CN116676293A - 具有纤维二糖水解酶活性的多肽以及对其进行编码的多核苷酸 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及纤维二塘水解酶领域，具体涉及具有纤维二糖水解酶活性的多肽、包含催化结构域的多肽、包含碳水化合物结合模块的多肽，以及包含上述多肽的组合物、编码上述多肽、催化结构域或碳水化合物结合模块的多核苷酸、重组宿主细胞。本发明还涉及包含这些多核苷酸的核酸构建体、载体和宿主细胞以及生产和使用这些多肽、催化结构域或碳水化合物结合模块的方法。本发明的多肽具有纤维二塘水解酶活性，能够水解纤维二塘。

Description

具有纤维二糖水解酶活性的多肽以及对其进行编码的多核 苷酸
本申请为申请日为2016年05月27日、申请号为201680024986.3、名称为“具有纤维二糖水解酶活性的多肽以及对其进行编码的多核苷酸”的中国发明专利申请的分案申请。
对序列表的引用
本申请含有一个计算机可读形式的序列表，将其通过引用结合在此。
技术领域
本发明涉及具有纤维二糖水解酶活性、催化结构域和碳水化合物结合模块的多肽，以及编码这些多肽、催化结构域和碳水化合物结合模块的分离的多核苷酸。本发明还涉及包含这些多核苷酸的核酸构建体、载体和宿主细胞以及生产和使用这些多肽、催化结构域、以及碳水化合物结合模块的方法。
背景技术
纤维素是由β-1,4-键连接的葡萄糖的聚合物。许多微生物产生水解β-连接的葡聚糖的酶。这些酶包括内切葡聚糖酶、纤维二糖水解酶、以及β-葡糖苷酶。内切葡聚糖酶在任意位置消化纤维素聚合物，使其打开而被纤维二糖水解酶攻击。纤维二糖水解酶从纤维素聚合物的末端顺序地释放纤维二糖分子。纤维二糖是葡萄糖的水溶性β-1,4-连接的二聚体。β-葡糖苷酶将纤维二糖水解成葡萄糖。
将木质纤维素原料转化成乙醇具有如下优点，即易于获得大量原料、避免燃烧或填埋材料的需要、以及乙醇燃料的清洁性。木材、农业废弃物、草本作物和城市固体废物被认为是用于乙醇生产的原料。这些材料主要由纤维素、半纤维素和木质素组成。一旦将纤维素转变成葡萄糖，就容易通过酵母将葡萄糖发酵成乙醇。由于葡萄糖容易通过各种酵母发酵成乙醇，而纤维二糖则不能，因此在水解结束时残余的任何纤维二糖都代表着乙醇产量的损失。更重要的是，纤维二糖是内切葡聚糖酶和纤维二糖水解酶的强力抑制剂。纤维二糖在水解过程中的累积不利于乙醇生产。
本发明提供了具有纤维二糖水解酶活性的多肽和编码该多肽的多核苷酸。
发明内容
本发明涉及具有纤维二糖水解酶活性的多肽，这些多肽选自下组，该组由以下各项组成：
(a)与SEQ ID NO:2的成熟多肽具有至少82％序列一致性的多肽；
(b)由以下多核苷酸编码的多肽，该多核苷酸在高严格条件下与(i)SEQ ID NO:1的成熟多肽编码序列，(ii)(i)的全长互补体杂交；
(c)由多核苷酸编码的多肽，该多核苷酸与SEQ ID NO:1的成熟多肽编码序列具有至少82％序列一致性；
(d)SEQ ID NO:2的成熟多肽的变体，该变体在一个或多个(例如，若干个)位置处包含取代、缺失、和/或插入；以及
(e)(a)、(b)、(c)或(d)的多肽的片段，该片段具有纤维二糖水解酶活性。
本发明还涉及包含选自下组的催化结构域的多肽，该组由以下各项组成：
(a)与SEQ ID NO:2的氨基酸26至466具有至少82％序列一致性的催化结构域；
(b)由以下多核苷酸编码的催化结构域，该多核苷酸在高严格条件下与(i)SEQ IDNO:1的核苷酸76至1398，(ii)(i)的全长互补体杂交；
(c)由多核苷酸编码的催化结构域，该多核苷酸与SEQ ID NO:的核苷酸76至1398具有至少82％序列一致性；
(d)SEQ ID NO:2的氨基酸26至466的变体，该变体在一个或多个(例如，若干个)位置处包含取代、缺失、和/或插入；以及
(e)(a)、(b)、(c)或(d)的催化结构域的片段，该片段具有纤维二糖水解酶活性。
本发明还涉及包含选自下组的碳水化物结合模块的多肽，该组由以下各项组成：
(a)与SEQ ID NO:2的氨基酸489至525具有至少82％序列一致性的碳水化合物结合模块；
(b)由以下多核苷酸编码的碳水化合物结合模块，该多核苷酸在高严格条件下与(i)SEQ ID NO:1的核苷酸1465至1575，(ii)(i)的全长互补体杂交；
(c)由多核苷酸编码的碳水化合物结合模块，该多核苷酸与SEQ ID NO:1的核苷酸1465至1575具有至少82％序列一致性；
(d)SEQ ID NO:2的氨基酸489至525的变体，该变体在一个或多个(例如，若干个)位置处包含取代、缺失、和/或插入；以及
(e)(a)、(b)、(c)或(d)的碳水化物结合模块的片段，该片段具有结合活性。
本发明还涉及编码本发明的多肽的多核苷酸；包含这些多核苷酸的核酸构建体、重组表达载体、重组宿主细胞；以及产生这些多肽的方法。
本发明还涉及用于降解纤维素材料的方法，这些方法包括：在本发明的具有纤维二糖水解酶活性的多肽的存在下，用酶组合物处理该纤维素材料。在一方面，这些方法进一步包括回收经降解或转化的纤维素材料。
本发明还涉及产生发酵产物的方法，这些方法包括：(a)在本发明的具有纤维二糖水解酶活性的多肽的存在下，用酶组合物使纤维素材料糖化；(b)用一种或多种(例如，若干种)发酵微生物发酵糖化的纤维素材料，以产生该发酵产物；并且(c)从发酵中回收该发酵产物。
本发明还涉及发酵纤维素材料的方法，这些方法包括：用一种或多种(例如，若干种)发酵微生物发酵纤维素材料，其中该纤维素材料是在存在本发明具有纤维二糖水解酶活性的多肽的条件下用酶组合物糖化的。在一方面，该纤维素材料的发酵产生发酵产物。在另一方面，这些方法进一步包括从该发酵中回收该发酵产物。
本发明还涉及一种编码信号肽的多核苷酸，该信号肽包含SEQ ID NO:2的氨基酸1至25或由其组成，该多核苷酸被可操作地连接至编码蛋白质的基因；包含这些多核苷酸的核酸构建体、表达载体、和重组宿主细胞；以及产生蛋白质的方法。
附图说明
图1示出了p505-GH7_Hami的DNA图谱。
定义
乙酰木聚糖酯酶：术语“乙酰木聚糖酯酶”意指羧基酯酶(EC 3.1.1.72)，其催化乙酰基基团从聚合木聚糖、乙酰化木糖、乙酰化葡萄糖、乙酸α-萘酯(alpha-napthylacetate)和对硝基苯乙酸酯(p-nitrophenyl acetate)的水解。可以在含有0.01％TWEENTM20(聚氧乙烯脱水山梨糖醇单月桂酸酯)的50mM乙酸钠(pH 5.0)中使用0.5mM对硝基苯基乙酸酯作为底物来确定乙酰木聚糖酯酶活性。将一个单位的乙酰木聚糖酯酶定义为在pH 5、25℃下每分钟能够释放1微摩尔对硝基酚根阴离子的酶的量。
等位基因变体：术语“等位基因变体”意指占用同一染色体基因座的基因的两个或更多个替代形式中的任一者。等位基因变异由突变天然产生，并且可以导致群体内多态性。基因突变可以是沉默的(所编码的多肽没有变化)或可编码具有改变的氨基酸序列的多肽。多肽的等位基因变体是由基因的等位基因变体编码的多肽。
α-L-阿拉伯呋喃糖苷酶：术语“α-L-阿拉伯呋喃糖苷酶”意指一种α-L-阿拉伯呋喃糖苷阿拉伯呋喃水解酶(EC 3.2.1.55)，其催化α-L-阿拉伯糖苷中的末端非还原性α-L-阿拉伯呋喃糖苷残基的水解。该酶对α-L-阿拉伯呋喃糖苷、含有(1,3)-和/或(1,5)-键的α-L-阿拉伯聚糖、阿拉伯糖基木聚糖以及阿拉伯半乳聚糖起作用。α-L-阿拉伯呋喃糖苷酶还被称为阿拉伯糖苷酶、α-阿拉伯糖苷酶、α-L-阿拉伯糖苷酶、α-阿拉伯呋喃糖苷酶、多糖α-L-阿拉伯呋喃糖苷酶、α-L-阿拉伯呋喃糖苷水解酶、L-阿拉伯糖苷酶、或α-L-阿拉伯聚糖酶。可以使用每ml的100mM乙酸钠(pH 5)中5mg的中等粘度小麦阿拉伯糖基木聚糖(麦格酶国际爱尔兰股份有限公司(Megazyme International Ireland,Ltd.)、布瑞公司，威克洛郡，爱尔兰(Bray,Co.Wicklow,Ireland))以总体积200μl在40℃下持续30分钟，接着通过HPX-87H柱层析(伯乐实验室有限公司(Bio-Rad Laboratories,Inc.)，赫拉克勒斯，加利福尼亚州，美国)进行阿拉伯糖分析来确定α-L-阿拉伯呋喃糖苷酶活性。
α-葡糖醛酸糖苷酶：术语“α-葡糖醛酸糖苷酶”意指可催化α-D-葡萄糖苷酸水解成为D-葡萄糖醛酸酯和醇的α-D-葡萄糖苷酸葡萄糖醛酸水解酶(EC 3.2.1.139)。可以根据deVries，1998，J.Bacteriol.[细菌学杂志]180:243-249来确定α-葡糖醛酸糖苷酶活性。一个单位的α-葡糖醛酸糖苷酶等于能够在pH 5、40℃下每分钟释放1微摩尔的葡糖醛酸或4-O-甲基葡糖醛酸的酶的量。
辅助活性9多肽：该术语“辅助活性9多肽”或“AA9多肽”意指分类为溶解性多糖单加氧酶(lytic polysaccharide monooxygenase)(Quinlan等人，2011，Proc.Natl.Acad.Sci.USA[美国科学院院刊]208:15079-15084；Phillips等人，2011，ACSChem.Biol.[ACS化学生物学]6:1399-1406；Lin等人，2012，Structure[结构]20:1051-1061)的多肽。根据Henrissat，1991，Biochem.J.[生物化学杂志]280:309-316；以及Henrissat和Bairoch，1996，Biochem.J.[生物化学杂志]316:695-696，AA9多肽之前被分类为糖苷水解酶家族61(GH61)。
AA9多肽通过具有纤维素分解活性的酶增强纤维素材料的水解。可以通过测量在以下条件下来自由纤维素分解酶水解纤维素材料的还原糖的增加或纤维二糖与葡萄糖总量的增加来确定纤维素分解增强活性：1-50mg总蛋白/g预处理的玉米秸秆(PCS)中的纤维素，其中总蛋白包含50-99.5％w/w纤维素分解酶蛋白和0.5-50％w/w AA9多肽蛋白，在适合的温度(如40℃-80℃，例如40℃、45℃、50℃、55℃、60℃、65℃、70℃、75℃、或80℃)和适合的pH(如，4-9，例如4.5、5.0、5.5、6.0、6.5、7.0、7.5、8.0、8.5、或9.0)下持续1-7天，与不具有纤维素分解增强活性的相等的总蛋白负载的对照水解(1-50mg纤维素分解蛋白/g PCS中的纤维素)进行比较。
可以使用CELLUCLASTTM1.5L(诺维信公司，巴格斯瓦德(Bagsvaerd)，丹麦)和β-葡糖苷酶的混合物作为纤维素分解活性的来源来确定AA9多肽增强活性，其中该β-葡糖苷酶是以纤维素酶蛋白负载的至少2％-5％蛋白的重量存在的。在一方面，该β-葡糖苷酶是米曲霉β-葡糖苷酶(例如，根据WO 02/095014，在米曲霉中重组产生的)。在另一方面，该β-葡糖苷酶是烟曲霉β-葡糖苷酶(例如，如在WO 02/095014中描述的，在米曲霉中重组产生的)。
AA9多肽增强活性还可通过以下来确定：在40℃下，将AA9多肽与0.5％磷酸溶胀纤维素(PASC)、100mM乙酸钠(pH 5)、1mM MnSO4、0.1％没食子酸、0.025mg/ml的烟曲霉β-葡糖苷酶，以及0.01％X-100(4-(1,1,3,3-四甲基丁基)苯基-聚乙二醇)一起孵育24-96小时，接着确定从PASC释放的葡萄糖。
还可以根据WO 2013/028928确定高温组合物的AA9多肽增强活性。
AA9多肽通过将达到相同的水解程度所需要的纤维素分解酶的量降低优选至少1.01倍，例如，至少1.05倍、至少1.10倍、至少1.25倍、至少1.5倍、至少2倍、至少3倍、至少4倍、至少5倍、至少10倍、或至少20倍，来增强由具有纤维素分解活性的酶催化的纤维素材料的水解。
根据WO 2008/151043或WO 2012/122518，AA9多肽可以在可溶性活化二价金属阳离子(例如锰或铜)的存在下使用。
该AA9多肽还可以在二氧化合物、二环化合物、杂环化合物、含氮化合物、醌化合物、含硫化合物、或从预处理的纤维素材料或半纤维素材料(如预处理的玉米秸秆)获得的液体的存在下使用(WO 2012/021394、WO 2012/021395、WO 2012/021396、WO 2012/021399、WO 2012/021400、WO 2012/021401、WO 2012/021408、以及WO 2012/021410)。
β-葡糖苷酶：术语“β-葡糖苷酶”意指β-D-葡糖苷葡糖水解酶(E.C.3.2.1.21)，其催化末端非还原性β-D-葡萄糖残基的水解，并释放β-D-葡萄糖。可以根据Venturi等人，2002，J.Basic Microbiol.[基础微生物学杂志]42:55-66的程序使用对硝基苯基-β-D-吡喃葡萄糖苷作为底物来确定β-葡糖苷酶活性。一个单位的β-葡糖苷酶定义为在25℃、pH4.8下，在含有0.01％20的50mM柠檬酸钠中从作为底物的1mM对硝基苯基-β-D-吡喃葡萄糖苷中每分钟产生1.0微摩尔的对硝基苯酚阴离子。
β-木糖苷酶：术语“β-木糖苷酶”意指催化短β(1→4)-木寡糖的外切水解，以从非还原末端去除连续的D-木糖残基的β-D-木糖苷木糖水解酶(E.C.3.2.1.37)。可以在含有0.01％20的100mM柠檬酸钠中，在pH 5、40℃下，使用1mM对硝基苯基-β-D-木糖苷作为底物确定β-木糖苷酶活性。一个单位的β-木糖苷酶定义为在40℃、pH 5下，在含有0.01％/>20的100mM柠檬酸钠中从1mM对硝基苯基-β-D-木糖苷中每分钟产生1.0微摩尔的对硝基酚根阴离子。
碳水化合物结合模块：术语“碳水化合物结合模块”意指提供碳水化合物结合活性的碳水化合物活性酶内的结构域(Boraston等人，2004，Biochem.J.[生物化学杂志]383:769-781)。大多数已知的碳水化合物结合模块(CBM)是具有离散折叠的连续氨基酸序列。碳水化合物结合模块(CBM)典型地发现于酶的N-末端处或C-末端的端点处。已知一些CBM具有针对纤维素的特异性。
过氧化氢酶：术语“过氧化氢酶”意指一种过氧化氢:过氧化氢氧化还原酶(E.C.1.11.1.6或E.C.1.11.1.21)，其催化将两个过氧化氢转化为氧和两个水。
可以基于以下反应通过在240nm下监测过氧化氢的降解而确定过氧化氢酶活性：
2H2O2→2H2O+O2
在25℃下，在具有10.3mM底物(H2O2)的50mM磷酸盐(pH 7)中进行该反应。用分光光度计监测16-24秒内的吸光度，这应该对应于从0.45至0.4的吸光度降低。可以将一个过氧化氢酶活性单位表示为在pH 7.0和25℃下每分钟降解一微摩尔的H2O2。
催化结构域：术语“催化结构域”意指酶的含有该酶的催化机构的区域。
纤维二糖水解酶：该术语“纤维二糖水解酶”意指一种1,4-β-D-葡聚糖纤维二糖水解酶(E.C.3.2.1.91和E.C.3.2.1.176)，其催化纤维素、纤维寡糖、或任何含有β-1,4-连接的葡萄糖的聚合物中的1,4-β-D-糖苷键的水解，从而从链的还原性末端(纤维二糖水解酶I)或非还原性末端(纤维二糖水解酶II)释放纤维二糖(Teeri，1997，Trends inBiotechnology[生物技术趋势]15:160-167；Teeri等人，1998，Biochem.Soc.Trans.[生物化学学会会刊]26:173-178)。可以根据Lever等人，1972，Anal.Biochem.[分析生物化学]47:273-279；van Tilbeurgh等人，1982，FEBS Letters[欧洲生化学会联合会快报]149:152-156；van Tilbeurgh和Claeyssens，1985，FEBS Letters[欧洲生化学会联合会快报]187:283-288；以及Tomme等人，1988，Eur.J.Biochem.[欧洲生物化学杂志]170:575-581所描述的程序来确定纤维二糖水解酶活性。
在一方面，本发明的多肽具有SEQ ID NO:2的成熟多肽的至少20％，例如至少40％、至少50％、至少60％、至少70％、至少80％、至少90％、至少95％、或至少100％的纤维二糖水解酶活性。
纤维素分解酶或纤维素酶：术语“纤维素分解酶”或“纤维素酶”意指一种或多种(例如，若干种)水解纤维素材料的酶。此类酶包括内切葡聚糖酶，纤维二糖水解酶，β-葡糖苷酶，或其组合。用于测量纤维素分解酶活性的两种基本方法包括：(1)测量总纤维素分解酶活性，以及(2)测量个体纤维素分解酶活性(内切葡聚糖酶、纤维二糖水解酶、和β-葡糖苷酶)，如在Zhang等人，2006，Biotechnology Advances[生物技术进展]24:452-481中所述的。可使用不溶性底物，包括沃特曼(Whatman)№1滤纸、微晶纤维素、细菌纤维素、藻类纤维素、棉花、预处理的木质纤维素等，测量总纤维素分解酶活性。最常见的总纤维素分解活性测定是将沃特曼№1滤纸用作底物的滤纸测定。该测定是由国际纯粹与应用化学联合会(IUPAC)建立的(Ghose，1987，Pure Appl.Chem.[纯粹与应用化学]59:257-68)。
可以通过测量在以下条件下与未添加纤维素分解酶蛋白的对照水解相比，在一种或多种纤维素分解酶对纤维素材料的水解过程中产生/释放的糖的增加来测定纤维素分解酶活性：1-50mg的纤维素分解酶蛋白/g于预处理的玉米秸秆(PCS)中的纤维素(或其他预处理的纤维素材料)，在适合的温度(如40℃-80℃，例如40℃、45℃、50℃、55℃、60℃、65℃、70℃、75℃、或80℃)和适合的pH(如4-9，例如，4.0、4.5、5.0、5.5、6.0、6.5、7.0、7.5、8.0、8.5、或9.0)下持续3-7天。典型条件为：1ml反应，洗涤或未洗涤的PCS，5％不溶性固体(干重)，50mM乙酸钠(pH 5)，1mM MnSO4，50℃、55℃、或60℃，72小时，通过HPX-87H柱层析(伯乐实验室有限公司(Bio-Rad Laboratories,Inc.)，赫拉克勒斯，加利福尼亚州，美国)进行糖分析。
纤维素材料：术语“纤维素材料”意指含有纤维素的任何材料。生物质的初生细胞壁中的主要多糖是纤维素，第二丰富的是半纤维素，而第三丰富的是果胶。细胞停止生长后产生的次生细胞壁也含有多糖，并且它通过与半纤维素共价交联的聚合木质素得到强化。纤维素是脱水纤维二糖的均聚物，因此是线性β-(l-4)-D-葡聚糖，而半纤维素包括多种化合物，如具有一系列取代基以复杂支链结构存在的木聚糖、木葡聚糖、阿拉伯糖基木聚糖、以及甘露聚糖。尽管纤维素一般为多态的，但发现其在植物组织中主要以平行葡聚糖链的不溶性晶体基质存在。半纤维素通常氢键合至纤维素连同其他半纤维素，这有助于稳定细胞壁基质。
纤维素通常见于例如植物的茎、叶、壳、皮和穗轴或树叶、树枝和树木中。纤维素材料可以是，但不限于：农业废弃物、草本材料(包括能源作物)、城市固体废物、纸浆和造纸厂废弃物、废纸、和木材(包括林业废弃物)(参见，例如Wiselogel等人，1995，在：Handbook onBioethanol[生物乙醇手册](Charles E.Wyman编辑)中，第105-118页，Taylor&Francis[泰勒-弗朗西斯出版集团]，华盛顿特区；Wyman，1994，Bioresource Technology[生物资源技术]50:3-16；Lynd，1990，Applied Biochemistry and Biotechnology[应用生物化学与生物技术]24/25:695-719；Mosier等人，1999，Recent Progress in Bioconversion ofLignocellulosics[木质纤维素的生物转化的最近进展]，在：Advances in BiochemicalEngineering/Biotechnology[生物化学工程/生物技术进展]，T.Scheper总编辑，第65卷，第23-40页，Springer-Verlag[施普林格出版公司]，纽约)。在此应该理解的是，纤维素可以处于木素纤维素，在混合基质中含有木质素、纤维素、和半纤维素的植物细胞壁材料的形式。在一方面，该纤维素材料是任何生物质材料。在另一方面，该纤维素材料是木质纤维素，该木质纤维素包含纤维素、半纤维素、以及木质素。
在一个实施例中，该纤维素材料是农业废弃物、草本材料(包括能源作物)、城市固体废物、纸浆和造纸厂废弃物、废纸、或木材(包括林业废弃物)。
在另一个实施例中，该纤维素材料是芦竹、甘蔗渣、竹子、玉米芯、玉米纤维、玉米秸秆、芒属、稻秸、甘蔗秸秆、柳枝稷或麦秸。
在另一个实施例中，该纤维素材料是山杨、桉树、冷杉、松树、白杨、云杉或柳树。
在另一个实施例中，该纤维素材料是海藻纤维素、细菌纤维素、棉短绒、滤纸、微晶纤维素(例如，)、或经磷酸处理的纤维素。
在另一个实施例中，该纤维素材料是水生生物质。如在此使用的，“水生生物质”意指在水生环境中由光合作用过程产生的生物质。水生生物质可为藻类、挺水植物(emergentplant)、浮叶植物(floating-leaf plant)或沉水植物(submerged plant)。
纤维素材料可以按原样使用或可以使用本领域已知的常规方法进行预处理，如在此所描述。在一个优选方面，对该纤维素材料进行预处理。
编码序列：术语“编码序列”意指直接指定一个多肽的氨基酸序列的多核苷酸。编码序列的边界一般由开放阅读框架确定，该开放阅读框架从起始密码子(如ATG、GTG或TTG)开始并且以终止密码子(如TAA、TAG或TGA)结束。编码序列可以是基因组DNA、cDNA、合成DNA或其组合。
控制序列：术语“控制序列”意指表达编码本发明的成熟多肽的多核苷酸所必需的核酸序列。每个控制序列对于编码该多肽的多核苷酸来说可以是天然的(即，来自相同基因)或外源的(即，来自不同基因)，或相对于彼此是天然的或外源的。此类控制序列包括但不限于前导子、聚腺苷酸化序列、前肽序列、启动子、信号肽序列、以及转录终止子。至少，控制序列包括启动子，以及转录和翻译终止信号。出于引入有利于将这些控制序列与编码多肽的多核苷酸的编码区连接的特异性限制酶切位点的目的，这些控制序列可以提供有多个接头。
溶解氧饱和度：在标准氧分压(0.21个大气压)下确定氧的饱和度。标准氧分压下的饱和度取决于温度和溶质浓度。在水解过程中的温度是50℃的实施例中，取决于溶质浓度，饱和度典型地应在5-5.5mg氧/kg浆料的范围内。因此，在50℃下0.5％至10％的饱和度的溶解氧浓度对应于从0.025ppm(0.5x5/100)至0.55ppm(10x 5.5/100)范围内的溶解氧量，例如像0.05至0.165ppm，并且在50℃下10％-70％的饱和度的溶解氧浓度对应于从0.50ppm(10x 5/100)至3.85ppm(70x 5.5/100)的范围内的溶解氧量，例如像1至2ppm。在一个实施例中，按0.5至5ppm的范围内的量添加氧，如0.5至4.5ppm、0.5至4ppm、0.5至3.5ppm、0.5至3ppm、0.5至2.5ppm、或0.5至2ppm。
内切葡聚糖酶：术语“内切葡聚糖酶”意指4-(1,3；1,4)-β-D-葡聚糖4-葡聚糖水解酶(E.C.3.2.1.4)，其催化纤维素、纤维素衍生物(如羧甲基纤维素和羟乙基纤维素)、地衣多糖中的1,4-β-D-糖苷键和混合的β-1,3-1,4葡聚糖如谷物β-D-葡聚糖或木葡聚糖以及含有纤维素组分的其他植物材料中的β-1,4键的内切水解。可以通过测量底物粘度的降低或通过还原糖测量所确定的还原性末端的增加来确定内切葡聚糖酶活性(Zhang等人，2006，Biotechnology Advances[生物技术进展]24:452-481)。还可以根据Ghose，1987，Pure andAppl.Chem.[纯粹与应用化学]59:257-268的程序，在pH 5、40℃下，使用羧甲基纤维素(CMC)作为底物确定内切葡聚糖酶活性。
表达：术语“表达”包括涉及多肽的产生的任何步骤，包括但不限于：转录、转录后修饰、翻译、翻译后修饰以及分泌。
表达载体：术语“表达载体”意指直链或环状DNA分子，该分子包含编码多肽的多核苷酸并且可操作地连接至提供用于其表达的控制序列。
阿魏酸酯酶：术语“阿魏酸酯酶”意指一种4-羟基-3-甲氧基肉桂酰基-糖水解酶(EC 3.1.1.73)，其催化4-羟基-3-甲氧基肉桂酰基(阿魏酰基)基团从酯化的糖(其在天然生物质底物中通常为阿拉伯糖)的水解，以产生阿魏酸酯(4-羟基-3-甲氧基肉桂酸酯)。阿魏酸酯酶(FAE)也被称为阿魏酸酯酶(ferulic acid esterase)、羟基肉桂酰基酯酶、FAE-III、肉桂酸酯水解酶、FAEA、cinnAE、FAE-I、或FAE-II。可以在50mM乙酸钠(pH 5.0)中，使用0.5mM对硝基苯基阿魏酸酯作为底物确定对阿魏酸酯酶活性。一个单位的阿魏酸酯酶等于，在pH 5，25℃下，每分钟能够释放1μmol的对硝基酚根阴离子的酶的量。
