico es ácido
glucurónico. En otra forma de realización más preferida, el ácido
orgánico es ácido glutárico. En otra forma de realización preferida,
el ácido orgánico es ácido 3-hidroxipropiónico. En
otra forma de realización más preferida, el ácido orgánico es ácido
itacónico. En otra forma de realización más preferida, el ácido
orgánico es ácido láctico. En otra forma de realización más
preferida, el ácido orgánico es ácido málico. En otra forma de
realización más preferida, el ácido orgánico es ácido malónico. En
otra forma de realización más preferida, el ácido orgánico es ácido
oxálico. En otra forma de realización más preferida, el ácido
orgánico es ácido propiónico. En otra forma de realización más
preferida, el ácido orgánico es ácido succínico. En otra forma de
realización más preferida, el ácido orgánico es ácido xilónico.
Véase, por ejemplo, Chen, R. y Lee, Y. Y., 1997,
Membrane-mediated extractive fermentation for lactic
acid production from cellulosic biomass, Appl. Biochem.
Biotechnol.,
63-65: 435-448.
63-65: 435-448.
En otra forma de realización preferida, la
sustancia orgánica es una cetona. Se entenderá que el término
"cetona" comprende una sustancia orgánica que contiene una o
más fracciones de cetona. En otra forma de realización más
preferida, la cetona es acetona. Véase, por ejemplo, Qureshi y
Blaschek, 2003, supra.
En otra forma de realización preferida, la
sustancia orgánica es un aminoácido. En otra forma de realización
más preferida, el ácido orgánico es ácido aspártico. En otra forma
de realización más preferida, el aminoácido es ácido glutámico. En
otra forma de realización más preferida, el aminoácido es glicina.
En otra forma de realización más preferida, el aminoácido es lisina.
En otra forma de realización más preferida, el aminoácido es serina.
En otra forma de realización más preferida, el aminoácido es
treonina. Véase, por ejemplo, Richard, A. y Margaritis, A., 2004,
Empirical modeling of batch fermentation kinetics for
poly(glutamic acid) production and other microbial
biopolymers, Biotechnology and Bioengineering, 87 (4):
501-515.
En otra forma de realización más preferida, la
sustancia orgánica es un gas. En otra forma de realización más
preferida, el gas es metano. En otra forma de realización más
preferida, el gas es H_{2}. En otra forma de realización más
preferida, el gas es CO_{2}. En otra forma de realización más
preferida, el gas es CO. Véase, por ejemplo, Kataoka, N., A. Miya y
K. Kiriyama, 1997, Studies on hydrogen production by continuous
culture system of hydrogen-producing anaerobic
bacteria, Water Science and Technology
36(6-7): 41-47; y Gunaseelan
V.N. en Biomass and Bioenergy, Vol. 13 (1-2), pp.
83-114, 1997, Anaerobic digestion of biomass for
methane production: A review.
La producción de una sustancia orgánica de
material lignocelulósico típicamente requiere cuatro pasos
importantes. Estos cuatro pasos son pretratamiento, hidrólisis
enzimática, fermentación y recuperación. A continuación se
ejemplifica un proceso para producir etanol, pero se entenderá que
pueden utilizarse procesos similares para producir otras sustancias
orgánicas, por ejemplo, las sustancias anteriormente descritas.
\newpage
Pretratamiento. En el paso de
pretratamiento o prehidrólisis, el material lignocelulósico se
calienta para descomponer la estructura de lignina y carbohidrato,
solubilizar la mayor parte de la hemicelulosa y hacer la fracción de
celulosa accesible a enzimas celulolíticas. El calentamiento se
realiza bien directamente con vapor o en compuesto acuoso donde
también puede añadirse un catalizador al material para acelerar las
reacciones. Los catalizadores incluyen ácidos fuertes, tales como
ácido sulfúrico y SO_{2}, o alcali, tal como hidróxido sódico. El
propósito de la fase de pretratamiento es facilitar la penetración
de las enzimas y los microorganismos. La biomasa lignocelulósica
también puede estar sujeta a un pretratamiento de explosión por
vapor hidrotérmico (véase la Solicitud de patente estadounidense n.º
20020164730).
Sacarificación. En el paso de la
hidrólisis enzimática, también conocida como sacarificación, las
enzimas según se describen en el presente documento se agregan al
material pretratado para convertir la fracción de celulosa en
glucosa y/u otros azúcares. La sacarificación generalmente es
realizada en reactores de tanque agitado o fermentadores bajo
condiciones controladas de mezcla, pH, temperatura. Un paso de
sacarificación puede durar hasta 120 horas. La sacarificación se
puede realizar a temperaturas de aproximadamente 30ºC a
aproximadamente 65ºC, en particular alrededor de 50ºC, y a un pH en
la gama entre aproximadamente 4 y aproximadamente 5, especialmente
alrededor de pH 4,5. Para producir glucosa que pueda metabolizarse
por levadura, la hidrólisis típicamente es realizada en presencia de
una beta-glucosidasa.
Fermentación. En el paso de fermentación,
los azúcares, liberados del material lignocelulósico como resultado
de los pasos de pretratamiento e hidrólisis enzimática, se fermentan
a etanol por un organismo de fermentación, tal como levadura. La
fermentación también puede efectuarse simultáneamente con la
hidrólisis enzimática en el mismo vaso, nuevamente bajo condiciones
controladas de mezcla, pH y temperatura. Cuando la sacarificación y
la fermentación se realizan simultáneamente en el mismo vaso, el
proceso generalmente es denominado sacarificación y fermentación
simultáneas o SSF.
Cualquier sustrato lignocelulósico o materia
prima adecuada se puede utilizar en un proceso de fermentación de la
presente invención. El sustrato generalmente es seleccionado según
el producto de fermentación deseado, es decir, la sustancia orgánica
para ser obtenida de la fermentación, y el proceso empleado, como es
bien sabido en la técnica. Ejemplos de sustratos adecuados para el
uso en los métodos de la presente invención incluyen materiales con
contenido de lignocelulosa, tales como madera o residuos vegetales o
azúcares de bajo peso molecular DP_{1-3} obtenidos
de material lignocelulósico procesado que puede ser metabolizado por
el microorganismo fermentativo, y que se pueden suministrar por
adición directa al medio de fermentación.
Se entenderá que el término "medio de
fermentación" se refiere a un medio antes de que se agregue/n
el/los microorganismo/s de fermentación, tal como un medio que
resulte a partir de un proceso de sacarificación, al igual que un
medio usado en un proceso simultáneo de sacarificación y
fermentación (SSF).
El "microorganismo fermentativo" se refiere
a cualquier microorganismo adecuado para el uso en un proceso de
fermentación deseado. Los microorganismos fermentativos adecuados
según la invención son capaces de fermentar, es decir, convertir
azúcares, tales como glucosa, xilosa, arabinosa, manosa, galactosa u
oligosacáridos directa o indirectamente en el producto de
fermentación deseado. Ejemplos de microorganismos fermentativos
incluyen organismos fúngicos, tales como levadura. La levadura
preferida incluye cepas de Sacchromyces spp., y en
particular, Sacchromyces cerevisiae. La levadura disponible
comercialmente incluye, por ejemplo, Red Star®/Lesaffre Ethanol Red
(disponible de Red Star/Lesaffre, USA) FALI (disponible de
Fleischmann's Yeast, una división de Burns Philp Food Inc., EE.
UU.), SUPERSTART (disponible de Alltech), GERT STRAND (disponible de
Gert Strand AB, Suecia) y FERMIOL (disponible de DSM
Specialties).
En una forma de realización preferida, la
levadura es Saccharomyces spp. En una forma de realización
más preferida, la levadura es Saccharomyces cerevisiae. En
otra forma de realización más preferida, la levadura es
Saccharomyces distaticus. En otra forma de realización más
preferida, la levadura es Saccharomyces uvarum. En otra forma
de realización preferida, la levadura es una Kluyveromyces.
En otra forma de realización más preferida, la levadura es
Kluyveromices marxianus. En otra forma de realización más
preferida, la levadura es Kluyveromyces fragilis. En otra
forma de realización preferida, la levadura es una Candida.
En otra forma de realización más preferida, la levadura es
Candida pseudotropicalis. En otra forma de realización más
preferida, la levadura es Candida brassicae. En otra forma de
realización preferida, la levadura es una Clavispora. En otra
forma de realización más preferida, la levadura es Clavispora
lusitaniae. En otra forma de realización más preferida, la
levadura es Clavispora opuntiae. En otra forma de realización
preferida, la levadura es un Pachysolen. En otra forma de
realización más preferida, la levadura es Pachysolen
tannophilus. En otra forma de realización preferida, la levadura
es un Bretannomyces. En otra forma de realización más
preferida, la levadura es Bretannomyces clausenii
(Philippidis, G. P., 1996, Cellulose bioconversion technology, en
Handbook on Bioethanol: Production and Utilization, Wyman, C. E.,
ed., Taylor & Francis, Washington, DC,
179-212).
Las bacterias que pueden fermentar eficazmente
la glucosa a etanol incluyen, por ejemplo, Zymomonas mobilis
y Clostridium thermocellum (Philippidis, 1996,
supra).
Es bien sabido en la técnica que los distintos
organismos anteriormente descritos también pueden ser usados para
producir otras sustancias orgánicas, como se describe en el presente
documento.
La clonación de genes heterólogos en
Saccharomyces cerevisiae (Chen, Z., Ho, N. W. Y., 1993,
Cloning and improving the expression of Pichia stipitis xylose
reductase gene in Saccharomyces cerevisiae, Appl. Biochem.
Biotechnol. 39-40: 135-147; Ho, N.
W. Y., Chen, Z, Brainard, A. P., 1998, Genetically engineered
Saccharomyces yeast capable of effectively cofermenting glucose and
xylose, Appl. Environ. Microbiol., 64: 1852-1859), o
en bacterias tales como Escherichia coli (Beall, D. S., Ohta,
K., Ingram, L. O., 1991, Parametric studies of ethanol production
from xylose and other sugars by recombinant Escherichia coli,
Biotech. Bioeng. 38: 296-303), Klebsiella
oxytoca (Ingram, L. O., Gomes, P. F., Lai, X., Moniruzzaman, M.,
Wood, B. E., Yomano, L. P., York, S. W., 1998, Metabolic engineering
of bacteria for ethanol production, Biotechnol. Bioeng. 58:
204-214), y Zymomonas mobilis (Zhang, M.,
Eddy, C., Deanda, K., Finkelstein, M., y Picataggio, S., 1995,
Metabolic engineering of a pentose metabolism pathway in
ethanologenic Zymomonas mobilis, Science 267:
240-243; Deanda, K., Zhang, M., Eddy, C. y
Picataggio, S., 1996, Development of an
arabinose-fermenting Zymomonas mobilis strain by
metabolic pathway engineering, Appl. Environ. Microbiol. 62:
4465-4470) ha conducido a la construcción de
organismos capaces de convertir hexosas y pentosas en etanol
(cofermentación).
La levadura u otro microorganismo típicamente se
añade a la lignocelulosa degradada o hidrolizada y la fermentación
está en curso durante aproximadamente 24 a aproximadamente 96 horas,
tal como aproximadamente 35 a aproximadamente 60 horas. La
temperatura típicamente está entre aproximadamente 26ºC a
aproximadamente 40ºC, en particular a aproximadamente 32ºC, y a pH 3
aproximadamente a pH 6 aproximadamente, en particular pH
4-5 aproximadamente.
En formas de realización preferidas, la levadura
u otro microorganismo se aplica a la lignocelulosa degradada o
hidrolizada y la fermentación está en curso durante aproximadamente
24 a aproximadamente 96 horas, tal como típicamente
35-60 horas. En formas de realización preferidas, la
temperatura generalmente está entre aproximadamente 26 a
aproximadamente 40ºC, en particular aproximadamente 32ºC, y el pH
generalmente es pH 3 aproximadamente a pH 6 aproximadamente,
preferiblemente pH 4-5 aproximadamente. La levadura
u otro microorganismo es preferiblemente aplicado en cantidades de
aproximadamente 10^{5} a 10^{12}, preferiblemente de
aproximadamente 10^{7} a 10^{10}, especialmente aproximadamente
cuenta viable 5\times10^{7} por ml de caldo de fermentación.
Durante una fase de producción de etanol el recuento de células de
levadura debería preferiblemente estar en la gama de aproximadamente
10^{7} a 10^{10}, especialmente alrededor de aproximadamente 2 x
10^{8}. Una orientación adicional respecto del uso de levadura
para fermentación puede encontrarse en, por ejemplo, "The Alcohol
Textbook" (Editors K. Jacques, T.P. Lyons and D. R. Kelsall,
Nottingham University Press, United Kingdom 1999).
El proceso más usado en la técnica es el proceso
de sacarificación y fermentación simultáneas (SSF) donde no hay
ninguna fase de retención para la sacarificación, lo cual significa
que la levadura y la enzima son agregados conjuntamente.
Para la producción de etanol, después de la
fermentación la trituración se destila para extraer el etanol. El
etanol obtenido según el proceso de la invención puede utilizarse
como, por ejemplo, etanol combustible; etanol potable, es decir,
licores neutros potables o etanol industrial.
Un estimulador de la fermentación puede
utilizarse en combinación con cualquiera de los procesos enzimáticos
descritos en el presente para mejorar aun más el proceso de
fermentación, y en particular, el rendimiento del microorganismo
fermentativo, tal como, mejoramiento del índice y la producción de
etanol. Un "estimulador de la fermentación" se refiere a
estimuladores para el crecimiento de los microorganismos
fermentativos, en particular, la levadura. Estimuladores de
fermentación preferidos para el crecimiento incluyen vitaminas y
minerales. Ejemplos de vitaminas incluyen multivitaminas, biotina,
pantotenato, ácido nicotínico, meso-inositol,
tiamina, piridoxina, ácido para-aminobenzoico, ácido
fólico, riboflavina y vitaminas A, B, C, D y E. Véase, por ejemplo,
Alfenore et al., Improving ethanol production and viability
of Saccharomyces cerevisiae by a vitamin feeding strategy
during fed-batch process'',
Springer-Verlag (2002). Ejemplos de minerales
incluyen minerales y sales minerales que pueden suministrar
nutrientes incluidos P, K, Mg, S, Ca, Fe, Zn, Mn y Cu.
Recuperación. El alcohol se separa del
material lignocelulósico fermentado y es purificado por métodos de
destilación convencionales. Puede obtenerse etanol con una pureza de
hasta aproximadamente 96 vol. % etanol, que puede ser usado como,
por ejemplo, etanol combustible, etanol potable, es decir, licores
neutros potables o etanol industrial.
Para otras sustancias orgánicas, cualquier
método conocido en la técnica puede ser usado incluidos, de modo
enunciativo y no limitativo, cromatografía (p. ej., de intercambio
iónico, exclusión por afinidad, hidrofóbica, por cromatoenfoque y
por tamaño), procedimientos electroforéticos (p. ej.,
isoelectroenfoque preparatorio), solubilidad diferencial (p. ej.,
precipitación de sulfato amónico), SDS-PAGE,
destilación o extracción.
\vskip1.000000\baselineskip
En los métodos de la presente invención, la/s
enzima/s celulolítica/s se puede/n suplementar por una o más
actividades enzimáticas adicionales para mejorar la degradación del
material lignocelulósico. Las enzimas adicionales preferidas son
hemicelulasas, esterasas (p. ej., lipasas, fosfolipasas y/o
cutinasas), proteasas, lacasas, peroxidasas o mezclas derivadas.
En los métodos de la presente invención, la/s
enzima/s adicional/es puede/n ser agregadas antes de o durante la
fermentación, incluso durante o después de la propagación del
microorganismo o los microorganismos de fermentación.
Las enzimas referenciadas en el presente se
pueden derivar u obtener de cualquier origen adecuado, incluido el
origen bacteriano, fúngico, de levadura o mamífero. El término
"obtenido" significa en el presente que la enzima puede haber
sido aislada de un organismo que produce naturalmente la enzima como
una enzima nativa. El término "obtenido" también significa en
el presente que la enzima puede haber sido producida de
recombinación en un organismo huésped, donde la enzima producida de
la recombinación es bien extranjera o nativa al organismo huésped o
tiene una secuencia de aminoácidos modificada, por ejemplo, con uno
o más aminoácidos que son delecionados, sustituidos y/o insertados,
es decir, una enzima producida de recombinación que es un mutante
y/o un fragmento de una secuencia de aminoácidos nativa o una enzima
producida por procesos de redistribución de ácido nucleico conocidos
en la técnica. Incluido en el significado de una enzima nativa están
las variantes naturales y en el significado de una enzima extranjera
están las variantes obtenidas de la recombinación, tales como por
mutagénesis dirigida o redistribución.
Las enzimas también pueden ser purificadas. El
término "purificadas" según se utiliza en este caso comprende
enzimas libres de otros componentes del organismo del cual se
derivan. El término "purificadas" también incluye enzimas
libres del componente del organismo nativo del cual son obtenidas.
Las enzimas pueden ser purificadas, sólo con cantidades menores de
otras proteínas que estén presentes. La expresión "otras
proteínas" se relaciona en particular con otras enzimas. El
término "purificadas" según se utiliza en este caso también se
refiere a la eliminación de otos componentes, particularmente otras
proteínas y, más particularmente, otras enzimas presentes en la
célula de origen de la enzima de la invención. La enzima puede ser
"substancialmente pura", es decir, libre de otros componentes
del organismo en el que es producida, es decir, por ejemplo, un
organismo huésped para enzimas producidas por recombinación. En una
forma de realización preferida, las enzimas son al menos 75% (p/p),
preferiblemente al menos 80%, más preferiblemente al menos 85%, más
preferiblemente al menos 90%, más preferiblemente al menos 95%, más
preferiblemente al menos 96%, más preferiblemente al menos 97%,
incluso más preferiblemente al menos 98%, o de la forma más
preferible al menos 99% pura. En otra forma de realización
preferida, la enzima es 100% pura.