片段：术语“片段”意指具有从成熟多肽或结构域或模块的氨基和/或羧基末端缺失的一个或多个(例如，若干个)氨基酸的多肽或催化结合模块或碳水化合物结合模块；其中该片段具有纤维二糖水解酶活性。在一方面，片段含有例如SEQ ID NO:2的成熟多肽的至少425个氨基酸残基、至少450个氨基酸残基或至少475个氨基酸残基。
半纤维素分解酶或半纤维素酶：术语“半纤维素分解酶”或“半纤维素酶”意指可对半纤维素材料进行水解的一种或多种(例如，若干种)酶。参见，例如，Shallom和Shoham，2003，Current Opinion In Microbiology[微生物学当前观点]6(3):219-228)。半纤维素酶是在植物生物质的降解中的关键组分。半纤维素酶的实例包括但不限于，乙酰甘露聚糖酯酶、乙酰木聚糖酯酶、阿拉伯聚糖酶、阿拉伯呋喃糖苷酶、香豆酸酯酶、阿魏酸酯酶、半乳糖苷酶、葡糖醛酸糖苷酶、葡糖醛酸酯酶、甘露聚糖酶、甘露糖苷酶、木聚糖酶、以及木糖苷酶。这些酶的底物半纤维素是支链和直链多糖的异质性组，其可通过氢键与植物细胞壁中的纤维素微纤维相结合，交联成坚固的网络。半纤维素还共价附接至木质素，从而与纤维素一起形成高度复杂的结构。半纤维素的可变结构和组织要求许多酶的协同作用以使其完全降解。半纤维素酶的催化模块是水解糖苷键的糖苷水解酶(GH)，或是水解乙酸或阿魏酸侧基团的酯键的碳水化合物酯酶(CE)。这些催化模块，基于其一级结构的同源性，可分配到GH和CE家族。一些家族，具有总体上类似的折叠，可进一步归类为宗族(clan)，以字母标记(例如，GH-A)。在碳水化合物活性酶(CAZy)数据库中可得到这些以及其他碳水化合物活性酶的最翔实和更新的分类。可以根据Ghose和Bisaria，1987，Pure&AppI.Chem.[纯粹与应用化学]59:1739-1752，在适合的温度如40℃-80℃，例如40℃、45℃、50℃、55℃、60℃、65℃、70℃、75℃、或80℃，以及适合的pH如4-9，例如4.0、4.5、5.0、5.5、6.0、6.5、7.0、7.5、8.0、8.5、或9.0下测量半纤维素分解酶活性。
半纤维素材料：该术语“半纤维素材料”意指包含半纤维素的任何材料。半纤维素包括木聚糖、葡糖醛酸木聚糖、阿拉伯糖基木聚糖、葡甘露聚糖以及木葡聚糖。这些多糖含有许多不同的糖单体。在半纤维素中的糖单体可以包括木糖、甘露糖、半乳糖、鼠李糖、以及阿拉伯糖。半纤维素含有大部分的D-戊糖糖类。在大多数情况下，木糖是以最大的量存在的糖单体，尽管在软木中甘露糖可以是最丰富的糖。木聚糖含有β-(1-4)-连接的木糖残基的主链。陆生植物的木聚糖是具有β-(1-4)-D-吡喃木糖主链的杂聚物，其通过短的碳水化合物链分支。它们包含D-葡糖醛酸或其4-O-甲基醚、L-阿拉伯糖、和/或不同的低聚糖，这些低聚糖由D-木糖、L-阿拉伯糖、D-或L-半乳糖、以及D-葡萄糖构成。可以将木聚糖类型的多糖分成同源木聚糖(homoxylan)和异源木聚糖(heteroxylan)，包括葡糖醛酸木聚糖、(阿拉伯糖)葡糖醛酸木聚糖、(葡糖醛酸)阿拉伯糖基木聚糖、阿拉伯糖基木聚糖、以及复杂的异源木聚糖。参见，例如，Ebringerova等人，2005，Adv.Polym.Sci.[聚合物科学进展]186:1-67。半纤维素材料在此也称为“含木聚糖的材料”。
半纤维素材料的来源基本上与在此描述的用于纤维素材料的那些来源相同。
在本发明的方法中，可以使用任何含有半纤维素的材料。在一个优选方面，该半纤维素材料是木素纤维素。
宿主细胞：术语“宿主细胞”意指易于用包含本发明的多核苷酸的核酸构建体或表达载体转化、转染、转导等的任何细胞类型。术语“宿主细胞”涵盖由于复制期间发生的突变而与亲本细胞不同的亲本细胞的任何后代。
分离的：术语“分离的”意指处于自然界中不存在的形式或环境中的物质。分离的物质的非限制性实例包括(1)任何非天然存在的物质；(2)至少部分地从一个或多个或所有与它在自然界中相关的天然存在的成分中除去的任何物质，包括但不限于：任何酶、变体、核酸、蛋白质、肽或辅因子，也就是；(3)相对于在自然界中发现的物质经过人为改变的任何物质；或(4)相对于与它天然相关联的其他组分通过增加该物质的量(例如，在宿主细胞中的重组生产；编码该物质的基因的多个拷贝；以及使用比与编码该物质的基因天然相关联的启动子更强的启动子)而改变的任何物质。分离的物质可以存在于发酵液样品中，例如，可以将宿主细胞进行遗传修饰来表达本发明多肽。来自宿主细胞的发酵液将包含分离的多肽。
漆酶：术语“漆酶”意指催化以下反应的苯二醇:氧气氧化还原酶(E.C.1.10.3.2)：1,2-或1,4-苯二醇+O2＝1,2-或1,4-苯并半醌+2H2O。
可以通过由漆酶将丁香醛连氮(4,4′-[连氮基双(甲基亚基)]双(2,6-二甲氧基苯酚))氧化为对应的醌4,4′-[偶氮双(甲基亚基])双(2,6-二甲氧基环已-2,5-二烯-1-酮)来确定漆酶活性。通过在530nm下吸光度的增加来检测该反应(以下所示)。
在30℃下，在具有19μM底物(丁香醛连氮)和1g/L聚乙二醇(PEG)6000的23mM MES(pH5.5)中进行该反应。将样品置于分光光度计中，并且在530nm下每15秒测量吸光度的变化，直至90秒。一个漆酶单位是在指定的分析条件下每分钟催化1微摩尔丁香醛连氮的转化的酶量。
成熟多肽：术语“成熟多肽”意指在翻译和任何翻译后修饰如N-末端加工、C-末端截短、糖基化作用、磷酸化作用等之后处于其最终形式的多肽。在一方面，基于预测SEQ IDNO:2的氨基酸1至25是信号肽的SignaIP程序(Nielsen等人，1997，Protein Engineering[蛋白质工程]10:1-6)，成熟多肽是SEQ ID NO:2的氨基酸26至525。MS分析示出成熟多肽的N-端以QQVGTQKAETHP开始，这证明了成熟多肽的预测是正确的。
本领域已知宿主细胞可以产生由相同多核苷酸表达的两种或更多种不同成熟多肽(即，具有不同C-末端和/或N-末端氨基酸)的混合物。
本领域还已知，不同的宿主细胞不同地加工多肽，并且因此一个表达多核苷酸的宿主细胞当与另一个表达相同多核苷酸的宿主细胞相比时可以产生不同的成熟多肽(例如，具有不同的C-末端和/或N-末端氨基酸)。在一方面，成熟多肽含有高达505个氨基酸残基(例如，SEQ ID NO:2的氨基酸21至525)，高达515个氨基酸残基(例如，SEQ ID NO:2的氨基酸11至525)或高达525个氨基酸残基(例如，SEQ ID NO:2的氨基酸1至525)。
成熟多肽编码序列：术语“成熟多肽编码序列”意指编码具有纤维二糖水解酶活性的成熟多肽的多核苷酸。在一方面，基于预测SEQ ID NO:1的核苷酸1至75编码一个信号肽的SignalP 3.0程序(Bendtsen等人，2004，同上)，该成熟多肽编码序列是SEQ ID NO:1的核苷酸76至1575或其cDNA序列。
核酸构建体：术语“核酸构建体”意指单-链或双-链的核酸分子，该核酸分子是从天然存在的基因中分离的，或以本来不存在于自然界中的方式被修饰成含有核酸的区段，或是合成的，该核酸分子包含一个或多个控制序列。
可操作地连接：该术语“可操作地连接”意指如下配置，其中控制序列相对于多核苷酸的编码序列放置在适当位置，以使得控制序列指导编码序列的表达。
过氧化物酶：术语“过氧化物酶”意指将过氧化物(例如，过氧化氢)转化为较少氧化的种类(例如，水)的酶。在此应该理解的是，过氧化物酶涵盖过氧化物分解酶。在此将术语“过氧化物分解酶”定义为一种供体：催化还原底物(2e-)+ROOR’→氧化底物+ROH+R’OH反应的过氧化物氧化还原酶(E.C.编号1.11.1.x，其中x＝1-3、5、7-19、或21)；如催化苯酚+H2O→醌+H2O反应的辣根过氧化物酶，和催化H2O2+H2O2→O2+2H2O反应的过氧化氢酶。除过氧化氢之外，其他过氧化物也可以被这些酶分解。
在如以下所示的过氧化氢的存在下，可以通过测量由过氧化物酶氧化2,2’-连氮基-双(3-乙基苯噻唑啉-6-磺酸(ABTS)来确定过氧化物酶活性。反应产物ABTS氧化形成了在418nm下可以量化的蓝-绿颜色。
H2O2+2ABTS还原+2H+→2H2O+2ABTS氧化
在30℃下，在具有1.67mM底物(ABTS)、1.5g/L X-405、0.88mM过氧化氢、和大约0.040个单位的酶/ml的0.1M磷酸盐(pH 7)中进行该反应。将样品置于分光光度计中，并且在418nm下从15秒直至60秒测量吸光度的变化。一个过氧化物酶单位可以表示为在指定的分析条件下每分钟催化1微摩尔过氧化氢所需要酶的量。
预处理的纤维素材料或半纤维素材料：该术语“预处理的纤维素材料或半纤维素材料”意指通过热处理和稀硫酸处理、碱预处理、中性预处理、或本领域已知的任何预处理从生物质得到的纤维素材料或半纤维素材料。
预处理的玉米秸秆：术语“预处理的玉米秸秆”或“PCS”意指通过热和稀硫酸处理、碱预处理、中性预处理、或本领域已知的任何预处理从玉米秸秆得到的纤维素材料。
序列一致性：两个氨基酸序列之间或两个核苷酸序列之间的关联度通过参数“序列一致性”来描述。
出于本发明的目的，使用尼德曼-翁施(Needleman-Wunsch)算法(Needleman和Wunsch，1970，J.Mol.Biol.[分子生物学杂志]48:443-453)来确定两个氨基酸序列之间的序列一致性，该算法如EMBOSS软件包(EMBOSS：欧洲分子生物学开放软件套件(TheEuropean Molecular Biology Open Software Suite)，Rice等人，2000，Trends Genet.[遗传学趋势]16:276-277)(优选5.0.0版或更新版本)的尼德尔(Needle)程序所实施的。所使用的参数是空位开放罚分10，空位延伸罚分0.5，以及EBLOSUM62(BLOSUM62的EMBOSS版本)取代矩阵。将标记为“最长一致性”的Needle输出(使用-nobrief选项获得)用作百分比一致性并且是如下计算的：
(一致的残基x 100)/(比对长度-比对中的空位总数)
出于本发明的目的，使用尼德曼-翁施算法(Needleman和Wunsch，1970，见上文)来确定两个脱氧核苷酸序列之间的序列一致性，该算法如EMBOSS软件包(EMBOSS：欧洲分子生物学开放软件套件，Rice等人，2000，见上文)(优选5.0.0版或更新版本)的尼德尔程序所实施的。所使用的参数是空位开放罚分10，空位延伸罚分0.5，以及EDNAFULL(NCBI NUC4.4的EMBOSS版)取代矩阵。将标记为“最长一致性”的Needle输出(使用-nobrief选项获得)用作百分比一致性并且是如下计算的：
(一致的脱氧核糖核苷酸x 100)/(比对长度-比对中的空位总数)
严格条件：术语“非常低严格条件”意指对于至少100个核苷酸长度的探针，遵循标准DNA印迹程序，在42℃下在5X SSPE、0.3％ SDS、200微克/ml剪切并变性的鲑鱼精子DNA和25％甲酰胺中预杂交和杂交12至24小时。最后在45℃下使用2X SSC、0.2％ SDS将载体材料洗涤三次，每次15分钟。
术语“低严格条件”意指对于长度为至少100个核苷酸的探针而言，遵循标准DNA印迹程序，在42℃下在5X SSPE、0.3％ SDS、200微克/ml剪切并变性的鲑鱼精子DNA和25％甲酰胺中预杂交和杂交12至24小时。最后在50℃下使用2X SSC、0.2％ SDS将载体材料洗涤三次，每次15分钟。
术语“中严格条件”意指对于长度为至少100个核苷酸的探针而言，遵循标准DNA印迹程序，在42℃下在5X SSPE、0.3％ SDS、200微克/ml剪切并变性的鲑鱼精子DNA和35％甲酰胺中预杂交和杂交12至24小时。最后在55℃下使用2X SSC、0.2％ SDS将载体材料洗涤三次，每次15分钟。
术语“中-高严格条件”意指对于长度为至少100个核苷酸的探针而言，遵循标准DNA印迹程序，在42℃下在5X SSPE、0.3％ SDS、200微克/ml剪切并变性的鲑鱼精子DNA和35％甲酰胺中预杂交和杂交12至24小时。最后在60℃下使用2X SSC、0.2％ SDS将载体材料洗涤三次，每次15分钟。
术语“高严格条件”意指对于长度为至少100个核苷酸的探针而言，遵循标准DNA印迹程序，在42℃下在5X SSPE、0.3％ SDS、200微克/ml剪切并变性的鲑鱼精子DNA和50％甲酰胺中预杂交和杂交12至24小时。最后在65℃下使用2X SSC、0.2％ SDS将载体材料洗涤三次，每次15分钟。
术语“非常高严格条件”意指对于长度为至少100个核苷酸的探针而言，遵循标准DNA印迹程序，在42℃下在5X SSPE、0.3％ SDS、200微克/ml剪切并变性的鲑鱼精子DNA和50％甲酰胺中预杂交和杂交12至24小时。最后在70℃下使用2X SSC、0.2％ SDS将载体材料洗涤三次，每次15分钟。
子序列：术语“子序列”意指使一个或多个(例如，若干个)核苷酸从成熟多肽编码序列的5’端和/或3’端缺少的多核苷酸，其中该子序列编码具有纤维二糖水解酶活性的片段。在一方面，子序列含有例如SEQ ID NO:1的成熟多肽编码序列的至少1275个核苷酸、至少1350个核苷酸或至少1425个核苷酸。
变体：术语“变体”意指具有纤维二糖水解酶活性的、包含改变(即在一个或多个(例如，若干个)位置处的取代、插入、和/或缺失)的多肽。取代意指占据位置的氨基酸由不同的氨基酸代替；缺失意指除去占据位置的氨基酸；以及插入意指在占据位置的氨基酸的毗邻处和紧邻处添加氨基酸。
含有木聚糖的材料：术语“含有木聚糖的材料”意指包含含有β-(1-4)连接的木糖残基主链的植物细胞壁多糖的任何材料。陆生植物的木聚糖是具有β-(1-4)-D-吡喃木糖主链的杂聚物，其通过短的碳水化合物链分支。它们包含D-葡糖醛酸或其4-O-甲基醚、L-阿拉伯糖、和/或不同的低聚糖，这些低聚糖由D-木糖、L-阿拉伯糖、D-或L-半乳糖、以及D-葡萄糖构成。可以将木聚糖类型的多糖分成同源木聚糖(homoxylan)和异源木聚糖(heteroxylan)，包括葡糖醛酸木聚糖、(阿拉伯糖)葡糖醛酸木聚糖、(葡糖醛酸)阿拉伯糖基木聚糖、阿拉伯糖基木聚糖、以及复杂的异源木聚糖。参见，例如，Ebringerova等人，2005，Adv.Polym.Sci.[聚合物科学进展]186:1-67。
在本发明的方法中，可以使用含有木聚糖的任何材料。在一个优选方面，含有木聚糖的材料是木质纤维素。
木聚糖降解活性或木聚糖分解活性：术语“木聚糖降解活性”或“木聚糖分解活性”意指水解含有木聚糖的材料的生物活性。用于测量木聚糖分解活性的两种基本方法包括：(1)测量总木聚糖分解活性，和(2)测量单独的木聚糖分解活性(例如内切木聚糖酶、β-木糖苷酶、阿拉伯呋喃糖苷酶、α-葡糖醛酸糖苷酶、乙酰木聚糖酯酶、阿魏酸酯酶、以及α-葡糖醛酸酯酶)。木聚糖分解酶的测定的最近进展总结于若干出版物中，这些出版物包括Biely和Puchard，2006，Journal of the Science of Food and Agriculture[食品与农业科学杂志]86(11):1636-1647；Spanikova和Biely，2006，FEBS Letters[欧洲生化学会联合会快报]580(19):4597-4601；Herrimann等人，1997，生物化学杂志321:375-381。
可以通过确定由不同类型的木聚糖，包括例如燕麦木聚糖、山毛榉木材木聚糖、和落叶松木材木聚糖形成的还原糖，或者通过光度确定从不同共价染色的木聚糖释放的染色的木聚糖片段，测量总木聚糖降解活性。一种常见的总木聚糖分解活性测定是基于由聚合4-O-甲基葡糖醛酸木聚糖产生还原糖，如描述于Bailey等人，1992，Interlaboratorytesting of methods for assay of xylanase activity[用于木聚糖酶活性测定的多个实验室测试方法]，Journal of Biotechnology[生物技术杂志]23(3):257-270中。木聚糖酶活性也可以在37℃下在0.01％X-100和200mM磷酸钠(pH 6)中用0.2％ AZCL-阿拉伯糖基木聚糖作为底物来确定。将一个单位的木聚糖酶活性定义为在37℃，pH 6下，在200mM磷酸钠(pH 6)中从作为底物的0.2％ AZCL-阿拉伯糖基木聚糖每分钟产生1.0微摩尔天青精。
还可以通过测量在以下典型条件下由一种或多种木聚糖降解酶引起的桦木木聚糖(西格玛化学有限公司(Sigma Chemical Co.,Inc.)，圣路易斯，密苏里州，美国)水解的增加来确定木聚糖降解活性：1ml反应，5mg/ml底物(总固形物)，5mg的木聚糖分解蛋白/g的底物，50mM的乙酸钠(pH 5)，50℃，24小时，使用对羟基苯甲酸酰肼(PHBAH)测定法的糖分析，如Lever，1972，Anal.Biochem.[分析生物化学]47:273-279中所述的。
木聚糖酶：术语“木聚糖酶”意指1,4-β-D-木聚糖-木糖水解酶(E.C.3.2.1.8)，其催化木聚糖中的1,4-β-D-木糖苷键的内切水解。木聚糖酶活性可以在37℃下在0.01％X-100和200mM磷酸钠(pH 6)中用0.2％ AZCL-阿拉伯糖基木聚糖作为底物来确定。将一个单位的木聚糖酶活性定义为在37℃，pH 6下，在200mM磷酸钠(pH 6)中从作为底物的0.2％ AZCL-阿拉伯糖基木聚糖每分钟产生1.0微摩尔天青精。
在此提及“约”一个数值或参数包括指向那个数值或参数本身的方面。例如，提及“约X”的描述包括方面“X”。
如在此和所附权利要求书中使用的，单数形式“一种/个”、“或”以及“该”包括复数指示物，除非上下文以另外的方式清楚表明。应理解的是，在此描述的本发明的这些方面包括“由方面组成”和/或“基本由方面组成”。
除非另外定义或由背景清楚指示，否则在此所用的全部技术与科学术语具有如本发明所属领域的普通技术人员通常理解的相同含义。
具体实施方式
具有纤维二糖水解酶活性的多肽
在一个实施例中，本发明涉及与SEQ ID NO:2的成熟多肽具有至少82％，例如至少83％、至少84％、至少85％、至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％、或100％序列一致性的多肽，这些多肽具有纤维二糖水解酶活性。在一方面，这些多肽与SEQID NO:2的成熟多肽相差多达10个(例如1个、2个、3个、4个、5个、6个、7个、8个、9个、或10个)氨基酸。
在一个实施例中，该多肽被分离。在另一个实施例中，纯化该多肽。
本发明的多肽优选地包含SEQ ID NO:2的氨基酸序列或其等位基因变体或由其组成；或是其具有纤维二糖水解酶活性的片段。在另一方面，多肽包含SEQ ID NO:2的成熟多肽或由其组成。在另一方面，该多肽包含SEQ ID NO:2的氨基酸26至525或由其组成。
在另一个实施例中，本发明涉及由以下多核苷酸编码的具有纤维二糖水解酶活性的多肽，该多核苷酸在非常低严格条件、低严格条件、中严格条件、中-高严格条件、高严格条件、或非常高严格条件下与以下各项杂交：(i)SEQ ID NO:1的成熟多肽编码序列，(ii)(i)的全长互补体(Sambrook等人，1989，Molecular Cloning,A Laboratory Manual[分子克隆实验指南]，第二版，冷泉港，纽约)。在一个实施例中，该多肽已经被分离。
SEQ ID NO:1的多核苷酸或其子序列，连同SEQ ID NO:2的多肽或其片段可根据本领域熟知的方法用于设计核酸探针以鉴定和克隆来自不同属或物种的菌株的、编码具有纤维二糖水解酶活性的多肽的DNA。具体而言，此类探针可以用于遵循标准DNA印迹程序与感兴趣的细胞的基因组DNA或cDNA杂交，以便鉴定和分离其中相应的基因。此类探针可以明显短于完整序列，但是长度应为至少15，例如至少25、至少35、或至少70个核苷酸。优选地，该核酸探针长度是至少100个核苷酸，例如长度至少200个核苷酸、至少300个核苷酸、至少400个核苷酸、至少500个核苷酸、至少600个核苷酸、至少700个核苷酸、至少800个核苷酸、或至少900个核苷酸。DNA和RNA探针两者都可使用。典型地将探针进行标记(例如，用32P、3H、35S、生物素、或抗生物素蛋白)，以检测相应的基因。本发明涵盖此类探针。
可以筛选从此类其他菌株制备的基因组DNA或cDNA文库的与上述探针杂交并编码具有纤维二糖水解酶活性的多肽的DNA。来自此类其他菌株的基因组DNA或其他DNA可以通过琼脂糖或聚丙烯酰胺凝胶电泳或其他分离技术来分离。可以将来自文库的DNA或分离的DNA转移到并固定在硝化纤维素或其他适合的载体材料上。为了鉴定与SEQ ID NO:1杂交的克隆或DNA或其子序列，在DNA印迹中使用载体材料。
出于本发明的目的，杂交表明多核苷酸在非常低到非常高严格条件下与一种被标记的核酸探针杂交，该探针对应于(i)SEQ ID NO:1；(ii)SEQ ID NO:1的成熟多肽编码序列；(iii)其全长互补体；或(iv)其子序列。可以使用例如X-射线胶片或本领域已知的任何其他检测手段来检测在这些条件下核酸探针杂交的分子。在一方面，该核酸探针是以下多核苷酸，该多核苷酸编码SEQ ID NO:2的多肽；其成熟多肽；或其片段。在另一方面，该核酸探针是SEQ ID NO:1。
在另一个实施例中，本发明涉及一种多肽，该多肽具有纤维二糖水解酶活性，由与SEQ ID NO:1的成熟多肽编码序列具有至少60％，例如至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％、或100％序列一致性的多核苷酸编码。在一个另外的实施例中，该多肽已经被分离。
在另一个实施例中，本发明涉及在一个或多个(例如，若干个)位置处包含取代、缺失、和/或插入的SEQ ID NO:2的成熟多肽的变体。在一个实施例中，引入SEQ ID NO:2的成熟多肽中的氨基酸取代、缺失和/或插入的数目多达10个，例如1、2、3、4、5、6、7、8、9或10个。氨基酸变化可以是微小性质的，即不显著影响蛋白质折叠和/或活性的保守性氨基酸置换或插入；典型地1至30个氨基酸的小缺失；小氨基-端或羧基端延长，如氨基端甲硫氨酸残基；至多20-25个残基的小连接肽；或通过改变净电荷或另一种功能而促进纯化的小延长部分，如多组氨酸束、抗原表位或结合模块。
保守取代的实例是在下组的范围内：碱性氨基酸(精氨酸、赖氨酸和组氨酸)、酸性氨基酸(谷氨酸和天冬氨酸)、极性氨基酸(谷氨酰胺和天冬酰胺)、疏水性氨基酸(亮氨酸、异亮氨酸和缬氨酸)、芳香族氨基酸(苯丙氨酸、色氨酸和酪氨酸)及小氨基酸(甘氨酸、丙氨酸、丝氨酸、苏氨酸和甲硫氨酸)。一般不会改变比活性的氨基酸取代是本领域已知的并且例如由H.Neurath和R.L.Hill，1979，在The Proteins[蛋白质]，Academic Press[学术出版社]，纽约中描述。常见取代是Ala/Ser、Val/Ile、Asp/Glu、Thr/Ser、Ala/Gly、Ala/Thr、Ser/Asn、Ala/Val、Ser/Gly、Tyr/Phe、Ala/Pro、Lys/Arg、Asp/Asn、Leu/Ile、Leu/Val、Ala/Glu、以及Asp/Gly。
可替代地，这些氨基酸改变具有如下此种性质：改变多肽的物理化学特性。例如，氨基酸改变可以提高多肽的热稳定性、改变底物特异性、改变最适pH，等等。
可以根据本领域中已知的程序，如定点诱变或丙氨酸扫描诱变(Cunningham和Wells，1989，Science[科学]244:1081-1085)来鉴定多肽中的必需氨基酸。在后一项技术中，在该分子中的每个残基处引入单个丙氨酸突变，并且对所得分子的纤维二糖水解酶活性进行测试以鉴定对于该分子的活性至关重要的氨基酸残基。还见Hilton等人，1996，J.Biol.Chem.[生物化学杂志]271:4699-4708。也可结合假定接触位点氨基酸的突变，如通过以下技术例如核磁共振、结晶学、电子衍射、或光亲和标记进行确定，对结构进行物理学分析，从而确定酶的活性位点或其他生物学相互作用。参见，例如de Vos等人，1992，Science[科学]255:306-312；Smith等人，1992，J.Mol.Biol.[分子生物学杂志]224:899-904；Wlodaver等人，1992，FEBS Lett.[欧洲生物化学学会联盟通讯]309:59-64。还可以从与相关多肽的比对来推断鉴定必需氨基酸。通过将如SEQ ID NO:2示出的纤维二糖水解酶与已知的GH7多肽比对，我们发现作为242E的一个保守活性位点。