Las enzimas usadas en la presente invención
pueden estar en cualquier forma adecuada para el uso en los procesos
descritos en el presente, tales como, por ejemplo, en forma de un
polvo seco o granulado, un granulado no espolvoreado, un líquido, un
líquido estabilizado o una enzima protegida. Los granulados pueden
ser producidos, por ejemplo, como se describe en las patentes
estadounidenses nos. 4.106.991 y 4.661.452, y pueden opcionalmente
ser revestidas por procesos conocidos en la técnica. Las
preparaciones enzimáticas líquidas pueden, por ejemplo, ser
estabilizadas añadiendo estabilizadores tales como un azúcar, un
alcohol de azúcar u otro poliol, y/o ácido láctico u otro ácido
orgánico según procesos establecidos. Las enzimas protegidas se
pueden preparar según el proceso descrito en EP 238.216.
\vskip1.000000\baselineskip
La hidrólisis enzimática de hemicelulosas puede
realizarse por una amplia variedad de hongos y bacterias. De igual
modo que la degradación de celulosa, la hidrólisis de hemicelulosa
requiere acción coordinada de muchas enzimas. Las hemicelulasas se
pueden colocar en tres categorías generales: las enzimas endo
activas que atacan los enlaces internos en la cadena polisacárida,
las enzimas exo activas que actúan de manera consecutiva desde el
extremo reductor o no reductor de la cadena polisacárida, y las
enzimas accesorias, acetilesterasas y esterasas que hidrolizan
enlaces de glucósido de lignina, tales como esterasa de ácido
cumárico y esterasa de ácido ferúlico (Wong, K.K.Y., Tan, L. U. L.,
y Saddler, J. N., 1988, Multiplicity of
\beta-1,4-xylanase in
microorganisms: Functions and applications, Microbiol. Rev. 52:
305-317; Tenkanen, M. y Poutanen, K., 1992,
Significance of esterases in the degradation of xylans, in Xylans
and Xylanases, Visser, J., Beldman, G., Kuster-van
Someren, M. A. y Voragen, A. G. J., eds., Elsevier, New York, NY,
203-212; Coughlan, M. P. y Hazlewood, G. P., 1993,
Hemicellulose and hemicellulases, Portland, Londres, Reino Unido;
Brigham, J. S., Adney, W. S. y Himmel, M. E., 1996, Hemicellulases:
Diversity and applications, en Handbook on Bioethanol: Production
and Utilization, Wyman, C. E., ed., Taylor & Francis,
Washington, DC, 119-141).
Las hemicelulasas incluyen xilanasas,
arabinofuranosidasas, acetil xilano esterasa, glucuronidasas,
endo-galactanasa, mananasas, endo o exo arabinasas,
exo-galactansas y sus mezclas derivadas. Ejemplos de
hemicelulasas endo-activas y enzimas auxiliares
incluyen endoarabinanasa, endoarabinogalactanasa, endoglucanasa,
endomananasa, endoxilanasa y feraxan endoxilanasa. Ejemplos de
hemicelulasas exo activas y enzimas auxiliares incluyen
\alpha-L-arabinosidasa,
\beta-L-arabinosidasa,
\alpha-1,2-L-fucosidasa,
\alpha-D-galactosidasa,
\beta-D-galactosidasa,
\beta-D-glucosidasa,
\beta-D-glucuronidasa,
\beta-D-manosidasa,
\beta-D-xilosidasa,
exoglucosidasa, exocelobiohidrolasa, exomanobiohidrolasa,
exomananasa, exoxilanasa, xilano
\alpha-glucuronidasa y coniferina
\beta-glucosidasa. Ejemplos de esterasas incluyen
acetil esterasas (acetilgalactano esterasa, acetilmanano esterasa y
acetilxilano esterasa) y arilesterasas (esterasa de ácido cumárico y
esterasa de ácido ferúlico).
Preferiblemente, la hemicelulasa es una
hemicelulasa exo activa, y más preferiblemente, una hemicelulasa exo
activa que tiene la capacidad de hidrolizar hemicelulosa bajo
condiciones acídicas por debajo de pH 7. Un ejemplo de una
hemicelulasa adecuada para el uso en la presente invención incluye
VISCOZYME^{TM} (disponible de Novozymes A/S, Dinamarca). La
hemicelulasa se añade en una cantidad eficaz de aproximadamente
0,001% a aproximadamente 5,0% en peso de sólidos, más
preferiblemente de aproximadamente 0,025% a aproximadamente 4,0% en
peso de sólidos, y de la forma más preferible de aproximadamente
0,005% a aproximadamente 2,0% en peso de sólidos.
Una xilanasa (E.C. 3.2.1.8) se puede obtener de
cualquier fuente adecuada, incluidos organismos bacterianos y
fúngicos, tales como Aspergillus, Disporotrichum, Penicillium,
Neurospora, Fusarium, Trichoderma, Humicola, Thermomyces y
Bacillus. Preparaciones preferidas disponibles comercialmente
que comprenden xilanasa incluyen SHEARZYME®, BIOFEED WHEAT®, BIOFEED
Plus® L, CELLUCLAST®, ULTRAFLO®, VISCOZYME®, PENTOPAN MONO® BG, y
PULPZYME® HC (Novozymes A/S); y LAMINEX® y SPEZYME® CP (Genencor
Int.).
\vskip1.000000\baselineskip
Las esterasas que se pueden usar para
bioconversión de lignocelulosa incluyen acetil esterasas tales como
acetilgalactano esterasa, acetilmanano esterasa y acetilxilano
esterasa, y esterasas que hidrolizan enlaces glucosídicos de
lignina, tales como esterasa de ácido cumárico y esterasa de ácido
ferúlico.
Según se utiliza en este caso, una
"esterasa" conocida también como una hidroliasa de éster
carboxílico, se refiere a enzimas que actúan en enlaces estéricos, e
incluye enzimas clasificadas en EC 3.1.1 Hidrolasas del éster
carboxílico según Nomenclatura Enzimática (Enzyme Nomenclature 1992,
Academic Press, San Diego, California, con Suplemento 1 (1993),
Suplemento 2 (1994), Suplemento 3 (1995), Suplemento 4 (1997) y
Suplemento 5, en Eur. J. Biochem. 223: 1-5, 1994;
Eur. J. Biochem. 232: 1-6, 1995; Eur. J. Biochem.
237: 1-5, 1996; Eur. J. Biochem. 250:
1-6, 1997, y Eur. J. Biochem. 264:
610-650, 1999; respectivamente). Ejemplos no
limitativos de esterasas incluyen arilesterasa,
triacilglicerol-lipasa, acetilesterasa,
acetilcolinesterasa, colinesterasa, tropinesterasa, pectinesterasa,
esterol-esterasa, clorofilasa,
L-arabinonolactonasa, gluconolactonasa,
uronolactonasa, tanasa, de retinil-palmitato
esterasa, hidroxibutirato-dímero hidrolasa,
acilglicerol lipasa, 3-oxoadipato
enol-lactonasa, 1,4-lactonasa,
galactolipasa, 4-piridoxolactonasa, acilcarnitina
hidrolasa, aminoacil-ARNt hidrolasa,
D-arabinonolactonasa,
6-fosfogluconolactonasa, fosfolipasa A1,
6-acetilglucosa desacetilasa,
lipoproteína-lipasa, dihidrocoumarina lipasa,
limonin-D-anillo-lactonasa,
esteroide-lactonasa,
triacetato-lactonasa, actinomicina lactonasa,
orselinato-depsido hidrolasa,
cefalosporina-C deacetilasa, clorogenato hidrolasa,
alfa-aminoácido esterasa,
4-metiloxaloacetato esterasa,
carboximetilenobutenolidasa, desoxilimonato
A-anillo-lactonasa,
2-acetil-1-alquilglicerofosfocolina
esterasa, fusarinina-C ornitinesterasa, sinapina
esterasa, sinapina esterasa, hidrolasa de éster de cera,
forbol-diéster hidrolasa, fosfatidilinositol
desacilasa, sialato O-acetilesterasa,
acetoxibutinilbitiofeno desacetilasa, acetilsalicilato desacetilasa,
metilumbeliferil-acetato desacetilasa,
2-pirona-4,6-dicarboxilato
lactonasa, N-acetilgalactosaminoglicano
desacetilasa, hormona juvenil esterasa,
bis(2-etilhexil)ftalato esterasa,
proteína-glutamato metilesterasa,
11-cis-retinil-palmitato
hidrolasa,
todo-trans-retinil-palmitato
hidrolasa,
L-ramnono-1,4-lactonasa,
5-(3,4-diacetoxibut-1-inil)-2,2'-bitiofeno
desacetilasa, sintasa de
acil-etil-éster-graso,
xilono-1,4-lactonasa,
n-acetilglucosaminilfosfatidilinositol desacetilasa,
cetraxato bencilesterasa, acetilalquilglicerol acetilhidrolasa y
acetilxilano esterasa.
Las esterasas preferidas para el uso en la
presente invención son enzimas lipolíticas, tales como, lipasas
(clasificadas como EC 3.1.1.3, EC 3.1.1.23, y/o EC 3.1.1.26) y
fosfolipasas (clasificadas como EC 3.1.1.4 y/o EC 3.1.1.32,
incluidas lisofosfolipasas clasificadas como EC 3.1.1.5). Otras
esterasas preferidas son cutinasas (clasificadas como EC
3.1.1.74).
La esterasa se puede agregar en una cantidad
eficaz para obtener el beneficio deseado para mejorar el
rendimiento del microorganismo fermentativo, por ejemplo, para
cambiar la composición/concentración de lípido dentro y/o fuera del
microorganismo fermentativo o en la membrana celular del
microorganismo fermentativo, para generar una mejora en el
movimiento de solutos dentro y/o fuera de los microorganismos
fermentativos durante la fermentación y/o para proporcionar fuentes
de energía más metabolizables (tales como, por ejemplo, por
conversión de los componentes, tales como aceite del sustrato de
maíz, en componentes útiles para el microorganismo fermentativo,
por ejemplo, ácidos grasos insaturados y glicerol), para aumentar el
rendimiento del etanol. Ejemplos de cantidades eficaces de esterasa
son de aproximadamente 0,01 a aproximadamente 400 UL/g DS (del
inglés Dry Solids = Sólidos Secos). Preferiblemente, la esterasa se
usa en una cantidad de aproximadamente 0,1 a aproximadamente 100
UL/g DS, más preferiblemente aproximadamente 0,5 a aproximadamente
50 UL/g DS, e incluso más preferiblemente aproximadamente 1 a
aproximadamente 20 UL/g DS. Una optimización adicional de la
cantidad de esterasa puede obtenerse en adelante usando
procedimientos estándares conocidos en la técnica.
Una Unidad Lipásica (UL) es la cantidad de
enzima que libera 1,0 \mumol de ácido graso titulable por minuto
con tributirina como sustrato y goma arábiga como un emulsionante a
30EC, pH 7,0 (tampón fosfato).
En una forma de realización preferida, la
esterasa es una enzima lipolítica, más preferiblemente, una lipasa.
Según se utiliza en este caso, una "enzima lipolítica" se
refiere a lipasas y fosfolipasas (incluidas las lisofosfolipasas).
La enzima lipolítica es preferiblemente de origen microbiano, en
particular de origen bacteriano, fúngico o de levadura. La enzima
lipolítica usada se puede derivar de cualquier fuente, incluidas,
por ejemplo, una cepa de Absidia, en particular Absidia
blakesleena y Absidia corymbifera, una cepa de
Achromobacter, en particular Achromobacter iophagus,
una cepa de Aeromonas, una cepa de Alternaria, en
particular Altemaria brassiciola, una cepa de
Aspergillus, en particular Aspergillus niger, Aspergillus
oryzae, Asoergillus fumigatus y Aspergillus flavus, una
cepa de Achromobacter, en particular Achromobacter
iophagus, una cepa de Aureobasidium, en particular
Aureobasidium pullulans, una cepa de Bacillus, en
particular Bacillus pumilus, Bacillus stearothermophilus y
Bacillus subtilis, una cepa de Beauveria, una cepa de
Brochothrix, en particular Brochothrix thermosohata,
una cepa de Candida, en particular Candida cylindracea
(Candida rugosa), Candida paralipolytica y Candida
antarctica, una cepa de Chromobacter, en particular
Chromobacter viscosum, una cepa de Coprinus, en
particular Coprinus cinerius, una cepa de Fusarium, en
particular Fusarium graminearum, Fusarium oxysporum, Fusarium
solani, Fusarium solani pisi, Fusarium roseum culmorum y
Fusarium venenatum, una cepa de Geotricum, en
particular Geotricum penicillatum, una cepa de
Hansenula, en particular Hansenula anomala, una cepa
de Humicola, en particular Humicola brevispora, Humicola
brevis var. thermoidea y Humicola insolens, una
cepa de Hyphozyma, una cepa de Lactobacillus, en
particular Lactobacillus curvatus, una cepa de
Metarhizium, una cepa de Mucor, una cepa de
Paecilomyces, una cepa de Penicillium, en particular
Penicillium cyclopium, Penicillium crustosum y Penicillium
expansum, una cepa de Pseudomonas en particular
Pseudomonas aeruginosa, Pseudomonas alcaligenes, Pseudomonas
cepacia (sin. Burkholderia cepacia), Pseudomonas
fluorescens, Pseudomonas fragi, Pseudomonas maltophilia, Pseudomonas
mendocina, Pseudomonas mephitica lipolytica, Pseudomonas
alcaligenes, Pseudomonas plantari, Pseudomonas pseudoalcaligenes,
Pseudomonas putida, Pseudomonas stutzeri, y Pseudomonas
wisconsinensis, una cepa de Rhizooctonia, en particular
Rhizooctonia solani, una cepa de Rhizomucor, en
particular Rhizomucor miehei, una cepa de Rhizopus, en
particular Rhizopus japonicus, Rhizopus microsporus y
Rhizopus nodosus, una cepa de Rhodosporidium, en
particular Rhodosporidium toruloides, una cepa de
Rhodotorula, en particular Rhodotorula glutinis, una
cepa de Sporobolomyces, en particular Sporobolomyces
shibatanus, una cepa de Thermomyces, en particular
Thermomyces lanuginosus (anteriormente Humicola
lanuginosa), una cepa de Thiarosporella, en particular
Thiarosporella phaseolina, una cepa de Trichoderma, en
particular, Trichoderma harzianum y Trichoderma
reesei, y/o una cepa de Verticillium.
En una forma de realización preferida, la enzima
lipolítica se deriva de una cepa de Aspergillus, Achromobacter,
Bacillus, Candida, Chromobacter, Fusarium, Humicola, Hyphozyma,
Pseudomonas, Rhizomucor, Rhizopus o Thermomyces.
En formas de realización más preferidas, la
enzima lipolítica es una lipasa. Las lipasas pueden ser aplicadas en
la presente por su capacidad para modificar la estructura y la
composición de grasas y aceites de triglicérido en los medios de
fermentación (incluida la levadura de fermentación), por ejemplo,
que resulten a partir de un sustrato de maíz. Las lipasas catalizan
diferentes tipos de conversiones de triglicérido, tales como
hidrólisis, esterificación y transesterificación. Las lipasas
adecuadas incluyen lipasas ácidas, neutras y básicas, como se sabe
bien en la técnica, aunque las lipasas ácidas (tales como, por
ejemplo, la lipasa G AMANO 50, disponible de Amano) parecen ser más
eficaces en concentraciones inferiores de lipasa en comparación con
las lipasas básicas o neutras. Las lipasas preferidas para el uso en
la presente invención incluyen lipasa de Candida antarctica y
lipasa de Candida cylindracea. Las lipasas más preferidas son
lipasas purificadas tales como lipasa de Candida antarctica
(lipasa A), lipasa de Candida antarctica (lipasa B), lipasa
de Candida cylindracea y lipasa de Penicillium
camembertii.
La lipasa puede ser la descrita en EP
258.068-A o puede ser una variante de lipasa tal
como una variante descrita en WO 00/60063 o WO 00/32758. Las lipasas
comerciales preferidas incluyen LECITASE^{TM}, LIPOLASE^{TM} y
LIPEXT^{TM} (disponible de Novozymes A/S, Dinamarca) y G
AMANO^{TM} 50 (disponible de Amano).
Las lipasas son preferiblemente agregadas en
cantidades de aproximadamente 1 a aproximadamente 400 LU/g DS,
preferiblemente aproximadamente 1 a aproximadamente 10 LU/g DS y más
preferiblemente aproximadamente 1 a aproximadamente 5 LU/g DS.
En otra forma de realización preferida de la
presente invención, la esterasa es una cutinasa. Las cutinasas son
enzimas que son capaces de degradar cutina. La cutinasa se puede
derivar de cualquier fuente. En una forma de realización preferida,
la cutinasa se deriva de una cepa de Aspergillus, en
particular Aspergillus oryzae, una cepa de Alternaria,
en particular Alternaria brassiciola, una cepa de
Fusarium, en particular Fusarium solani, Fusarium solani
pisi, Fusarium roseum culmorum, o Fusarium roseum
sambucium, una cepa de Helminthosporum, en particular
Helminthosporum sativum, una cepa de Humicola, en
particular Humicola insolens, una cepa de Pseudomonas,
en particular Pseudomonas mendocina o Pseudomonas
putida, una cepa de Rhizoctonia, en particular
Rhizoctonia solani, una cepa de Streptomyces, en
particular Streptomyces scabies, o una cepa de
Ulocladium, en particular Ulocladium consortiale. En
una forma de realización más preferida la cutinasa se deriva de una
cepa de Humicola insolens, en particular la cepa de
Humicola insolens DSM 1800. La cutinasa de Humicola
insolens está descrita en WO 96/13580. La cutinasa puede ser una
variante tal como una de las variantes descritas en WO 00/34450 y WO
01/92502. Las variantes de cutinasa preferidas incluyen variantes
catalogadas en el ejemplo 2 de WO 01/92502. Una cantidad eficaz de
cutinasa es de aproximadamente 0,01 a aproximadamente 400 LU/g DS,
preferiblemente de aproximadamente 0,1 a aproximadamente 100 LU/g
DS, y más preferiblemente de aproximadamente 1 a aproximadamente 50
LU/g DS. Una optimización adicional de la cantidad de cutinasa puede
de aquí en adelante ser obtenida usando procedimientos estándares
conocidos en la técnica.