可以做出单个或多个氨基酸取代、缺失和/或插入并且使用诱变、重组和/或改组的已知方法进行测试，随后进行相关筛选程序，如由Reidhaar-Olson和Sauer，1988，Science[科学]241:53-57；Bowie和Sauer，1989，Proc.Natl.Acad.Sci.USA[美国国家科学院院刊]86:2152-2156；WO 95/17413；或WO 95/22625披露的那些。可以使用的其他方法包括易错PCR、噬菌体展示(例如，Lowman等人，1991，Biochemistry[生物化学]30:10832-10837；美国专利号5,223,409；WO 92/06204)以及区域定向诱变(Derbyshire等人，1986，Gene[基因]46:145；Ner等人，1988，DNA 7:127)。
诱变/改组方法可以与高通量自动化筛选方法组合以检测由宿主细胞表达的克隆的诱变多肽的活性(Ness等人，1999，Nature Biotechnology[自然生物技术]17:893-896)。可以从宿主细胞回收编码活性多肽的诱变的DNA分子，并且使用本领域内标准方法快速测序。这些方法允许迅速确定多肽中单个氨基酸残基的重要性。
该多肽可以是杂合多肽，其中一种多肽的区域在另一种多肽的区域的N-末端或C-末端处融合。
该多肽可以是融合多肽或可裂解的融合多肽，其中另一种多肽在本发明多肽的N-末端或C-末端处融合。通过将编码另一种多肽的多核苷酸与本发明多核苷酸融合而产生融合多肽。用于产生融合多肽的技术是本领域已知的，并且包括连接编码多肽的编码序列，这样使得它们在框内，并且融合多肽的表达处于相同的启动子和终止子的控制之下。也可以使用内含肽技术构建融合多肽，其中以翻译后方式产生融合多肽(Cooper等人，1993，EMBOJ.[欧洲分子生物学学会杂志]12:2575-2583；Dawson等人，1994，Science[科学]266:776-779)。
融合多肽可以进一步包含两种多肽之间的切割位点。在融合蛋白分泌之时，该位点被切割，从而释放出这两种多肽。切割位点的实例包括但不限于在如下文献中披露的位点：Martin等人，2003，J.Ind.Microbiol.Biotechnol.[工业微生物学生物技术杂志]3:568-576；Svetina等人，2000，J.Biotechnol.[生物技术杂志]76:245-251；Rasmussen-Wilson等人，1997，Appl.Environ.Microbiol.[应用与环境微生物学]63:3488-3493；Ward等人，1995，Biotechnology[生物技术]13:498-503；以及Contreras等人，1991，Biotechnology[生物技术]9:378-381；Eaton等人，1986，Biochemistry[生物化学]25:505-512；Collins-Racie等人，1995，Biotechnology[生物技术]13:982-987；Carter等人，1989，Proteins:Structure,Function,and Genetics[蛋白质：结构、功能和遗传学]6:240-248；和Stevens，2003，Drug Discovery World[世界药物发现]4:35-48。
具有纤维二糖水解酶活性的多肽的来源
本发明的具有纤维二糖水解酶活性的多肽可以获得自任何属的微生物。出于本发明的目的，如在此与给出的来源结合使用，术语“从…获得”应当意指由多核苷酸编码的多肽是由该来源或由其中已经插入来自该来源的多核苷酸的菌株产生的。在一方面，将从给定来源获得的多肽分泌至细胞外。
该多肽可以是半内果菌属(Hamigera)多肽。在另一方面，该多肽是榛色半内果菌(Hamigeraavellanea)多肽。在另一方面，该多肽是棕色半内果菌(Hamigera fusca)多肽。在另一方面，该多肽是膨半内果菌(Hamigera inflate)多肽。在另一方面，该多肽是Hamigera ingelheimensis多肽。在另一方面，该多肽是Hamigera insecticola多肽。在另一方面，该多肽是灰绿半内果菌(Hamigera pallida)多肽。在另一方面，该多肽是Hamigeraparavellanea多肽。在另一方面，该多肽是栖土半内果菌(Hamigeraterricola)多肽。
将理解的是，对于以上提到的物种，本发明涵盖完全状态和不完全状态(perfectand imperfectstates)二者、以及其他分类学等效物，例如无性型，而不管它们已知的物种名称。本领域普通技术人员将容易地识别适当等效物的身份。
这些物种的菌株可以容易地在许多培养物保藏中心为公众所获得，如美国典型培养物保藏中心(ATCC)、德国微生物保藏中心(Deutsche Sammlung von Mikroorganismenund Zellkulturen GmbH，DSMZ)、真菌菌种保藏中心(Centraalbureau VoorSchimmelcultures，CBS)以及农业研究机构培养物保藏中心(NRRL)。
可以使用以上提到的探针从其他来源，包括从自然界(例如，土壤、堆肥、水等等)分离的微生物或直接从自然材料(例如，土壤、堆肥、水等等)获得的DNA样品鉴定和获得该多肽。用于从自然生活环境中直接分离微生物和DNA的技术是本领域熟知的。然后可以通过类似地筛选另一微生物的基因组DNA或cDNA文库或混合的DNA样品来获得编码该多肽的多核苷酸。一旦已经用探针检测到编码多肽的多核苷酸，则可以通过利用本领域普通技术人员所知的技术分离或克隆多核苷酸(参见，例如Sambrook等人，1989，上文)。
催化结构域
本发明还涉及与SEQ ID NO:2的氨基酸26到466具有至少82％，例如至少83％、至少84％、至少85％、至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％、或100％序列一致性的催化结构域。在一方面，这些催化结构域包含的氨基酸序列与SEQ ID NO:2的氨基酸26至466相差多达10个(例如1个、2个、3个、4个、5个、6个、7个、8个、9个、或10个)氨基酸。
该催化结构域优选地包含SEQ ID NO:2的氨基酸26到466或其等位基因变体或由它们组成；或为其具有纤维二糖水解酶活性的片段。
在一个实施例中，本发明还涉及在非常低严格条件件、低严格条件、中严格条件、中-高严格条件、高严格条件、或非常高严格条件下(如上所定义)与(i)SEQ ID NO:1的核苷酸76到1398，(ii)(i)的全长互补体杂交的多核苷酸编码的催化结构域(Sambrook等人，1989，同上)。
在另一个实施例中，本发明还涉及由以下多核苷酸编码的催化结构域，这些多核苷酸与SEQ ID NO:1的核苷酸76到1398具有至少82％，例如至少83％、至少84％、至少85％、至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％、或100％序列一致性。
优选地，编码催化结构域的多核苷酸包含SEQ ID NO:1的核苷酸76至1398或由其组成。
在另一个实施例中，本发明还涉及SEQ ID NO:2的氨基酸26至466的催化结构域变体，这些变体在一个或多个(例如，若干个)位置处包含取代、缺失、和/或插入。在一方面，引入SEQ ID NO:2的氨基酸26至466的序列中的氨基酸取代、缺失和/或插入的数目多达10个，例如1个、2个、3个、4个、5个、6个、8个、9个、或10个。
碳水化合物结合模块：
在一个实施例中，本发明还涉及与SEQ ID NO:2的氨基酸489到525具有至少82％，例如至少83％、至少84％、至少85％、至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％、或100％序列一致性的碳水化合物结合模块。在一方面，这些碳水化合物结合模块包含的氨基酸序列与SEQ ID NO:2的氨基酸489到525具有多达10个(例如1个、2个、3个、4个、5个、6个、7个、8个、9个、或10个)氨基酸的差异。
该碳水化合物结合模块优选地包含SEQ ID NO:2的氨基酸489到525或其等位基因变体或由其组成；或为其具有碳水化合物结合活性的片段。
在另一个实施例中，本发明还涉及在非常低严格条件件、低严格条件、中严格条件、中-高严格条件、高严格条件、或非常高严格条件下(如上所定义)与(i)SEQ ID NO:1的核苷酸489到525，(ii)(i)的全长互补体杂交的多核苷酸编码的碳水化合物结合模块(Sambrook等人，1989，同上)。
在另一个实施例中，本发明还涉及由以下多核苷酸编码的碳水化合物结合模块，这些多核苷酸与SEQ ID NO:1的核苷酸1465到1575具有至少60％，例如至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％、或100％序列一致性。
优选地，编码碳水化合物结合模块的多核苷酸包含SEQ ID NO:1的核苷酸1465至1575或由其组成。
在另一个实施例中，本发明还涉及SEQ ID NO:2的氨基酸489到525的碳水化合物结合模块变体，这些变体在一个或多个(例如，若干个)位置处包含取代、缺失和/或插入。在一方面，引入SEQ ID NO:2的氨基酸489至525的序列中的氨基酸取代、缺失和/或插入的数目多达10个，例如1个、2个、3个、4个、5个、6个、8个、9个、或10个。
可操作地连接到该碳水化合物结合模块的催化结构域可以来自水解酶、异构酶、连接酶、裂解酶、氧化还原酶或转移酶，例如氨肽酶、淀粉酶、糖酶、羧肽酶、过氧化氢酶、纤维二糖水解酶、纤维素酶、壳多糖酶、角质酶、环糊精糖基转移酶、脱氧核糖核酸酶、内切葡聚糖酶、酯酶、α-半乳糖苷酶、β-半乳糖苷酶、葡糖淀粉酶、α-葡糖苷酶、β-葡糖苷酶、转化酶、漆酶、脂肪酶、甘露糖苷酶、变位酶、氧化酶、果胶分解酶、过氧化物酶、植酸酶、多酚氧化酶、蛋白水解酶、核糖核酸酶、转谷氨酰胺酶、木聚糖酶或β-木糖苷酶。编码催化结构域的多核苷酸可以从任何原核、真核或其他来源获得。
多核苷酸
本发明还涉及编码如在此所述的本发明的多肽、催化结构域或碳水化合物结合模块的多核苷酸。在一个实施例中，编码本发明的多肽、催化结构域、或碳水化合物结合模块的多核苷酸已经被分离。
用于分离或克隆多核苷酸的技术在本领域中是已知的，并包括从基因组DNA或cDNA，或其组合分离。可以例如通过使用熟知的聚合酶链反应(PCR)或表达文库的抗体筛选来检测具有共有结构特征的克隆DNA片段，实现从基因组DNA克隆多核苷酸。参见例如，Innis等人，1990，PCR:A Guide to Methods and Application[PCR:方法和应用指南]，学术出版社(Academic Press)，纽约。可以使用其他核酸扩增程序如连接酶链式反应(LCR)、连接激活转录(LAT)和基于多核苷酸的扩增(NASBA)。这些多核苷酸可以克隆自半内果菌属的菌株或相关有机体，并且因此，例如可以是该多核苷酸多肽编码区的等位基因变体或物种变体。
编码本发明多肽的多核苷酸的修饰对于合成实质上类似于该多肽的多肽可能是必需的。术语“基本上类似于”该多肽是指该多肽的非天然存在的形式。这些多肽可以因某种工程化方式而与从其天然来源分离的多肽不同，例如在比活性、热稳定性、最适pH等方面不同的变体。这些变体可以基于以SEQ ID NO:1的成熟多肽编码序列、或其cDNA序列(例如其子序列)呈现的多核苷酸，和/或通过引入不会导致该多肽的氨基酸序列变化，但对应于预定用于产生该酶的宿主有机体的密码子用法的核苷酸取代，或通过引入可以产生不同氨基酸序列的核苷酸取代来构建。对于核苷酸置换的一般描述，参见，例如Ford等人，1991，Protein Expression and Purification[蛋白质表达与纯化]2:95-107。
核酸构建体
本发明还涉及核酸构建体，这些核酸构建体包含可操作地连接至一个或多个控制序列的本发明的多核苷酸，在与控制序列相容的条件下，这个或这些控制序列指导编码序列在合适的宿主细胞中的表达。一个或多个控制序列可以是与该多核苷酸异源的。
该多核苷酸可以按多种方式操纵，以提供该多肽的表达。取决于表达载体，在其插入载体以前操纵多核苷酸可以是希望的或必需的。用于利用重组DNA方法修饰多核苷酸的技术是本领域熟知的。
该控制序列可以是启动子，即，被宿主细胞识别以对编码本发明多肽的多核苷酸进行表达的一种多核苷酸。该启动子含有转录控制序列，这些序列介导了该多肽的表达。该启动子可以是在宿主细胞中显示出转录活性的任何多核苷酸，包括变体、截短型及杂合型启动子，并且可以是由编码与该宿主细胞同源或异源的细胞外或细胞内多肽的基因获得。
用于在细菌宿主细胞中指导本发明的核酸构建体的转录的适合启动子的实例是从以下基因中获得的启动子：解淀粉芽孢杆菌α-淀粉酶基因(amyQ)、地衣芽孢杆菌α-淀粉酶基因(amyL)、地衣芽孢杆菌青霉素酶基因(penP)、嗜热脂肪芽孢杆菌产麦芽糖淀粉酶基因(amyM)、枯草芽孢杆菌果聚糖蔗糖酶基因(sacB)、枯草芽孢杆菌xylA和xylB基因、苏云金芽孢杆菌cryIIIA基因(Agaisse和Lereclus，1994，Molecular Microbiology[分子微生物学]13:97-107)、大肠杆菌lac操纵子、大肠杆菌trc启动子(Egon等人，1988，Gene[基因]69:301-315)、天蓝链霉菌琼脂水解酶基因(dagA)、以及原核β-内酰胺酶基因(Villa-Kamaroff等人，1978，Proc.Natl.Acad.Sci.USA[美国国家科学院院刊]75:3727-3731)以及tac启动子(DeBoer等人，1983，Proc.Natl.Acad.Sci.USA[美国国家科学院院刊]80:21-25)。其他启动子描述在Gilbert等人，1980，Scientific American[科学美国人]242:74-94的“Usefulproteins from recombinant bacteria[来自重组细菌的有用蛋白质]”；以及在Sambrook等人，1989，同上。串联启动子的实例披露在WO 99/43835中。
在丝状真菌宿主细胞中，用于指导本发明的核酸构建体的转录的合适启动子的实例是获得自以下各项的基因的启动子：构巢曲霉乙酰胺酶、黑曲霉中性α-淀粉酶、黑曲霉酸稳定性α-淀粉酶、黑曲霉或泡盛曲霉葡萄糖淀粉酶(glaA)、米曲霉TAKA淀粉酶、米曲霉碱性蛋白酶、米曲霉丙糖磷酸异构酶、尖镰孢胰蛋白酶-样蛋白酶(WO 96/00787)、镶片镰孢菌淀粉葡糖苷酶(WO 00/56900)、镶片镰孢菌Daria(达莉亚)(WO 00/56900)、镶片镰孢菌Quinn(奎恩)(WO 00/56900)、米黑根毛霉脂肪酶、米黑根毛霉天冬氨酸蛋白酶、里氏木霉β-葡糖苷酶、里氏木霉纤维二糖水解酶I、里氏木霉纤维二糖水解酶II、里氏木霉内切葡聚糖酶I、里氏木霉内切葡聚糖酶II、里氏木霉内切葡聚糖酶III、里氏木霉内切葡聚糖酶V、里氏木霉木聚糖酶I、里氏木霉木聚糖酶II、里氏木霉木聚糖酶III、里氏木霉β-木糖苷酶，以及里氏木霉翻译延伸因子，连同NA2-tpi启动子(来自曲霉属中性α-淀粉酶基因的修饰的启动子，其中已经用来自曲霉属丙糖磷酸异构酶基因的未翻译的前导子替换未翻译的前导子；非限制性实例包括来自黑曲霉中性α-淀粉酶基因的修饰的启动子，其中已经用来自构巢曲霉或米曲霉丙糖磷酸异构酶基因的未翻译的前导子替换未翻译的前导子)；和变体的、截短的和杂合的启动子。其他启动子在美国专利号6,011,147中描述。
在酵母宿主中，从针对以下各项的基因获得有用的启动子：酿酒酵母烯醇酶(ENO-1)、酿酒酵母半乳糖激酶(GAL1)、酿酒酵母乙醇脱氢酶/甘油醛-3-磷酸脱氢酶(ADH1，ADH2/GAP)、酿酒酵母磷酸丙糖异构酶(TPI)、酿酒酵母金属硫蛋白(CUP1)、和酿酒酵母3-磷酸甘油酸激酶。由Romanos等人，1992，Yeast[酵母]8:423-488描述了酵母宿主细胞的其他有用启动子。
控制序列也可以是由宿主细胞识别以终止转录的转录终止子。终止子与编码该多肽的多核苷酸的3’-末端可操作地连接。在宿主细胞中有功能的任何终止子可以用于本发明中。
细菌宿主细胞的优选终止子从针对以下各项的基因获得：克劳氏芽孢杆菌碱性蛋白酶(aprH)、地衣芽孢杆菌α-淀粉酶(amyL)、和大肠杆菌核糖体RNA(rrnB)。
用于丝状真菌宿主细胞的优选终止子是从以下各项的基因获得：构巢曲霉乙酰胺酶、构巢曲霉邻氨基苯甲酸合酶、黑曲霉葡糖淀粉酶、黑曲霉α-葡糖苷酶、米曲霉TAKA淀粉酶、尖镰孢胰蛋白酶样蛋白酶、里氏木霉β-葡糖苷酶、里氏木霉纤维二糖水解酶I、里氏木霉纤维二糖水解酶II、里氏木霉内切葡聚糖酶I、里氏木霉内切葡聚糖酶II、里氏木霉内切葡聚糖酶III、里氏木霉内切葡聚糖酶V、里氏木霉木聚糖酶I、里氏木霉木聚糖酶II、里氏木霉木聚糖酶III、里氏木霉β-木糖苷酶以及里氏木霉翻译延长因子。
用于酵母宿主细胞的优选终止子从以下各项的基因获得：酿酒酵母烯醇酶、酿酒酵母细胞色素C(CYC1)、以及酿酒酵母甘油醛-3-磷酸脱氢酶。由Romanos等人，1992，见上文描述了酵母宿主细胞的其他有用终止子。
该控制序列还可以是在启动子下游并且在基因编码序列上游的mRNA稳定子区域，它增加该基因的表达。
适合的mRNA稳定子区域的实例是从以下获得的：苏云金芽孢杆菌cryIIIA基因(WO94/25612)和枯草芽孢杆菌SP82基因(Hue等人，1995，Journal of Bacteriology[细菌学杂志]177:3465-3471)。
该控制序列还可以是前导子，一种对宿主细胞翻译很重要的非翻译mRNA区域。该前导子与编码该多肽的多核苷酸的5’-末端可操作地连接。可以使用在宿主细胞中有功能的任何前导子。
用于丝状真菌宿主细胞的优选前导子是从米曲霉TAKA淀粉酶和构巢曲霉丙糖磷酸异构酶的基因获得。
适用于酵母宿主细胞的前导子从以下各项的基因获得：酿酒酵母烯醇酶(ENO-1)、酿酒酵母3-磷酸甘油酸激酶、酿酒酵母α因子、以及酿酒酵母醇脱氢酶/甘油醛-3-磷酸脱氢酶(ADH2/GAP)。
控制序列也可以是多聚腺苷化序列，一种与多核苷酸3’-末端可操作地连接并在转录时由宿主细胞识别为向转录的mRNA添加聚腺苷酸残基的信号序列。可以使用在宿主细胞中起作用的任何聚腺苷酸化序列。
用于丝状真菌宿主细胞的优选聚腺苷酸化序列是从以下各项的基因中获得的：构巢曲霉邻氨基苯甲酸合成酶、黑曲霉葡糖淀粉酶、黑曲霉α-葡糖苷酶、米曲霉TAKA淀粉酶以及尖镰孢胰蛋白酶样蛋白酶。
对于酵母宿主细胞有用的多聚腺苷酸化序列由Guo和Sherman，1995，Mol.Cellular Biol.[分子细胞生物学]15:5983-5990描述。
控制序列也可以是编码与多肽的N-末端连接并指导多肽进入细胞的分泌通路的信号肽的信号肽编码区。多核苷酸的编码序列的5’-端可以固有地含有在翻译阅读框中与编码多肽的编码序列的区段天然地连接的信号肽编码序列。可替代地，编码序列的5’-末端可以含有相对于编码序列为外源的信号肽编码序列。在编码序列不天然地含有信号肽编码序列的情况下，可能需要外源信号肽编码序列。可替代地，外源信号肽编码序列可以单纯地替代天然信号肽编码序列以便增强多肽的分泌。然而，可以使用指导已表达多肽进入宿主细胞的分泌途径的任何信号肽编码序列。
用于细菌宿主细胞的有效信号肽编码序列是从芽孢杆菌NCIB 11837生麦芽糖淀粉酶、地衣芽孢杆菌枯草杆菌蛋白酶、地衣芽孢杆菌鈣-内酰胺酶、嗜热脂肪芽孢杆菌醹-淀粉酶、嗜热脂肪芽孢杆菌中性蛋白酶(nprT、nprS、nprM)和枯草芽孢杆菌prsA的基因获得的信号肽编码序列。其他信号序列由Simonen和Palva，1993，Microbiological Reviews[微生物评论]57:109-137描述。
用于丝状真菌宿主细胞的有效信号肽编码序列是从黑曲霉中性淀粉酶、黑曲霉葡糖淀粉酶、米曲霉TAKA淀粉酶、特异腐质霉纤维素酶、特异腐质霉内切葡聚糖酶V、疏棉状腐质霉脂肪酶和米黑根毛霉天冬氨酸蛋白酶的基因获得的信号肽编码序列。
从酿酒酵母α-因子和酿酒酵母转化酶的基因获得用于酵母宿主细胞的有用信号肽。其他的有用的信号肽编码序列由Romanos等人，1992，见上文描述。
控制序列也可以是编码位于多肽N-末端处的前肽的前肽编码序列。生成的多肽被称为前体酶(proenzyme)或多肽原(或在一些情况下被称为酶原(zymogen))。多肽原通常是无活性的并且可以通过催化切割或自身催化切割来自多肽原的前肽而转化为活性多肽。可以从枯草芽孢杆菌碱性蛋白酶(aprE)、枯草芽孢杆菌中性蛋白酶(nprT)、嗜热毁丝霉漆酶(WO 95/33836)、米黑根毛霉天冬氨酸蛋白酶和酿酒酵母醹-因子的基因获得前肽编码序列。
在信号肽序列和前肽序列二者都存在的情况下，该前肽序列定位成紧邻多肽的N-末端并且该信号肽序列定位成紧邻该前肽序列的N-末端。
也可能令人希望的是添加调节序列，这些调节序列调节相对于宿主细胞的生长的多肽的表达。调节序列的实例是引起基因表达以响应于化学或物理刺激(包括调节化合物的存在)而开启或关闭的那些。原核系统中的调节序列包括lac、tac以及trp操纵子系统。在酵母中，可以使用ADH2系统或GAL1系统。在丝状真菌中，可以使用黑曲霉葡糖淀粉酶启动子、米曲霉TAKAα-淀粉酶启动子和米曲霉葡糖淀粉酶启动子、里氏木霉纤维二糖水解酶I启动子以及里氏木霉纤维二糖水解酶II启动子。调节序列的其他实例是那些允许基因扩增的序列。在真核系统中，这些调控序列包括在甲氨蝶呤存在下被扩增的二氢叶酸还原酶基因以及用重金属扩增的金属硫蛋白基因。在这些情况中，编码多肽的多核苷酸将与调控序列可操作地连接。
表达载体
本发明还涉及包含本发明的多核苷酸、启动子、以及转录和翻译终止信号的重组表达载体。不同的核苷酸和控制序列可以连接在一起以产生重组表达载体，该重组表达载体可以包括一个或多个便利的限制酶切位点以允许在这些位点处插入或取代编码该多肽的多核苷酸。可替代地，该多核苷酸可以通过将该多核苷酸或包含该多核苷酸的核酸构建体插入用于表达的适当载体中来表达。在产生该表达载体时，该编码序列位于该载体中，这样使得该编码序列与该用于表达的适当控制序列可操作地连接。
重组表达载体可以是可便利地经受重组DNA程序并且可引起多核苷酸表达的任何载体(例如，质粒或病毒)。载体的选择将典型地取决于该载体与有待引入该载体的宿主细胞的相容性。该载体可以是一种线性的或闭合的环形质粒。
载体可以是自主复制载体，即，作为染色体外实体存在的载体，其复制独立于染色体复制，例如，质粒、染色体外元件、微染色体或人工染色体。该载体可以含有用于确保自我复制的任何装置。可替代地，该载体可以是这样载体，当它被引入该宿主细胞中时，被整合到基因组中并且与其中已整合了它的一个或多个染色体一起复制。此外，可以使用单一载体或质粒或两个或更多个载体或质粒(这些载体或质粒共同含有待引入到宿主细胞的基因组中的总DNA)或转座子。
该载体优选含有一个或多个允许方便地选择转化细胞、转染细胞、转导细胞等细胞的选择性标志物。选择性标志物是这样一种基因，该基因的产物提供了杀生物剂抗性或病毒抗性、重金属抗性、营养缺陷型的原养型等。
细菌性选择性标志物的实例是地衣芽孢杆菌或枯草芽孢杆菌dal基因，或赋予抗生素抗性(如氨比西林、氯霉素、卡那霉素、新霉素、大观霉素或四环素抗性)的标志物。用于酵母宿主细胞的适合的标志物包括但不限于ADE2、HIS3、LEU2、LYS2、MET3、TRP1、以及URA3。用于在丝状真菌宿主细胞中使用的选择性标志物包括但不限于，adeA(磷酸核糖酰氨基咪唑-琥珀羧胺合酶)、adeB(磷酸核糖酰-氨基咪唑合酶)、amdS(乙酰胺酶)、argB(鸟氨酸氨甲酰基转移酶)、bar(草丁膦乙酰转移酶)、hph(潮霉素磷酸转移酶)、niaD(硝酸还原酶)、pyrG(乳清酸核苷-5'-磷酸脱羧酶)、sC(硫酸腺苷基转移酶)、以及trpC(邻氨基苯甲酸合酶)、连同其等效物。优选地用于曲霉细胞中的是构巢曲霉或米曲霉amdS和pyrG基因以及吸水链霉菌bar基因。在木霉属细胞中优选使用的是adeA、adeB、amdS、hph以及pyrG基因。
选择性标志物可以是如在WO 2010/039889中描述的双选择性标志物系统。在一方面，双选择性标志物是hph-tk双选择性标志物系统。
载体优选含有允许载体整合到宿主细胞的基因组中或载体在细胞中独立于基因组自主复制的一个或多个元件。
对于整合到该宿主细胞基因组中，该载体可以依靠编码该多肽的多核苷酸序列或者用于通过同源或非同源重组整合到该基因组中的该载体的任何其他元件。可替代地，该载体可以含有用于指导通过同源重组而整合到宿主细胞基因组中的一个或多个染色体中的一个或多个精确位置的另外的多核苷酸。为了增加在精确位置整合的可能性，这些整合的元件应含有足够数量的核酸，如100至10,000个碱基对、400至10,000个碱基对、以及800至10,000个碱基对，这些碱基对与对应的靶序列具有高度的序列一致性以提高同源重组的可能性。这些整合元件可以是与宿主细胞的基因组内的靶序列同源的任何序列。此外，这些整合元件可以是非编码多核苷酸或编码多核苷酸。另一方面，该载体可以通过非同源重组整合到宿主细胞的基因组中。
对于自主复制，载体可以进一步包含使该载体能够在所讨论的宿主细胞中自主复制的复制起点。复制起点可以是在细胞中起作用的介导自主复制的任何质粒复制子。术语“复制起点”或“质粒复制子”意指使质粒或载体能够在体内复制的多核苷酸。
细菌复制起点的实例是允许在大肠杆菌中复制的质粒pBR322、pUC19、pACYC177、以及pACYC184的复制起点，以及允许在芽孢杆菌属中复制的质粒pUB110、pE194、pTA1060、以及pAMβ1的复制起点。
用于酵母宿主细胞中的复制起点的实例是2微米复制起点；ARS1；ARS4；ARS1与CEN3的组合；及ARS4与CEN6的组合。
在丝状真菌细胞中有用的复制起点的实例是AMA1和ANS1(Gems等人，1991，基因98:61-67；Cullen等人，1987，Nucleic Acids Res.[核酸研究]15:9163-9175；WO 00/24883)。可以根据WO 00/24883中披露的方法完成AMA1基因的分离和包含该基因的质粒或载体的构建。
可以将本发明多核苷酸的一个以上的拷贝插入宿主细胞以增加多肽的产生。通过将序列的至少一个另外的拷贝整合到宿主细胞基因组中或者通过包括与该多核苷酸一起的可扩增的选择性标志物基因可以获得多核苷酸的增加的拷贝数目，其中通过在适当的选择性试剂的存在下培养细胞可以选择含有选择性标志物基因的经扩增的拷贝的细胞、以及由此该多核苷酸的另外的拷贝。
用于连接以上所描述的元件以构建本发明的重组表达载体的程序是本领域的普通技术人员熟知的(参见，例如，Sambrook等人，1989，同上)。
宿主细胞
本发明还涉及重组宿主细胞，这些重组宿主细胞包含本发明的多核苷酸，该多核苷酸可操作地连接至一个或多个控制序列，该一个或多个控制序列指导本发明的多肽的产生。将包含多核苷酸的构建体或载体引入宿主细胞中，这样使得该构建体或载体被维持作为染色体整合体或作为自主复制的染色体外载体，如早前所述。术语“宿主细胞”涵盖由于复制期间发生的突变而与亲本细胞不同的亲本细胞的任何后代。宿主细胞的选择在很大程度上取决于编码该多肽的基因及其来源。
该宿主细胞可以是有用于重组产生本发明的多肽的任何细胞，例如原核细胞或真核细胞。
原核宿主细胞可以是任何革兰氏阳性或革兰氏阴性细菌。革兰氏阳性细菌包括但不限于：芽孢杆菌属、梭菌属、肠球菌属、土芽孢杆菌属、乳杆菌属、乳球菌属、海洋芽孢杆菌属、葡萄球菌属、链球菌属、以及链霉菌属。革兰氏阴性细菌包括但不限于：弯曲杆菌属、大肠杆菌、黄杆菌属、梭杆菌属、螺杆菌属、泥杆菌属、奈瑟氏菌属、假单孢菌属、沙门氏菌属、以及脲原体属。
细菌宿主细胞可以是任何芽孢杆菌属细胞，包括但不限于：嗜碱芽孢杆菌、解淀粉芽孢杆菌、短芽孢杆菌、环状芽孢杆菌、克劳氏芽孢杆菌、凝结芽孢杆菌、坚硬芽孢杆菌、灿烂芽孢杆菌、迟缓芽孢杆菌、地衣芽孢杆菌、巨大芽孢杆菌、短小芽孢杆菌、嗜热脂肪芽孢杆菌、枯草芽孢杆菌以及苏云金芽孢杆菌细胞。
细菌宿主细胞还可以是任何链球菌属细胞，包括但不限于：似马链球菌、酿脓链球菌、乳房链球菌以及马链球菌兽瘟亚种细胞。
细菌宿主细胞还可以是任何链霉菌属细胞，包括但不限于：不产色链霉菌、除虫链霉菌、天蓝链霉菌、灰色链霉菌以及浅青紫链霉菌细胞。
将DNA引入芽孢杆菌属细胞中可通过以下来实现：原生质体转化(参见例如，Chang和Cohen，1979，Mol.Gen.Genet.[分子遗传学与基因组学]168:111-115)、感受态细胞转化(参见，例如，Young和Spizizen，1961，J.Bacteriol.[细菌学杂志]81:823-829；或Dubnau以及Davidoff-Abelson，1971，J.Mol.Biol.[分子生物学杂志]56:209-221)、电穿孔(参见，例如，Shigekawa和Dower，1988，Biotechniques[生物技术]6:742-751)、或者共轭(参见，例如Koehler和Thorne，1987，J.Bacteriol.[细菌学杂志]169:5271-5278)。将DNA引入大肠杆菌细胞中可通过以下来实现：原生质体转化(参见，例如，Hanahan，1983，J.Mol.Biol.[分子生物学杂志]166:557-580)或电穿孔(参见，例如，Dower等人，1988，Nucleic Acids Res.[酸研究]16:6127-6145)。将DNA引入链霉菌属细胞中可通过以下来实现：原生质体转化、电穿孔(参见例如，Gong等人，2004，Folia Microbiol.[叶线形微生物学](布拉格(Praha))49:399-405)、共轭(参见例如，Mazodier等人，1989，J.Bacteriol.[细菌学杂志]171:3583-3585)、或转导(参见，例如，Burke等人，2001，Proc.Natl.Acad.Sci.USA[美国科学院院刊]98:6289-6294)。将DNA引入假单孢菌属细胞中可通过以下来实现：电穿孔(参见，例如，Choi等人，2006，J.Microbiol.Methods[微生物学方法杂志]64:391-397)或共轭(参见，例如，Pinedo和Smets，2005，Appl.Environ.Microbiol.[应用与环境微生物学]71:51-57)。将DNA引入链球菌属细胞中可通过以下来实现：天然感受态(参见，例如，Perry和Kuramitsu，1981，Infect.Immun.[感染与免疫]32:1295-1297)、原生质体转化(参见，例如，Catt和Jollick，1991，Microbios[微生物]68:189-207)、电穿孔(参见，例如，Buckley等人，1999，Appl.Environ.Microbiol.[应用与环境微生物学]65:3800-3804)或者共轭(参见，例如，Clewell，1981，Microbiol.Rev.[微生物学评论]45:409-436)。然而，可以使用本领域已知的将DNA引入宿主细胞的任何方法。
宿主细胞还可以是真核细胞，如哺乳动物、昆虫、植物、或真菌细胞。
宿主细胞可以是真菌细胞。如在此使用的“真菌”包括子囊菌门(Ascomycota)、担子菌门(Basidiomycota)、壶菌门(Chytridiomycota)和接合菌门(Zygomycota)以及卵菌门(Oomycota)和所有有丝分裂孢子真菌(如由Hawksworth等人所定义得，在：Ainsworth andBisby’s Dictionary of The Fungi[Ainsworth和Bisby的真菌大词典]，第8版，1995，国际CAB，大学出版社，剑桥，英国)。
真菌宿主细胞可以是酵母细胞。如在此使用的“酵母”包括产子嚢酵母(内孢霉目)、产担子酵母和属于半知菌类(芽孢纲)的酵母。由于酵母的分类可能在将来变化，为了本发明的目的，酵母应当如酵母的生物学与活性(Skinner、Passmore和Davenport编辑，Soc.App.Bacteriol.Symposium Series No.9[应用细菌学学会专题论文集系列9]，1980)所描述那样定义。
酵母宿主细胞可以是假丝酵母属、汉逊酵母属、克鲁弗酵母属、毕赤酵母属、酵母属、裂殖酵母属、或耶氏酵母属细胞，如乳酸克鲁维酵母、卡尔酵母、酿酒酵母、糖化酵母、道格拉氏酵母、克鲁弗酵母、诺地酵母、卵形酵母或解脂耶氏酵母细胞。
该真菌宿主细胞可以是丝状真菌细胞。“丝状真菌”包括真菌门(Eumycota)和卵菌门(Oomycota)亚类的所有丝状形式(如由Hawksworth等人，1995，见上文所定义的)。通常，丝状真菌的特征在于由几丁质、纤维素、葡聚糖、壳聚糖、甘露聚糖、以及其他复杂多糖构成的菌丝体壁。营养生长是通过菌丝延伸，而碳分解代谢是专性需氧的。相反，酵母(如酿酒酵母)的营养生长是通过单细胞菌体的出芽(budding)，而碳分解代谢可以是发酵性的。
丝状真菌宿主细胞可以是枝顶孢属、曲霉属、短梗霉属、烟管霉属(Bjerkandera)、拟腊菌属、金孢子菌属、鬼伞属、革盖菌属(Coriolus)、隐球菌属、线黑粉菌科(Filibasidium)、镰孢属、腐质霉属、梨孢菌属、毛霉属、毁丝霉属、新美鞭菌属、链孢菌属、拟青霉属、青霉属、平革菌属、射脉菌属(Phlebia)、瘤胃壶菌属、侧耳属(Pleurotus)、裂褶菌属、篮状菌属、嗜热子囊菌属、梭孢壳属、弯颈霉属、栓菌属(Trametes)或木霉属细胞。
例如，丝状真菌宿主细胞可以是泡盛曲霉、臭曲霉、烟曲霉、日本曲霉、构巢曲霉、黑曲霉、米曲霉、黑刺烟管菌(Bjerkandera adusta)、干拟蜡菌(Ceriporiopsisaneirina)、卡内基拟蜡菌(Ceriporiopsis caregiea)、浅黄拟蜡孔菌(Ceriporiopsisgilvescens)、潘诺希塔拟蜡菌(Ceriporiopsis pannocinta)、环带拟蜡菌(Ceriporiopsisrivulosa)、微红拟蜡菌(Ceriporiopsis subrufa)、虫拟蜡菌(Ceriporiopsissubvermispora)、狭边金孢子菌(Chrysosporium inops)、嗜角质金孢子菌、卢克诺文思金孢子菌(Chrysosporium lucknowense)、粪状金孢子菌(Chrysosporium merdarium)、租金孢子菌、昆士兰金孢子菌(Chrysosporium queenslandicum)、热带金孢子菌、褐薄金孢子菌(Chrysosporium zonatum)、灰盖鬼伞(Coprinus cinereus)、毛革盖菌(Coriolushirsutus)、杆孢状镰孢、谷类镰孢、库威镰孢、大刀镰孢、禾谷镰孢、禾赤镰孢、异孢镰孢、合欢木镰孢、尖镰孢、多枝镰孢、粉红镰孢、接骨木镰孢、肤色镰孢、拟分枝孢镰孢、硫色镰孢、圆镰孢、拟丝孢镰孢、镶片镰孢、特异腐质霉、疏棉状腐质霉、米黑毛霉、嗜热毁丝霉、粗糙链孢菌、产紫青霉、黄孢平革菌(Phanerochaete chrysosporium)、射脉菌(Phlebiaradiata)、刺芹侧耳(Pleurotus eryngii)、土生梭孢壳霉、长域毛栓菌(Trametesvillosa)、变色栓菌(Trametes versicolor)、哈茨木霉、康宁木霉、长枝木霉、里氏木霉、或绿色木霉细胞。
真菌细胞能以本身已知的方式的通过涉及原生质体形成、原生质体的转化、以及细胞壁的再生的过程进行转化。用于转化曲霉属和木霉属宿主细胞的适合程序描述在EP238023和Yelton等人，1984，Proc.Natl.Acad.Sci.USA[美国国家科学院院刊]81:1470-1474以及Christensen等人，1988，Bio/Technology[生物/技术]6:1419-1422中。用于转化镰孢菌属物种的适合方法由Malardier等人，1989，Gene[基因]78:147-156和WO 96/00787描述。可以使用由如以下文献描述的程序转化酵母：Becker和Guarente，在阿贝尔森，J.N.和Simon，M.I.编辑，Guide to Yeast Genetics and Molecular Biology[酵母遗传学与分子生物学指南]，Methods in Enzymology[酶学方法]，第194卷，第182-187页，学术出版社有限公司，纽约；Ito等人，1983，J.Bacteriol.[细菌学杂志]153:163；以及Hinnen等人，1978，Proc.Natl.Acad.Sci.USA[美国国家科学院院刊]75:1920。
制备方法
本发明还涉及产生本发明的多肽的方法，这些方法包括(a)在有益于产生该多肽的条件下培养一种细胞，该细胞以其野生型形式产生该多肽；并且可任选地(b)回收该多肽。在一方面，该细胞是半内果菌属细胞。在另一方面，该细胞是榛色半内果菌细胞。在另一方面，该细胞是棕色半内果菌细胞。在另一方面，该细胞是膨半内果菌细胞。在另一方面，该细胞是Hamigera ingelheimensis细胞。在另一方面，该细胞是Hamigera insecticola细胞。在另一方面，该细胞是灰绿半内果菌细胞。在另一方面，该细胞是Hamigeraparavellanea细胞。在另一方面，该细胞是栖土半内果菌细胞。
本发明还涉及产生本发明的多肽的方法，这些方法包括(a)在有益于产生该多肽的条件下培养一种本发明的重组宿主细胞；并且可任选地(b)回收该多肽。
这些宿主细胞是在适合于使用本领域中已知的方法产生该多肽的一种营养介质中培养的。例如，可以通过摇瓶培养、或在实验室或工业发酵罐中小规模或大规模发酵(包括连续、分批、补料分批或固态发酵)培养细胞，所述培养在适合的介质中并且在允许表达和/或分离多肽的条件下进行。该培养是使用本领域中已知的程序，在一种适合营养介质中发生，该介质包含碳和氮来源及无机盐。适合的介质可从商业供应商获得或可以根据公开的组成(例如，在美国典型培养物保藏中心的目录中)制备。如果多肽被分泌到该营养介质中，那么可直接从介质中回收多肽。如果多肽不分泌，那么其可从细胞裂解液中进行回收。
可以使用特异性针对该多肽的本领域已知的方法来检测该多肽。这些检测方法包括但不限于，特异性抗体的使用、酶产物的形成或酶底物的消失。例如，可以使用酶测定来确定该多肽的活性。
可以使用本领域已知的方法来回收多肽。例如，可以通过常规程序，包括但不限于：收集、离心、过滤、提取、喷雾干燥、蒸发、或沉淀，从该营养介质回收该多肽。在一方面，回收包含该多肽的发酵液。
可以通过本领域已知的多种程序纯化多肽，这些程序包括但不限于：色谱(例如，离子交换色谱法、亲和色谱法、疏水色谱法、聚焦色谱法和大小排阻色谱法)、电泳方法(例如，制备性等电聚焦)、差异性溶解(例如，硫酸铵沉淀)、SDS-PAGE或提取(参见，例如，Protein Purification[蛋白质纯化]，Janson和Ryden编辑，VCH出版公司，纽约，1989)，以便获得基本上纯的多肽。
在替代性方面，不回收多肽，而是使用表达该多肽的本发明宿主细胞作为多肽的来源。
植物
本发明还涉及分离的植物，例如转基因植物、植物部分或植物细胞，该分离的植物、植物部分或植物细胞包含本发明的多核苷酸，以用来按可回收的量表达并且产生多肽或结构域或模块。可从植物或植物部分回收多肽或结构域或模块。作为替代方案，包括该多肽或结构域或模块的植物或植物部分可以按原样用于改进食品或饲料的质量，例如改进营养价值、可口性及流变学特性，或破坏抗营养因素。
转基因植物可以是双子叶的(双子叶植物)或单子叶的(单子叶植物)。单子叶植物的实例是草，如草甸草(蓝草，早熟禾属)；饲草，如羊茅属(Festuca)、黑麦草属(Lolium)；温带草，如翦股颖属(Agrostis)；以及谷类，例如小麦、燕麦、黑麦、大麦、稻、高粱、以及玉蜀黍(玉米)。
双子叶植物的实例是烟草、豆类(如羽扇豆(lupins)、马铃薯、糖甜菜(sugarbeet)、豌豆、豆(bean)和大豆(soybean))、以及十字花科植物(十字花科(familyBrassicaceae))(如花椰菜、油菜籽、以及紧密相关的模式有机体拟南芥)。
植物部分的实例是茎、愈伤组织、叶、根、果实、种子、以及块茎、以及包含这些部分的独立组织，例如，表皮、叶肉、薄壁组织(parenchyme)、维管组织、分生组织。特定植物细胞区室，如叶绿体、质外体(apoplast)、线粒体、液泡、过氧化物酶体以及细胞质也被认为是植物部分。
同样包括于本发明范围内的是此类植物、植物部分以及植物细胞的后代。
表达多肽或结构域或模块的转基因植物或植物细胞可根据本领域已知的方法构建。简单来说，通过将一个或多个编码多肽或结构域或模块的表达构建体导入到植物宿主基因组或叶绿体基因组中并使所得的修饰的植物或植物细胞繁殖成转基因植物或植物细胞，从而构建植物或植物细胞。
表达构建体便利地为核酸构建体，该核酸构建体包含与适合的调控序列可操作地连接的编码多肽或结构域或模块的多核苷酸，该调控序列对于在所选的植物或植物部分中进行多核苷酸的表达是必需的。而且，表达构建体可以包含用于鉴定整合了此表达构建体的植物细胞的选择性标志物，和将此构建体引入所讨论的植物所必需的DNA序列(后者取决于所用的引入DNA的方法)。
调节序列(如启动子和终止子序列及可任选的信号或转运序列)的选择例如基于何时、在何处并且如何表达所希望的多肽或结构域或模块来确定(Sticklen，2008，NatureReviews[自然评论]9:433-443)。比如，编码多肽或结构域或模块的基因的表达可以是组成型表达或诱导型表达，或者可以是发育性表达、阶段表达或组织特异性表达，且基因产物可靶向特定的组织或植物部分，如种子或叶。调节序列由例如Tague等人，1988，PlantPhysiology[植物生理学]86:506描述。
对于组成型表达，可以使用35S-CaMV、玉米泛素1、或稻肌动蛋白1启动子(Franck等人，1980，Cell[细胞]21:285-294；Christensen等人，1992，Plant Mol.Biol.[植物分子生物学]18:675-689；Zhang等人，1991，Plant Cell[植物细胞]3:1155-1165)。器官特异性启动子可以是以下各项的启动子，例如来自贮藏库组织(如种子、马铃薯块茎、和果实)(Edwards和Coruzzi，1990，Ann.Rev.Genet.[遗传学年鉴]24:275-303)，或来自代谢库组织(如分生组织)(Ito等人，1994，Plant Mol.Biol.[植物分子生物学]24:863-878)的启动子，种子特异性启动子，如来自稻的谷蛋白、醇溶谷蛋白、球蛋白或白蛋白启动子(Wu等人，1998，Plant Cell Physiol.[植物与细胞生理学]39:885-889)，来自豆球蛋白B4的蚕豆启动子和来自蚕豆的未知种子蛋白基因(Conrad等人，1998，J.Plant Physiol.[植物生理学杂志]152:708-711)，来自种子油体蛋白的启动子(Chen等人，1998，Plant Cell Physiol.[植物与细胞生理学]39:935-941)，来自欧洲油菜的贮藏蛋白napA启动子，或本领域已知的任何其他种子特异性启动子，例如，如在WO 91/14772中所描述的。此外，启动子可以是叶特异性启动子，如来自稻或番茄的rbcs启动子(Kyozuka等人，1993，Plant Physiol.[植物生理学]102:991-1000)、小球藻病毒腺嘌呤甲基转移酶基因启动子(Mitra和Higgins，1994，Plant Mol.Biol.[植物分子生物学]26:85-93)、来自稻的aldP基因启动子(Kagaya等人，1995，Mol.Gen.Genet.[分子遗传学与基因组学]248:668-674)、或伤口诱导型启动子(如马铃薯pin2启动子)(Xu等人，1993，Plant Mol.Biol.[植物分子生物学]22:573-588)。同样，该启动子可以通过如温度、干旱或盐度变化等非生物处理来诱导，或通过外源地施加使该启动子活化的物质(例如乙醇；雌激素；植物激素，如乙烯、脱落酸及赤霉酸；及重金属)来诱导。
还可使用启动子增强子元件，从而在植物中达到多肽或结构域或模块的更高表达。例如，启动于增强子元件可以是位于启动子和编码多肽或结构域或模块的多核苷酸之间的内含子。例如，Xu等人，1993，同上，披露了使用稻肌动蛋白1基因的第一内含子以增强表达。
该选择性标志物基因及该表达构建体的任何其他部分可以选自本领域中可用的那些。
可以根据本领域中已知的常规技术将核酸构建体结合到植物基因组中，这些常规技术包括土壤杆菌介导的转化、病毒介导的转化、微注射、粒子轰击、生物射弹转化、以及电穿孔(Gasser等人，1990，Science[科学]244:1293；Potrykus，1990，Bio/Technology[生物/技术]8:535；Shimamoto等人，1989，Nature[自然]338:274)。
目前根癌土壤杆菌介导的基因转移是用于产生转基因双子叶植物(关于综述，请参见Hooykas和Schilperoort，1992，Plant Mol.Biol.[植物分子生物学]19:15-38)并且用于转化单子叶植物的方法，尽管对于这些植物可以使用其他转化方法。用于产生转基因单子叶植物的方法是粒子(涂覆有转化DNA的微观金或钨粒子)轰击胚愈伤组织或发育中的胚(Christou，1992，Plant J.[植物杂志]2:275-281；岛本，1994，Curr.Opin.Biotechnol.[生物技术当前述评]5:158-162；Vasil等人，1992，Bio/Technology[生物/技术]10:667-674)。用于转化单子叶植物的替代方法是基于原生质体转化，如由Omirulleh等人，1993，PlantMol.Biol.[植物分子生物学]21:415-428所描述。另外的转化方法包括美国专利号6,395,966和7,151,204(两者都通过引用以其全文结合于此)中所描述的那些。
在转化后，根据本领域熟知的方法选出已并入了表达构建体的转化体，并使其再生成为完整植物。通常设计转化程序用于通过如下方法在再生期间或在后续世代中选择性消除选择基因：例如，使用带有两个独立的T-DNA构建体的共转化或利用特异性重组酶位点特异性地切除选择基因。
除用本发明的构建体直接转化具体植物基因型之外，还可以通过使具有构建体的植物与缺乏该构建体的第二植物杂交来产生转基因植物。例如，可将编码多肽或结构域或模块的构建体通过杂交而引入特定植物品种，而根本无需直接转化该给定品种的植物。因此，本发明不仅涵盖从依照本发明经转化的细胞直接再生的植物，还涵盖此类植物的后代。如在此所用的，后代可以是指根据本发明制备的亲本植物的任何代的后代。此类后代可以包括根据本发明制备的DNA构建体。杂交导致通过供体植物系与起始系交叉授粉，将转基因引入植物系。此类步骤的非限制性实例描述于美国专利号7,151,204中。
植物可以通过回交转化方法生成。例如，植物包括被称为回交转化的基因型、种系、近交体、或杂交体的植物。
可以使用遗传标志物以协助本发明的一种或多种转基因从一个遗传背景渗入到另一个。标志物协助的选择提供了相对于常规育种的优势，在于其可以用于避免由表型变异引起的错误。另外，遗传标志物可以在具体杂交的个别后代中提供有关良种种质相对程度的数据。例如，当具有所希望性状并且另外具有非农艺学所希望的遗传背景的植物与良种亲本杂交时，可以使用遗传标志物来选择不仅具有感兴趣的性状，还具有相对较大比例所希望种质的后代。以此方式，使一种或多种性状渗入特定遗传背景所需的世代数得以最小化。
本发明还涉及产生本发明的多肽或结构域或模块的方法，该方法包括：(a)在有益于产生该多肽或结构域或模块的条件下，培养包含编码该多肽或结构域或模块的多核苷酸的转基因植物或植物细胞，以及(b)回收该多肽或结构域或模块。
去除或减少纤维二糖水解酶活性
本发明还涉及用于产生亲本细胞突变体的方法，其包括破坏或缺失编码本发明的多肽的多核苷酸或其部分，这些方法导致在相同条件下培养时，与亲本细胞相比突变的细胞产生较少的所述多肽。
可以使用本领域熟知的方法通过降低或消除该多核苷酸的表达来构建突变体细胞，例如插入、破坏、替换、或缺失。在一个优选方面，将该多核苷酸失活。例如，待修饰或失活的多核苷酸可以是活性必需的编码区或其部分，或编码区的表达所需的调节元件。这种调节或控制序列的实例可以是启动子序列或其功能部分，即足以影响该多核苷酸的表达的部分。可修饰的其他控制序列包括但不限于前导子、多腺苷酸化序列、前肽序列、信号肽序列、转录终止子、和转录激活因子。
该多核苷酸的修饰或失活可以通过使亲本细胞经受诱变，并且选择该多核苷酸的表达被降低或消除的突变体细胞来进行。该诱变可以是特异的或随机的，例如通过使用适宜的物理或化学诱变剂、通过使用适宜的寡核苷酸、或通过对DNA序列PCR产生诱变来进行。此外，诱变可通过使用这些诱变剂的任意组合来进行。
适用于本发明目的的物理或化学诱变剂的实例包括紫外线(UV)照射，羟胺，N-甲基-N’-硝基-N-亚硝基胍(MNNG)，邻-甲基羟胺，亚硝酸，乙基甲磺酸(EMS)，亚硫酸氢钠，甲酸和核苷酸类似物。
当使用这些试剂时，诱变一般是在适宜条件下在所选的诱变剂的存在下通过孵育有待诱变的亲本细胞并筛选和/或选择展示基因表达降低或不表达的突变体细胞来进行的。
该多核苷酸的修饰或失活可以通过在基因中或在其转录或翻译所需的调控元件中插入、取代、或缺失一个或多个核苷酸来完成。例如，可插入或除去核苷酸从而导致终止密码子的引入、起始密码子的除去、或开放读码框的变化。此类修饰或失活可根据本领域已知的方法通过定点诱变或PCR产生的诱变来完成。尽管原则上，修饰可以在体内进行，即直接在表达待修饰的多核苷酸的细胞上进行，但是优选的是如下所示例地在体外进行修饰。