En otra forma de realización preferida, la
esterasa es una fosfolipasa. Como se utiliza en este caso, el
término "fospfolipasa" es una enzima que tiene actividad hacia
los fosfolípidos, por ejemplo, actividad hidrolítica. Los
fosfolípidos, tales como lecitina o fosfatidilcolina, consisten en
glicerol esterificado con dos ácidos grasos en una posición externa
(sn-1) y del medio (sn-2) y
esterificado con ácido fosfórico en la tercera posición. El ácido
fosfórico se puede esterificar a un alcohol amino. Pueden
distinguirse diferentes tipos de actividad fosfolipásica, incluidas
las fosfolipasas A_{1} y A_{2} que hidrolizan un grupo acilo
graso (en la posición sn-1 y sn-2,
respectivamente) para formar lisofosfolípido; y lisofosfolipasa (o
fosfolipasa B) que hidroliza el grupo acilo graso restante en
lisofosfolípido. La fosfolipasa C y la fosfolipasa D
(fosfodiesterasas) liberan diacilglicerol o ácido fosfatídico
respectivamente.
El término "fosfolipasa" incluye enzimas
con actividad fosfolipásica, por ejemplo, fosfolipasa A (A_{1} o
A_{2}), actividad de fosfolipasa B, actividad de fosfolipasa C, o
actividad de fosfolipasa D. El término "fosfolipasa A" según se
utiliza en este caso tiene la intención de comprender una enzima con
fosfolipasa A_{1} y/o actividad de fosfolipasa A_{2}. La
actividad fosfolipásica puede ser proporcionada por enzimas que
tienen otras actividades también, tales como, por ejemplo, una
lipasa con actividad fosfolipásica. La actividad fosfolipásica
puede, por ejemplo, ser de una lipasa con actividad fosfolipásica
lateral. En otras formas de realización, la actividad enzimática de
la fosfolipasa está provista por una enzima que tiene esencialmente
actividad fosfolipásica solamente y donde la actividad enzimática de
la fosfolipasa no es una actividad secundaria.
La fosfolipasa puede ser de cualquier origen,
por ejemplo, de origen animal (p. ej., mamífero, por ejemplo,
páncreas porcino o bovino), o veneno de serpiente o veneno de abeja.
Alternativamente, la fosfolipasa puede ser de origen microbiano, por
ejemplo, de hongos filamentosos, levadura o bacterias, tal como
Aspergillus, por ejemplo, A. awamori, A. foetidus, A.
japonicus, A. niger, o A. oryzae, Dictyostelium, por
ejemplo, D. discoideum; Fusarium, por ejemplo, F.
culmorum, F. graminearum, F. heterosporum, F. solani, F.
oxysporum, o F. venenatum; Mucor, por ejemplo, M.
javanicus, M. mucedo, o M. subtilissimus; Neurospora, por
ejemplo, N. crassa; Rhizomucor, por ejemplo, R. pusillus;
Rhizopus, por ejemplo, R. arrhizus, R. japonicus, R.
stolonifer, Sclerotinia, por ejemplo, S. libertiana;
Trichophyton, por ejemplo, T. rubrum; Whetzelinia, por
ejemplo, W. sclerotiorum; Bacillus, por ejemplo, B.
megaterium, o B. subtilis; Citrobacter, por ejemplo,
C. freundii; Enterobacter, por ejemplo, E. aerogenes o
E. cloacae; Edwardsiella, E. tarda; Erwinia, por ejemplo,
E. herbicola; Escherichia, por ejemplo, E. coli;
Klebsiella, por ejemplo, K. pneumoniae; Proteus, por
ejemplo, P. vulgaris; Providencia, por ejemplo, P.
stuartii; Salmonella, por ejemplo, S. typhimurium;
Serratia, por ejemplo, S. liquefasciens, S. marcescens;
Shigella, por ejemplo, S. flexneri; Streptomyces, por
ejemplo, S. violeceoruber, o Yersinia, por ejemplo,
Y. enterocolitica.
Las fosfolipasas comerciales preferidas incluyen
LECITASE^{TM} y LECITASE^{TM} ULTRA (disponible de Novozymes
A/S, Dinamarca).
Una cantidad eficaz de fosfolipasa es de
aproximadamente 0,01 a aproximadamente 400 LU/g DS, preferiblemente
de aproximadamente 0,1 a aproximadamente 100 LU/g DS, y más
preferiblemente de aproximadamente 1 a aproximadamente 50 LU/g DS.
Una optimización adicional de la cantidad de fosfolipasa puede en
adelante obtenerse usando procedimientos estándares conocidos en la
técnica.
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En otra forma de realización preferida de la
invención, al menos un tensioactivo y al menos una enzima generadora
de carbohidrato se usa en combinación con al menos una proteasa. La
proteasa puede ser utilizada, por ejemplo, para digerir proteína
para producir amino nitrógeno libre (FAN -del inglés Free
Amino-Nitrogen). Tales aminoácidos libres funcionan
como nutrientes para la levadura, aumentando así el crecimiento de
la levadura y, consecuentemente, la producción de etanol.
El microorganismo fermentativo para el uso en un
proceso de fermentación se puede producir mediante la propagación
del microorganismo fermentativo en presencia de al menos una
proteasa. Aunque sin limitarse a ninguna teoría de operación, se
cree que la propagación del microorganismo fermentativo con una
cantidad eficaz de al menos una proteasa reduce el tiempo de lapso
del microorganismo fermentativo cuando el microorganismo
fermentativo es posteriormente usado en un proceso de fermentación
en comparación con un microorganismo fermentativo que fue propagado
bajo las mismas condiciones sin la adición de la proteasa. Se cree
que la acción de la proteasa en el proceso de propagación genera
directa o indirectamente la supresión o la expresión de genes que
son perjudiciales o beneficiosos, respectivamente, para el
microorganismo fermentativo durante la fermentación, disminuyendo
así el tiempo de lapso y dando como resultado un ciclo de
fermentación más rápida.
Las proteasas se conocen bien en la técnica y se
refieren a enzimas que catalizan la escisión de enlaces peptídicos.
Las proteasas adecuadas incluyen proteasas bacterianas y fúngicas.
Las proteasas preferidas son proteasas acídicas, es decir, proteasas
caracterizadas por la capacidad para hidrolizar proteínas bajo
condiciones acídicas por debajo de pH 7. Las proteasas fúngicas de
ácido adecuadas incluyen proteasas fúngicas derivadas de
Aspergillus, Mucor, Rhizopus, Candida, Coriolus, Endothia,
Enthomophtra, Irpex, Penicillium, Sclerotium y
Torulopsis. Especialmente contempladas están las proteasas
derivadas de Aspergillus niger (véase, por ejemplo, Koaze
et al., 1964, Agr. Biol. Chem. Japan 28: 216), Aspergillus
saitoi (véase, por ejemplo, Yoshida, 1954, J. Agr. Chem. Soc.
Japan 28: 66), Aspergillus awamori (Hayashida et al.,
1977, Agric. Biol. Chem. 42: 927-933, Aspergillus
aculeatus (WO 95/02044), o Aspergillus oryzae; y
proteasas acídicas de Mucor pusillus o Mucor
miehei.
Las proteasas bacterianas, que no son proteasas
acídicas, incluyen los productos disponibles comercialmente
ALCALASE^{TM} y NEUTRASE^{TM} (disponibles de Novozimes A/S).
Otras proteasas incluyen GC106 de Genencor Int, Inc., EE. UU. y
NOVOZYM^{TM} 50006 de Novozymes A/S.
Preferiblemente, la proteasa es una proteasa de
ácido aspártico, como se describe, por ejemplo, en Handbook of
Proteolytic Enzymes, Editado potr A.J. Barrett, N.D. Rawlings y J.F.
Woessner, Academic Press, San Diego, 1998, capítulo 270). Ejemplos
adecuados de proteasa de ácido aspártico incluyen, por ejemplo,
aquellas descritas por Berka et al., 1990, Gene 96: 313;
Berka et al., 1993, Gene 125: 195-198; y Gomi
et al., 1993, Biosci. Biotech. Biochem. 57:
1095-1100.
\vskip1.000000\baselineskip
Otros compuestos que poseen actividad de
peroxidasa pueden ser cualquier peroxidasa (EC 1.11.1.7), o
cualquier fragmento que tenga actividad de peroxidasa derivada del
mismo, que muestre actividad de peroxidasa.
Preferiblemente, la peroxidasa es producida por
plantas (p. ej., peroxidasa de alfalfa o semilla de soja) o
microorganismos tales como hongos o bacterias.
Algunos hongos preferidos incluyen cepas
pertenecientes a la subdivisión Deuteromycotina, clase
Hyphomycetes, por ejemplo, Fusarium, Humicola,
Trichoderma, Myrothecium, Verticillum, Arthromyces, Caldariomyces,
Ulocladium, Embellisia, Cladosporium, o Dreschlera, en
particular Fusarium oxysporum (DSM 2672), Humicola
insolens, Trichoderma resii, Myrothecium verrucaria (IFO 6113),
Verticillum alboatrum, Verticillum dahlie, Arthromyces
ramosus (FERM P-7754), Caldariomyces fumago,
Ulocladium chartarum, Embellisia alli, o Dreschlera
halodes.
Otros hongos preferidos incluyen cepas de la
subdivisión Basidiomycotina, clase Basidiomycetes, por
ejemplo., Coprinus, Phanerochaete, Coriolus, o
Trametes, en particular Coprinus cinereus f.
microsporus (IFO 8371), Coprinus macrorhizus,
Phanerochaete chrysosporium (e.g. NA-12), o
Trametes (previamente llamada Polyporus), por ejemplo,
T. versicolor (por ejemplo PR4 28-A).
Otros hongos preferidos incluyen cepas de la
subdivisión Zygomycotina, clase Mycoraceae, por
ejemplo, Rhizopus o Mucor, en particular Mucor
hiemalis.
Algunas bacterias preferidas incluyen cepas del
orden Actinomycetales, por ejemplo Streptomyces
spheroides (ATTC 23965), Streptomyces thermoviolaceus
(IFO 12382), o Streptoverticillum verticillium ssp.
verticillium.
Otras bacterias preferidas incluyen cepas
Rhodobacter sphaeroides, Rhodomonas palustri, Streptococcus
lactis, Pseudomonas purrocinia (ATCC 15958), Pseudomonas
fluorescens (NRRL B-11) y Bacillus, por
ejemplo, Bacillus pumilus (ATCC 12905) y Bacillus
stearothermophilus.
Otras bacterias preferidas incluyen cepas de
Mixococcus, por ejemplo, M. virescens.
La peroxidasa también puede ser una que se
produzca por un método que comprenda cultivar una célula huésped
transformada con un vector de ADN recombinante que lleve una
secuencia de ADN que codifique la peroxidasa al igual que secuencias
de ADN para la expresión de la secuencia de ADN que codifique la
peroxidasa, en un medio de cultivo bajo condiciones que permitan la
expresión de la peroxidasa y la recuperación de la peroxidasa del
cultivo.
En una forma de realización preferida, una
peroxidasa producida por recombinación es una peroxidasa derivada de
una Coprinus sp., en particular C. macrorhizus o C.
cinereus según WO 92/16634.
En la presente invención, los compuestos que
poseen actividad de peroxidasa comprenden enzimas peroxidasas y
fragmentos activos de peroxidasa derivados de citocromos,
hemoglobina o enzimas peroxidasas.
Una unidad de peroxidasa (POXU) es la cantidad
de enzima que bajo las siguientes condiciones cataliza la conversión
de 1 \mumol de peróxido de hidrógeno por minuto a 30ºC en tampón
fosfato 0,1 M pH 7,0, peróxido de hidrógeno 0,88 mM y
2,2'-azino-bis(3-etilbenzotiazolina-6-sulfonato)(ABTS)
1,67 mM. La reacción se sigue durante 60 segundos (15 segundos
después de mezclar) por el cambio en absorbencia a 418 nm, que
debería estar en la gama de 0,15 a 0,30. Para el cálculo de la
actividad, se utiliza un coeficiente de absorción de ABTS oxidado de
36 mM^{-1} cm^{-1} y una estequiometría de un \mumol de
H_{2}O_{2} convertido por dos \mumol de ABTS oxidado.
\vskip1.000000\baselineskip
En la presente invención, las lacasas y las
enzimas relacionadas con la lacasa comprenden cualquier enzima
lacasa clasificada como EC 1.10.3.2, cualquier enzima oxidasa de
catecol clasificada como EC 1.10.3.1, cualquier enzima oxidasa de
bilirrubina clasificada como EC 1.3.3.5 o cualquier enzima de
monofenol-monoxigenasa clasificada como EC
1.14.18.1.
Las enzimas mencionadas más arriba pueden ser
microbianas, es decir, obtenidas de bacterias u hongos (incluidos
hongos filamentosos y levaduras), o se pueden derivar de
plantas.
Ejemplos adecuados de hongos incluyen una lacasa
obtenida de una cepa de Aspergillus, Neurospora, por ejemplo,
N. crassa, Podospora, Botrytis, Collybia, Fomes, Lentinus,
Pleurotus, Trametes, por ejemplo, T. villosa y T.
versicolor, Rhizooctonia, por ejemplo, R. solani,
Coprinus, por ejemplo, C. cinereus, C. comatus, C.
friesii y C. plicatilis, Psathyrella, por ejemplo, P.
condelleana, Panaeolus, por ejemplo, P. papilionaceus,
Myceliophthora, por ejemplo, M. thermophila,
Schytalidium, por ejemplo, S. thermophilum, Polyporus,
por ejemplo, P. pinsitus, Pycnoporus, por ejemplo, P.
cinnabarinus, Phlebia, por ejemplo, P. radita (WO
92/01046) o Coriolus, por ejemplo, C. hirsutus (JP
2-238885).
Ejemplos adecuados de bacterias incluyen una
lacasa obtenida de una cepa de Bacillus.
Se prefiere una lacasa obtenida de Coprinus,
Myceliophthora, Polyporus, Pycnoporus, Scytalidium o
Rhizoctonia; en particular una lacasa obtenida de Coprinus
cinereus, Myceliophthora thermophila, Polyporus pinsitus, Pycnoporus
cinnabarinus, Scytalidium thermophilum, o Rhizoctonia
solani.
Lacasas disponibles comercialmente son NS51001
(una lacasa de Polyporus pinsitius, disponible de Novozymes
A/S, Dinamarca) y NS51002 (una lacasa de Myceliopthora
thermophila, disponible de Novozymes A/S, Dinamarca).
La lacasa o la enzima relacionada a la lacasa
también puede ser una que se produzca por un método que comprenda
cultivar una célula huésped transformada con un vector de ADN
recombinante que lleve una secuencia de ADN que codifique la lacasa
al igual que secuencias de ADN para la expresión de la secuencia de
ADN que codifique la lacasa, en un medio de cultivo bajo condiciones
que permitan la expresión de la enzima lacasa y la recuperación de
la lacasa del cultivo.
La actividad de lacasa (LACU) se determina a
partir de la oxidación de siringaldazina bajo condiciones aeróbicas
a pH 5,5. El color violeta producido se mide con fotómetro a 530 nm.
Las condiciones analíticas son 19 mM de siringaldazina, 23 mM de
tampón de acetato, pH 5,5, 30ºC, tiempo de reacción de 1 minuto. Una
unidad de lacasa (LACU) es la cantidad de enzima que cataliza la
conversión de 1,0 \mumol de siringaldazina por minuto bajo las
condiciones anteriores.
La actividad de lacasa (LAMU) se determina a
partir de la oxidación de siringaldazina bajo condiciones aeróbicas
a pH 7,5. El color violeta producido se fotometrea a 530 nm. Las
condiciones analíticas son 19 mM siringaldazina, 23 mM Tris/maleato
pH 7,5, 30ºC, tiempo de reacción de 1 minuto. Una unidad de lacasa
(LAMU) es la cantidad de enzima que cataliza la conversión de 1,0
\mumol siringaldazina por minuto bajo las condiciones
anteriores.
La presente invención es descrita además por los
siguientes ejemplos, los cuales no deben interpretarse como
limitadores del ámbito de la invención.
\vskip1.000000\baselineskip
Los productos químicos usados como tampones y
sustratos fueron productos comerciales de al menos grado
reactivo.
\vskip1.000000\baselineskip
RutC30 de Trichoderma reesei (ATCC 56765;
Montenecourt y Eveleigh, 1979, Adv. Chem. Ser. 181:
289-301), que fue derivada de Qm6A de Trichoderma
reesei (ATCC 13631; Mandels y Reese, 1957, J. Bacteriol. 73:
269-278), fue usada como un huésped para la
expresión de beta-glucosidasa de Aspergillus
oryzae.
Células TOP10 de la cepa de Escherichia
coli (Invitrogen, Carlsbad, California) y células competentes de
electroporación de Epicurian coli SURE (Stratagene, La Jolla,
CA) fueron usadas para propagación de plásmidos.
La cepa JaL250 de Aspergillus oryzae (WO
99/61651) fue usada para la expresión de
beta-glucosidasa de Aspergillus fumigatus.
PaHa34 de Aspergillus fumigatus fue usada como la fuente de
la beta-glucosidasa de la familia GH3A.
\vskip1.000000\baselineskip
El medio YP fue compuesto por litro de 10 g de
extracto de levadura y 20 g de bactopeptona.
Las placas de la selección COVE fueron
compuestas por litro de 342,3 g de sacarosa, 20 ml de solución
salina COVE, 10 mM acetamida, 15 mM CsCl_{2} y 25 g de agar
Noble.
Las placas COVE2 fueron compuestas por litro de
30 g de sacarosa, 20 ml de solución salina COVE, 10 mM acetamida y
25 g de agar Noble.
La solución salina fue compuesta por litro de 26
g de KCI, 26 g de MgSO_{4} \cdot7H_{2} O, 76 g de KH_{2}
PO_{4} y 50 ml de solución de metales traza COVE.
La solución de metales de traza COVE fue
compuesta por litro de 0,04 g de NaB_{4}O_{7}\cdot10H_{2}O,
0,4 g de CuSO_{4}\cdot5H_{2}O, 1,2 g de
FeSO_{4}\cdot7H_{2}O, 0,7 g de MnSO_{4}\cdotH_{2}O, 0,8
g de Na_{2}MoO_{2}\cdot2H_{2}O y 10 g de
ZnSO_{4}\cdot7H_{2}O.
Los medios inductores de celulasa fueron
compuestos por litro de 20 g de fibras de celulosa Arbocel
B800-natural (J. Rettenmaier USA LP, Schoolcraft,
Michigan), 10 g de sólidos de maíz fermentado (Sigma Chemical Co.,
St. Louis, MO), 1,45 g de (NH_{4})_{2}SO_{4}, 2,08 g de
KH_{2}PO_{4}, 0,28 g de CaCl_{2}, 0,42 g de
MgSO_{4}\cdot7H_{2} O, 0,42 ml de solución de metales traza de
Trichoderma reesei y 2 gotas de ácido plurónico; pH a 6,0 con
10 N NaoH.
La solución de metales traza Trichoderma
reesei fue compuesta por litro de 216 g de
FeCl_{3}-6H_{2}O, 58 g de
ZnSO_{4}\cdot7H_{2}O, 27 g de MnSO_{4}\cdotH_{2}O, 10 g
de CuSO_{4}\cdot5H_{2}O, 2,4 g de H_{3}BO_{3} y 336 g de
ácido cítrico.
El tampón PEG fue compuesto por litro de 500 g
de PEG 4000 (BDH, Poole, Inglaterra), 10 mM CaCl_{2} y 10 mM
tris-HCl pH 7,5 (esterilización con filtro).
STC fue compuesto por litro de 1 M de sorbitol,
10 mM de CaCl_{2} y 10 mM de tris-HCl pH 7,5
(esterilización con filtro).
El medio YPD fue compuesto por litro de 10 g de
extracto de levadura, 20 g de bacto triptona y 40 ml de glucosa al
50%.
El medio de selección de levadura fue compuesto
por litro de 6,7 g de base nitrogenada de levadura, 0,8 g de mezcla
de suplemento completa (CSM, Qbiogene, Inc., Carlsbad, CA; carente
de uracilo y con 40 mg/ml de adenina), 5 g de ácidos de casamino
(sin aminoácidos), 100 ml de 0,5 M de succinato pH 5,.0, 40 ml de
glucosa al 50%, 1 ml de 100 mM de CuSO_{4}, 50 mg de ampicilina y
25 mg de cloranfenicol.
El medio de placa de selección de levadura fue
compuesto por litro de medio de selección de levadura suplementado
con 20 g de bacto agar y 150 mg de
5-bromo-4-cloro-3-indolil-beta-D-glucopiranósido
(X-Glc, INALCO SPA, Milán, Italia) pero careciendo
ambos de ampicilina y cloranfenicol.
El medio de dextrosa de patata fue compuesto por
litro de 39 gramos de dextrosa de patata (Difco).
Las placas PDA fueron compuestas por litro de 39
gramos de agar de dextrosa de patata.
El medio MDU2BP fue compuesto por litro de 45 g
de maltosa, 1 g de MgSO_{4}\cdot7H_{2}O, 1 g de NaCl, 2 g de
K_{2}SO_{4}, 12 g de KH_{2}PO_{4}, 7 g de extracto de
levadura, 2 g de urea y 0,5 ml de solución de metales traza AMG, pH
a 5,0.
La solución de metales traza AMG fue compuesta
por litro de 14,3 g de ZnSO_{4}\cdot7H_{2}O, 2,5 g de
CuSO_{4}\cdot5H_{2}O, 0.5 g de NiCl_{2}\cdot6H_{2}O,
13.8 g de FeSO_{4}\cdot7H_{2}O, 8,5 g de
MnSO_{4}\cdotH_{2}O y 3 g de ácido cítrico.
El medio CIM fue compuesto por litro de 20 g de
celulosa, 10 g de sólidos de maíz fermentado, 1,45 g de
(NH_{4})_{2}
SO_{4}, 2,08 g de KH_{2}PO_{4}, 0,28 g de CaCl_{2}, 0,42 g de MgSO_{4}\cdot7H_{2}O, y 0,42 ml de solución de metales traza, pH a 6,0.
SO_{4}, 2,08 g de KH_{2}PO_{4}, 0,28 g de CaCl_{2}, 0,42 g de MgSO_{4}\cdot7H_{2}O, y 0,42 ml de solución de metales traza, pH a 6,0.
La solución de metales traza fue compuesta por
litro de 41,2 mg de FeCl_{3}\cdot6H_{2} O, 11,6 mg de
ZnSO_{4}\cdot7H_{2}O, 5,4 mg de MnSO_{4}\cdotH_{2}O, 2,0
mg de CuSO_{4}\cdot5H_{2} O, 0,48 mg de H_{3}BO_{3} y 67,2
mg de ácido cítrico.
\vskip1.000000\baselineskip
La actividad de beta-glucosidasa
fue determinada a temperatura ambiente en 25 \mul de sobrenadantes
crudos de cultivo, diluido 1:10 en 50 mM de succinato pH 5,0, usando
200 \mul de 0,5 mg/ml de
P-nitrofenil-beta-D-glucopiranósido
(pnpBDG) como sustrato en 50 mM de succinato pH 5,0. Después de 15
minutos de incubación, la reacción fue detenida añadiendo 100 \mul
de 1 M Tris-HCl pH 8,0 y la absorbencia fue leída
espectrofotométricamente a 405 nm. La
beta-glucosidasa de Aspergillus niger
(Novozyme 188, Novozymes A/S, Bagsværd, Dinamarca) fue usada como un
estándar enzimático.
\vskip1.000000\baselineskip
La actividad específica de endoglucanasas hacia
carboximetilcelulosa (CMC, 5 mg/ml) fue determinada midiendo el
nivel inicial de hidrólisis en la gama de aumento lineal de la
concentración de azúcar de reducción (RS del inglés Reduction Sugar)
con el paso del tiempo en 50 mM de acetato sódico pH 5,0 a 50ºC. La
hidrólisis se efectúa sin agitación en presencia de 0,5 mg/ml de
BSA. La actividad específica fue expresada en unidades
internacionales (IU -del inglés International Unit-) por mg de
proteína. Una IU es definida como el \mumol de enlaces
glicosídicos hidrolizados en un minuto durante el periodo inicial de
la hidrólisis. Las enzimas fueron diluidas para dar una relación
lineal entre la concentración enzimática y la actividad medida.
La carboximetilcelulosa (tipo 7L2, Hercules
Inc., Wilmington, DE) con grado medio de sustitución (DS) de 0,7.
Una solución de 6,25 mg/ml de CMC en 50 mM de acetato sódico pH 5,0
fue preparada añadiendo lentamente CMC al tampón enérgicamente
agitado, seguido de calentamiento a aproximadamente 60ºC bajo
agitación continua hasta la disolución completa.
\vskip1.000000\baselineskip
La actividad de celobiohidrolasa fue determinada
según el procedimiento descrito por Deshpande et al.
(Deshpande, M.V., Eriksson, K.-E., Pettersson, L.G., 1984, An assay
for selective determination of
exo-1,4-\beta-glucanases
in a mixture of cellulolytic enzymes, Anal. Biochem. 138:
481-487), que fue modificado a un formato de
microplaca de 96 pocillos. La concentración de
p-nitrofenol (PNP) producida de 2,5 mM de
P-nitrofenil-\beta-D-celobiósido
(PNPC, Cat. # 5754, Sigma, St. Louis, MO) fue medido
espectrofotométricamente a 405 nm (A_{405}) después de 30 minutos
de hidrólisis en 50 mM de acetato sódico pH 5,0 a 40ºC. Antes de la
hidrólisis, las enzimas fueron diluidas en 50 mM de acetato sódico
pH 5,0 para dar menos de 8% de conversión de PNPC en las condiciones
especificadas.
\vskip1.000000\baselineskip
Celluclast 1,5 L se obtuvo de Novozymes A/S,
Bagsværd, Dinamarca. La concentración de proteína en las muestras
de celulasa fue determinada por el ensayo de microplaca de BCA como
se describe en las Instrucciones para el equipo de reactivos del
ensayo de proteínas PCS (Pierce Chemical Co., Rockford, IL). Antes
de determinar la concentración, algunas muestras fueron desaladas
pasando a través de columnas Bio Spin 6 (BioRad Laboratories,
Hercules, CA) según las instrucciones del fabricante.
Antes de los experimentos de hidrólisis, la
beta-glucosidasa de Aspergillus oryzae
(producida por recombinación en Aspergillus oryzae según WO
02/095014), la beta-glucosidasa de Aspergillus
fumigatis (producida por recombinación en Aspergillus
oryzae) y la endoglucanasa I de Trichoderma reesei
(producida por recombinación en Aspergillus oryzae) fueron
desaladas e intercambiadas en 50 mM de acetato sódico pH 5,0 tampón,
usando filtro centrífugo Centricon Plus-20 con
membrana Biomax-5 (5000 NMWL; Millipore, Bedford,
MA).
Las diluciones enzimáticas fueron preparadas
nuevas antes de cada experimento a partir de soluciones de enzima de
materia prima, que fueron almacenadas a -20ºC.
\vskip1.000000\baselineskip
El vector de expresión pAlLo1 fue construido
modificando pBANe6 (Patente estadounidense 6.461.837), que comprende
un híbrido de los promotores de los genes para
alfa-amilasa neutra de Aspergillus niger y
triosa fosfato isomerasa de Aspergillus oryzae (promotor
NA2-tpi), secuencia del terminador de
amiloglucosidasa de Aspergillus niger (terminador AMG) y gen
de acetamidasa de Aspergillus nidulans (amdS). La
modificación de pBANe6 fue realizada eliminando primero tres sitios
de restricción NcoI en las posiciones 2051, 2722 y 3397 bp del
marcador de selección amdS por mutagénesis dirigida. Todos los
cambios fueron diseñados para ser "silenciosos" dejando la
secuencia de proteína real del producto genético amdS sin
modificaciones. La eliminación de estos tres sitios fue realizada
simultáneamente con un equipo de mutagénesis dirigida GeneEditor
(Promega, Madison, WI) según las instrucciones del fabricante usando
los siguientes cebadores (el nucleótido subrayado representa la base
cambiada):
AMDS3NcoMut (2050):
- 5'-GTGCCCCATGATACGCCTCCGG-3'
- (SEC ID N.º 1)
\vskip1.000000\baselineskip
AMDS2NcoMut (2721):
- 5'-GAGTCGTATTTCCAAGGCTCCTGACC-3'
- (SEC ID N.º 2)
\vskip1.000000\baselineskip
AMDS1 NcoMut (3396):
- 5'-GGAGGCCATGAAGTGGACCAACGG-3'
- (SEC ID N.º 3)
\vskip1.000000\baselineskip
Luego se sometió a mutagénesis dirigida un
plásmido que comprende los tres cambios de la secuencia previstos,
usando un equipo de mutagénesis QuickChange (Stratagene, La Jolla,
CA), para eliminar el sitio de restricción NcoI al final del
terminador AMG en la posición 1643. Los siguientes cebadores (el
nucleótido subrayado representa la base cambiada) fueron usados para
la mutagénesis:
Cebador superior para mutagenizar la secuencia
del terminador AMG:
- 5'-CACCGTGAAAGCCATGCTCTTTCCTTCGTGTAGAAGACCAGACAG-3'
- (SEC ID N.º 4)
\vskip1.000000\baselineskip
Cebador inferior para mutagenizar la secuencia
del terminador AMG:
- 5'-CTGGTCTTCTACACGAAGGAAAGAGCATGGCTTTCACGGTGTCTG-3'
- (SEC ID N.º 5)
\vskip1.000000\baselineskip
El último paso en la modificación de pBANe6 fue
la adición de un nuevo sitio de restricción NcoI al principio
del poliligador usando un equipo de mutagénesis QuickChange y los
siguientes cebadores (los nucleótidos subrayados representan las
bases cambiadas) para producir pAlLo1 (figura 3).
Cebador superior para mutagenizar el promotor
NA2-tpi:
- 5'-CTATATACACAACTGGATTTACCATGGGCCCGCGGCCGCAGATC-3'
- (SEC ID N.º 6)
\vskip1.000000\baselineskip
Cebador inferior para mutagenizar el promotor
NA2-tpi:
- 5'-GATCTGCGGCCGCGGGCCCATGGTAAATCCAGTTGTGTATATAG-3'
- (SEC ID N.º 7)
\vskip1.000000\baselineskip
El vector de expresión pMJ04 fue construido por
PCR amplificando el terminador de celobiohidrolasa 1 de Cel7A de
Trichoderma reesei de ADN genómico de RutC30 de
Trichoderma reesei usando cebadores 993429 (antisentido) y
993428 (sentido) mostrados más abajo. El cebador antisentido fue
creado genéticamente para tener un sitio PacI en el extremo 5' y un
sitio SpeI en el extremo 5' del cebador sentido.
Cebador 993429 (antisentido):
- 5'-AACGTTAATTAAGGAATCGTTTTGTGTTT-3'
- (SEC ID N.º 8)
\vskip1.000000\baselineskip
Cebador 993428 (sentido):
- 5'-AGTACTAGTAGCTCCGTGGCGAAAGCCTG-3'
- (SEC ID N.º 9)
\vskip1.000000\baselineskip
Las reacciones de la amplificación (50 \mul)
fueron compuestas de 1X tampón de reacción Thermopol (New England
Biolabs, Beverly, MA), 0,3 mM dNTPs, 100 ng de ADN genómico de
RutC30 de Trichoderma reesei (que fue aislado usando un
equipo DNeasy Plant Maxi, QIAGEN Inc., Chatsworth, CA, QIAGEN Inc.,
Chatsworth, CA), 0,3 \muM de cebador 993429, 0,3 \muM de cebador
993428 y 2 unidades de polimerasa Vent (New England Biolabs,
Beverly, MA). Las reacciones fueron incubadas en un Eppendorf
Mastercycler 5333 (Hamburgo; Alemania) programado de la siguiente
manera: 30 ciclos cada uno durante 30 segundos a 94ºC, 30 segundos a
55ºC y 30 segundos a 72ºC (extensión final de 15 minutos). Los
productos reactivos fueron aislados en un gel de agarosa al 1,0%
usando tampón Tris base 40 mM- acetato de sodio 20
mM-EDTA disodio 1 mM (TAE) donde una banda de
producto de 229 bp fue cortada del gel y purificada usando un Equipo
de extracción de gel QIAquick (QIAGEN Inc., Chatswort, CA) según las
instrucciones del fabricante.
El fragmento de PCR resultante fue digerido con
PacI y SpeI y ligado en pAlLo1 digerido con las mismas enzimas de
restricción usando un equipo de ligadura rápida (Roche,
Indianápolis, IN), para generar pMJ04 (figura 2).
\vskip1.000000\baselineskip
El plásmido de expresión pCaHj568 fue construido
de pCaHj170 (Patente estadounidense n.º 5.763.254) y
pMT2188. El plásmido pCaHj170 comprende la región de codificación de la endoglucanasa 5 de Humicola insolens (Cel45A). El plásmido pMT2188 fue construido de la siguiente manera: El origen de replicación pUC19 fue amplificado por PCR de pCaHj483 (WO 98/00529) con cebadores 142779 y 142780 mostrados a continuación. El cebador 142780 introduce un sitio BbuI en el fragmento de PCR.
pMT2188. El plásmido pCaHj170 comprende la región de codificación de la endoglucanasa 5 de Humicola insolens (Cel45A). El plásmido pMT2188 fue construido de la siguiente manera: El origen de replicación pUC19 fue amplificado por PCR de pCaHj483 (WO 98/00529) con cebadores 142779 y 142780 mostrados a continuación. El cebador 142780 introduce un sitio BbuI en el fragmento de PCR.
142779:
- 5'-TTGAATTGAAAATAGATTGATTTAAAACTTC-3'
- (SEC ID N.º 10)
\vskip1.000000\baselineskip
142780:
- 5'-TTGCATGCGTAATCATGGTCATAGC-3'
- (SEC ID N.º 11)
\vskip1.000000\baselineskip
El sistema Expand PCR (Roche Molecular
Biochemicals, Basel, Suiza) fue usado para la amplificación
siguiendo las instrucciones del fabricante para ésta y
amplificaciones con PCR posteriores. Los productos de PCR fueron
separados en un gel de agarosa y un fragmento de 1160 bp fue aislado
y purificado usando un equipo de centrifugación para extracción de
gel Jetquick (Genomed, Wielandstr, Alemania).
El gen URA3 fue amplificado desde el vector de
clonación pYES2 de Saccharomyces cerevisiae general
(Invitrogen, Carlsbad, CA) usando los cebadores 140288 y 142778 a
continuación. El cebador 140288 introduce un sitio Eco RI en el
fragmento de PCR.
140288:
- 5'-TTGAATTCATGGGTAATAACTGATAT-3'
- (SEC ID N.º 12)
\vskip1.000000\baselineskip
142778:
- 5'-AAATCAATCTATTTTCAATTCAATTCATCATT-3'
- (SEC ID N.º 13)
\vskip1.000000\baselineskip
Los productos de PCR fueron separados en un gel
de agarosa y un fragmento de 1126 bp fue aislado y purificado
usando un equipo de centrifugación para extracción de gel
Jetquick.
Los dos fragmentos de PCR fueron fundidos
mediante mezcla y amplificados usando los cebadores 142780 y 140288
mostrados más arriba por empalme de método de recubrimiento (Horton
et al., 1989, Gene 77: 61-68). Los productos
de PCR fueron separados en un gel de agarosa y un fragmento de 2263
pb fue aislado y purificado usando un equipo de centrifugación para
extracción de gel Jetquick.
El fragmento resultante fue digerido con EcoRI y
BbuI y ligado al fragmento más grande de pCaHj483 digerido con las
mismas enzimas. La mezcla de ligadura fue usada para transformar la
cepa de E. coli DB6507 pyrF^{-} (ATCC 35673) y
hacerla competente por el método de Mandel y Higa, 1970, J. Mol.
Biol. 45: 154. Los transformantes fueron seleccionados en medio
sólido M9 (Sambrook et al., 1989, Molecular Cloning, A
Laboratory Manual, 2ª edición, Cold Spring Harbor Laboratory Press)
suplementado por litro con 1 g de casaminoácidos, 500 \mug de
tiamina y 10 mg de canamicina. Un plásmido de un transformante fue
aislado y designado pCaHj527 (figura 3).