消除或降低多核苷酸的表达的便利的方法的实例是基于基因替换、基因缺失、或基因破坏技术的。例如，在基因破坏方法中，将对应于内源多核苷酸的核酸序列在体外进行诱变以产生缺陷的核酸序列，然后将其转化到亲本细胞中以产生缺陷基因。通过同源重组，该缺陷的核酸序列替换内源多核苷酸。令人希望的是，缺陷的多核苷酸还编码可用于选择其中该多核苷酸已经被修饰或破坏的转化体的标志物。在一方面，用选择性标志物如在此描述的那些来破坏该多核苷酸。
本发明还涉及抑制具有纤维二糖水解酶活性的多肽在细胞中表达的方法，其包括对细胞施用双链RNA(dsRNA)分子或者在细胞中表达双链RNA(dsRNA)分子，其中dsRNA包含本发明多核苷酸的亚序列。在一个优选方面，该dsRNA长约15个、16个、17个、18个、19个、20个、21个、22个、23个、24个、25个或更多个双核苷酸。
该dsRNA优选是一个小干扰RNA(siRNA)或微小RNA(miRNA)。在一个优选方面，该dsRNA是用于抑制转录的小干扰RNA。在另一个优选方面，该dsRNA是用于抑制翻译的微小RNA。
本发明还涉及此类双链RNA(dsRNA)分子，包含用于抑制该多肽在细胞中的表达的SEQ ID NO:1的成熟多肽编码序列的部分。虽然本发明不局限于任何具体的作用机制，但是该dsRNA可以进入一个细胞并且引起相似的或一致的序列的单链RNA(ssRNA)(包括内源mRNA)的降解。当细胞被暴露于dsRNA时，来自同源基因的mRNA选择性地被一种叫做RNA干扰(RNAi)的过程所降解。
本发明的dsRNA可以用于基因沉默。在一方面，本发明提供了使用本发明的dsRNAi来选择性地降解RNA的方法。可以在体外、离体或体内进行该过程。在一方面，可以使用这些dsRNA分子来在细胞、器官或动物中产生功能缺失突变。用于制备并使用dsRNA分子选择性降解RNA的方法在本领域中是熟知的；参见，例如美国专利号6,489,127；6,506,559；6,511,824；以及6,515,109。
本发明进一步涉及在编码该多肽的多核苷酸或其控制序列或编码该多肽的沉默基因中包含破坏或缺失的亲本细胞的突变体细胞，这导致与亲本细胞相比，该突变体细胞产生的多肽少或不产生多肽。
这些多肽缺陷的突变体细胞作为用于原生和异源多肽的表达的宿主细胞尤其有用。因此，本发明进一步涉及产生天然或异源多肽的方法，这些方法包括(a)在有益于产生该多肽的条件下培养该突变体细胞；并且(b)回收该多肽。术语“异源多肽”是指对该宿主细胞来说不是原生的多肽，例如天然蛋白质的变体。该宿主细胞可以包含多于一个拷贝的编码该原生或异源多肽的多核苷酸。
可使用本领域已知的方法进行培养和感兴趣的产物的纯化。
本发明用于产生基本上无纤维二糖水解酶的产物的方法在多肽，特别是蛋白质如酶的产生中是特别令人有兴趣的。纤维二糖水解酶缺陷细胞也可以用于表达在制药上感兴趣的异源蛋白质如激素、生长因子、受体等。
在另外的方面，本发明涉及通过本发明方法产生的基本上无纤维二糖水解酶活性的蛋白质产物。
发酵液配制品或细胞组合物
本发明还涉及包含本发明的多肽的发酵液配制品或细胞组合物。发酵液产物进一步包含在发酵过程中使用的另外的成分，例如像，细胞(包括含有编码本发明的多肽的基因的宿主细胞，这些宿主细胞被用于产生多肽)、细胞碎片、生物质、发酵介质和/或发酵产物。在一些实施例中，该组合物是含有一种或多种有机酸、杀灭的细胞和/或细胞碎片以及培养基的细胞杀灭的全培养液。
术语“发酵液”是指由细胞发酵产生、不经历或经历最低限的回收和/或纯化的制品。例如，当微生物培养株在允许蛋白质合成(例如，由宿主细胞的酶表达)并且将蛋白质分泌到细胞培养基中的碳受限的条件下孵育生长到饱和时，产生发酵液。发酵液可以含有在发酵结束时得到的发酵材料的未分级的或分级的内容物。典型地，发酵液是未分级的并且包含耗尽的培养基以及例如通过离心去除微生物细胞(例如，丝状真菌细胞)之后存在的细胞碎片。在一些实施例中，发酵液含有用过的细胞培养基、胞外酶以及有活力的和/或无活力的微生物细胞。
在一个实施例中，该发酵液配制品和细胞组合物包含第一有机酸组分(包含至少一种1-5碳的有机酸和/或其盐)以及第二有机酸组分(包含至少一种6碳或更多碳的有机酸和/或其盐)。在具体实施例中，该第一有机酸组分是乙酸、甲酸、丙酸、其盐，或前述两种或更多种的混合物；并且该第二有机酸组分是苯甲酸、环己烷羧酸、4-甲基戊酸、苯乙酸、其盐，或前述两种或更多种的混合物。
在一方面，该组合物包括一种或多种有机酸，并且任选地进一步含有杀灭的细胞和/或细胞碎片。在一个实施例中，从细胞杀灭的全培养液中去除这些杀灭的细胞和/或细胞碎片，以提供不含这些组分的组合物。
这些发酵液配制品或细胞组合物可以进一步包含防腐剂和/或抗微生物(例如，抑菌)剂，包括但不限于：山梨醇、氯化钠、山梨酸钾、以及本领域中已知的其他试剂。
这些发酵液配制品或细胞组合物可以进一步包含多种酶活性，如一种或多种(例如，若干种)选自下组的酶，该组由以下各项组成：纤维素酶、半纤维素酶、AA9多肽、纤维素诱导蛋白(CIP)、过氧化氢酶、酯酶、棒曲霉素、漆酶、木质素分解酶、果胶酶、过氧化物酶、蛋白酶以及膨胀蛋白(swollenin)。这些发酵液配制品或细胞组合物还可以包含选自下组的一种或多种(例如，若干种)酶，该组由以下各项组成：水解酶、异构酶、连接酶、裂解酶、氧化还原酶或转移酶，例如，α-半乳糖苷酶、α-葡糖苷酶、氨肽酶、淀粉酶、β-半乳糖苷酶、β-葡糖苷酶、β-木糖苷酶、糖酶、羧肽酶、过氧化氢酶、纤维二糖水解酶、纤维素酶、壳多糖酶、角质酶、环糊精糖基转移酶、脱氧核糖核酸酶、内切葡聚糖酶、酯酶、葡糖淀粉酶、转化酶、漆酶、脂肪酶、甘露糖苷酶、变位酶、氧化酶、果胶分解酶、过氧化物酶、植酸酶、多酚氧化酶、蛋白分解酶、核糖核酸酶、转谷氨酰胺酶或木聚糖酶。
该细胞杀灭的全培养液或组合物可以含有在发酵结束时得到的发酵材料的未分级的内容物。典型地，该细胞杀灭的全培养液或组合物含有用过的培养基以及在微生物细胞(例如，丝状真菌细胞)生长至饱和、在碳限制条件下孵育以允许蛋白质合成(例如，纤维素酶和/或一种或多种葡糖苷酶的表达)之后存在的细胞碎片。在一些实施例中，该细胞杀灭的全培养液或组合物包括用过的细胞培养基、胞外酶和杀灭的丝状真菌细胞。在一些实施例中，可以使用本领域已知的方法来使细胞杀灭的全培养液或组合物中存在的微生物细胞透性化和/或裂解。
如在此描述的，全培养液或细胞组合物典型地是液体，但是可以含有不溶性组分，如杀灭的细胞、细胞碎片、培养基组分和/或一种或多种不溶性酶。在一些实施例中，可以除去不溶性组分以提供澄清的液体组合物。
本发明的全液配制品和细胞组合物可以通过WO 90/15861或WO 2010/096673中所描述的方法来产生。
下面给出了本发明的组合物的用途的实例。该组合物的剂量以及使用该组合物的其他条件可以基于本领域中已知的方法进行确定。
酶组合物
本发明还涉及包含本发明的多肽的组合物。优选地，这些组合物富含这种多肽。术语“富含”指示该组合物的纤维二糖水解酶活性已经增加，例如，富集因子为至少1.1。
这些组合物可以包含本发明的多肽作为主要酶组分，例如单组分组合物。可替代地，这些组合物可以包含多种酶活性，如选自下组的一种或多种(例如，若干种)酶，该组由以下各项组成：纤维素酶、半纤维素酶、AA9多肽、纤维素诱导蛋白(CIP)、过氧化氢酶、酯酶、棒曲霉素、漆酶、木质素分解酶、果胶酶、过氧化物酶、蛋白酶以及膨胀蛋白。这些组合物还可以包含一种或多种(例如，若干种)选自下组的酶，该组由以下各项组成：水解酶、异构酶、连接酶、裂解酶、氧化还原酶、或转移酶、例如α-半乳糖苷酶、α-葡糖苷酶、氨肽酶、淀粉酶、β-半乳糖苷酶、β-葡糖苷酶、β-木糖苷酶、糖酶、羧肽酶、过氧化氢酶、纤维二糖水解酶、纤维素酶、壳多糖酶、角质酶、环糊精糖基转移酶、脱氧核糖核酸酶、内切葡聚糖酶、酯酶、葡糖淀粉酶、转化酶、漆酶、脂肪酶、甘露糖苷酶、变位酶、氧化酶、果胶分解酶、过氧化物酶、植酸酶、多酚氧化酶、蛋白水解酶、核糖核酸酶、转谷氨酰胺酶、或木聚糖酶。
这些组合物可根据本领域已知的方法制备并且可以是液体或干燥组合物的形式。可以根据本领域中已知的方法稳定这些组合物。
下文中给出本发明的组合物的优选用途的实例。组合物的剂量以及组合物使用的其他条件可以根据本领域已知的方法来确定。
用途
本发明还涉及使用具有纤维二糖水解酶活性的多肽或其组合物的以下方法。
本发明还涉及用于降解纤维素材料的方法，这些方法包括：用包含本发明的具有纤维二糖水解酶活性的多肽的酶组合物处理该纤维素材料。在一方面，这些方法进一步包含回收该降解的纤维素材料。可以使用本领域已知的方法将来自纤维素材料的降解的可溶性产物与不溶性纤维素材料分开，这些方法例如像离心、过滤、或重力沉降。
本发明还涉及产生发酵产物的方法，这些方法包括：(a)用包含本发明的具有纤维二糖水解酶活性的多肽的酶组合物使纤维素材料糖化；(b)用一种或多种(例如，若干种)发酵微生物发酵糖化的纤维素材料，以产生该发酵产物；并且(c)从发酵中回收该发酵产物。
本发明还涉及发酵纤维素材料的方法，这些方法包括：用一种或多种(例如，若干种)发酵微生物发酵纤维素材料，其中该纤维素材料是用包含本发明的具有纤维二糖水解酶活性的多肽的酶组合物糖化的。在一方面，该纤维素材料的发酵产生发酵产物。在另一方面，这些方法进一步包括从该发酵中回收该发酵产物。
本发明的方法可以用于将纤维素材料糖化为可发酵糖，并且将可发酵糖转化为多种有用的发酵产物，例如燃料(乙醇、正丁醇、异丁醇、生物柴油、喷气燃料)和/或平台化合物(例如酸、醇、酮、气体、油等)。由该纤维素材料产生所希望的发酵产物典型地涉及预处理、酶水解(糖化)、以及发酵。
根据本发明的纤维素材料的加工可以使用本领域常规的方法来完成。此外，本发明的方法可以使用被配置成根据本发明来操作的任何常规生物质加工设备来实施。
分开或同时的水解(糖化)和发酵包括但不限于：分开水解和发酵(SHF)、同时糖化和发酵(SSF)、同时糖化和共发酵(SSCF)、杂合的水解和发酵(HHF)、分开水解和共发酵(SHCF)、杂合的水解和共发酵(HHCF)，以及直接微生物转化(DMC)，有时还被称为合并的生物加工(CBP)。SHF使用分开的处理步骤，以首先将纤维素材料酶促水解为可发酵糖(例如，葡萄糖、纤维二糖、以及戊糖单体)，并且然后将可发酵糖发酵为乙醇。在SSF中，纤维素材料的酶水解和糖发酵成乙醇被组合在一个步骤中(Philippidis,G.P.，1996，Cellulosebioconversion technology[纤维素生物转化技术]，Handbook on Bioethanol:Production and Utilization[生物乙醇手册：生产和利用]，Wyman,C.E.编辑，泰勒-弗朗西斯出版集团(Taylor&Francis)，华盛顿特区，179-212))。SSCF涉及多种糖的共发酵(Sheehan和Himmel，1999，Biotechnol.Prog.[生物技术进展]15:817-827)。HHF涉及一个分开的水解步骤，并且另外涉及一个同时糖化和水解步骤，这些步骤可以在同一反应器中进行。HHF过程中的步骤可以在不同的温度下进行，即高温酶糖化，接着在发酵菌株能够耐受的更低温度下进行SSF。DMC在一个或多个(例如，若干个)步骤中合并了所有的三个过程(酶生产、水解、和发酵)，其中使用相同的有机体生产用于将纤维素材料转化为可发酵糖的酶并且用于将可发酵糖转化为终产物的酶(Lynd等人，2002，Microbiol.Mol.Biol.Reviews[微生物学与分子生物学评论]66:506-577)。在此应理解的是，本领域中已知的包括预处理、酶法水解(糖化)、发酵、或其组合的任何方法，可以用于实施本发明的方法。
常规的装置可以包括分批补料搅拌反应器、批式搅拌反应器、具有超滤作用的连续流搅拌反应器、和/或连续活塞流柱式反应器(continuous plug-flow column reactor)(de Castilhos Corazza等人，2003，Acta Scientiarum.Technology[技术学报]25:33-38；Gusakov和Sinitsyn，1985，Enz.Microb.Technol.[酶学与微生物学技术]7:346-352)、碾磨反应器(Ryu和Lee，1983，Biotechnol.Bioeng.[生物技术与生物工程]25:53-65)。另外的反应器类型包括：用于水解和/或发酵的流化床反应器、升流层(upflow blanket)反应器、固定化反应器、以及挤出机型反应器。
预处理.在实践本发明的方法中，可以使用本领域中已知的任何预处理方法来破坏纤维素材料的植物细胞壁组分(Chandra等人，2007，Adv.Biochem.Engin./Biotechnol.[生化工程/生物技术进展]108:67-93；Galbe和Zacchi，2007，Adv.Biochem.Engin./Biotechnol.[生化工程/生物技术进展]，108:41-65；Hendriks和Zeeman，2009，Bioresource Technology[生物资源技术]100:10-18；Mosier等人，2005，BioresourceTechnology[生物资源技术]96:673-686；Taherzadeh和Karimi，2008，Int.J.Mol.Sci.[分子科学国际杂志]9:1621-1651；Yang和Wyman，2008，Biofuels Bioproducts andBiorefining-Biofpr.[生物燃料，生物产品和生物精制Biofpr.]2:26-40)。
纤维素材料也可以在预处理之前使用本领域中已知的方法进行粒度减小、筛分、预浸泡、润湿、洗涤和/或调理。
常规预处理包括但不限于：蒸汽预处理(伴随或不伴随爆炸)、稀酸预处理、热水预处理、碱预处理、石灰预处理、湿氧化、湿爆炸、氨纤维爆炸、有机溶剂预处理、以及生物预处理。另外的预处理包括氨渗滤、超声、电穿孔、微波、超临界CO2、超临界H2O、臭氧、离子液体以及γ辐射预处理。
可以在水解和/或发酵之前对纤维素材料进行预处理。优选在水解前进行预处理。可替代地，预处理可以与酶水解同时进行，以释放可发酵的糖，如葡萄糖、木糖、和/或纤维二糖。在多数情况下，预处理步骤自身导致将生物质转化为可发酵糖(即使在没有酶的情况下)。
蒸汽预处理.在蒸汽预处理中，加热纤维素材料以破坏植物细胞壁成分，包括木质素、半纤维素、以及纤维素，以使纤维素和其他级分，例如，半纤维素可接近酶。纤维素材料经过或穿过反应容器，将蒸汽注入该反应容器以增加温度至所需温度和压力，并且将蒸汽保持在其中持续希望的反应时间。优选在140℃-250℃，例如160℃-200℃或170℃-190℃进行蒸汽预处理，其中最佳温度范围取决于化学催化剂的任选添加。蒸汽预处理的停留时间优选是1-60分钟，例如1-30分钟、1-20分钟、3-12分钟、或4-10分钟，其中最适停留时间取决于温度和化学催化剂的任选添加。蒸汽预处理允许相对较高的固体加载量，这样使得纤维素材料在预处理过程中通常仅变得潮湿。蒸汽预处理经常与预处理后的材料的爆炸放料组合，这被称为蒸汽爆炸，即，快速闪变至大气压和材料湍流，以通过破碎增加可及的表面积(Duff和Murray，1996，Bioresource Technology[生物资源技术]855:1-33；Galbe和Zacchi，2002，Appl.Microbiol.Biotechnol.[应用微生物学与生物技术]59:618-628；美国专利申请号2002/0164730)。在蒸汽预处理过程中，半纤维素乙酰基基团被裂解，并且得到的酸自催化半纤维素部分水解成单糖和寡糖。仅在有限的程度上去除木质素。
化学预处理.术语“化学处理”是指促进纤维素、半纤维素、和/或木质素的分离和/或释放的任何化学预处理。此种预处理可将晶体纤维素转化为无定形纤维素。适合的化学预处理方法的实例包括例如稀酸预处理、石灰预处理、湿法氧化、氨纤维/冷冻膨胀(AFEX)、氨渗滤(APR)、离子液体、以及有机溶剂预处理。
经常在蒸汽预处理之前添加化学催化剂(如H2SO4或SO2)(典型地是0.3％至5％w/w)，该催化剂减少时间并降低温度、增加回收率、并改进酶水解(Ballesteros等人，2006，Appl.Biochem.Biotechnol.[应用生物化学与生物技术]129-132:496-508；Varga等人，2004，Appl.Biochem.Biotechnol.[应用生物化学与生物技术]113-116:509-523；Sassner等人，2006，Enzyme Microb.Technol.[酶与微生物技术]39:756-762)。在稀酸预处理中，纤维素材料与稀酸(典型地是H2SO4)和水混合，以形成浆料，由蒸汽加热至希望的温度，并且在停留时间后闪变至大气压。可采用多种反应器设计来进行稀酸预处理，例如活塞流反应器、逆流反应器或连续逆流收缩床反应器(Duff和Murray，1996，Bioresource Technology[生物资源技术]855:1-33；Schell等人，2004，Bioresource Technology[生物资源技术]91:179-188；Lee等人，1999，Adv.Biochem.Eng.Biotechnol.[生物化学工程/生物技术进展]65:93-115)。
还可以使用碱性条件下的若干种预处理方法。这些碱性预处理包括但不限于：氢氧化钠、石灰、湿氧化、氨渗滤(APR)、以及氨纤维/冷冻膨胀(AFEX)预处理。
用氧化钙或氢氧化钙，在85℃-150℃的温度下进行石灰预处理，并且停留时间为从1小时到若干天(Wyman等人，2005，Bioresource Technology[生物资源技术]96:1959-1966；Mosier等人，2005，Bioresource Technology[生物资源技术]96:673-686)。WO 2006/110891、WO 2006/110899、WO 2006/110900以及WO 2006/110901披露了使用氨的预处理方法。
湿氧化是一种热预处理，其典型地在添加氧化剂(如过氧化氢或过压氧)的情况下在180℃-200℃下持续5-15分钟进行(Schmidt和Thomsen，1998，Bioresource Technology[生物资源技术]64:139-151；Palonen等人，2004，Appl.Biochem.Biotechnol.[应用生物化学与生物技术]117:1-17；Varga等人，2004，Biotechnol.Bioeng.[生物技术与生物工程]88:567-574；Martin等人，2006，J.Chem.Technol.Biotechnol.[化学技术与生物技术杂志]81:1669-1677)。优选在1％-40％干物质，例如2％-30％干物质或5％-20％干物质进行预处理，并且通常通过添加碱，如碳酸钠提高初始pH。
被称为湿爆炸(湿氧化和蒸汽爆炸的组合)的湿氧化预处理方法的修改方案能够处理高达30％的干物质。在湿爆炸中，在某一停留时间后，在预处理期间引入氧化剂。然后通过急骤蒸发至大气压结束预处理(WO 2006/032282)。
氨纤维爆发(AFEX)涉及在中等温度如90℃-150℃和高压如17至20巴下，用液体或气态氨处理纤维素材料5至10分钟，其中干物质含量可以高达60％(Gollapalli等人，2002，Appl.Biochem.Biotechnol.[应用生物化学与生物技术]98:23-35；Chundawat等人，2007，Biotechnol.Bioeng.[生物技术与生物工程]96:219-231；Alizadeh等人，2005，Appl.Biochem.Biotechnol.[应用生物化学与生物技术]121:1133-1141；Teymouri等人，2005，Bioresource Technology[生物资源技术]96:2014-2018)。在AFEX预处理过程中，纤维素和半纤维素保持相对完整。木质素-碳水化合物复合物被裂解。
有机溶剂预处理通过使用含水乙醇(40％-60％乙醇)在160℃-200℃下提取30-60分钟而将纤维素材料脱木质素(Pan等人，2005，Biotechnol.Bioeng.[生物技术与生物工程]90:473-481；Pan等人，2006，Biotechnol.Bioeng.[生物技术与生物工程]94:851-861；Kurabi等人，2005，Appl.Biochem.Biotechnol.[应用生物化学与生物技术]121:219-230)。通常加入硫酸作为催化剂。在有机溶剂预处理中，大部分半纤维素和木质素被去除。
适合的预处理方法的其他实例由Schell等人，2003，Appl.Biochem.Biotechnol.[应用生物化学与生物技术]105-108:69-85，和Mosier等人，2005，BioresourceTechnology[生物资源技术]96:673-686，以及美国专利申请2002/0164730进行描述。
在一方面，化学预处理优选作为稀酸处理，并且更优选作为连续稀酸处理进行。酸通常是硫酸，但也可以使用其他酸，如乙酸、柠檬酸、硝酸、磷酸、酒石酸、琥珀酸、氯化氢、或其混合物。弱酸处理优选在1至5，例如1至4或1至2.5的pH范围中进行。在一方面，酸浓度优选在从0.01wt.％至10wt.％酸，例如0.05wt.％至5wt.％酸或0.1wt.％至2wt.％酸的范围内。使酸与纤维素材料相接触，并且保持在优选140℃-200℃，例如165℃-190℃范围内的温度下，持续从1至60分钟范围内的时间。
在另一方面，预处理在水性浆料中进行。在优选方面，在预处理过程中纤维素材料以优选在10wt.％至80wt.％之间，例如20wt.％至70wt.％或30wt.％至60wt.％，如大约40wt.％的量存在。预处理的纤维素材料可以不洗涤或使用本领域已知的任何方法洗涤，例如，用水洗涤。
机械预处理或物理预处理：术语“机械预处理”或“物理预处理”是指促进颗粒粒度减小的任何预处理。例如，这种预处理可以涉及各种类型的研磨或碾磨(例如，干磨、湿磨、或振动球磨)。
纤维素材料可以物理地(机械地)且化学地预处理。机械或物理预处理可以与蒸汽/蒸汽爆炸、水热解(hydrothermolysis)、稀酸或弱酸处理、高温、高压处理、辐射(例如，微波福射)或其组合相结合。在一方面，高压意指在优选约100至约400psi，例如约150至约250psi范围中的压力。在另一方面，高温意指在约100℃至约300℃，例如约140℃至约200℃范围内的温度。在一个优选的方面，机械预处理或物理预处理在使用如上所定义的高压和高温的蒸汽枪水解器系统的分批过程中进行，例如可购自顺智公司(Sunds DefibratorAB)，瑞典的Sunds水解器。根据需要，可以顺序或同时进行物理和化学预处理。
因此，在一个优选方面，使纤维素材料经受物理(机械)或化学预处理、或其任何组合，以促进纤维素、半纤维素、和/或木质素的分离和/或释放。
生物预处理.术语“生物预处理”是指促进纤维素、半纤维素、和/或木质素从纤维素材料中分离和/或释放的任何生物预处理。生物预处理技术可以涉及应用溶解木质素的微生物和/或酶(参见，例如，Hsu,T.-A.，1996，Pretreatment of biomass[生物质的预处理]，Handbook on Bioethanol:Production and Utilization[生物乙醇手册：生产和利用]，Wyman,C.E.编辑，泰勒-弗朗西斯出版集团，华盛顿特区，179-212；Ghosh和Singh，1993，Adv.Appl.Microbiol.[应用微生物学进展]39:295-333；McMillan,J.D.，1994，Pretreating lignocellulosic biomass:a review[预处理木质纤维素生物质：综述]，用于燃料生产的生物质的酶转化，Himmel,M.E.、Baker,J.O.、以及Overend,R.P.编辑，ACSSymposium Series 566[美国化学学会讨论会系列566]，American Chemical Society[美国化学学会]，华盛顿特区，第15章；Gong,C.S.、Cao,N.J.、Du,J.、以及Tsao,G.T.，1999，Ethanol production from renewable resources[由可再生资源生产乙醇]，Advances inBiochemical Engineering/Biotechnology[生物化学工程/生物技术的进展]，Scheper,T.编辑，施普林格出版社，柏林，海德堡，德国，65:207-241；Olsson和Hahn-Hagerdal，1996，Enz.Microb.Tech.[酶与微生物技术]18:312-331；以及Vallander和Eriksson，1990，Adv.Biochem.Eng./Biotechnol.[生物化学工程/生物技术的进展]42:63-95)。