El promotor NA2/tpi presente en pCaHj527 fue
sometido a mutagénesis dirigida por un enfoque de PCR simple. Los
nucleótidos 134-144 fueron convertidos de
GTACTAAAACC a CCGTTAAATTT usando cebador mutagénico 141223:
Cebador 141223:
- 5'-GGATGCTGTTGACTCCGGAAATTTAACGGTTTGGTCTTGCATCCC-3'
- (SEC ID N.º 14)
\vskip1.000000\baselineskip
Los nucleótidos 423-436 fueron
convertidos de ATGCAATTTAAACT a CGGCAATTTAACGG usando el cebador
mutagénico 141222:
Cebador 141222:
- 5'-GGTATTGTCCTGCAGACGGCAATTTAACGGCTTCTGCGAATCGC-3'
- (SEC ID N.º 15)
\vskip1.000000\baselineskip
El plásmido resultante fue designado pMT2188
(figura 4).
La región de codificación de la endoglucanasa 5
de Humicola insolens fue transferida de pCaHj170 como un
fragmento BamHI-SalI en pMT2188 digerida con BamHI y
XhoI para generar pCaHj568 (figura 5).
\vskip1.000000\baselineskip
El vector de expresión pMJ05 fue construido por
PCR amplificando la región de codificación de endoglucanasa 5 de
Humicola insolens de 915 bp de CaHj568 usando los cebadores
HiEGV-F y HiEGV-R que se muestran a
continuación.
HiEGV-F (sentido):
- 5'-AAGCTTAAGCATGCGTTCCTCCCCCCTCC-3'
- (SEC ID N.º 16)
\vskip1.000000\baselineskip
HiEGV-R (antisentido):
- 5'-CTGCAGAATTCTACAGGCACTGATGGTACCAG-3'
- (SEC ID N.º 17)
\vskip1.000000\baselineskip
Las reacciones de la amplificación (50 de
\mul) fueron compuestas de 1X tampón de reacción Thermopol, 0,3 mM
dNTPs, 10 ng/\mul pCaHj568 plásmido, 0,3 \muM
HiEGV-F cebador, 0,3 \muM HiEGV-R
cebador y 2 unidades de polimerasa Vent. Las reacciones fueron
incubadas en un Eppendorf Mastercycler 5333 programado de la
siguiente manera: 5 ciclos cada uno durante 30 segundos a 94ºC, 30
segundos a 50ºC, y 60 segundos a 72ºC, seguidos de 25 ciclos cada
uno durante 30 segundos a 94ºC, 30 segundos a 65ºC y 120 segundos a
72ºC (extensión final de 5 minutos). Los productos reactivos fueron
aislados en un gel de agarosa al 1,0% usando tampón TAE donde una
banda de producto de 937 bp fue cortado del gel y purificado usando
un equipo de extracción de gel QIAquick según las instrucciones del
fabricante.
Este fragmento purificado de 937 bp fue usado
como ADN molde para amplificaciones posteriores usando los
siguientes cebadores:
| HiEGV-R (antisentido): | 5'-CTGCAGAATTCTACAGGCACTGATGGTACCAG-3' | |
| (SEC ID N.º 18) | ||
| HiEGV-F-recubrimiento (sentido): | 5'-ACCGCGGACTGCGCATC ATGCGTTCCTCCCCCCTCC-3' | |
| (SEC ID N.º 19) |
\vskip1.000000\baselineskip
Las secuencias de cebador en cursiva son
homólogas a 17 bp del promotor de celobiohidrolasa 1 Cel7A de
Trichoderma reesei y las secuencias de cebador subrayadas son
homólogas a 29 bp de la región de codificación de endoglucanasa 5 de
Humicola insolens. El recubrimiento de 36 bp entre el
promotor y la secuencia codificante permitió la fusión precisa del
fragmento de 994 bp que comprende el promotor de celobiohidrolasa 1
de Cel7A de Trichoderma reesei al fragmento de 918 bp que
comprende el marco de lectura abierto de endoglucanasa 5 de
Humicola insolens.
Las reacciones de amplificación (50 \mul)
fueron compuestas de 1X tampón de reacción Thermopol, 0,3 mM de
dNTPs, 1 \mul del fragmento de PCR de 937 bp purificado, 0,3
\muM de cebador de recubrimiento HiEGV-F, 0,3
\muM de cebador HiEGV-R y 2 unidades de polimerasa
Vent. Las reacciones fueron incubadas en un Eppendorf Mastercycler
5333 programado de la siguiente manera: 5 ciclos cada uno durante 30
segundos a 94ºC, 30 segundos a 50ºC, y 60 segundos a 72ºC, seguidos
de 25 ciclos cada uno durante 30 segundos a 94ºC, 30 segundos a 65ºC
y 120 segundos a 72ºC (extensión final de 5 minutos). Los productos
reactivos fueron aislados en un gel de agarosa al 1,0% usando tampón
TAE donde una banda de producto de 945 bp fue cortada del gel y
purificada usando un equipo de extracción de gel QIAquick según las
instrucciones del fabricante.
Se realizó una PCR por separado para amplificar
la secuencia del promotor de celobiohidrolasa 1 de Cel7A de
Trichoderma reesei que se extiende desde 994 bp arriba del
codón de iniciación ATG del gen de ADN genómico de RutC30 de
Trichoderma reesei usando los siguientes cebadores (el
cebador sentido fue creado genéticamente para tener un sitio de
restricción Sal I en el extremo 5'):
TrCBHIpro-F (sentido):
- 5'-AAACGTCGACCGAATGTAGGATTGTTATC-3'
- (SEC ID N.º 20)
\vskip1.000000\baselineskip
TrCBHIpro-R (antisentido):
- 5'-GATGCGCAGTCCGCGGT-3'
- (SEC ID N.º 21)
\vskip1.000000\baselineskip
Las reacciones de amplificación (50 \mul)
fueron compuestas de 1X tampón de reacción Thermopol, 0,3 mM de
dNTPs, 100 ng/\mul de ADN genómico de RutC30 de Trichoderma
reesei, 0,3 \muM de cebador TrCBHIpro-F, 0,3
\muM de cebador TrCBHIpro-R y 2 unidades de
polimerasa Vent. Las reacciones fueron incubadas en un Eppendorf
Mastercycler 5333 programado de la siguiente manera: 30 ciclos cada
uno durante 30 segundos a 94ºC, 30 segundos a 55ºC y 120 segundos a
72ºC (extensión final de 5 minutos). Los productos reactivos fueron
aislados en un gel de agarosa al 1,0% usando tampón TAE donde una
banda de producto de 998 bp fue cortado del gel y purificado usando
un equipo de extracción de gel QIAquick según las instrucciones del
fabricante.
El fragmento de PCR de 998 bp purificado fue
usado para como ADN molde para amplificaciones posteriores usando
los siguientes cebadores:
TrCBHIpro-F:
- 5'-AAACGTCGACCGAATGTAGGATTGTTATC-3'
- (SEC ID N.º 22)
\vskip1.000000\baselineskip
TrCBHIpro-R-recubrimiento:
- 5'-GGAGGGGGGAGGAACGCA TGATGCGCAGTCCGCGGT-3'
- (SEC ID N.º 23)
\vskip1.000000\baselineskip
Las secuencias en cursiva son homólogas a 17 bp
del promotor cbh1 de Trichoderma reesei y las
secuencias subrayadas son homólogas a 29 bp de la región de
codificación de endoglucanasa 5 de Humicola insolens. El
recubrimiento de 36 bp entre el promotor y la secuencia codificante
permitió la fusión precisa del fragmento de 994 bp que comprende el
promotor Cel7A de Trichoderma reesei al fragmento de 918 bp
que comprende el marco de lectura abierto de endoglucanasa 5 de
Humicola insolens.
Las reacciones de amplificación (50 \mul)
fueron compuestas de tampón de reacción 1X Thermopol, 0,3 mM dNTPs,
1 \mul del fragmento purificado de PCR de 998 bp, 0,3 \muM de
cebador TrCBH1pro-F, 0,3 \muM de cebador
TrCBH1pro-R-recubrimiento y 2
unidades de polimerasa Vent. Las reacciones fueron incubadas en un
Eppendorf Mastercycler 5333 programado de la siguiente manera: 5
ciclos cada uno durante 30 segundos a 94ºC, 30 segundos a 50ºC, y 60
segundos a 72ºC, seguidos de 25 ciclos cada uno durante 30 segundos
a 94ºC, 30 segundos a 65ºC y 120 segundos a 72ºC (extensión final de
5 minutos). Los productos reactivos fueron aislados en un gel de
agarosa al 1,0% usando tampón TAE donde una banda de producto de
1017 bp fue cortada del gel y purificada usando un equipo de
extracción de gel QIAquick según las instrucciones del
fabricante.
El fragmento de PCR del promotor de
celobiohidrolasa 1 Cel7A de Trichoderma reesei de 1017 bp y
el fragmento de PCR de endoglucanasa 5 de Humicola insolens
de 945 bp fueron usados como ADN molde para la amplificación
posterior usando los siguientes cebadores para fusionar precisamente
el promotor de celobiohidrolasa 1 Cel7A de Trichoderma reesei
de 994 bp a la región de codificación de endoglucanasa 5 de
Humicola insolens de 918 pb usando la PCR de
superposición.
TrCBHIpro-F:
- 5'-AAACGTCGACCGAATGTAGGATTGTTATC-3'
- (SEC ID N.º 24)
\vskip1.000000\baselineskip
HiEGV-R:
- 5'-CTGCAGAATTCTACAGGCACTGATGGTACCAG-3'
- (SEC ID N.º 25)
\vskip1.000000\baselineskip
Las reacciones de amplificación (50 \mul)
fueron compuestas de tampón de reacción 1X Thermopol, 0,3 mM de
dNTPs, 0,3 \muM de cebador TrCBH1pro-F, 0,3 \muM
cebador HiEGV-R y 2 unidades de polimerasa Vent. Las
reacciones fueron incubadas en un Eppendorf Mastercycler 5333
programado de la siguiente manera: 5 ciclos cada uno durante 30
segundos a 94ºC, 30 segundos a 50ºC, y 60 segundos a 72ºC, seguidos
de 25 ciclos cada uno durante 30 segundos a 94ºC, 30 segundos a 65ºC
y 120 segundos a 72ºC (extensión final de 5 minutos). Los productos
reactivos fueron aislados en un gel de agarosa al 1,0% usando tampón
TAE donde una banda de producto de 1926 bp fue cortada del gel y
purificada usando un equipo de extracción de gel QIAquick según las
instrucciones del fabricante.
El fragmento de 1926 bp resultante fue clonado
en el vector
pCR-Blunt-11-TOPO
(Invitrogen, Carlsbad, CA) usando un equipo de clonación de PCR
ZeroBlunt TOPO siguiendo el protocolo del fabricante. El plásmido
resultante fue digerido con NotI y SalI y el fragmento
de 1926 bp fue purificado y ligado en pMJ04, que también fue
digerido con las mismas dos enzimas de restricción, para generar
pMJ05 (figura 6).
\vskip1.000000\baselineskip
La región de codificación de
beta-glucosidasa de Aspergillus oryzae (WO
2002/095014, E. coli DSM 14240, menos la secuencia señal
putativa, véase la figura 7, SEC ID Nos: 26 y 27) de
Lys-20 al codón de parada TAA fue amplificado por
PCR de pJaL660 (WO 2002/095014) como molde con cebador 993728
(sentido) y cebador 993727 (antisentido) que se muestra a
continuación. Las secuencias en cursiva son homólogas a la secuencia
señal de endoglucanasa 5 de Humicola insolens de 20 pb y las
secuencias subrayadas son homólogas a la región de codificación de
beta-glucosidasa de Aspergillus oryzae de 22
bp. Un sitio SpeI fue creado genéticamente en el extremo 5'
del cebador antisentido.
Cebador 993728:
- 5'-TGCCGGTGTTGGCCCTTGCC AAGGATGATCTCGCGTACTCCC-3'
- (SEC ID N.º 28)
\vskip1.000000\baselineskip
Cebador 993727:
- 5'-GACTAGTCTTACTGGGCCTTAGGCAGCG-3'
- (SEC ID Nº: 29)
\vskip1.000000\baselineskip
Las reacciones de amplificación (50 \mul)
fueron compuestas de tampón de amplificación Pfx, 0,25 mM de
dNTPs, 10 ng/\mul de pJaL660, 6,4 \muM de cebador 993728, 3,2
\muM de cebador 993727, 1 mM de MgCl_{2} y 2,5 unidades de
polimerasa Pfx. Las reacciones fueron incubadas en un
Eppendorf Mastercycler 5333 programado de la siguiente manera: 30
ciclos cada uno durante 60 segundos a 94ºC, 60 segundos a 55ºC y 180
segundos a 72ºC (extensión final de 15 minutos). Los productos
reactivos fueron aislados en un gel de agarosa al 1,0% usando tampón
TAE donde una banda de producto de 2523 bp fue cortada del gel y
purificada usando un equipo de extracción de gel QIAquick según las
instrucciones del fabricante.
Se realizó una amplificación con PCR separada
para amplificar 1000 bp del promotor de celobiohidrolasa 1 Cel7A de
Trichoderma reesei y 63 bp de la secuencia señal de
endoglucanasa 5 de Humicola insolens putativa (codón de
iniciación ATG a Ala-21, figura 8, SEC ID Nos: 30
(secuencia de ADN) y 31 (secuencia de amino ácido deducido); n.º de
acceso AAB03660 para la secuencia de ADN), usando cebador 993724
(sentido) y cebador 993729 (antisentido) mostrados a continuación.
Las secuencias de cebador en cursiva son homólogas a 20 bp de la
secuencia señal de endoglucanasa 5 de Humicola insolens y las
secuencias de cebador subrayadas son homólogas a 22 bp de la región
de codificación de beta-glucosidasa de
Aspergillus oryzae. El plásmido pMJ05, que comprende la
región de codificación de endoglucanasa 5 de Humicola
insolens bajo el control del promotor de celobiohidrolasa 1
Cel7A de Trichoderma reesei, fue usado como un molde para
generar un fragmento de 1063 bp que comprende el promotor de
celobiohidrolasa 1 Cel7A de Trichoderma reesei/el fragmento
de secuencia señal de endoglucanasa 5 de Humicola insolens.
Un recubrimiento de 42 bp fue compartido entre el promotor Cel7A de
Trichoderma reesei/la secuencia señal de endoglucanasa 5 de
Humicola insolens y la secuencia de codificación de
Aspergillus oryzae para proporcionar una unión perfecta entre
el promotor y el codón de iniciación ATG de
beta-glucosidasa de Aspergillus oryzae de
2523 bp.
Cebador 993724:
- 5'-ACGCGTCGACCGAATGTAGGATTGTTATCC-3'
- (SEC ID N.º 32)
\vskip1.000000\baselineskip
Cebador 993729:
- 5'-GGGAGTACGCGAGATCATCCTT GGCAAGGGCCAACACCGGCA-3'
- (SEC ID N.º 33)
\vskip1.000000\baselineskip
Las reacciones de amplificación (50 \mul)
fueron compuestas de tampón de amplificación Pfx, 0.25 mM de dNTPs,
10 ng/\mul de pMJ05, 6.4 \muM de cebador 993728, 3.2 \muM de
cebador 993727, 1 mM MgCl_{2}, y 2.5 unidades de polimerasa Pfx.
Las reacciones fueron incubadas en un Eppendorf Mastercycler 5333
programado de la siguiente manera: 30 ciclos cada uno durante 60
segundos a 94ºC, 60 segundos a 60ºC y 240 segundos a 72ºC (extensión
final de 15 minutos) Los productos reactivos fueron aislados en un
gel de agarosa al 1,0% usando tampón TAE donde una banda de producto
de 1063 bp fue cortada del gel y purificada usando un equipo de
extracción de gel QIAquick según las instrucciones del
fabricante.
Los fragmentos de superposición purificados
fueron usados como un molde para la amplificación usando el cebador
993724 (sentido) y el cebador 993727 (antisentido) anteriormente
descritos para fusionar precisamente el promotor de celobiohidrolasa
1 Cel7A de Trichoderma reesei de 1063 bp/el fragmento de
secuencia señal de endoglucanasa V5 de Humicola insolens a
los 2523 bp de beta-glucosidasa de Aspergillus
oryzae por PCR de superposición.
Las reacciones de amplificación (50 \mul)
fueron compuestas de tampón de amplificación Pfx, 0,25 mM dNTPs,
6,4 \muM cebador 993724, 3,2 \muM cebador 993727, 1 mM
MgCl_{2} y 2,5 unidades de polimerasa Pfx. Las reacciones fueron
incubadas en un Eppendorf Mastercycler 5333 programado de la
siguiente manera: 30 ciclos cada uno durante 60 segundos a 94ºC, 60
segundos a 60ºC y 240 segundos a 72ºC (extensión final de 15
minutos). Los productos reactivos fueron aislados en un gel de
agarosa al 1,0% usando tampón TAE donde una banda de producto de
3591 bp fue cortada del gel y purificada usando un equipo de
extracción de gel QIAquick según las instrucciones del
fabricante.
El fragmento de 3591 bp resultante fue digerido
con SalI y SpeI y ligado en pMJ04 digerido con las
mismas enzimas de restricción para generar pSMai135 (figura 9).
\vskip1.000000\baselineskip
El plásmido pSMai135 que codifica la enzima de
beta-glucosidasa de Aspergillus oryzae
madura, vinculado a la señal de secreción de endoglucanasa 5 de
Humicola insolens (figura 8, SEC ID Nos: 30 (secuencia de
ADN) y 31 (secuencia de aminoácidos deducida), fue introducido en
RutC30 de Trichoderma reesei por transformación mediada por
PEG. El plásmido de expresión contiene el gen amdS de
Aspergillus nidulans para permitir que los transformantes se
desarrollen en acetamida como la única fuente de nitrógeno.
La preparación de protoplasto y la
transformación fue realizada usando un protocolo modificado por
Penttila et al., 1987, Gene 61: 155-164.
Brevemente, RutC30 de Trichoderma reesei fue cultivada a 27ºC
y 90 r.p.m. en 25 ml de medio YP suplementado con 2% (p/v) de
glucosa y 10 mM de uridina durante 17 horas. Los micelios fueron
recogidos por filtración usando el sistema de filtración desechable
impulsado por vacío Millipore (Millipore, Bedford, MA) y lavados dos
veces con agua desionizada y dos veces con 1,2 M de sorbitol. Los
protoplastos fueron generados suspendiendo los micelios lavados en
20 ml de 1,2 M de sorbitol con 15 mg de Glucanex (Novozymes A/S,
Bagsværd, Dinamarca) por ml y 0,36 unidades de quitinasa (Sigma
Chemical Co., St. Louis, MO) por ml e incubandos durante
15-25 minutos a 34ºC con agitación suave a 90 r.p.m.
Los protoplastos fueron recogidos por centrifugado durante 7 minutos
a 400 x g y lavados dos veces con 1,2 M de sorbitol frío. Los
protoplastos fueron contados usando un hemacitómetro y resuspendidos
en STC a una concentración final de 1 X 10^{8} protoplastos por
ml. Los protoplastos de exceso fueron almacenados en un contenedor
de congelación Cryo 1ºC (Nalgene, Rochester, NY) a -80ºC.
Se agregaron aproximadamente 7 \mug de
pSMai135 digerido con PmeI a 100 \mul de solución de
protoplasto y se mezcló suavemente, seguido de 260 \mul de tampón
PEG, se mezcló e incubó a temperatura ambiente durante 30 minutos.
Luego se agregó STC (3 ml), se mezcló y la solución de
transformación fue colocada en placas COVE usando selección de
amdS de Aspergillus nidulans. Las placas fueron
incubadas a 28ºC durante 5-7 días. Los
transformantes fueron subcultivados sobre placas COVE2 y se
desarrollaron a 28ºC.
Sesenta y siete transformantes
(SMA135-01 a SMA135-67) conteniendo
el gen de beta-glucosidasa de Aspergillus
oryzae fueron seleccionados de forma aleatoria y cultivados en
frascos de agitación de 125 ml disipados conteniendo 25 ml de medios
de inducción de celulasa a 28ºC y 200 r.p.m. durante 7 días. RutC30
de Trichoderma reesei fue probada como un control. Las
muestras de caldo de cultivo fueron eliminadas 7 días después de la
inoculación, centrifugadas a 15.700 x g durante 5 minutos en un
micro-centrifugador y los sobrenadantes fueron
transferidos a tubos nuevos. Las muestras fueron almacenadas a 4ºC
hasta el ensayo enzimático. Los sobrenadantes fueron evaluados en
cuanto a la actividad de beta-glucosidasa usando
P-nitrofenil-beta-D-glucopiranósido
como sustrato, como se describió anteriormente.
Varios transformantes SMA135 mostraron
actividades de beta-glucosidasa varias veces más que
RutC30 de Trichoderma reesei. El transformante
SMA135-04 produjo la actividad de
beta-glucosidasa más alta con 7 veces más actividad
de beta-glucosidasa que la producida por RutC30 de
Trichoderma reesei como un control.
La electroforesis en poliacrilamida SDS se
efectuó usando el geles de Criterion Tris-HCl
(resolución del 5%) (BioRad, Hercules, CA) con The Criterion System
(BioRad, Hercules, CA). Cinco \mul de sobrenadantes del día 7
(véase más arriba) fueron suspendidos en 2X concentración de tampón
de muestra Laemmli (BioRad, Hercules, CA) y hervidos durante 3
minutos en presencia de betamercaptoetanol al 5%. Las muestras de
sobrenadantes fueron cargadas sobre un gel de poliacrilamida y
sometidas a electroforesis con 1 X tris/Glicina/SDS como tampón de
desplazamiento (BioRad, Hercules, CA). El gel resultante fue
manchado con Bio-Safe Coomassie Stain de BioRad.
Veintiséis de los 67 transformantes de
Trichoderma reesei SMA135 produjeron una proteína de
aproximadamente 110 kDa que no fue visible en la cepa huésped,
RutC30 de Trichoderma reesei. El transformante de
Trichoderma reesei, SMA135-04, produjo el
nivel máximo de beta-glucosidasa.
\vskip1.000000\baselineskip
La fermentación fue realizada en la cepa de
Trichoderma reesei SMA135-04 para producir
cantidades de beta-glucosidasa de Aspergillus
oryzae. RutC30 de Trichoderma reesei (cepa huésped) fue
probada como un control. Las fermentaciones fueron realizadas usando
las condiciones estándares como describen Mandels y Weben, 1969,
Adv. Chem. Ser. 95: 391-413) en celulosa al 2%. Las
fermentaciones se produjeron durante 165 horas, tiempo en el que los
caldos de fermentación finales fueron centrifugados y los
sobrenadantes fueron almacenados a -20ºC hasta el ensayo de
actividad de beta-glucosidasa usando el
procedimiento descritos anteriormente.
Se determinó que la actividad de
beta-glucosidasa en la muestra de fermentación
SMA135-04 de Trichoderma reesei fue
aproximadamente 8 veces más activa que la de RutC30 de
Trichoderma reesei.
\vskip1.000000\baselineskip
Se realizó una búsqueda Blast (Altschul et
al., 1997, Nucleic Acids Res. 25: 3389-3402) de
la secuencia de genoma parcial de Aspergillus fumigatus (The
Institute for Genomic Research, Rockville, MD) usando como pregunta
una secuencia de proteína de beta-glucosidasa de
Aspergillus aculeatus (nº. de acceso P48825). Diferentes
genes fueron identificados como homólogos de familia GH3A putativos
sobre la base de un alto grado de similitud a la secuencia de
pregunta en el nivel de aminoácidos. Se escogió una región genómica
de aproximadamente 3000 bp con más del 70% de identidad a la
secuencia de pregunta en el nivel de aminoácidos para estudio
adicional.
\vskip1.000000\baselineskip
Aspergillus fumigatus fue cultivada en
250 ml de medio de dextrosa de patata en un matraz vibrante disipado
a 37ºC y 240 r.p.m. Los micelios fueron recogidos por filtración,
lavados dos veces en TE (10 mM Tris-1 mM EDTA) y
congelados bajo nitrógeno líquido. Los micelios congelados fueron
molidos, con mortero y mano de mortero, y convertidos a un polvo
fino, que fue resuspendido en tampón pH 8,0 con 10 mM de Tris, 100
mM de EDTA, Tritón X-100 al 1%, 0,5 M de
guanidina-HCl y 200 mM de NaCl. Se agregó RNasa A
libre de Dnasa a una concentración de 20 mg/litro y el lisado fue
incubado a 37ºC durante 30 minutos. El detrito celular fue eliminado
por centrifugación y el ADN fue aislado usando una columna Qiagen
Maxi 500 (QIAGEN Inc., Chatswort, CA). Las columnas fueron
equilibradas en 10 ml de QBT, lavadas con 30 ml de QC y eluidas con
15 ml de QF (todos los tampones de QIAGEN Inc., Chatsworth, CA). El
ADN fue precipitado en isopropanol, lavado en etanol al 70% y
recuperado por centrifugación. El ADN fue resuspendido en tampón
TE.
\vskip1.000000\baselineskip
El gen amdS de pAILo1 (ejemplo 1) fue
cambiado con el gen pyrG de Aspergillus nidulans. El
plásmido pBANe10 (figura 11) fue usado como una fuente para el gen
pyrG. El análisis de la secuencia de pBANe10 mostró que el
marcador pyrG fue contenido dentro de un fragmento de
restricción NsiI y no contiene sitios de restricción
NcoI ni PacI. Ya que el amdS también es
flanqueado por sitios de restricción NsiI, la estrategia de
cambiar el marcador de selección fue un simple intercambio de
fragmentos de restricción de NsiI. El ADN plásmido de pAILo1
y pBANe10 fue digerido con la enzima de restricción NsiI y
los productos fueron purificados por electroforesis en gel de
agarosa usando procedimientos estándares. El fragmento NsiI
de pBANe10 con el gen pyrG fue ligado a la estructura de
pAILo1 para reemplazar el fragmento de ADN de NsiI original
con el gen amdS. Se analizaron los clones recombinantes por
digestión de restricción para determinar si los mismos tenían el
inserto correcto y la orientación correcta. Se seleccionó un clon
con el
gen pyrG transcrito en el sentido contrario a las agujas del reloj. El plásmido nuevo fue designado pAILo2 (figura 12).
gen pyrG transcrito en el sentido contrario a las agujas del reloj. El plásmido nuevo fue designado pAILo2 (figura 12).
\vskip1.000000\baselineskip
Dos cebadores oligonucleótidos sintéticos
mostrados más abajo fueron diseñados para amplificar por PCR un gen
de Aspergillus fumigatus que codifica una
beta-glucosidasa de la familia GH3A del ADN genómico
preparado en el ejemplo 9. Se utilizó un equipo de clonación
InFusion (BD Biosciences, Palo Alto, CA) para clonar el fragmento
directamente en el vector de expresión, pAILo2, sin la necesidad de
digestiones de restricción y ligadura.
| Cebador directo: | 5'-ACTGGATTTACCATGAGATTCGGTTGGCTCG-3' | (SEC ID N.º 34) |
| Cebador inverso: | 5'-AGTCACCTCTAGTTACTAGTAGACACGGGGC-3' | (SEC ID N.º 35) |
\vskip1.000000\baselineskip
Las letras en negrita representan la secuencia
codificante. La secuencia restante es homóloga a los sitios de
inserción de pAILo2.
Cincuenta picomoles de cada uno de los cebadores
indicados anteriormente fueron usados en una reacción por PCR con
100 ng de ADN genómico de Aspergillus fumigatus, tampón de
amplificación 1X Pfx (Invitrogen, Carlsbad, CA), 1,5 \mul de 10 mM
mezcla de dATP, dTTP, dGTP y dCTP, 2,5 unidades de ADN polimerasa
Platinum Pfx (Invitrogen, Carlsbad, CA), 1 \mul de 50 mM
MgSO_{4} y 2,5 \mul de 10X pCRx solución intensificadora
(Invitrogen, Carlsbad, CA) en un volumen final de 50 \mul. Las
condiciones de amplificación fueron un ciclo a 94ºC durante 2
minutos; 30 ciclos cada uno a 94ºC durante 15 segundos, 55ºC durante
30 segundos y 68ºC durante 3 minutos. El bloque de calor luego pasó
a un ciclo de remojo a 4ºC.
Los productos reactivos fueron aislados en un
gel de agarosa al 1,0% usando tampón TAE donde una banda de producto
de 3 kb fue cortada del gel y purificada usando un equipo de
extracción de gel QIAquick según las instrucciones del
fabricante.
El fragmento luego fue clonado en el vector de
expresión pAILo2 usando un equipo de clonación InFusion. El vector
fue digerido con endonucleasas de restricción NcoI y
PacI (usando las condiciones especificadas por el
fabricante). El fragmento fue purificado por electroforesis en gel y
el equipo de extracción de gel QIAquick. El fragmento de gen y el
vector digerido fueron ligados en una reacción dando como resultado
el plásmido de expresión pEJG97 (figura 13) en el que la
transcripción del gen de beta-glucosidasa de familia
GH3A estuvo bajo el control del promotor NA2-tpi. La
reacción de ligadura (50 \mul) estuvo compuesta de 1X tampón
InFusión (BD Biosciences, Palo Alto, CA), 1X BSA (BD Biosciences,
Palo Alto, CA), 1 \mul de enzima InFusión (diluida 1:10) (BD
Biosciences, Palo Alto, CA), 150 ng de pAILo2 digerido con NcoI y
PacI, y 50 ng de producto purificado con PCR de
beta-glucosidasa de Aspergillus fumigatus. La
reacción fue incubada a temperatura ambiente durante 30 minutos. Un
\mul de la reacción fue usado para transformar células Solopac
Gold XL10 de E. coli (Stratagene, La Jolla, CA). Un
transformante de E. coli con el plásmido pEJG97 fue detectado
por digestión de restricción y el ADN plásmido fue preparado usando
un Biorobot 9600 (QIAGEN Inc., Chatsworth, CA).
\vskip1.000000\baselineskip
La secuenciación del ADN del gen de
beta-glucosidasa de Aspergillus fumigatus de pEJG97
fue realizada con un secuenciador de ADN automatizado modelo 377 XL
de Perkin-Elmer Applied Biosystems
(Perkin-Elmer/Applied Biosystems, Inc., Foster City,
CA) usando la química de terminador de coloración (Giesecke et
al., 1992, Journal of Virology Methods 38:
47-60) y estrategia de paseo de cebador. Los datos
de la secuencia de nucleótidos fueron analizados en detalle en
cuanto a la calidad y se compararon todas las secuencias entre sí
con asistencia del software PHRED/PHRAP (Universidad de Washington,
Seattle, WA).
Se construyó un modelo de gen para la secuencia
Aspergillus fumigatus sobre la base de la similitud con genes
homólogos de Aspergillus aculeatus, Aspergillus niger y
Aspergillus kawachii. La secuencia de nucleótidos (SEC ID N.º
36) y la secuencia de aminoácidos deducida (SEC ID N.º 37) se
muestran en la figura 10. El fragmento genómico codifica un
polipéptido de 863 aminoácidos, interrumpido por 8 intrones de 62,
55, 58, 63, 58, 58, 63 y 51 bp. El contenido %G+C del gen es 54,3%.
Usando el programa de software SignalP (Nielsen et al., 1997,
Protein Engineering 10: 1-6), se predijo un péptido
señal de 19 residuos. La proteína madura predicha contiene 844
aminoácidos con una masa molecular de 91,7 kDa.
Se determinó una alineación comparativa de
secuencias de beta-glucosidasa usando el método de
Clustal W (Higgins, 1989, CABIOS 5: 151-153) usando
el software LASERGENET^{TM} MEGALIGN^{TM} (DNASTAR, Inc.,
Madison, WI) con una tabla de identidad y los siguientes parámetros
de alineación: Penalización de espacio de 10 y penalización de
longitud de espacio de 10. Los parámetros de alineación en pareja
fueron Ktuple=1, penalización de espacio=3, ventanas=5 y
diagonales=5. La alineación mostró que la secuencia de aminoácidos
deducida del gen de beta-glucosidasa de
Aspergillus fumigatus compartió 78%, 76%, y 76% de identidad
con las secuencias de aminoácidos deducidas de las
beta-glucosidasas de Aspergillus aculeatus
(número de acceso P48825), Aspergillus niger (número de
acceso 000089) y Aspergillus kawachii (número de acceso
P87076).
\vskip1.000000\baselineskip
Los protoplastos de JaL250 de Aspergillus
oryzae fueron preparados según el método de Christensen et
al., 1988, Bio/Technology 6: 1419-1422. Se
utilizaron cinco \mug de pEJG97 (así como pAILo2 como un control
de vector para transformar JaL250 de Aspergillus oryzae.
La transformación de JaL250 de Aspergillus
oryzae con pEJG97 produjo aproximadamente 100 transformantes.
Diez transformantes fueron aislados en placas de PDA
individuales.
Las placas PDA confluentes de cinco de los diez
transformantes fueron lavadas con 5 ml de Tween 20 al 0,01% e
inoculadas separadamente en 25 ml de medio MDU2BP en frascos de
agitación de vidrio de 125 ml e incubadas a 34ºC, 250 r.p.m. Cinco
días después de la incubación, se analizaron 0,5 \mul del
sobrenadante de cada cultivo usando geles SDS-PAGE
de tris-glicina al 8-16%
(Invitrogen, Carlsbad, CA) según las instrucciones del fabricante.
Los perfiles de SDS-PAGE de los cultivos mostraron
que uno de los transformantes (designado transformante 1) tuvo una
banda más importante de aproximadamente 130 kDa.
\global\parskip0.900000\baselineskip
Una placa confluente del transformante 1
(cultivado en PDA) fue lavado con 10 ml de Tween 20 al 0,01% e
inoculada en un 2 litro de Fernbach con 400 ml de medio MDU2BP para
generar caldo para caracterización de la enzima. El matraz fue
recogido el día 5 y filtrado usando una membrana GP Express de 0,22
\mum (Millipore, Bedford, MA).
Antes de los experimentos de hidrólisis, la
beta-glucosidasa de Aspergillus oryzae
(producida por recombinación en Aspergillus oryzae) fue
desalada y cambiada a tampón acetato sódico 50 mM pH 5,0, usando un
filtro por centrifugación Centricon Plus-20 con
membrana Biomax-5 (5000 NMWL; Millipore, Bedford,
MA).
\vskip1.000000\baselineskip
El vector pMJ06 fue construido amplificando por
PCR el promotor de gen de celobiohidrolasa 1 Cel7A de
Trichoderma reesei (cbh1) del ADN genómico de RutC30 de
Trichoderma reesei usando cebadores 993696 (antisentido) y
993695 (sentido) mostrados más abajo. El cebador antisentido fue
creado genéticamente para tener un sitio Sal I en el extremo 5' del
cebador sentido y un sitio NcoI en el extremo 5' del cebador
antisentido.
Cebador 993695 (sentido):
- 5'-ACTAGTCGACCGAATGTAGGATTGTT-3'
- (SEC ID N.º 38)
\vskip1.000000\baselineskip
Cebador 993696 (antisentido):
- 5'-TGACCATGGTGCGCAGTCC-3'
- (SEC ID N.º 39)
\vskip1.000000\baselineskip
Las reacciones de amplificación (50 \mul)
fueron compuestas de 1X tampón de reacción ThermoPol, 0,3 mM dNTPs,
100 ng de ADN genómico de RutC30 de Trichoderma reesei (que
fue preparado usando un equipo QIAGEN DNeasy Plant Maxi), 0,3 \muM
de cebador 993696, 0,3 \muM de cebador 993695 y 2 unidades de
polimerasa Vent. Las reacciones fueron incubadas en un Eppendorf
Mastercycler 5333 programado de la siguiente manera: 30 ciclos cada
uno durante 30 segundos a 94ºC, 30 segundos a 55ºC y 60 segundos a
72ºC (extensión final de 15 minutos).