糖化.在水解步骤(还称为糖化)中，将(例如预处理的)纤维素材料水解，以将纤维素和/或半纤维素分解成可发酵糖，如葡萄糖、纤维二糖、木糖、木酮糖、阿拉伯糖、甘露糖、半乳糖和/或可溶性寡糖。在一个或多个阶段中，水解是由一种或多种酶组合物酶促进行。水解可以作为分批过程或系列分批过程进行。水解可以作为分批补料或连续过程、或系列分批补料或连续过程进行，其中将该纤维素材料逐渐进料至例如含有酶组合物的水解溶液中。在一个实施例中，该糖化是连续糖化，其中在整个糖化过程中以不同间隔添加纤维素材料和纤维素分解酶组合物，并且在整个糖化过程中以不同间隔去除水解产物。可以在添加纤维素材料和纤维素分解酶组合物之前、同时或之后进行水解产物的去除。
酶法水解优选在易于由本领域技术人员确定的条件下，在合适的水性环境中进行。在一方面，水解在适合于一种或多种酶的活性，即对于该一种或多种酶来说最佳的条件下进行。
糖化通常在受控的pH、温度以及混合条件下在搅拌釜反应器或发酵罐中进行。适合的处理时间、温度以及pH条件可以由本领域技术人员容易地确定。例如，总糖化时间可以持续长达200小时，但是典型地进行优选约4至约120小时，例如约12至约96小时或约24至约72小时。温度优选在约25℃至约80℃，例如约30℃至约70℃、约40℃至约60℃、或约50℃至55℃的范围内。pH优选在约3至约9，例如约3.5至约8、约4至约7、约4.2至约6、或约4.3至约5.5的范围内。
干固体含量在大约5到大约50wt.％的范围内，例如大约10至大约40wt.％，或大约20到大约30wt.％。
在一方面，在至少0.5％饱和度的浓度的溶解氧的存在下，进行该糖化。
在本发明的实施例中，糖化过程中的溶解氧浓度在至少0.5％上至30％饱和度范围内，如至少1％上至25％、至少1％上至20％、至少1％上至15％、至少1％上至10％、至少1％上至5％、和至少1％上至3％。在优选的实施例中，在至少25％，如在糖化期的至少50％或至少75％过程中，将溶解氧的浓度维持在至少0.5％上至30％的饱和度的浓度下，如至少1％上至25％、至少1％上至20％、至少1％上至15％、至少1％上至10％、至少1％上至5％、至少1％上至3％。当该酶组合物包含氧化还原酶时，该溶解氧的浓度可以更高，高达70％的饱和度。
向容器中添加氧，以在糖化过程中达到所希望的溶解氧浓度。可以通过经由扩散器或喷雾器添加压缩空气或通过其他已知的通气方法给容器、槽等通气而将溶解氧水平维持在所希望的范围内。可以在来自放置于容器/槽中的溶解氧传感器的反馈的基础上控制通气速率或该系统可以在没有反馈控制的情况下以恒定速率运行。在水解行列由多个串联的容器/槽组成的情况下，可以在这些容器/槽中的一个或多个或所有容器/槽中实施通气。通氧系统在本领域是熟知的。根据本发明，可以使用任何适合的通气系统。商业通气系统由例如英格兰德比的凯米尼尔公司(Chemineer)设计并且由例如美国密苏里州的保罗·穆勒公司(Paul Mueller Company)制造。
这些酶组合物可以包含有用于降解纤维素材料的任何蛋白。
在一方面，该酶组合物包含或进一步包含选自下组的一种或多种(例如，若干种)蛋白质，该组由以下各项组成：纤维素酶、AA9多肽、半纤维素酶、酯酶、棒曲霉素、木质素分解酶、氧化还原酶、果胶酶、蛋白酶以及膨胀蛋白。在另一方面，纤维素酶优选是一种或多种(例如，若干种)选自下组的酶，该组由以下各项组成：内切葡聚糖酶、纤维二糖水解酶和β-葡糖苷酶。在另一方面，半纤维素酶优选是一种或多种(例如，若干种)选自下组的酶，该组由以下各项组成：乙酰甘露聚糖酯酶、乙酰木聚糖酯酶、阿拉伯聚糖酶、阿拉伯呋喃糖苷酶、香豆酸酯酶、阿魏酸酯酶、半乳糖苷酶、葡糖醛酸糖苷酶、葡萄糖醛酸酯酶、甘露聚糖酶、甘露糖苷酶、木聚糖酶、以及木糖苷酶。在另一方面，该氧化还原酶优选是选自下组的一种或多种(例如，若干种)酶，该组由以下各项组成：过氧化氢酶、漆酶以及过氧化物酶。
在另一方面，该酶组合物包含一种或多种(例如，若干种)纤维素分解酶。在另一方面，该酶组合物包含或进一步包含一种或多种(例如，若干种)半纤维素分解酶。在另一方面，该酶组合物包含一种或多种(例如，若干种)纤维素分解酶和一种或多种(例如，若干种)半纤维素分解酶。在另一方面，该酶组合物包含选自纤维素分解酶和半纤维素分解酶的组的一种或多种(例如，若干种)酶。在另一方面，该酶组合物包含内切葡聚糖酶。在另一方面，该酶组合物包含纤维二糖水解酶。在另一方面，该酶组合物包含β-葡糖苷酶。在另一方面，该酶组合物包含AA9多肽。在另一方面，该酶组合物包含内切葡聚糖酶和AA9多肽。在另一方面，该酶组合物包含纤维二糖水解酶和AA9多肽。在另一方面，该酶组合物包含β-葡糖苷酶和AA9多肽。在另一方面，该酶组合物包含内切葡聚糖酶和纤维二糖水解酶。在另一方面，该酶组合物包含内切葡聚糖酶I、内切葡聚糖酶II、或内切葡聚糖酶I和内切葡聚糖酶II的组合、以及纤维二糖水解酶I、纤维二糖水解酶II、或纤维二糖水解酶I和纤维二糖水解酶II的组合。在另一方面，该酶组合物包含内切葡聚糖酶和β-葡糖苷酶。在另一方面，该酶组合物包含内切葡聚糖酶I、内切葡聚糖酶II、或内切葡聚糖酶I和内切葡聚糖酶II的组合、以及β-葡糖苷酶。在另一方面，该酶组合物包含β-葡糖苷酶和纤维二糖水解酶。在另一方面，该酶组合物包含β-葡糖苷酶和纤维二糖水解酶I、纤维二糖水解酶II、或纤维二糖水解酶I和纤维二糖水解酶II的组合。在另一方面，该酶组合物包含内切葡聚糖酶、AA9多肽、以及纤维二糖水解酶。在另一方面，该酶组合物包含内切葡聚糖酶I、内切葡聚糖酶II、或内切葡聚糖酶I和内切葡聚糖酶II的组合、AA9多肽、以及纤维二糖水解酶I、纤维二糖水解酶II、或纤维二糖水解酶I和纤维二糖水解酶II的组合。在另一方面，该酶组合物包含内切葡聚糖酶、β-葡糖苷酶、和AA9多肽。在另一方面，该酶组合物包含β-葡糖苷酶、AA9多肽、和纤维二糖水解酶。在另一方面，该酶组合物包含β-葡糖苷酶、AA9多肽、以及纤维二糖水解酶I、纤维二糖水解酶II、或纤维二糖水解酶I和纤维二糖水解酶II的组合。在另一方面，该酶组合物包含内切葡聚糖酶、β-葡糖苷酶和纤维二糖水解酶。在另一方面，该酶组合物包含内切葡聚糖酶I、内切葡聚糖酶II、或内切葡聚糖酶I和内切葡聚糖酶II的组合、β-葡糖苷酶、以及纤维二糖水解酶I、纤维二糖水解酶II、或纤维二糖水解酶I和纤维二糖水解酶II的组合。在另一方面，该酶组合物包含内切葡聚糖酶、纤维二糖水解酶、β-葡糖苷酶、和AA9多肽。在另一方面，该酶组合物包含内切葡聚糖酶I、内切葡聚糖酶II、或内切葡聚糖酶I和内切葡聚糖酶II的组合、β-葡糖苷酶、AA9多肽、以及纤维二糖水解酶I、纤维二糖水解酶II、或纤维二糖水解酶I和纤维二糖水解酶II的组合。
在另一方面，酶组合物包含乙酰甘露聚糖酯酶。在另一方面，该酶组合物包含乙酰木聚糖酯酶。在另一方面，该酶组合物包含阿拉伯聚糖酶(例如，α-L-阿拉伯聚糖酶)。在另一方面，该酶组合物包含阿拉伯呋喃糖苷酶(例如，α-L-阿拉伯呋喃糖苷酶)。在另一方面，该酶组合物包含香豆酸酯酶。在另一方面，该酶组合物包含阿魏酸酯酶。在另一方面，该酶组合物包含半乳糖苷酶(例如，α-半乳糖苷酶和/或β-半乳糖苷酶)。在另一方面，该酶组合物包含葡糖醛酸糖苷酶(例如，α-D-葡糖醛酸糖苷酶)。在另一方面，该酶组合物包含葡糖醛酸酯酶。在另一方面，该酶组合物包含甘露聚糖酶。在另一方面，该酶组合物包含甘露糖苷酶(例如，β-甘露糖苷酶)。在另一方面，该酶组合物包含木聚糖酶。在一个实施例中，木聚糖酶是家族10的木聚糖酶。在另一个实施例中，木聚糖酶是家族11的木聚糖酶。在另一方面，该酶组合物包含木糖苷酶(例如β-木糖苷酶)。
在另一方面，该酶组合物包含酯酶。在另一方面，该酶组合物包含棒曲霉素。在另一方面，该酶组合物包含木质素分解酶。在一个实施例中，木质素分解酶是锰过氧化物酶。在另一个实施例中，木质素分解酶是木质素过氧化物酶。在另一个实施例中，木质素分解酶是H2O2产生酶。在另一方面，该酶组合物包含果胶酶。在另一方面，该酶组合物包含氧化还原酶。在一个实施例中，氧化还原酶是过氧化氢酶。在另一个实施例中，氧化还原酶是漆酶。在另一个实施例中，氧化还原酶是过氧化物酶。在另一方面，酶组合物包含蛋白酶。在另一方面，酶组合物包含膨胀蛋白。
在本发明的方法中，可以在糖化、糖化和发酵、或发酵之前或期间添加该一种或多种酶。
该酶组合物的一种或多种(例如，若干种)组分可以是天然蛋白、重组蛋白或天然蛋白与重组蛋白的组合。例如，一种或多种(例如，若干种)组分可以是用作宿主细胞以重组表达该酶组合物的一种或多种(例如，若干种)其他组分的细胞的天然蛋白。在此应理解的是，重组蛋白对于宿主细胞可以是异源的(例如，外源的)和/或原生的。可以作为单组分生成酶组合物的一种或多种(例如，若干种)组分，然后将它们组合以形成酶组合物。酶组合物可以是多组分和单组分蛋白制剂的组合。
在本发明的方法中使用的酶可以是以任何适于使用的形式存在的，例如像发酵液配制品或细胞组合物、具有或不具有细胞碎片的细胞裂解物、半纯化或纯化的酶制剂、或作为酶的来源的宿主细胞。该酶组合物可以是干粉或颗粒、非尘颗粒、液体、稳定化的液体或稳定化的受保护的酶。可以根据已建立的方法例如通过添加稳定剂(如糖、糖醇或其他多元醇)、和/或乳酸或另一种有机酸，对液体酶制剂进行稳定化。
具有纤维二糖水解酶活性的酶和多肽的最佳量取决于若干因素，包括但不限于：纤维素分解酶和/或半纤维素分解酶的混合物、纤维素材料、纤维素材料的浓度、纤维素材料的一种或多种预处理、温度、时间、pH、以及发酵有机体(例如，用于同时糖化和发酵)的纳入。
在一方面，纤维素分解酶或半纤维素分解酶对纤维素材料的有效量是约0.5至约50mg，例如，约0.5至约40mg、约0.5至约25mg、约0.75至约20mg、约0.75至约15mg、约0.5至约10mg、或约2.5至约10mg/g纤维素材料。
在另一方面，具有纤维二糖水解酶活性的多肽对纤维素材料的有效量是约0.01至约50.0mg，例如，约0.01至约40mg、约0.01至约30mg、约0.01至约20mg、约0.01至约10mg、约0.01至约5mg、约0.025至约1.5mg、约0.05至约1.25mg、约0.075至约1.25mg、约0.1至约1.25mg、约0.15至约1.25mg、或约0.25至约1.0mg/g纤维素材料。
在另一方面，对于纤维素分解酶或半纤维素分解酶来说的具有纤维二糖水解酶活性的多肽的有效量是约0.005至约1.0g，例如约0.01至约1.0g、约0.15至约0.75g、约0.15至约0.5g、约0.1至约0.5g、约0.1至约0.25g、或约0.05至约0.2g/g的纤维素分解酶或半纤维素分解酶。
具有纤维素分解酶活性或半纤维素分解酶活性的多肽以及有用于降解纤维素材料的其他蛋白/多肽(例如，AA9多肽)可以从任何合适的来源衍生或获得，包括古细菌、细菌、真菌、酵母、植物或哺乳动物来源。术语“获得的”在此还指已经采用在此所述的方法，在宿主有机体中重组产生的酶，其中重组产生的酶对于宿主有机体而言是天然的或外源的，或具有修饰的氨基酸序列，例如具有一个或多个(例如，若干个)缺失、插入和/或取代的氨基酸，即重组产生的酶是天然氨基酸序列的突变体和/或片段或由本领域已知的核酸改组过程产生的酶。天然酶的含义中涵盖天然变体，而外源酶的含义中涵盖如通过定点诱变或改组获得的变体。
每种多肽都可以是细菌多肽。例如，每种多肽可以是具有酶活性的革兰氏阳性细菌多肽，或具有酶活性的革兰氏阴性细菌多肽。
每种多肽还可以是真菌多肽(例如，酵母菌多肽或丝状真菌多肽)。
还可以使用多肽的化学修饰的或蛋白工程化的突变体。
该酶组合物的一种或多种(例如，若干种)组分可以是重组组分，即，通过克隆编码该单一组分的DNA序列并且随后用该DNA序列转化细胞并且在宿主中表达产生(参见，例如，WO 91/17243和WO 91/17244)。该宿主可以是异源宿主(酶对于宿主来说是外源的)，但该宿主在某些条件下也可以是同源宿主(酶对于宿主来说是原生的)。还可以通过纯化来自发酵液的这样一种蛋白来制备单组分纤维素分解蛋白。
在一方面，该一种或多种(例如，若干种)纤维素分解酶包含商业纤维素分解酶制剂。适用于本发明的商业纤维素分解酶制剂的实例包括例如：CTec(诺维信公司)、CTec2(诺维信公司)、/>CTec3(诺维信公司)、CELLUCLASTTM(诺维信公司)、NOVOZYMTM188(诺维信公司)、SPEZYMETMCP(杰能科国际(Genencor Int.))、ACCELLERASETMTRIO(杜邦公司(DuPont))、/>NL(DSM公司)；/>S/L 100(DSM公司)、ROHAMENTTM7069W(罗姆公司(/>GmbH))、或/>CMAX3TM(Dyadic国际有限公司(Dyadic International,Inc.))。以从约0.001wt.％至约5.0wt.％的固体，例如0.025wt.％至约4.0wt.％的固体、或约0.005wt.％至约2.0wt.％的固体的有效量添加纤维素分解酶制剂。
可在本发明的方法中使用的细菌内切葡聚糖酶的实例包括但不限于：解纤维热酸菌(Acidothermus cellulolyticus)内切葡聚糖酶(WO 91/05039；WO 93/15186；美国专利申请号5,275,944；WO 96/02551；美国专利申请号5,536,655，WO 00/70031，WO 05/093050)、胡萝卜软腐欧文氏菌(Erwinia carotovara)内切葡聚糖酶(Saarilahti等人，1990，Gene[基因]90:9-14)、嗜热裂孢菌(Thermobifida fusca)内切葡聚糖酶III(WO 05/093050)、以及嗜热裂孢菌(Thermobifida fusca)内切葡聚糖酶V(WO 05/093050)。
可以用于本发明的真菌内切葡聚糖酶的实例包括但不限于：里氏木霉内切葡聚糖酶I(Penttila等人，1986，基因45:253-263，里氏木霉Cel7B内切葡聚糖酶I(GenBank:M15665)、里氏木霉内切葡聚糖酶II(Saloheimo等人，1988，Gene[基因]63:11-22)，里氏木霉Cel5A内切葡聚糖酶II(GenBank:M19373)、里氏木霉内切葡聚糖酶III(Okada等人，1988，Appl.Environ.Microbiol.[应用与环境微生物学]64:555-563，GenBank:AB003694)、里氏木霉内切葡聚糖酶V(Saloheimo等人，1994，Molecular Microbiology[分子微生物学]13:219-228，GenBank:Z33381)、棘孢曲霉内切葡聚糖酶(Ooi等人，1990，Nucleic AcidsResearch[核酸研究]18:5884)、白曲霉内切葡聚糖酶(Sakamoto等人，1995，CurrentGenetics[当代遗传学]27:435-439)、尖镰孢内切葡聚糖酶(GenBank:L29381)、灰腐质霉高温变种(Humicola grisea var.thermoidea)内切葡聚糖酶(GenBank:AB003107)、热白丝菌(Melanocarpus albomyces)内切葡聚糖酶(GenBank:MAL515703)、粗糙脉孢菌内切葡聚糖酶(GenBank:XM_324477)、特异腐质霉内切葡聚糖酶V、嗜热毁丝霉CBS 117.65内切葡聚糖酶、金黄色嗜热子囊菌内切葡聚糖酶I(GenBank:AF487830)、里氏木霉菌株号VTT-D-80133内切葡聚糖酶(GenBank:M15665)、以及嗜松青霉内切葡聚糖酶(WO 2012/062220)。
可用在本发明中的纤维二糖水解酶的实例包括但不限于：棘孢曲霉纤维二糖水解酶II(WO 2011/059740)、烟曲霉纤维二糖水解酶I(WO 2013/028928)、烟曲霉纤维二糖水解酶II(WO 2013/028928)、嗜热毛壳菌纤维二糖水解酶I、嗜热毛壳菌纤维二糖水解酶II、特异腐质霉纤维二糖水解酶I、嗜热毁丝霉纤维二糖水解酶II(WO 2009/042871)、奥斯塔尼青霉(Penicillium occitanis)纤维二糖水解酶I(GenBank:AY690482)、埃默森篮状菌纤维二糖水解酶I(GenBank:AF439936)、赫卡尼亚梭孢壳霉(Thielavia hyrcanie)纤维二糖水解酶II(WO 2010/141325)、土生梭孢壳霉纤维二糖水解酶II(CEL6A，WO 2006/074435)、里氏木霉纤维二糖水解酶I、里氏木霉纤维二糖水解酶II、以及褐孢长毛盘菌纤维二糖水解酶II(WO 2010/057086)。
适用于本发明的β-葡糖苷酶的实例包括但不限于来自以下各项的β-葡糖苷酶：棘孢曲霉(Kawaguchi等人，1996，Gene[基因]173:287-288)、烟曲霉(WO 2005/047499)、黑曲霉(Dan等人，2000，J.Biol.Chem.[生物化学杂志]275:4973-4980)、米曲霉(WO 02/095014)、巴西青霉菌IBT 20888(WO 2007/019442和WO 2010/088387)、土生梭孢壳霉(WO2011/035029)、以及褐孢长毛盘菌(WO 2007/019442)。
其他有用的内切葡聚糖酶、纤维二糖水解酶和β-葡糖苷酶在采用根据下述文献的分类的很多糖基水解酶家族中披露：Henrissat，1991，Biochem.J.[生物化学杂志]280:309-316，以及Henrissat和Bairoch，1996，生物化学杂志316:695-696。
在本发明的方法中，任何AA9多肽都可以被用作酶组合物的组分。
在本发明的方法中有用的AA9多肽的实例包括但不限于来自于以下各项的AA9多肽：土生梭孢壳霉(WO 2005/074647、WO 2008/148131和WO 2011/035027)、金黄色嗜热子囊菌(WO 2005/074656和WO 2010/065830)、里氏木霉(WO 2007/089290和WO 2012/149344)、嗜热毁丝霉(WO 2009/085935、WO 2009/085859、WO 2009/085864、WO 2009/085868及WO2009/033071)、烟曲霉(WO 2010/138754)、嗜松青霉(WO 2011/005867)、嗜热子嚢菌属物种(WO 2011/039319)、青霉菌属物种(埃默森青霉菌)(WO 2011/041397和WO 2012/000892)、甲壳嗜热子囊菌(Thermoascus crustaceous)(WO 2011/041504)、棘孢曲霉(WO 2012/125925)、疏棉状嗜热丝孢菌(WO 2012/113340、WO 2012/129699、WO 2012/130964及WO2012/129699)、Aurantiporus alborubescens(WO 2012/122477)、褐孢长毛盘菌(WO 2012/122477)、托姆青霉(WO 2012/122477)、柄篮状菌(WO 2012/135659)、特异腐质霉(WO 2012/146171)、樟绒枝霉(WO 2012/101206)、Talaromyces leycettanus(WO 2012/101206)、以及嗜热毛壳菌(WO 2012/101206)和嗜热篮状菌(Talaromyces thermophilus)(WO 2012/129697和WO 2012/130950)。
在一方面，AA9多肽在根据WO 2008/151043或WO 2012/122518的可溶性活化二价金属阳离子(例如锰或铜)的存在下使用。
在另一方面，AA9多肽在二氧化合物、二环化合物、杂环化合物、含氮化合物、醌化合物、含硫化合物、或从预处理的纤维素材料(如预处理的玉米秸秆)获得的液体的存在下使用(WO 2012/021394、WO 2012/021395、WO 2012/021396、WO 2012/021399、WO 2012/021400、WO 2012/021401、WO 2012/021408、以及WO 2012/021410)。
在一方面，以这样一种化合物对纤维素的葡糖基单元的以下摩尔比添加该化合物：约10-6至约10，例如，约10-6至约7.5、约10-6至约5、约10-6至约2.5、约10-6至约1、约10-5至约1、约10-5至约10-1、约10-4至约10-1、约10-3至约10-1、或约10-3至约10-2。在另一方面，这样一种化合物的有效量是约0.1μM至约1M，例如约0.5μM至约0.75M、约0.75μM至约0.5M、约1μM至约0.25M、约1μM至约0.1M、约5μM至约50mM、约10μM至约25mM、约50μM至约25mM、约10μM至约10mM、约5μM至约5mM、或约0.1mM至约1mM。
术语“液体(liquor)”意指在如描述于WO 2012/021401中的条件下，由处理浆料中的木质纤维素和/或半纤维素材料、或其单糖(例如，木糖、阿拉伯糖、甘露糖等)所产生的溶液相(水相、有机相或其组合)、及其可溶性内容物。用于AA9多肽的纤维素分解增强的液体可以通过，任选在催化剂(例如酸)的存在下、任选在有机溶剂的存在下、并且任选与物理破坏一种木质纤维素或半纤维素材料(或原料)组合，通过施加热和/或压力来对该材料进行处理，并且然后将溶液与残余固体分离来产生。在由纤维素分解酶制剂对纤维素底物的水解过程中，从液体与AA9多肽的组合中可得到纤维素分解增强的程度是由这类条件确定的。可以使用本领域的标准方法，如过滤、沉淀或离心，而将液体与经过处理的材料进行分离。
在一方面，该液体对纤维素的有效量是约10-6至约10g/g的纤维素，例如约10-6至约7.5g、约10-6至约5g、约10-6至约2.5g、约10-6至约1g、约10-5至约1g、约10-5至约10-1g、约10-4至约10-1g、约10-3至约10-1g、或约10-3至约10-2g/g的纤维素。
在一方面，该一种或多种(例如，若干种)半纤维素分解酶包含商业半纤维素分解酶制剂。适于在本发明中使用的商业化半纤维素分解酶制剂的实例包括例如SHEARZYMETM(诺维信公司)、HTec(诺维信公司)、/>HTec2(诺维信公司)、/>HTec3(诺维信公司)、/>(诺维信公司)、/>(诺维信公司)、/>HC(诺维信公司)、/>木聚糖酶(杰能科公司)、/>XY(杰能科公司)、/>XC(杰能科公司)、/>TX-200A(AB酶公司(AB Enzymes))、HSP 6000木聚糖酶(DSM)、DEPOLTM333P(生物催化剂有限公司(Biocatalysts Limit)，威尔士，英国)、DEPOLTM740L(生物催化剂有限公司，威尔士，英国)以及DEPOLTM762P(生物催化剂有限公司，威尔士，英国)、ALTERNA FUEL 100P(Dyadic公司)和ALTERNA FUEL 200P(Dyadic公司)。
在本发明的方法中有用的木聚糖酶的实例包括但不限于来自以下各项的木聚糖酶：棘孢曲霉(GeneSeqP:AAR63790；WO 94/21785)、烟曲霉(WO 2006/078256)、嗜松青霉(WO2011/041405)、青霉属物种(WO 2010/126772)、疏棉状嗜热丝孢菌(GeneSeqP：BAA22485)、嗜热篮状菌(GeneSeqP：BAA22834)、土生梭孢霉NRRL 8126(WO 2009/079210)、以及褐孢长毛盘菌(WO 2011/057083)。
在本发明的方法中有用的β-木糖苷酶包括但不限于来自以下各项的β-木糖苷酶：粗糙脉孢菌(SwissProt:Q7SOW4)、里氏木霉(UniProtKB/TrEMBL：Q92458)、埃默森篮状菌(SwissProt:Q8X212)、以及嗜热篮状菌(GeneSeqP：BAA22816)。
在本发明的方法中有用的乙酰木聚糖酯酶的实例包括但不限于来自以下各项的乙酰木聚糖酯酶：棘孢曲霉(WO 2010/108918)，球毛壳菌(UniProt:Q2GWX4)，细丽毛壳菌(Chaetomium gracile)(GeneSeqP：AAB82124)，特异腐质霉DSM 1800(WO 2009/073709)，红褐肉座菌(WO 2005/001036)，嗜热毁丝菌(Myceliophtera thermophila)(WO 2010/014880)，粗糙脉孢菌(UniProt:q7s259)，颖枯壳针孢(Phaeosphaeria nodorum)(UniProt:Q0UHJ1)，以及土生梭孢壳霉NRRL 8126(WO 2009/042846)。
在本发明的方法中有用的阿魏酸酯酶(feruloyl esterase，ferulic acidesterase)的实例包括但不限于来自以下的阿魏酸酯酶：特异腐质霉DSM 1800(WO 2009/076122)，费希新萨托菌(Neosartorya fischeri)(UniProt:A1D9T4)，粗糙脉孢菌(UniProt:Q9HGR3)，黄灰青霉(Penicillium aurantiogriseum)(WO 2009/127729)，以及土生梭孢壳霉(WO 2010/053838和WO 2010/065448)。
在本发明的方法中有用的阿拉伯呋喃糖苷酶的实例包括但不限于来自以下的阿拉伯呋喃糖苷酶：黑曲霉(GeneSeqP:AAR94170)、特异腐质霉DSM 1800(WO 2006/114094和WO 2009/073383)、以及大型亚灰树花菌(M.giganteus)(WO 2006/114094)。
在本发明的方法中有用的α-葡糖醛酸糖苷酶的实例包括但不限于来自以下的α-葡糖醛酸糖苷酶：棒曲霉(UniProt:alcc12)、烟曲霉(SwissProt:Q4WW45)、黑曲霉(UniProt:Q96WX9)、土曲霉(SwissProt:Q0CJP9)、特异腐质霉(WO 2010/014706)、黄灰青霉(WO 2009/068565)、埃默森踝节菌(UniProt:Q8X211)、以及里氏木霉(UniProt:Q99024)。
在本发明的方法中有用的氧化还原酶的实例包括但不限于：Aspergilluslentilus过氧化氢酶、烟曲霉过氧化氢酶、黑曲霉过氧化氢酶、米曲霉过氧化氢酶、特异腐质霉过氧化氢酶、粗糙脉孢菌过氧化氢酶、埃默森青霉过氧化氢酶、嗜热色串孢(Scytalidium thermophilum)过氧化氢酶、柄篮状菌过氧化氢酶、橙色嗜热子囊菌过氧化氢酶、灰盖鬼伞(Coprinus cinereus)漆酶、嗜热毁丝霉漆酶、Polyporus pinsitus漆酶、鲜红密孔菌(Pycnoporus cinnabarinus)漆酶、立枯丝核菌(Rhizoctonia solani)漆酶、天蓝链霉菌(Streptomyces coelicolor)漆酶、灰盖鬼伞过氧化物酶、大豆过氧化物酶、王棕(Royal palm)过氧化物酶。
用于本发明的方法中的具有酶活性的多肽可以通过在含有适合碳源和氮源以及无机盐的营养介质上，使用本领域中已知的程序发酵上述微生物菌株来产生(参见，例如，班尼特，J.W.(Bennett,J.W.)和拉热，L.(LaSure,L.)(编辑)，真菌中的更多基因操纵(MoreGene Manipulations in Fungi)，学术出版社，加州，1991)。适合的介质可从商业供应商获得或可以根据公开的组成(例如，在美国典型培养物保藏中心的目录中)制备。适合于生长和酶产生的温度范围和其他条件在本领域中是已知的(参见，例如，贝利·J.E.(Bailey,J.E.)和奥利斯·D.F.(Ollis,D.F.)，生物化学工程基础(Biochemical EngineeringFundamentals)，麦格劳-希尔图书公司(McGraw-Hill Book Company)，纽约，1986)。
发酵可以是导致酶或蛋白质的表达或分离的培养细胞的任何方法。所以，可以将发酵理解为包含摇瓶培养，或者在一种适合的介质中并且在允许表达或分离该酶的条件下在实验室或工业发酵罐中进行小规模或大规模发酵(包括连续发酵、分批发酵、分批补料发酵或固态发酵)。通过上述方法产生的所得酶可以从发酵介质回收并且通过常规程序纯化。
发酵.可以通过能够将糖直接或间接发酵成所希望的发酵产物的一种或多种(例如，若干种)发酵微生物发酵从水解的纤维素材料获得的可发酵糖。“发酵”或“发酵过程”指任何发酵过程或包括发酵步骤的任何方法。发酵过程还包括用于消费性醇工业(例如啤酒和葡萄酒)、乳品工业(例如发酵的乳制品)、皮革工业和烟草工业的发酵过程。发酵条件取决于所希望的发酵产物和发酵有机体，并且可以由本领域的普通技术人员容易地确定。
在发酵步骤中，作为预处理和酶水解步骤的结果从纤维素材料释放的糖，通过发酵有机体(如酵母)发酵成为产物，例如，乙醇。水解(糖化)和发酵可以是分开的或同时的。
在实践本发明的发酵步骤中可以使用任何适合的水解的纤维素材料。该材料一般是基于经济学，即，每当量糖势的成本，以及对酶致转变的难降解性而进行选择。
术语“发酵介质”在此可理解为指在添加一种或多种发酵微生物之前的介质，如，由糖化过程产生的介质，以及在同时糖化和发酵过程(SSF)中使用的介质。
“发酵微生物”是指适用于所希望的发酵过程以产生发酵产物的任何微生物，包括细菌有机体和真菌有机体。发酵有机体可以是己糖和/或戊糖发酵有机体、或其组合。己糖和戊糖发酵有机体二者均是本领域中所熟知的。适合的发酵微生物能够将糖(如葡萄糖、木糖、木酮糖、阿拉伯糖、麦芽糖、甘露糖、半乳糖、和/或寡糖)直接或间接地发酵(即，转化)成所希望的发酵产物。由Lin等人，2006，Appl.Microbiol.Biotechnol.[应用微生物学与生物技术]69:627-642描述了产生乙醇的细菌和真菌发酵有机体的实例。
能够发酵己糖的发酵微生物的实例包括细菌有机体和真菌有机体，如酵母。酵母包括以下各项的菌株：假丝酵母属、克鲁维酵母属、以及酵母菌属，例如萨纳瑞西斯假丝酵母(Candida sonorensis)、马克斯克鲁维酵母、以及酿酒酵母。
可以发酵处于其原生状态的戊糖的发酵微生物的实例包括细菌有机体和真菌有机体，如一些酵母。发酵木糖的酵母包括假丝酵母属的菌株，优选是休哈塔假丝酵母(C.sheatae)或萨纳瑞西斯假丝酵母(C.sonorensis)；以及毕赤酵母属的菌株，例如是树干毕赤酵母，如树干毕赤酵母CBS 5773。发酵戊糖的酵母包括管囊酵母属的菌株，优选是嗜鞣管囊酵母(P.tannophilus)。不能发酵戊糖(如木糖和阿拉伯糖)的生物可以通过本领域已知方法来进行遗传修饰而发酵戊糖。
能够有效地将己糖和戊糖发酵成乙醇的细菌的实例包括，例如，凝结芽孢杆菌、丙酮丁醇梭菌(Clostridium acetobutylicum)、热纤维梭菌(Clostridium thermocellum)、发酵植物多糖梭菌(Clostridium phytofermentans)、土芽孢杆菌属物种、解糖热厌氧杆菌(Thermoanaerobacter saccharolyticum)、以及运动发酵单胞菌(Zymomonas mobilis)(Philippidis,G.P.，1996，Cellulose bioconversion technology[纤维素生物转化技术]，Handbook on Bioethanol:Production and Utilization[生物乙醇手册：生产和利用]，Wyman,C.E.编辑，泰勒-弗朗西斯出版集团，华盛顿特区，179-212)。
其他发酵有机体包括以下各项的菌株：芽孢杆菌属，如凝结芽孢杆菌；假丝酵母属，如萨纳瑞西斯假丝酵母、甲醇山梨糖假丝酵母(C.methanosorbosa)、迪丹斯假丝酵母(C.diddensiae)、近平滑假丝酵母(Candida parapsilosis)、C.naedodendra、布朗克假丝酵母(C.blankii)、嗜虫假丝酵母(C.entomophilia)、芸薹假丝酵母(C.brassicae)、假热带假丝酵母(C.pseudotropicalis)、博伊丁假丝酵母(C.boidinii)、产朊假丝酵母(C.utilis)、以及休哈塔假丝酵母；梭菌属，如丙酮丁醇梭菌、热纤维梭菌、以及发酵植物多糖梭菌；大肠杆菌，特别是已被遗传修饰以改善乙醇产量的大肠杆菌菌株；土芽孢杆菌属种；汉逊酵母属，如异常汉逊酵母(Hansenula anomala)；克雷伯氏菌属(Klebsiella)，如产酸克雷伯氏菌(K.oxytoca)；克鲁维酵母属，如马克斯克鲁维酵母(K.marxianus)、乳酸克鲁维酵母(K.lactis)、耐热克鲁维酵母(K.thermotolerans)、以及脆壁克鲁维酵母(K.fragilis)；裂殖酵母属，如粟酒裂殖酵母(S.pombe)；热厌氧杆菌属(Thermoanaerobacter),如解糖热厌氧杆菌、以及发酵单胞菌属(Zymomonas),如运动发酵单胞菌。
适于乙醇生产的可商购的酵母包括，例如，AFT和XR(拉曼特殊化学公司(Lallemand Specialities,Inc.)，美国)、ETHANOL/>酵母(乐斯富公司(Lesaffre etCo)，派尼尔(pagnie)，法国)、/>(AB毛里食品有限公司(AB Mauri Food Inc.)，美国)、(雷姆科国际股份有限公司(Rymco International AG)，丹麦)、GERT STRANDTM(格特·斯特兰德公司(Gert Strand AB)，瑞典)、和SUPERSTARTTM和/>新鲜酵母(拉曼特殊化学公司，美国)。
在一方面，发酵微生物已经经过遗传修饰，以提供发酵戊糖的能力，如利用木糖的微生物、利用阿拉伯糖的微生物、以及共同利用木糖和阿拉伯糖的微生物。
将异源基因克隆到多种发酵微生物中已经构建出能够将己糖和戊糖转化成乙醇(共发酵)的有机体(Chen和Ho，1993，Appl.Biochem.Biotechnol.[应用生物化学与生物技术]39-40:135-147；Ho等人，1998，Appl.Environ.Microbiol.[应用与环境微生物学]64:1852-1859；Kotter和Ciriacy，1993，Appl.Microbiol.Biotechnol.[应用微生物学与生物技术]38:776-783；Walfridsson等人，1995，Appl.Environ.Microbiol.[应用与环境微生物学]61:4184-4190；Kuyper等人，2004，FEMS Yeast Research[欧洲微生物学会联合会酵母研究]4:655-664；Beall等人，1991，Biotech.Bioeng.[生物技术与生物工程]38:296-303；Ingram等人，1998，Biotechnol.Bioeng.[生物技术与生物工程]58:204-214；Zhang等人，1995，Science[科学]267:240-243；Deanda等人，1996，Appl.Environ.Microbiol.[应用与环境微生物学]62:4465-4470；WO 2003/062430)。
在一方面，该发酵微生物包含一种多核苷酸，该多核苷酸编码本发明的一种具有纤维二糖水解酶活性的多肽。
在另一方面，该发酵有机体包含编码在此描述的一种或多种纤维素分解酶、半纤维素分解酶和辅助酶的一个或多个多核苷酸。
本领域中熟知的是，以上所描述的有机体还可以用于产生其他物质，如在此所描述的。
典型地向降解的纤维素材料或水解物中添加发酵微生物，并且进行发酵持续约8至约96小时，例如约24至约60小时。温度典型地在约26℃至约60℃之间，例如约32℃或50℃，并且pH为约pH 3至约pH 8，例如pH 4至5、6、或7。
在一方面，应用酵母和/或另一种微生物至降解的纤维素材料并且进行发酵，持续约12至约96小时，如典型地24-60小时。在另一方面，温度优选在约20℃至约60℃之间，例如约25℃至约50℃、约32℃至约50℃、或约32℃至约50℃，并且pH通常是从约pH 3至约pH 7，例如约pH 4至约pH 7。然而，一些发酵有机体(例如细菌)具有更高的最适发酵温度。酵母或另一种微生物优选以每ml发酵液大约105至1012，优选从大约107至1010，特别是大约2×108个活细胞计数的量施用。关于使用酵母进行发酵的进一步指南可以见于例如“The AlcoholTextbook[醇教材]”(K.Jacques、Lyons以及D.R.Kelsall编辑，(诺丁汉大学出版社)Nottingham University Press，英国1999)，将其通过引用结合在此。
发酵刺激剂可以与在此所述的任何方法组合使用，以进一步改进发酵过程，而且特定地，改进发酵微生物的性能，如，速率增加和乙醇产量。“发酵刺激剂”是指用于发酵微生物(特别是酵母)生长的刺激剂。用于生长的优选发酵刺激剂包括维生素和矿物质。维生素的实例包括多种维生素、生物素、泛酸、烟酸、内消旋肌醇、硫胺素、吡哆醇、对氨基苯酸、叶酸、核黄素、以及维生素A、B、C、D和E。例如，参见Alfenore等人，Improving ethanolproduction and viability of Saccharomyces cerevisia by a vitamin feedingstrategy during fed-batch process[通过在进料分批方法过程中的一种维生素进料策略改进乙醇产生和酿酒酵母的存活力]，施普林格(2002)，其通过引用结合在此。矿物质的实例包括可以供应包含P、K、Mg、S、Ca、Fe、Zn、Mn、和Cu营养素的矿物质和矿物盐。
发酵产物：发酵产物可以是由发酵得到的任何物质。发酵产物可以是而不限于：醇(例如，阿拉伯糖醇、正丁醇、异丁醇、乙醇、甘油、甲醇、乙二醇、1,3-丙二醇(丙二醇)、丁二醇、丙三醇、山梨醇、以及木糖醇)；烷烃(例如戊烷、己烷、庚烷、辛烷、壬烷、癸烷、十一烷、以及十二烷)；环烷烃(例如，环戊烷、环己烷、环庚烷、以及环辛烷)；烯烃(例如，戊烯、己烯、庚烯、以及辛烯)；氨基酸(例如，天冬氨酸、谷氨酸、甘氨酸、赖氨酸、丝氨酸、以及苏氨酸)；气体(例如，甲烷、氢气(H2)、二氧化碳(CO2)、以及一氧化碳(CO))；异戊二烯；酮(例如，丙酮)；有机酸(例如，乙酸、醋酮酸、己二酸、抗坏血酸、柠檬酸、2,5-二酮-D-葡糖酸、甲酸、富马酸、葡糖二酸、葡糖酸、葡糖醛酸、戊二酸、3-羟基丙酸、衣康酸、乳酸、苹果酸、丙二酸、草酸、草酰乙酸、丙酸、琥珀酸、以及木糖酸)；以及聚酮化合物。
在一方面，该发酵产物是醇。术语“醇”涵盖含有一个或多个羟基部分的物质。醇可以是而不限于：正丁醇、异丁醇、乙醇、甲醇、阿拉伯糖醇、丁二醇、乙二醇、甘油(glycerin)、丙三醇(glycerol)、1,3-丙二醇、山梨醇、木糖醇。参见，例如，Gong等人，1999，Ethanolproduction from renewable resources[由可再生资源生产乙醇]，在：Advances inBiochemical Engineering/Biotechnology[生化工程/生物技术进展]中，Scheper,T.编辑，施普林格出版社，柏林，海德堡，德国，65:207-241；Silveira和Jonas，2002，Appl.Microbiol.Biotechnol.[应用微生物学与生物技术]59:400-408；Nigam和Singh，1995，Process Biochemistry[加工生物化学]30(2):117-124；Ezeji等人，2003，WorldJournal of Microbiology and Biotechnology[微生物与生物技术世界杂志]19(6):595-603。
在另一方面，该发酵产物是烷烃。该烷烃可以是非支链或支链烷烃。烷烃可以是而不限于：戊烷、己烷、庚烷、辛烷、壬烷、癸烷、十一烷、或十二烷。
在另一方面，该发酵产物是环烷烃。环烷烃可以是而不限于：环戊烷、环己烷、环庚烷或环辛烷。
在另一方面，该发酵产物是烯烃。该烯烃可以是非支链或支链烯烃。烯烃可以是而不限于：戊烯、己烯、庚烯或辛烯。
在另一方面，该发酵产物是氨基酸。有机酸可以是而不限于：天冬氨酸、谷氨酸、甘氨酸、赖氨酸、丝氨酸、或苏氨酸。参见，例如Richard和Margaritis，2004，Biotechnologyand Bioengineering[生物技术和生物工程]87(4):501-515。
在另一方面，该发酵产物是气体。气体可以是而不限于：甲烷、H2、CO2、或CO。参见，例如，Kataoka等人，1997，Water Science and Technology[水科学与技术]36(6-7)：41-47；以及Gunaseelan，1997，Biomass and Bioenergy[生物质与生物能源]13(1-2):83-114。
在另一方面，该发酵产物是异戊二烯。
在另一方面，该发酵产物是一种酮。术语“酮”涵盖含有一个或多个酮部分的物质。酮可以是而不限于：丙酮。
在另一方面，该发酵产物是一种有机酸。有机酸可以是而不限于：乙酸、醋酮酸、己二酸、抗坏血酸、柠檬酸、2,5-二酮-D-葡糖酸、甲酸、富马酸、葡糖二酸、葡糖酸、葡糖醛酸、戊二酸、3-羟基丙酸、衣康酸、乳酸、苹果酸、丙二酸、草酸、丙酸、琥珀酸、或木糖酸)。参见，例如，Chen和Lee，1997，Appl.Biochem.Biotechnol.[应用生物化学与生物技术]63-65:435-448。
在另一方面，该发酵产物是聚酮化合物。
回收.可以使用本领域中已知的任何方法可任选地从发酵介质回收一种或多种发酵产物，这些方法包括但不限于，层析法、电泳程序、差别溶解度、蒸馏、或提取。例如，通过常规蒸馏方法从发酵的纤维素材料中分离和纯化醇。可以获得具有高达约96vol.％的纯度的乙醇，这可以用作例如燃料乙醇、饮用乙醇，即可饮用的中性烈酒、或工业乙醇。
通过以下实施例进一步对本发明进行描述，但不应将其理解为对本发明范围的限制。
实例
菌株
通过在37℃下在YG琼脂板上稀释而从自2000年中国湖南省收集的土壤样本中分离真菌菌株NN046817。通过将单个分生孢子转移到YG琼脂板上进行纯化。根据形态特征和ITS rDNA序列二者，将NN046817菌株鉴定为半内果菌属物种。
介质和溶液
基本介质平板：20g琼脂、20ml盐溶液、30g蔗糖、100μl Triton X-100，调节pH至6，添加H2O至1升，高压釜中。使用之前，沸腾并冷却至约50℃，并且然后添加10ml 1M乙酰胺。
PDA介质含有39克的马铃薯右旋糖琼脂和补足至1升的去离子水。
YG琼脂平板含有5.0g的酵母提取物、10.0g的葡萄糖、20.0g的琼脂和去离子水加至1升。
YPG介质在去离子水中含有0.4％的酵母提取物、0.1％的KH2PO4、0.05％的MgSO4·7H2O、1.5％的葡萄糖。
YPM介质含有1％酵母提取物、2％的蛋白胨和2％的麦芽糖。
实例1：半内果菌属物种NN046817基因组的DNA提取
将半内果菌属物种菌株NN046817接种到PDA板上，并且在37℃下于暗处孵育3天。然后将若干个菌丝-PDA塞接种于含有100ml的YPG介质的500ml摇瓶中。在以160rpm振荡下，将这些烧瓶在37℃下孵育3天。通过过滤通过(康碧泉公司(Calbiochem))来收集这些菌丝，并且在液氮中冷冻。用研钵和研棒将冷冻的菌丝磨碎成细粉，并且使用Plant Maxi试剂盒(凯杰有限公司(QIAGEN))遵循制造商的说明分离出基因组DNA。
实例2：基因组测序、装配与标注
将提取的基因组DNA样品递送至Fasteris(瑞士)使用HiSeq 2000系统(Illumina公司)进行基因组测序。使用SOAPdenovo程序(Li等人，2010，Genome Research[基因组研究]20:265-72)将原始读数在Fasteris装配。使用标准生物信息学方法分析装配的序列，用于基因鉴定和功能预测。使用GeneMark(Ter-Hovhannisyan V等人，2008，GenomeResearch[基因组研究]18(12):1979-1990)预测基因。使用Blastall版本2.2.10(Altschul等人，1990，J.Mol.Biol.[分子生物学杂志]215(3):403-410)和HMMER版本2.1.1(美国国家生物技术信息中心(NCBI)，贝塞斯达，马里兰州，美国)基于结构同源性预测功能。GH7家族纤维二糖水解酶多肽通过分析Blast结果直接鉴定出。使用Agene程序(Munch和Krogh，2006，BMC Bioinformatics[BMC生物信息学]7:263)和SignalP程序(Nielsen等人，1997，Protein Engineering[蛋白质工程]10:1-6)鉴定起始密码子。进一步使用SignalP程序来预测信号肽。使用Pepstats(Rice等人，2000，Trends Genet.[遗传学趋势]16(6):276-277)来预测等电点和分子量。
实例3：从基因组DNA克隆半内果菌属物种GH7纤维二糖水解酶I基因
选择GH7纤维二糖水解酶I基因，GH7_Hami(针对基因组DNA序列的SEQ ID NO:1以及针对推导的氨基酸序列的SEQ ID NO:2)用于表达克隆。
基于获得自基因组测序的DNA信息，设计以下示出的寡核苷酸引物以从半内果菌属物种菌株NN046817的基因组DNA中扩增GH7纤维二糖水解酶I的编码序列。这些引物是由中国北京的英杰公司(Invitrogen)合成的。
正向引物：
5’-ACACAACTGGGGATCCACCatggctgctacaaaatcttaccgaatctac-3’(SEQ ID NO:3)
反向引物：
5’-CCCTCTAGATCTCGAGacgtaacttctccagccgtctctc-3’(SEQ ID NO:4)
正向引物中的小写字符表示基因的编码区并且反向引物中的小写字符表示基因的侧翼区域，而粗体字符表示与pCaHj505的插入位置同源的区域(WO 2013029496)。正向引物中的编码序列之前的4个字母表示用于启动翻译的Kozark序列。
将上述正向和反向引物的二十皮摩尔用于PCR，该PCR由1μl的半内果菌属物种菌株NN046817基因组DNA、10μl的5XHF缓冲液(Finnzymes Oy公司，艾斯堡，芬兰)、1.5μl的DMSO、各1.5μl的2.5mM的dATP、dTTP、dGTP和dCTP以及0.6单位的PHUSIONTM高保真度DNA聚合酶(Finnzymes Oy公司，艾斯堡，芬兰)，最终体积为50μl。该PCR是使用热循环仪进行的，该热循环仪被编程为在98℃下变性1分钟；8个循环的在98℃下变性30秒、在66℃下退火30秒(其中每个循环降低1℃)、以及在72℃下伸长2分钟；25个循环的各在98℃下30秒、60℃下30秒、以及72℃下2分钟；以及在72℃下最终延伸7分钟。加热块然后进入4℃浸泡循环。
通过1.0％的琼脂糖凝胶电泳，使用90mM Tris-硼酸盐及1mM EDTA(TBE)缓冲液来分离这些PCR产物，其中在UV光下观测约1.6kb的单一产物带。用克隆增强子(ClontechLaboratories,Inc.[克罗泰克实验有限公司])处理PCR溶液，通过添加2μl的克隆增强子至5μl的PCR溶液中。将PCR溶液在37℃孵育20分钟，并且然后在热循环仪中在80℃孵育15分钟。
将质粒pCaHj505用Bam HI和Xho I消化，使用TBE缓冲液通过1.0％琼脂糖凝胶电泳来分离，并且根据制造商的说明书，使用ILLUSTRATMGFXTMPCR DNA和凝胶带纯化试剂盒(通用电气医疗集团)进行纯化。
根据制造商的说明书，使用克隆试剂盒(克罗泰克实验有限公司)连接克隆增强子处理的PCR溶液和消化的质粒pCaHj505，得到质粒p505-GH7_Hami(图1)，其中半内果菌属物种GH7纤维二糖水解酶I多肽编码序列的转录是在米曲霉α-淀粉酶基因启动子的控制下。简言之，将1μl用Bam HI和Xho I消化的30ng/ul的pCaHj505，和含有约60ng的半内果菌属物种GH7纤维二糖水解酶I PCR片段的3μl的克隆增强子处理的PCR溶液添加至1μl的5X In-Fusion HD酶预混物。将反应在37℃下孵育15分钟，并且然后在50℃下孵育15分钟。使用3μl的连接反应物转化大肠杆菌TOP10感受态细胞(天根生物科技(TIANGENBiotech))。通过菌落PCR检测含有表达构建体的大肠杆菌转化体。菌落PCR是一种用于直接从大肠杆菌菌落快速筛选质粒插入片段的方法。简言之，将一个单一菌落转移至PCR管中的预混合的PCR溶液中，该PCR溶液包括PCR缓冲液、MgCl2、dNTPs、以及从其中产生PCR片段的引物对。筛选若干个菌落。在PCR后，将反应通过1.0％琼脂糖凝胶电泳使用TBE缓冲液进行分析。使用/>Spin Miniprep试剂盒(凯杰公司)从示出具有预期大小的插入物的菌落制备质粒DNA。使用3730XL DNA分析仪(应用生物系统有限公司(Applied BiosystemsInc.))通过DNA测序确认插入p505-GH7_Hami中的半内果菌属物种GH7纤维二糖水解酶I编码序列。
实例4：米曲霉中半内果菌属物种GH7纤维二糖水解酶I基因的表达
使用米曲霉菌株MT3568用于半内果菌属物种GH7纤维二糖水解酶I的编码序列异源性表达。米曲霉MT3568是米曲霉JaL355的amdS(乙酰胺酶)破坏的基因衍生物(WO 02/40694)，其中通过用pyrG基因破坏米曲霉乙酰胺酶(amdS)基因来恢复pyrG营养缺陷型。