Los productos reactivos fueron aislados en un
gel de agarosa al 1.0% usando tampón TAE donde una banda de producto
de 988 bp fue cortado del gel y purificado usando un equipo de
extracción de gel QIAGEN QIAquick según las instrucciones del
fabricante.
El fragmento de PCR resultante fue digerido con
NcoI y SalI y ligado en pMJ04 digerido con las mismas
enzimas de restricción, usando un equipo de ligadura rápida, para
generar pMJ06 (figura 14).
El vector de expresión pMJ09 fue construido
amplificando por PCR el terminador del gen de celobiohidrolasa 1
Cel7A de Trichoderma reesei (cbh1) de ADN genómico de
RutC30 de Trichoderma reesei usando cebadores 993843
(antisentido) y 99344 (sentido) mostrados más abajo. El cebador
antisentido fue creado genéticamente para tener un sitio PacI
y un sitio SpeI en el extremo 5' y un sitio PvuI en el
extremo 5' del cebador sentido.
Cebador 993844 (sentido):
- 5'-CGATCGTCTCCCTATGGGTCATTACC-3'
- (SEC ID N.º 40)
\vskip1.000000\baselineskip
Cebador 993843 (antisentido):
- 5'-ACTAGTTAATTAAGCTCCGTGGCGAAAG-3'
- (SEC ID N.º 41)
\vskip1.000000\baselineskip
Las reacciones de amplificación (50 \mul)
fueron compuestos de 1X tampón de reacción ThermoPol, 0,3 mM de
dNTPs, 100 ng de ADN genómico de RutC30 de Trichoderma reesei
(que fue extraído usando un equipo QIAGEN DNeasy Plant Maxi), 0,3
\muM de cebador 993844, 0,3 \muM de cebador 993843 y 2 unidades
de polimerasa Vent. Las reacciones fueron incubadas en un Eppendorf
Mastercycler 5333 programado de la siguiente manera: 30 ciclos cada
uno durante 30 segundos a 94ºC, 30 segundos a 55ºC y 60 segundos a
72ºC (extensión final de 15 minutos).
Los productos reactivos fueron aislados en un
gel de agarosa al 1,0% usando tampón TAE donde una banda de producto
de 473 bp fue cortada del gel y purificada usando un equipo de
extracción de gel QIAGEN QIAquick según las instrucciones del
fabricante.
El fragmento de PCR resultante fue digerido con
PvuI y SpeI y ligado en pMJ06, digerido con
PacI y SpeI usando un equipo de ligadura rápida, para
generar pMJ09 (figura 15).
\global\parskip1.000000\baselineskip
Dos cebadores oligonucleótidos sintéticos
mostrados más abajo fueron diseñados para amplificar por PCR un gen
de Trichoderma reesei que codifica una endoglucanasa de
familia 7 putativa de ADNc obtenido a partir de RutC30 de
Trichoderma reesei usando un equipo de células a ADNc
(Ambion, Austin, TX) según las instrucciones del fabricante.
| Cebador directo: | 5'-CTTCACCATGGCGCCCTCAGTTACACTGC-3' | (SEC ID N.º 42) |
| Cebador inverso: | 5'-GCCGTTAATTAAGGCAAGTCAACGCTCTAAAGG-3' | (SEC ID N.º 43) |
\vskip1.000000\baselineskip
Se utilizaron cincuenta picomoles de cada uno de
los cebadores mencionados en una reacción de PCR con 100 ng de ADNc
de Trichoderma reesei, 1X tampón de amplificación Pwo (Roche,
Indianápolis, IN), 4 \mul de 10 mM de mezcla de dATP, dTTP, dGTP y
dCTP y 2.5 unidades de ADN-polimerasa Pwo (Roche,
Indianápolis, IN) en un volumen final de 50 \mul. Las condiciones
de amplificación fueron 1 ciclo a 94ºC durante 2 minutos; 35 ciclos
cada a 94ºC durante 15 segundos, 55ºC durante 30 segundos y 72ºC
durante 2 minutos. El bloque de calor luego pasó a un ciclo de
remojo a 4ºC.
Los productos reactivos fueron aislados en un
gel de agarosa al 1,0% usando tampón TAE donde una banda de producto
de 1,5 kb fue cortada del gel y purificada usando un equipo de
extracción de gel QIAquick (QIAGEN Inc., Chatswort, CA) según las
instrucciones del fabricante.
El fragmento luego fue clonado en pAILo2. El
fragmento y el vector fueron digeridos con NcoI y
PacI, y luego fueron purificados por electroforesis en gel y
purificación de gel QIAquick. El fragmento de gen y el vector
digeridos fueron ligados en una reacción dando como resultado el
plásmido de expresión pJZHEG1 (figura 16) en el que la transcripción
del gen eg1 estuvo bajo el control del promotor TAKA. La
reacción de ligadura (40 de \mul) fue compuesta por 1X tampón de
unión (Roche, Indianápolis, IN), 1X tampón de dilución de ADN
(Roche, Indianápolis, IN), 5,0 unidades enzimáticas de T4
ADN-ligasa (Roche, Indianápolis, IN), 100 ng de
pAILo2 digerido con NcoI y PacI, y 100 ng del producto
de PCR eg1 de Trichoderma reesei. La reacción fue
incubada a temperatura ambiente durante 30 minutos. Un \mul de la
reacción fue usado para transformar células Solopac Gold XL10 de
E. coli (Stratagene, La Jolla, CA). Un transformante de E.
coli con el plásmido pJZHEG1 fue detectado por digestión de
restricción y el ADN plásmido fue preparado usando un BioRobot 9600
(QIAGEN Inc., Chatsworth, CA).
La secuenciación del ADN del eg1 de
Trichoderma reesei de pJZHEG1 fue realizada con un
secuenciador de ADN automatizado modelo 377 XL de
Perkin-Elmer Applied Biosystems
(Perkin-Elmer/Applied Biosystems, Inc., Foster City,
CA) usando química de terminador de coloración según las
instrucciones del fabricante. Los datos de la secuencia de
nucleótidos fueron analizados en detalle en cuanto a la calidad y se
compararon todas las secuencias entre sí con asistencia del software
PHRED/PHRAP (Universidad de Washington, Seattle, WA). Una alineación
comparativa de la secuencia eg1 fue determinada usando el
método de Clustal W (Higgins, 1989, CABIOS 5:
151-153) con el software Vector NTI (InfoMax, San
Francisco, CA). La alineación indicó que la secuencia de aminoácido
deducida del gen eg1 de Trichoderma reesei es idéntica
a la secuencia de aminoácidos deducida del EG1 de Trichoderma
reesei (número de acceso AAA34212, Penttila et al., 1986,
Gene 45: 253-263).
Los protoplastos JaL250 de Aspergillus
oryzae fueron preparados según el método de Christensen et
al., 1988, supra. Se utilizaron cinco \mug de pJZHEG1
(así como pAILo2 como un control de vector) para transformar JaL250
de Aspergillus oryzae.
La transformación de JaL250 de Aspergillus
oryzae con pJZHEG1 produjo aproximadamente 40 transformantes por
\mug de ADN. Veinte transformantes fueron aislados en placas PDA
individuales. Cada placa fue lavada con 5 ml de Tween 20 al 0,01% e
inoculada separadamente en 25 ml de medio MDU2BP en frascos de
agitación de vidrio de 125 ml e incubada a 34ºC, 250 r.p.m. Cinco
días después de la incubación, se analizaron 0,5 \mul del
sobrenadante de cada cultivo usando geles SDS-PAGE
de tris-glicina al 8-16%
(Invitrogen, Carlsbad, CA) según las instrucciones del fabricante.
Los perfiles de SDS-PAGE de los cultivos mostraron
que uno de los transformantes (designado transformante 9) tuvo una
banda más importante de aproximadamente 58 kDa.
Una placa confluente de transformante 9
(cultivado en PDA) fue lavada con 10 ml de Tween 20 al 0,01% e
inoculada en un Fernbach de 2 litros con 400 ml de medio MDU2BP para
generar caldo para caracterización de la enzima. El matraz fue
recogido el día 5 y filtrado usando una membrana GP Express de 0,22
\mum (Millipore, Bedford, MA). La actividad de endoglucanasa se
determinó como se describe en la presente.
Antes de los experimentos de hidrólisis, la
endoglucanasa I de Trichoderma reesei (producida por
recombinación en Aspergillus oryzae) fue desalada y cambiada
en tampón acetato sódico 50 mM pH 5,0 usando un filtro por
centrifugación Centricon Plus-20 con membrana
Biomax-5 (5000 NMWL; Millipore, Bedford, MA).
\vskip1.000000\baselineskip
El forraje de maíz fue pretratado en el
Departamento de Energía Estadounidense del Laboratorio de Energía
Nacional Renovable (NREL por sus siglas en ingles) usando ácido
sulfúrico diluido. Se utilizaron las siguientes condiciones para el
pretratamiento: 1,4 peso % ácido sulfúrico a 165ºC y 107 psi durante
8 minutos. Los sólidos insolubles en agua en forraje de maíz
pretratado (PCS) con celulosa al 56,5%, hemicelulosa al 4,6% y
lignina al 28,4%. La celulosa y la hemicelulosa fueron determinadas
por una hidrólisis de ácido sulfúrica de dos etapas con análisis
posterior de azúcares por cromatografía en fase líquida de alto
rendimiento usando procedimiento analítico estándar del NREL n.º
002. La lignina fue determinada gravimétricamente después de
hidrolizar las fracciones de celulosa y hemicelulosa con ácido
sulfúrico usando procedimiento analítico estándar del NREL n.º 003.
Antes de la hidrólisis enzimática, el PCS fue lavado con un volumen
grande de agua DDI en un filtro de vidrio. El peso en seco del PCS
lavado con agua resultó ser 24,54%.
\vskip1.000000\baselineskip
El residuo lignoso fue preparado incubando PCS
al 5% con caldo de fermentación filtrado libre de células de
beta-glucosidasa de Aspergillus oryzae
(producido por recombinación en Trichoderma reesei) a 10 mg
por g de PCS bajo agitación constante en una reacción de 900 ml
durante 6 días a pH 5,0, 50ºC. Después de la hidrólisis, el líquido
hidrolizado fue eliminado por centrifugación a 3836 x g durante 10
minutos, y el residuo enriquecido con lignina sólida fue lavado
cuatro veces con 250 ml de agua desionizada. El residuo luego fue
incubado durante 5 días en 250 ml de agua desionizada bajo agitación
constante a 65ºC para inactivar cualquier enzima adsorbida restante.
Después del lavado adicional con agua desionizada seguida de
centrifugación como se describió anteriormente, se obtuvieron
aproximadamente 100 ml de una suspensión al 15% de residuo lignoso
en agua desionizada.
\vskip1.000000\baselineskip
Alícuotas de veinte \mul fueron eliminadas de
reacciones de hidrólisis PCS en puntos de tiempo específicos usando
una pipeta de 8 canales, y se agregaron a 180 \mul de mezcla
alcalina (102 mM de Na_{2}CO_{3} más 58 mM de NaHCO_{3}) en
una placa de filtración MultiScreen HV de 96 pocillos (Millipore,
Bedford, MA) para terminar la reacción. Las muestras fueron
filtradas al vacío en otra microplaca de fondo plano para eliminar
el residuo de PCS. Después de dilución apropiada, se analizó el
azúcar de reducción (RS) en los filtrados usando ensayo de hidracida
de ácido p-hidroxibenzoico (PHBAH) (Lever M., 1973,
Colorimetric and fluorometric carbohydrate determination with
p-hydroxybenzoic acid hydrazide, Biochemical
Medicine 7: 274-281) en un formato de
microplaca.
Un alícuota de 90 \mul de la muestra diluida
fue colocada en cada pocillo de una microplaca de 96 pocillos de
fondo cónico (Corning Inc., Acton, MA, Costar, policarbonato claro).
El ensayo se inició añadiendo 60 \mul de PHBAH al 1,25% en
hidróxido sódico al 2% a cada pocillo. La placa descubierta fue
calentada en un bloque de calentamiento hecho a medida durante 10
minutos a 95ºC. Después de que la microplaca fuera enfriada a
temperatura ambiente, se agregaron 35 \mul de agua desionizada a
cada pocillo. Se eliminó una alícuota de 100 \mul de cada pocillo
y se transfirió a una placa de 96 posillos de fondo plano (Corning
Inc., Acton, MA, Costar, poliestireno de unión de medio). La
absorbencia a 410 nm (A_{410}) se midió usando un lector de
microplacas SpectraMAX (Molecular Devices, Sunnyvale, CA). El valor
A_{410} se tradujo en equivalentes de glucosa usando una curva
estándar.
La curva estándar se obtuvo con seis estándares
de glucosa (0,005, 0,010, 0,025, 0,050, 0,075 y 0,100 mg/ml), que
fueron tratados de forma similar a las muestras. Los estándares de
glucosa fueron preparados diluyendo 10 mg/ml de solución de glucosa
de materia prima con agua desionizada.
El grado de conversión de celulosa a azúcar de
reducción (rendimiento de hidrólisis, %) se calculó usando la
siguiente ecuación:
rendimiento RS
_{(%)} = RS _{(mg/ml)} * 100 * 162 / (Celulosa _{(mg/ml)} *
180 = = RS_{ (mg/ml)} * 100 / (Celulosa _{(mg/ml)} *
1,111)
En esta ecuación, RS es la concentración de
azúcar de reducción en solución medida en equivalentes de glucosa
(mg/ml) y el factor 1,111 refleja el aumento de peso en la
conversión de celulosa a glucosa.
\vskip1.000000\baselineskip
La hidrólisis de PCS (5% p/v en una base de peso
en seco) por Celluclast 1,5L (2,5, 5, 10, y 20 mg/g PCS)
suplementado con beta-glucosidasa de Aspergillus
oryzae desalada y con tampón cambiado (producida por
recombinación en Aspergillus oryzae) a 0,6 mg por g de PCS se
efectuó en 50 mM de acetato sódico pH 5,0 en un volumen de 10 ml con
agitación intermitente a 50ºC. Las muestras fueron tomadas en puntos
de tiempo diferentes y analizadas en relación a azúcares de
reducción como se describe en el ejemplo 18. Las reacciones con
Celluclast 1,5L a 2,5 y 5 mg por g de PCS fueron suplementadas con
0,5% v/v Softanol® 90 (0,1 ml/g PCS), y los resultados fueron
comparados con reacciones de control sin el tensioactivo.
Los resultados, como se muestra en la tabla 2 y
la figura 17, demostraron que la adición de Softanol® 90 aumentó el
rendimiento de la hidrólisis de azúcares de reducción tras la
incubación durante 125 horas de 70% a 86% para reacciones con 2,5 mg
PCS Celluclast/g (mejora de 23%) y de 83% a 94% para reacciones con
5 mg PCS Celluclast/g (mejora del 14%). Usando Softanol® 90, fue
posible reducir la carga enzimática por un factor de dos en
comparación con reacciones sin el tensioactivo, al tiempo que se
alcanzó el mismo rendimiento de hidrólisis de 125 horas.
\vskip1.000000\baselineskip
\newpage
El ejemplo 19 fue repetido, excepto que se
utilizó Lutensol® AT80 a 0,1 ml/g PCS (0,5% v/v).
Los resultados, como se muestran en la tabla 2 y
la figura 18, demostraron que la adición de Lutensol® AT80 aumentó
el rendimiento de la hidrólisis de 125 horas azúcares de reducción
de 70% a 82% para reacciones con 2,5 mg Celluclast/g PCS (mejora del
17%) y de 83% a 90% para reacciones con 5 mg de Celluclast/g de PCS
(mejora del 9%).
\vskip1.000000\baselineskip
El ejemplo 19 fue repetido, excepto que se
incluyó la carga adicional de Celluclast 1.5L (1,25 mg/g PCS), se
utilizó Softanol® 90 a 0,2 ml/g de PCS (1,0% p/p) y la hidrólisis se
realizó a dos temperaturas, 50ºC y 55ºC. Se añadió Softanol® 90 a
las reacciones con 1,25, 2,5 y 5 mg de Celluclast 1.5L por g de PCS,
y los resultados fueron comparados con reacciones de control sin el
tensioactivo. Los resultados se muestran en la tabla 3 y las Figuras
19 y 20.
A 50ºC, la adición de Softanol® 90 aumentó el
rendimiento de la hidrólisis de 120 horas de azúcares de reducción
en 14-20% en comparación con reacciones sin el
tensioactivo. La figura 19 muestra que en presencia de Softanol® 90,
la carga enzimática podría ser reducida por un factor de dos en
comparación con reacciones sin el tensioactivo mientras se mantiene
el mismo rendimiento de hidrólisis.
A 55ºC, el Softanol® 90 mostró una mejora más
significativa que a 50ºC. La adición de Softanol® 90 a 55ºC aumentó
los rendimientos de la hidrólisis de 120 horas de azúcares de
reducción en 36-59% en comparación con reacciones
sin el tensioactivo. La figura 20 muestra que en presencia de
Softanol®, cargas de enzima cuatro veces inferiores en comparación
con reacciones sin el tensioactivo podrían conseguir rendimientos de
hidrólisis comparables de azúcares de reducción.
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
(Tabla pasa a página
siguiente)
\vskip1.000000\baselineskip
\newpage
El ejemplo 19 fue repetido, excepto que se
agregó Softanol® 90 a PCS 0,05, 0,1, 0,2, 0,3 y 0,4 ml/g PCS a
reacciones con 2 mg de Celluclast 1.5L por g de PCS y se agregó beta
glucosidasa de Aspergillus oryzae desalada y con tampón
cambiado (producida por recombinación en Aspergillus oryzae)
a 3% de carga de Celluclast (0,6 mg/g de PCS).
Los resultados se muestran en la tabla 4 y la
figura 21. La carga óptima de Softanol® 90 resultó ser 0,1 ml por g
de PCS, que correspondió a una concentración de Softanol® 90 de 0.5%
p/p.
\vskip1.000000\baselineskip
El ejemplo 22 fue repetido, excepto que se
agregaron diferentes productos de Softanol®, Softanol® 50, 90, 120 o
200, con grado en aumento de etoxilación y valores de equilibrio
hidrofílico/lipofílico (HLB) en aumento a 0,2 ml por g de PCS (1.0%
v/v) a reacciones con 2 mg de Celluclast 1.5L por g de PCS.
La figura 22 muestra que todos los productos de
Softanol® se comportaron de forma similar, aumentando el rendimiento
de hidrólisis final de azúcares de reducción en
17-30% en comparación con reacciones sin
tensioactivos.
\vskip1.000000\baselineskip
El ejemplo 22 fue repetido, excepto que se
agregó Softanol® 90 a 0,2 ml por g de PCS (1,0% v/v) a reacciones
con Celluclast 1.5L (2 mg/g PCS) suplementadas con beta glucosidasa
de Aspergillus oryzae desalada y con tampón cambiado
(producida por recombinación en Aspergillus oryzae) a 0,06 mg
por g de PCS o a reacciones con caldo de fermentación filtrado libre
de células de Beta-glucosidasa de Aspergillus
oryzae (producidas por recombinación en Trichoderma
reesei) a 2 mg por g de PCS.
Sin Softanol® 90, ambas enzimas se comportaron
de forma similar. La figura 23 muestra que la adición de Softanol®
90 proporcionó un efecto de ascenso comparable para ambas
enzimas.
\vskip1.000000\baselineskip
La celobiohidrolasa I (CBHI) de Trichoderma
reesei fue aislada y purificada a homogeneidad de Celluclast
1.5L usando métodos descritos por Suumäkki et al., 2000,
Cellulose 7: 189-209.
Se realizó la hidrólisis de PCS molido/lavado
con etanol (1% p/v en una base de peso en seco) por CBHI de
Trichoderma reesei purificada (2, 5 y 10 mg/g de PCS) en 50
mM de acetato sódico pH 5,0 en un volumen de 0,5 ml con agitación
intermitente a 40ºC, 50ºC, 55ºC, 60ºC y 65ºC. Las muestras fueron
tomadas en puntos de tiempo diferentes y analizadas en cuanto a
azúcares de reducción como se describe en el ejemplo 18. Las
reacciones con CBHI de Trichoderma reesei a 2 mg/g de PCS
fueron suplementadas con 0,1% v/v Softanol® 90 (0,1 ml/g PCS), y los
resultados fueron comparados con reacciones de control realizadas
sin el tensioactivo.
Los resultados se muestran en la figura 24. A
55ºC, la adición de Softanol® 90 aumentó el rendimiento de la
hidrólisis de 24 horas de azúcares de reducción en 94% en
comparación con la reacción sin el tensioactivo (de 6,1% a 11,9%).
Lograr un rendimiento de hidrólisis comparable en ausencia de
Softanol® 90 requirió carga de enzima 2,5 veces más alta (5 mg/g
PCS).
\vskip1.000000\baselineskip
El ejemplo 25 fue repetido, excepto que se
suplementó CBHI de Trichoderma reesei con
beta-glucosidasa de Aspergillus fumigatus
desalada y con tampón cambiado (producido por recombinación en
Aspergillus oryzae) a 5% de la carga de proteína CBHI (0,1,
0,25 y 0,5 mg/g PCS).
Los resultados, como se muestra en la figura 25,
demostraron que a 55ºC, la adición de Softanol® 90 aumentó el
rendimiento de la hidrólisis de 24 horas de azúcares de reducción en
115% en comparación con la reacción sin el tensioactivo (de 9,8% a
21,1 %). Lograr el rendimiento de hidrólisis comparable en ausencia
de Softanol® 90 requirió carga de enzima 2,5 veces más alta (5 mg/g
PCS).
\vskip1.000000\baselineskip
El ejemplo 25 fue repetido, excepto que se
suplementó CBHI de Trichoderma reesei (2, 5, 10 y 20 mg/g
PCS) con endoglucanasa I de Trichoderma reesei desalada y con
tampón cambiado (EGI; producido por recombinación en Aspergillus
oryzae) a 20% de la carga de proteína CBHI (0,4, 1, 2, y 4 mg/g
PCS) y beta-glucosidasa de Aspergillus
fumigatus desalada y con tampón cambiado (producido por
recombinación en Aspergillus oryzae) a 5% de carga de
proteína CBHI (0,1, 0,25, 0,5 y 1 mg/g de PCS).
Los resultados se muestran en la figura 26. A
55ºC, la adición de Softanol® 90 aumentó el rendimiento de la
hidrólisis de 24 horas de azúcares de reducción en 132% en
comparación con la reacción sin el tensioactivo (de 11,9% a 27,6%).
El rendimiento de la hidrólisis resultante fue superior al obtenido
usando carga de enzima 2,5 veces más alta (5 mg/g de PCS) en
ausencia de Softanol® 90 (27,6% contra 21,3%).
\vskip1.000000\baselineskip
El Ejemplo 27 fue repetido, excepto que se
utilizó endoglucanasa bacteriana, E1cd de Acidothermus
cellulolyticus obtenido de NREL, en vez de endoglucanasa
fúngica, EGI de Trichoderma reesei. E1cd de Acidothermus
cellulolyticus fue expresado de TK24 de Streptomyces
lividans según la patente estadounidense n.º 5.275.944. Una
forma truncada de esta enzima fue producida sometiendo las enzimas
expresadas en Streptomyces lividans a tratamiento
proteolítico para eliminar el dominio de unión a la celulosa (Baker
et al., 1995, en Enzymatic Degradation of Insoluble
Polysaccharides, Saddler, J. N. y Penner, M. H., eds., ACS Series
618, American Chemical Society, Washington, DC,
113-141).
Los resultados, como se muestra en la figura 27,
demostraron que a 55ºC, la adición de Softanol® 90 aumentó el
rendimiento de la hidrólisis de 24 horas de azúcares de reducción en
70% en comparación con la reacción sin el tensioactivo (de 22,2% a
37,7%) El rendimiento de la hidrólisis resultante fue superior al
obtenido usando carga de enzima 2,5 veces más alta (5 mg/g de PCS)
en ausencia de Softanol® 90 (37,7% contra 33%).
\vskip1.000000\baselineskip
La hidrólisis de celulosa microcristalina,
Avicel f101 (1% p/v en una base de peso en seco, FMC Corporation,
Filadelfia, PA) por Celluclast 1.5L (1,25, 2,5, 5, 10, y 20 mg/g
celulosa) suplementada con beta-glucosidasa de
Aspergillus oryzae desalada y con tampón cambiado (producida
por recombinación en Aspergillus oryzae) a 0.6 mg por g de
celulosa se efectuó en 50 mM de acetato sódico pH 5,0 en un volumen
de 1 ml con agitación intermitente a 50ºC. Las muestras fueron
tomadas en puntos de tiempo diferentes y analizadas en cuanto a
azúcares de reducción como se describe en el ejemplo 18. Las
reacciones con Celluclast 1.5L a 1,25, 2,5 y 5 mg/g de celulosa
fueron suplementadas con Softanol® 90 a 0,05, 0,1 y 0,2 ml/g de
celulosa y los resultados fueron comparados con reacciones de
control sin el tensioactivo.
Las muestras de la figura 28 que Softanol® 90 no
tuvo ningún efecto de ascenso significativo en la hidrólisis de
Avicel bajo las condiciones anteriores.
\vskip1.000000\baselineskip
La hidrólisis de PCS molido/lavado con agua (5%
p/v en una base de peso en seco) por caldo de fermentación libre de
células filtrado de beta-glucosidasa de
Aspergillus oryzae (producido por recombinación en
Trichoderma reesei) a 2 mg por g de PCS se efectuó en
presencia de varios tensioactivos no iónicos (0,1 ml/g PCS) como se
muestra en la tabla 5 en un volumen de 2 ml con agitación
intermitente a pH 5,0, 50ºC durante 71 horas. Las muestras fueron
tomadas a puntos de tiempo diferentes y analizadas para azúcares de
reducción como se describe en el ejemplo 18. Los resultados fueron
comparados con una reacción de control sin ningún tensioactivo.
La tabla 5 muestra que la adición de
tensioactivos aumentó el rendimiento de la hidrólisis de 71 horas de
azúcar de reducción de 60% (sin ningún tensioactivo) a
63-72% (mejora de 4-19%).
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
El siguiente material biológico ha sido
depositado según las condiciones del Tratado de Budapest en la
Colección de Cultivos de Patentes del Servicio de Investigaciones
Agrícolas, Centro de Investigaciones Regionales del Norte, 1815
University Street, Peoria, Illinois, 61604, y recibió el siguiente
número de acceso:
- Depósito
- Número de acceso Fecha de depósito
- TOP10 de E. coli (pEJG113) NRRL B-30695
- 17 de octubre de 2003
\vskip1.000000\baselineskip
La cepa ha sido depositada bajo condiciones que
aseguran que el acceso al cultivo estará disponible durante la
pendencia de este pedido de patente a la persona determinada por el
comisario de patentes y marcas registradas con derecho a ello bajo
37 C.F.R. \NAK1.14 y 35 U.S.C. \NAK122. El depósito representa
un cultivo substancialmente puro de la cepa depositada. El depósito
está disponible según sea necesario por leyes de patente extranjeras
en países donde se presenten duplicados de la aplicación en
cuestión, o su descendiente. No obstante, debe entenderse que la
disponibilidad de un depósito no constituye una licencia para
practicar la invención en cuestión en derogación de derechos de las
patentes concedidas por acción gubernamental.
\vskip1.000000\baselineskip
Esta lista de referencias citada por el
solicitante ha sido recopilada exclusivamente para la información
del lector. No forma parte del documento de patente europea. La
misma ha sido confeccionada con la mayor diligencia; la OEP sin
embargo no asume responsabilidad alguna por eventuales errores u
omisiones.
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\hskip-.1em\dddseqskipgtgccccatg atacgcctcc gg
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<213> Aspergillus oryzae
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\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipctatatacac aactggattt accatgggcc cgcggccgca gatc
\hfill44
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 7
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 44
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Aspergillus oryzae
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 7
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipgatctgcggc cgcgggccca tggtaaatcc agttgtgtat atag
\hfill44
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 8
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 29
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Trichoderma reesei
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 8
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipaacgttaatt aaggaatcgt tttgtgttt
\hfill29
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 9
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 29
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Trichoderma reesei
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 9
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipagtactagta gctccgtggc gaaagcctg
\hfill29
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 10
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 31
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Humicola insolens
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 10
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipttgaattgaa aatagattga tttaaaactt c
\hfill31
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 11
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 25
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Humicola insolens
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 11
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipttgcatgcgt aatcatggtc atagc
\hfill25
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 12
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 26
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Saccharomyces cerevisiae
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 12
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipttgaattcat gggtaataac tgatat
\hfill26
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 13
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 32
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Saccharomyces cerevisiae
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 13
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipaaatcaatct attttcaatt caattcatca tt
\hfill32
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 14
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 45
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Aspergillus oryzae
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 14
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipggatgctgtt gactccggaa atttaacggt ttggtcttgc atccc
\hfill45
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 15
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 44
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Aspergillus oryzae
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 15
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipggtattgtcc tgcagacggc aatttaacgg cttctgcgaa tcgc
\hfill44
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 16
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 29
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Humicola insolens
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 16
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipaagcttaagc atgcgttcct cccccctcc
\hfill29
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 17
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 32
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Humicola insolens
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 17
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipctgcagaatt ctacaggcac tgatggtacc ag
\hfill32
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 18
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 32
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Humicola insolens
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 18
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipctgcagaatt ctacaggcac tgatggtacc ag
\hfill32
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 19
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 36
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Humicola insolens
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 19
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipaccgcggact gcgcatcatg cgttcctccc ccctcc
\hfill36
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 20
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 29
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Trichoderma reesei
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 20
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipaaacgtcgac cgaatgtagg attgttatc
\hfill29
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 21
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 17
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Trichoderma reesei
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 21
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipgatgcgcagt ccgcggt
\hfill17
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 22
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 29
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Trichoderma reesei
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 22
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipaaacgtcgac cgaatgtagg attgttatc
\hfill29
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 23
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 36
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Trichoderma reesei
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 23
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipggagggggga ggaacgcatg atgcgcagtc cgcggt
\hfill36
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 24
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 29
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Trichoderma reesei
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 24
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipaaacgtcgac cgaatgtagg attgttatc
\hfill29
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 25
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 32
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Trichoderma reesei
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 25
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipctgcagaatt ctacaggcac tgatggtacc ag
\hfill32
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 26
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 57
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Aspergillus oryzae
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 26
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipatgaagcttg gttggatcga ggtggccgca ttggcggctg cctcagtagt cagtgcc
\hfill57
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 27
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 19
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Aspergillus oryzae
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 27
\hskip1cm
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 28
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 42
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Aspergillus oryzae
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 28
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskiptgccggtgtt ggcccttgcc aaggatgatc tcgcgtactc cc
\hfill42
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 29
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 28
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Aspergillus oryzae
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 29
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipgactagtctt actgggcctt aggcagcg
\hfill28
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 30
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 63
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Humicola insolens
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 30
\vskip1.000000\baselineskip
\hskip1cm
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 31
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 21
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Humicola insolens
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 31
\vskip1.000000\baselineskip
\hskip1cm
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 32
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 30
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Aspergillus oryzae
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 32
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipacgcgtcgac cgaatgtagg attgttatcc
\hfill30
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 33
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 42
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Aspergillus oryzae
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 33
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipgggagtacgc gagatcatcc ttggcaaggg ccaacaccgg ca
\hfill42
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 34
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 31
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Aspergillus fumigatus
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 34
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipactggattta ccatgagatt cggttggctc g
\hfill31
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 35
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 31
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Aspergillus fumigatus
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 35
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipagtcacctct agttactagt agacacgggg c
\hfill31
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 36
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 3060
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Aspergillus fumigatus
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 36
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 37
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 863
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Aspergillus fumigatus
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 37
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 38
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 26
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Trichoderma reesei
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 38
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipactagtcgac cgaatgtagg attgtt
\hfill26
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 39
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 19
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Trichoderma reesei
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 39
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskiptgaccatggt gcgcagtcc
\hfill19
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 40
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 26
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Trichoderma reesei
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 40
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipcgatcgtctc cctatgggtc attacc
\hfill26
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 41
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 28
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Trichoderma reesei
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 41
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipactagttaat taagctccgt ggcgaaag
\hfill28
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 42
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 29
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Trichoderma reesei
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 42
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipcttcaccatg gcgccctcag ttacactgc
\hfill29
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 43
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 33
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Trichoderma reesei
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 43
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipgccgttaatt aaggcaagtc aacgctctaa agg
\hfill33
Claims (15)
1. Método para degradar un material
lignocelulósico, que comprende: tratar el material lignocelulósico
con una cantidad eficaz de una o más enzimas celulolíticas en la
presencia de al menos un tensioactivo donde el tensioactivo es un
alcohol etoxilado secundario, y donde la presencia del tensioactivo
aumenta la degradación del material lignocelulósico en comparación
con la ausencia del tensioactivo.
2. Método según la reivindicación 1, donde el
material lignocelulósico es seleccionado del grupo que consiste en
material herbáceo, residuo agrícola, residuo forestal, desperdicios
sólidos municipales, papel de desecho y pulpa y residuo de fábrica
de papel.
3. Método según la reivindicación 1 o 2, donde
la enzima o enzimas celulolíticas son seleccionadas del grupo que
consiste en una celulasa, endoglucanasa, celobiohidrolasa y
beta-glucosidasa.
4. Método según cualquiera de las
reivindicaciones 1 a 3, que comprende además tratar el material
lignocelulósico con una cantidad eficaz de una o más enzimas
seleccionadas del grupo que consiste en una hemicelulasa, esterasa,
proteasa, lacasa, peroxidasa o una mezcla de las mismas.
5. Método según cualquiera de las
reivindicaciones 1 a 4, donde el método es un proceso de
pretratamiento.
6. Método según cualquiera de las
reivindicaciones 1 a 5, donde el método es un paso en un proceso
simultáneo de sacarificación y fermentación (SSF).
7. Método según cualquiera de las
reivindicaciones 1 a 6, donde el método es un paso en un proceso de
hidrólisis híbrida y fermentación (HHF).
8. Método según cualquiera de las
reivindicaciones 1 a 7, que comprende además la recuperación del
material lignocelulósico degradado.
9. Método para la producción de una sustancia
orgánica, que comprende:
- (a)
- sacarificar un material lignocelulósico con una cantidad eficaz de una o más enzimas celulolíticas en presencia de al menos un tensioactivo, donde el tensioactivo es un alcohol etoxilado secundario, y donde la presencia del tensioactivo aumenta la degradación de material lignocelulósico en comparación con la ausencia del tensioactivo;
- (b)
- fermentar el material lignocelulósico sacarificado del paso (a) con uno o más microorganismos fermentativos; y
- (c)
- recuperar la sustancia orgánica de la fermentación.
\vskip1.000000\baselineskip
10. Método según la reivindicación 9, donde el
material lignocelulósico es seleccionado del grupo que consiste en
material herbáceo, residuo agrícola, residuo forestal, desperdicios
sólidos municipales, papel de desecho y pulpa y residuo de fábrica
de papel.
11. Método según cualquiera de las
reivindicaciones 9 o 10, donde la primera o más enzimas
celulolíticas son seleccionadas del grupo que consiste en una
celulasa, endoglucanasa, celobiohidrolasa y
beta-glucosidasa.
12. Método según cualquiera de las
reivindicaciones 9 a 11, que comprende además tratar el material
lignocelulósico con una cantidad eficaz de una o más enzimas
seleccionadas del grupo que consiste en una hemicelulasa, esterasa,
proteasa, lacasa, peroxidasa o una mezcla de las mismas.
13. Método según cualquiera de las
reivindicaciones 9 a 12, donde los pasos (a) y (b) se realizan
simultáneamente en una sacarificación y fermentación
simultáneas.
14. Método según cualquiera de reivindicaciones
9 a 13, donde la sustancia orgánica es un alcohol, ácido orgánico,
cetona, aminoácido o gas.
15. Método según la reivindicación 14, donde el
alcohol es arabinitol, butanol, etanol, glicerol, metanol,
1,3-propanodiol, sorbitol o xilitol.
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