根据如US 20140179588 A1的实例2中“曲霉表达宿主的转化”所描述的方法制备原生质体。使用3μg的p505-GH7_Hami来转化米曲霉MT3568，其产出约50个转化体。分离四个转化体至单独的基本介质平板，并且然后单独地接种到在24孔板中的3ml YPM介质中，并且在30℃、150rpm下孵育。3天的孵育之后，根据制造商的说明，在NuPAGE Novex 4％-12％Bis-Tris凝胶w/MES(英杰公司(Invitrogen Corporation))上对来自每一培养物的20μl上清液进行分析。所得到的凝胶用即用Instant Blue(艾本德有限公司(Expedeon Ltd.))进行染色。培养物的SDS-PAGE概貌显示大多数转化体具有大约55kDa的主要条带。将该表达菌株指定为米曲霉O521DH。
实例5：表达菌株米曲霉O521DH的发酵
将米曲霉O521DH的斜面用10ml的YPM介质洗涤并接种至四个2升烧瓶中，每个烧瓶含有400ml的YPM介质以产生用于半内果菌属物种GH7纤维二糖水解酶I纯化和表征的肉汤。在第3天收获培养物，并且使用0.45μm DURAPORE膜(密理博公司)进行过滤。
实例6：来自米曲霉O521DH的重组体半内果菌属物种CBHI的纯化
将1600ml体积的米曲霉O521DH(实例5)的经过滤的上清液用硫酸铵(80％饱和)沉淀，再溶解于50ml的20mM乙酸钠(pH 5.5)中，用同一缓冲液透析，并且通过0.45μm过滤器过滤。最终体积是60ml。将该溶液施加至用20mM乙酸钠(pH 5.5)平衡的40ml Q快流柱(通用电气医疗集团)上。使用0-0.25M NaCl的线性梯度NaCl对这些蛋白质进行洗脱。收集未结合至柱上的级分，并且使用具有1.2-0M硫酸铵线性梯度的40ml苯基6快流柱(通用电气医疗集团)进一步进行纯化。使用具有50mM MES的4％-12％ Bis-Tris(英杰公司)凝胶通过SDS-PAGE分析各级分。所得到的凝胶用INSTANTBLUETM(艾本德有限公司)进行染色。合并含有大约55kDa的条带的级分。然后将合并的溶液通过超滤进行浓缩。
实例7：酶组合物的制备
制备含有30％烟曲霉GH6纤维二糖水解酶II、10％里氏木霉GH5内切葡聚糖酶II、10％里氏木霉GH7内切葡聚糖酶I、3％埃默森青霉菌GH61A多肽、4％烟曲霉GH10木聚糖酶、36％烟曲霉β-葡糖苷酶、和7％烟曲霉β-木糖苷酶的指定为“没有纤维二糖水解酶I的纤维素分解酶组合物”的基础酶组合物。
如在WO 2011/057140中所述，在米曲霉中重组地制备烟曲霉GH6A纤维二糖水解酶II(GENESEQP:AZI04854)。根据W/O 2012/122518纯化烟曲霉GH6A纤维二糖水解酶II。
使用米曲霉用作宿主，根据WO 2011/057140重组地制备里氏木霉GH5内切葡聚糖酶II(GENESEQP:AZI04858)。将里氏木霉内切葡聚糖酶II的经过滤肉汤使用配备有10kDa聚醚砜膜(颇尔滤清器公司(Pall Filtron))的切向流动浓缩器(颇尔滤清器公司)进行脱盐并且与20mM Tris(pH8.0)进行缓冲液交换。
使用米曲霉用作宿主，根据WO 2005/067531重组地制备里氏木霉GH7内切葡聚糖酶I(GENESEQP:ARV30516)。为了纯化里氏木霉GH7内切葡聚糖酶I，用0.75M硫酸铵稀释经过滤肉汤至20mM Tris pH 8.0。将蛋白质施加至用具有1M硫酸铵的20mM Tris(pH 8.0)平衡的Phenyl SepharoseTM高效柱(通用电气医疗集团)中，并且用从1至0M硫酸铵的线性梯度对结合蛋白进行洗脱。浓缩合并的级分并使用VIVASPINTM20离心浓缩器(其分子量截留为10kDa(赛多利斯斯泰迪生物技术有限公司(Sartorius Stedim Biotech S.A.)))脱盐到含150mM氯化钠的50mM乙酸钠(pH 5.0)。
使用里氏木霉用作宿主，根据WO 20111/057140重组地制备青霉属GH61A多肽(GENESEQP:AZI04878)。为了纯化青霉属物种GH61A多肽，使用配备有10kDa聚醚砜膜(颇尔滤清器公司)的切向流动浓缩器(颇尔滤清器公司)将发酵培养基脱盐到20mM Tris-HCl(pH8.5)中。将缓冲液交换的样品装载到用20mM Tris-HCl,(pH 8.0)预平衡的Q 快流柱(通用电气医疗集团)上，用20mM Tris-HCl(pH 8.0)和1M NaCl洗脱。合并所选级分，并且添加硫酸铵至0.85M，并且然后装载到用20mM Tris-HCl(pH 7.5)和0.85M硫酸铵预平衡的苯基/>快流柱(通用电气医疗集团)上，用20mM Tris-HCl(pH 7.5)洗脱。合并级分，并且使用配备有10kDa聚醚砜膜的切向流动浓缩器(颇尔滤清器公司)脱盐到50mM乙酸钠(pH 5.0)中。
使用米曲霉BECh2(WO 2000/39322)作为宿主，根据WO 2006/078256重组地制备烟曲霉GH10木聚糖酶(GENESEQP:AZI04884)。使用26/10脱盐柱(通用电气医疗集团)将烟曲霉木聚糖酶的经过滤肉汤脱盐并缓冲液交换到50mM乙酸钠(pH 5.0)中。
根据WO 2012/044915重组地制备烟曲霉Cel3Aβ-葡糖苷酶4M变体(GENESEQP：AZU67153)。使用配备有10kDa聚醚砜膜(颇尔滤清器公司)的切向流浓缩器(颇尔滤清器公司)浓缩烟曲霉Cel3Aβ-葡糖苷酶4M的经过滤肉汤并用含有100mM氯化钠的50mM乙酸钠(pH5.0)进行缓冲液交换。将4-硝基苯基-β-D-吡喃葡萄糖苷(西格玛化学有限公司)用作底物并且将根据WO 2012/044915纯化的烟曲霉Cel3Aβ-葡糖苷酶4M 280用作蛋白标准品，同时将使用该蛋白在280nm处的理论消光系数和吸光度来确定蛋白浓度。如下进行4-硝基苯基-β-D-吡喃葡萄糖苷(pNPG)测定：将pNPG溶解于DMSO中以制备100mM储备溶液。将100mM pNPG储备溶液用0.01％20在50mM乙酸钠缓冲液(pH 5)中稀释100X，用0.01％/>20稀释至含有50mM乙酸钠缓冲液(pH 5)的1mM pNPG。将该蛋白用0.01％/>20在50mM乙酸钠缓冲液(pH 5)中稀释至若干浓度。然后，将20μl的稀释蛋白添加至100μl的含有50mM乙酸钠缓冲液(pH 5)与0.01％ />20的1mM pNPG中。将反应在40℃下孵育20分钟，并且然后用50μl的1M碳酸钠缓冲液(pH 10)使反应停止。在405nm处测量pNP产品吸光度。
如在WO 2011/057140中所述，在米曲霉中重组地制备烟曲霉GH3β-木糖苷酶(GENESEQP:AZI05042)。使用26/10脱盐柱(通用电气医疗集团)将烟曲霉GH3β-木糖苷酶的经过滤肉汤脱盐并缓冲液交换到50mM乙酸钠(pH 5.0)中。
使用A280确定上述每种单组分的蛋白浓度。
实例8：半内果菌属物种纤维二糖水解酶I和烟曲霉A纤维二糖水解酶I的制备
根据实例6中所述方法制备半内果菌属物种纤维二糖水解酶I。
如在WO 2011/057140中所述，在米曲霉中重组地制备烟曲霉Cel7A纤维二糖水解酶I(GENESEQP:AZI04842)。为了纯化烟曲霉Cel7A纤维二糖水解酶I，使用配备有10kDa聚醚砜膜(颇尔滤清器公司)的切向流动浓缩器(颇尔滤清器公司)将发酵培养基脱盐到20mMTris-HCl(pH 8.0)中。将脱盐材料装载到在20mM Tris(pH 8.0)中平衡的Q高效柱(通用电气医疗集团)上，并且用从0至600mM氯化钠的线性梯度对结合蛋白进行洗脱。将合并级分组合。
使用A280确定上述每种组分的蛋白浓度。
实例9：预处理的玉米秸秆水解测定
在美国能源部国家可再生能源实验室(NREL)使用0.048g硫酸/g干生物质在190℃下和25％w/w干固体对玉米秸秆预处理约1分钟。预处理的玉米秸秆(PCS)中的不溶于水的固体含有5653.2％纤维素，3.6％半纤维素和29.8％木质素。通过两阶段硫酸水解，接着通过使用NREL标准分析程序#002的高效液相色谱分析糖来确定纤维素和半纤维素。木质素在用硫酸水解纤维素和半纤维素级分之后使用NREL标准分析程序#003以重量分析法确定。
在酶水解之前，使用多效用研磨机(EssEmm公司)将PCS磨碎，通过420um筛子筛分，并在121℃下高压灭菌30分钟。磨碎和筛过的PCS的干含量是3.84％。/>
在50℃，pH 5.0下，使用没有1.5mg酶/g总固体的纤维二糖水解酶I的，补充有0.4、0.5、0.6或0.7mg酶/g总固体的半内果菌属物种纤维二糖水解酶I或烟曲霉纤维二糖水解酶I的纤维素分解酶组合物(实例7)进行磨碎/筛过的PCS的水解。PCS的总不溶性固体加载量为31g/L(在含有1mM硫酸锰的50mM乙酸钠pH 5.0缓冲液中)。总反应体积为96孔板中的0.25ml(飞世尔科技公司(Fisher Scientific))。一式三份运行测定。在50℃下72小时孵育后，取上清液并通过0.45μm 96孔过滤板(密理博公司)过滤，在5mM H2SO4中稀释两倍，并使用装备有Aminex HPX-87H柱(伯乐实验室有限公司(Bio-Rad Laboratories,Inc.))的安捷伦HPLC(安捷伦科技公司)和折射指数检测进行分析。水解数据表示为转化为葡萄糖的总纤维素的％。纤维素转化为还原糖的程度使用下述方程计算：
转化(％)＝RS(mg/ml)*100*162/(纤维素(mg/ml)*180)
＝RS(mg/ml)*100/(纤维素(mg/ml)*1.111)
RS是以葡萄糖当量(mg/ml)测量的溶液中还原糖的浓度，并且因子1.111反映了纤维素转化为葡萄糖的重量增加。表1示出了在NREL PCS水解中，在50℃，pH 5.0下，半内果菌属物种纤维二糖水解酶I优于烟曲霉纤维二糖水解酶I。
表1.在PCS水解中，在50℃，pH 5.0下通过两种CBHI酶的转化。
在此描述并且要求保护的本发明不限于在此披露的特定方面的范围，因为这些方面旨在作为本发明若干方面的说明。预期任何等效方面都处于本发明的范围内。实际上，除在此所示和描述的那些之外，对于本领域普通技术人员而言本发明的不同修改将从前述描述变得清楚。这样的修改也预期落入所附权利要求书的范围之内。在发生冲突的情况下，以包括定义在内的本披露为准。
通过以下编号的段落进一步说明本发明：
1.一种具有纤维二糖水解酶活性的多肽，该多肽选自下组，该组由以下各项组成：
(a)与SEQ ID NO:2的成熟多肽具有至少82％序列一致性的多肽；
(b)由以下多核苷酸编码的多肽，该多核苷酸在高严格条件下与(i)SEQ ID NO:1的成熟多肽编码序列，(ii)(i)的全长互补体杂交；
(c)由多核苷酸编码的多肽，该多核苷酸与SEQ ID NO:1的成熟多肽编码序列具有至少82％序列一致性；
(d)SEQ ID NO:2的成熟多肽的变体，该变体在一个或多个位置处包含取代、缺失、和/或插入；以及
(e)(a)、(b)、(c)或(d)的多肽的片段，该片段具有纤维二糖水解酶活性。
2.如段落1所述的多肽，该多肽与SEQ ID NO:2的成熟多肽具有至少82％、至少83％、至少84％、至少85％、至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％的序列一致性。
3.如段落1或2所述的多肽，该多肽是由一种多核苷酸编码，该多核苷酸在高严格条件下、或非常高严格条件下与(i)SEQ ID NO:1的成熟多肽编码序列、(ii)(i)的全长互补体杂交。
4.如段落1-3中任一段所述的多肽，该多肽由以下多核苷酸编码，该多核苷酸与SEQ ID NO:1的成熟多肽编码序列具有至少82％、至少83％、至少84％、至少85％、至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％序列一致性。
5.如段落1-4中任一段所述的多肽，该多肽包含SEQ ID NO:2或SEQ ID NO:2的成熟多肽或由其组成。
6.如段落5所述的多肽，其中该成熟多肽是SEQ ID NO:2的氨基酸26至525。
7.如段落1-4中任一段所述的多肽，该多肽是SEQ ID NO:2的成熟多肽的变体，该变体在一个或多个位置处包含取代、缺失和/或插入。
8.如段落1所述的多肽，该多肽是SEQ ID NO:2的片段，其中该片段具有纤维二糖水解酶活性。
9.一种包含催化结构域的多肽，该催化结构域选自下组，该组由以下各项组成：
(a)与SEQ ID NO:2的氨基酸26至466具有至少82％序列一致性的催化结构域；
(b)由以下多核苷酸编码的催化结构域，该多核苷酸在高严格条件下与(i)SEQ IDNO:1的核苷酸76至1398，(ii)(i)的全长互补体杂交；
(c)由多核苷酸编码的催化结构域，该多核苷酸与SEQ ID NO:1的催化结构域具有至少82％序列一致性；
(d)在一个或多个位置处包含取代、缺失、和/或插入的SEQ ID NO:2的氨基酸26至466的变体；以及
(e)(a)、(b)、(c)或(d)的催化结构域的片段，该片段具有纤维二糖水解酶活性。
10.如段落9所述的多肽，该多肽进一步包含碳水化物结合模块。
11.一种包含可操作地连接至催化结构域的碳水化合物结合模块的多肽，其中该结合模块选自下组，该组由以下各项组成：
(a)与SEQ ID NO:2的氨基酸489至525具有至少81％序列一致性的碳水化合物结合模块；
(b)由以下多核苷酸编码的碳水化合物结合模块，该多核苷酸在高严格条件下与(i)SEQ ID NO:1的核苷酸1465至1575，(ii)(i)的全长互补体杂交的一种多核苷酸编码的一个碳水化合物结合模块；
(c)由多核苷酸编码的碳水化合物结合模块，该多核苷酸与SEQ ID NO:1的核苷酸1465至1575具有至少82％序列一致性；
(d)在一个或多个位置处包含取代、缺失、和/或插入的SEQ ID NO:2的氨基酸489至525的变体；以及
(e)(a)、(b)、(c)、(d)或(e)的片段，该片段具有碳水化物结合活性。
12.如段落11所述的多肽,其中该催化结构域获得自水解酶、异构酶、连接酶、裂解酶、氧化还原酶或转移酶，例如氨肽酶、淀粉酶、糖酶、羧肽酶、过氧化氢酶、纤维二糖水解酶、纤维素酶、壳多糖酶、角质酶、环糊精糖基转移酶、脱氧核糖核酸酶、内切葡聚糖酶、酯酶、α-半乳糖苷酶、β-半乳糖苷酶、葡糖淀粉酶、α-葡糖苷酶、β-葡糖苷酶、转化酶、漆酶、脂肪酶、甘露糖苷酶、变位酶、氧化酶、果胶分解酶、过氧化物酶、植酸酶、多酚氧化酶、蛋白水解酶、核糖核酸酶、转谷氨酰胺酶、木聚糖酶或β-木糖苷酶。
13.一种包含如段落1-12中任一段所述的多肽的组合物。
14.一种全培养液配制品或细胞培养组合物，其包含如段落1-12任一段所述的多肽。
15.一种编码如段落1-12中任一段所述的多肽的多核苷酸。
16.一种核酸构建体或表达载体，该核酸构建体或表达载体包含如段落15所述的多核苷酸，该多核苷酸可操作地连接至指导该多肽在表达宿主内产生的一个或多个控制序列。
17.一种重组宿主细胞，该重组宿主细胞包含如段落15所述的多核苷酸，该多核苷酸可操作地连接至指导该多肽产生的一个或多个控制序列。
18.一种产生如段落1-12中任一段所述的多肽的方法，该方法包括：在有益于产生该多肽的条件下培养细胞，该细胞以其野生型形式产生该多肽。
19.如段落17所述的方法，该方法进一步包括回收该多肽。
20.一种产生具有纤维二糖水解酶活性的多肽的方法，该方法包括：在有益于产生该多肽的条件下培养如段落16所述的宿主细胞。
21.如段落19所述的方法，该方法进一步包括回收该多肽。
22.一种用编码如段落1-12中任一段所述的多肽的多核苷酸转化的转基因植物、植物部分或植物细胞。
23.一种产生具有纤维二糖水解酶活性的多肽的方法，该方法包括：在有益于产生该多肽的条件下培养如段落22所述的转基因植物或植物细胞。
24.如段落23所述的方法，该方法进一步包括回收该多肽。
25.一种用于降解纤维素材料或半纤维素材料的方法，该方法包括：用包含如段落1-11中任一段所述的具有纤维二糖水解酶活性的多肽的酶组合物处理该纤维素材料或半纤维素材料。
26.如段落25所述的方法，其中对该纤维素材料或半纤维素材料进行预处理。
27.如段落25或26所述的方法，其中该酶组合物进一步包含一种或多种选自下组的酶，该组由以下各项组成：纤维素酶、AA9多肽、半纤维素酶、纤维素诱导蛋白(CIP)、酯酶、扩张蛋白、木质素分解酶、氧化还原酶、果胶酶、蛋白酶、以及膨胀蛋白。
28.如段落27所述的方法，其中该纤维素酶是一种或多种选自下组的酶，该组由以下各项组成：内切葡聚糖酶、纤维二糖水解酶、和β-葡糖苷酶。
29.如段落27所述的方法，其中该半纤维素酶是一种或多种选自下组的酶，该组由以下各项组成：木聚糖酶、乙酰木聚糖酯酶、阿魏酸酯酶、阿拉伯呋喃糖苷酶、木糖苷酶和葡糖醛酸糖苷酶。
30.如段落25-29中任一段所述的方法，该方法进一步包括回收该降解的纤维素材料或半纤维素材料。
31.如段落30所述的方法，其中该降解的纤维素材料或半纤维素材料是糖。
32.如段落31所述的方法，其中该糖选自下组，该组由以下各项组成：葡萄糖、木糖、甘露糖、半乳糖以及阿拉伯糖。
33.一种产生发酵产物的方法，该方法包括：
(a)用包含如段落1-9中任一段所述的具有纤维二糖水解酶活性的多肽的酶组合物糖化纤维素材料或半纤维素材料；
(b)用一种或多种发酵微生物发酵糖化的纤维素材料或半纤维素材料，以产生该发酵产物；并且
(c)从该发酵中回收该发酵产物。
34.如段落33所述的方法，其中对该纤维素材料或半纤维素材料进行预处理。
35.如段落32或34所述的方法，其中该酶组合物进一步包含一种或多种选自下组的酶，该组由以下各项组成：纤维素酶、AA9多肽、半纤维素酶、CIP、酯酶、扩张蛋白、木质素分解酶、氧化还原酶、果胶酶、蛋白酶、以及膨胀蛋白。
36.如段落35所述的方法，其中该纤维素酶是一种或多种选自下组的酶，该组由以下各项组成：内切葡聚糖酶、纤维二糖水解酶、和β-葡糖苷酶。
37.如段落35或36所述的方法，其中该半纤维素酶是选自下组的一种或多种酶，该组由以下各项组成：木聚糖酶、乙酰木聚糖酯酶、阿魏酸酯酶、阿拉伯呋喃糖苷酶、木糖苷酶、以及葡糖醛酸糖苷酶。
38.如段落33-37中任一段所述的方法，其中在同时的糖化和发酵中同时进行步骤(a)和(b)。
39.如段落33-38中任一段所述的方法，其中该发酵产物是醇、烷烃、环烷烃、烯烃、氨基酸、气体、异戊二烯、酮、有机酸或聚酮化合物。
40.一种发酵纤维素材料或半纤维素材料的方法，该方法包括：用一种或多种发酵微生物发酵纤维素材料或半纤维素材料，其中将该纤维素材料或半纤维素材料用酶组合物和如段落1-9中任一段所述的具有纤维二糖水解酶活性的多肽糖化。
41.如段落40所述的方法，其中在糖化之前对该纤维素材料或半纤维素材料进行预处理。
42.如段落40或41所述的方法，其中该酶组合物进一步包含一种或多种选自下组的酶，该组由以下各项组成：纤维素酶、AA9多肽、半纤维素酶、CIP、酯酶、扩张蛋白、木质素分解酶、氧化还原酶、果胶酶、蛋白酶、以及膨胀蛋白。
43.如段落42所述的方法，其中该纤维素酶是一种或多种选自下组的酶，该组由以下各项组成：内切葡聚糖酶、纤维二糖水解酶、和β-葡糖苷酶。
44.如段落42所述的方法，其中该半纤维素酶是一种或多种选自下组的酶，该组由以下各项组成：木聚糖酶、乙酰木聚糖酯酶、阿魏酸酯酶、阿拉伯呋喃糖苷酶、木糖苷酶和葡糖醛酸糖苷酶。
45.如段落40-44中任一段所述的方法，其中该纤维素材料或半纤维素材料的发酵产生发酵产物。
46.如段落45所述的方法，该方法进一步包括从该发酵中回收该发酵产物。
47.如段落45或46所述的方法，其中该发酵产物是醇、链烷烃、环烷烃、链烯烃、氨基酸、气体、异戊二烯、酮、有机酸、或聚酮化合物。

Claims (19)

1.一种具有纤维二糖水解酶活性的多肽，该多肽选自下组，该组由以下各项组成：
(a)与SEQ ID NO:2的成熟多肽具有至少90％序列一致性的多肽；
(b)由以下多核苷酸编码的多肽，该多核苷酸在高严格条件下与(i)SEQ ID NO:1的成熟多肽编码序列，(ii)(i)的全长互补体杂交；
(c)由多核苷酸编码的多肽，该多核苷酸与SEQ ID NO:1的成熟多肽编码序列具有至少90％序列一致性；
(d)SEQ ID NO:2的成熟多肽的变体，该变体在一个或多个位置处包含取代、缺失、和/或插入；以及
(e)(a)、(b)、(c)或(d)的多肽的片段，该片段具有纤维二糖水解酶活性；
其中，所述多肽来自半内果菌属。
2.如权利要求1所述的多肽，该多肽与SEQ ID NO:2的成熟多肽具有至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％的序列一致性；
和/或，该多肽由以下多核苷酸编码，该多核苷酸与SEQ ID NO:1的成熟多肽编码序列具有至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％序列一致性。
3.一种具有纤维二糖水解酶活性的多肽，该多肽包含SEQ ID NO:2或SEQ ID NO:2的成熟多肽或由其组成。
4.如权利要求1-3中任一项所述的多肽，其中该成熟多肽是SEQ ID NO:2的氨基酸26至525。
5.一种包含催化结构域的多肽，该催化结构域选自下组，该组由以下各项组成：
(a)与SEQ ID NO:2的氨基酸26至466具有至少90％序列一致性的催化结构域；
(b)由以下多核苷酸编码的催化结构域，该多核苷酸在高严格条件下与(i)SEQ ID NO:1的核苷酸76至1398，(ii)(i)的全长互补体杂交；
(c)由多核苷酸编码的催化结构域，该多核苷酸与SEQ ID NO:1的催化结构域具有至少90％序列一致性；
(d)在一个或多个位置处包含取代、缺失、和/或插入的SEQ ID NO:2的氨基酸26至466的变体；以及
(e)(a)、(b)、(c)或(d)的催化结构域的片段，该片段具有纤维二糖水解酶活性；
其中，所述催化结构域来自半内果菌属。
6.如权利要求5所述的多肽，该多肽进一步包含碳水化物结合模块。
7.一种包含可操作地连接至催化结构域的碳水化合物结合模块的多肽，其中该结合模块选自下组，该组由以下各项组成：
(a)与SEQ ID NO:2的氨基酸489至525具有至少90％序列一致性的碳水化合物结合模块；
(b)由以下多核苷酸编码的碳水化合物结合模块，该多核苷酸在高严格条件下与(i)SEQ ID NO:1的核苷酸1465至1575，(ii)(i)的全长互补体杂交的一种多核苷酸编码的一个碳水化合物结合模块；
(c)由多核苷酸编码的碳水化合物结合模块，该多核苷酸与SEQ ID NO:1的核苷酸1465至1575具有至少90％序列一致性；
(d)在一个或多个位置处包含取代、缺失、和/或插入的SEQ ID NO:2的氨基酸489至525的变体；以及
(e)(a)、(b)、(c)、(d)或(e)的片段，该片段具有碳水化物结合活性；
其中，所述结合模块来自半内果菌属。
8.如权利要求7所述的多肽,其中该催化结构域获得自水解酶、异构酶、连接酶、裂解酶、氧化还原酶或转移酶，例如氨肽酶、淀粉酶、糖酶、羧肽酶、过氧化氢酶、纤维二糖水解酶、纤维素酶、壳多糖酶、角质酶、环糊精糖基转移酶、脱氧核糖核酸酶、内切葡聚糖酶、酯酶、α-半乳糖苷酶、β-半乳糖苷酶、葡糖淀粉酶、α-葡糖苷酶、β-葡糖苷酶、转化酶、漆酶、脂肪酶、甘露糖苷酶、变位酶、氧化酶、果胶分解酶、过氧化物酶、植酸酶、多酚氧化酶、蛋白水解酶、核糖核酸酶、转谷氨酰胺酶、木聚糖酶或β-木糖苷酶。
9.一种包含如权利要求1-8中任一项所述的多肽的组合物。
10.一种包含如权利要求1-8中任一项所述的多肽的全培养液配制品或细胞培养组合物。
11.一种编码如权利要求1-8中任一项所述的多肽的多核苷酸。
12.一种核酸构建体或表达载体，该核酸构建体或表达载体包含如权利要求11所述的多核苷酸，该多核苷酸可操作地连接至指导该多肽在表达宿主内产生的一个或多个控制序列。
13.一种重组宿主细胞，该重组宿主细胞包括含如权利要求11所述的多核苷酸，该多核苷酸可操作地连接至指导该多肽产生的一个或多个控制序列。
14.一种产生如权利要求1-8中任一项所述的多肽的方法，该方法包括：在有益于产生该多肽的条件下培养细胞，该细胞以其野生型形式产生该多肽。
15.如权利要求13所述的方法，该方法进一步包括回收该多肽。
16.一种产生具有纤维二糖水解酶活性的多肽的方法，该方法包括：在有益于产生该多肽的条件下培养如权利要求13所述的宿主细胞。
17.如权利要求15所述的方法，该方法进一步包括回收该多肽。
18.一种产生具有纤维二糖水解酶活性的多肽的方法，该方法包括：在有益于产生该多肽的条件下，培养用编码如权利要求1-8中任一项所述多肽的多核苷酸转化的转基因植物或植物细胞。
19.如权利要求18所述的方法，该方法进一步包括回收该多肽。
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