MX2013008096A - Polipeptidos que tienen actividad celobiohidrolasa y polinucleotidos que codifican los mismos. - Google Patents

Abstract

La presente invención se refiere a polipéptidos aislados que tienen actividad celobiohidrolasa y polinucleótidos que codifican los polipéptidos. La invención también se refiere a constructos de ácido nucleico, vectores, y células huéspedes que comprenden los polinucleótidos así como también métodos para producir y usar los polipéptidos.

Description

POLIPEPTIDOS QUE TIENEN ACTIVIDAD CELOBIOHIDROLASA Y POLINUCLEOTIDOS QUE CODIFICAN LOS MISMOS Campo de la Invención La presente invención se refiere a polipéptidos que tienen actividad celobiohidrolasa y polinucleótidos que codifican los polipéptidos. La invención también se refiere a constructos de ácido nucleico, vectores, y células huéspedes que comprenden los polinucleótidos asi como también métodos para producir y usar los polipéptidos.

Antecedentes de la Invención La celulosa es un polímero de glucosa enlazado por beta-1, -enlaces . Muchos microorganismos producen enzimas que hidrolizan los glucanos beta-enlazados. Estas enzimas incluyen endoglucanasas, celobiohidrolasas , y beta-glucosidasas . Las endoglucanasas digieren el polímero de celulosa en ubicaciones aleatorias, abriéndolo al ataque por las celobiohidrolasas. Las celobiohidrolasas consecutivamente liberan las moléculas de celobiosa de los extremos del polímero de celulosa. La celobiosa es un dímero de glucosa beta-1, -enlazado soluble en agua. Las beta-glucosidasas hidrolizan la celobiosa a glucosa.

La conversión de materias primas lignocelulósicas en etanol tiene las ventajas de la fácil disponibilidad de grandes cantidades de materia prima, la deseabilidad de evitar la quema o vertido de los materiales, y la limpieza' del Ref. 242192 combustible etanol. La madera, residuos agrícolas, cultivos herbáceos, y residuos sólidos municipales se han considerado como materias primas para la producción de etanol. Estos materiales principalmente consisten de celulosa, hemicelulosa, y lignina. Una vez que la celulosa se convierte a glucosa, la glucosa fácilmente se fermenta por levadura en etanol. Puesto que la glucosa se fermenta fácilmente a etanol por una variedad de levaduras mientras que la celobiosa no, cualquier celobiosa remanente al final de la hidrólisis representa una pérdida de rendimiento de etanol. De manera más importante, la celobiosa es un potente inhibidor de endoglucanasas y celobiohidrolasas . La acumulación de celobiosa durante la hidrólisis es indeseable para la producción de etanol.

La presente invención proporciona polipéptidos que tienen actividad celobiohidrolasa y polinucleótidos que codifican los polipéptidos.

El polipéptido P23YSY GH7, descrito como SEC ID NO: 4, que tiene actividad celobiohidrolasa comparte 78.3% de identidad (excluyendo aberturas) con la secuencia de aminoácidos deducida de una proteína de la familia GH7 predicha de Aspergillus fumigatus (número de acceso GENESEQP: AZH96970) .

Breve Descripción de la Invención La presente invención se refiere a polipéptidos aislados que tienen actividad celobiohidrolasa seleccionados del grupo que consiste de: (a) un polipéptido que tiene al menos 84% de identidad de secuencia con el polipéptido maduro de la SEC ID NO: 2, o un polipéptido que tiene al menos 81% de identidad de secuencia con el polipéptido maduro de la SEC ID NO: 4; (b) un polipéptido codificado por un polinucleótido que se híbrida bajo condiciones de baja, o media, o media alta, o alta, o muy alta severidad (i) la secuencia codificante de polipéptido maduro de la SEC ID NO: 1, o SEC ID NO: 3, (ii) la secuencia de cADN del mismo, o (iii) el complemento de longitud completa de (i) o (ii) ; (c) un polipéptido codificado por un polinucleótido que tiene al menos 60% de identidad de secuencia con la secuencia codificante de polipéptido maduro de la SEC ID NO: 1, o SEC ID NO: 3; o la secuencia de cADN del mismo; ; ; (d) una variante del polipéptido maduro de la SEC ID NO: 2, o SEC ID NO: 4 que comprende una sustitución, supresión, y/o inserción en una o más (por ejemplo, varias) posiciones; y (e) un fragmento del polipéptido de (a), (b) , (c) , o (d) que tiene actividad celobiohidrolasa .

La presente invención también se refiere a polipéptidos aislados que comprenden un dominio, catalítico seleccionado del grupo que consiste de: (a) un dominio catalítico que tiene al menos 80% de identidad de secuencia con el dominio catalítico de la SEC ID NO: 2 (por ejemplo, aminoácidos 26 a 460 de la SEC ID NO: 2) o un dominio catalítico que tiene al menos 80% de identidad de secuencia con el dominio catalítico de la SEC ID NO: 4 (por ejemplo, aminoácidos 26 a 459 de la SEC ID NO: 4 ) ; (b) un dominio catalítico codificado por un polinucleótido que tiene al menos 80% de identidad de secuencia con el dominio catalítico que codifica la secuencia de la SEC ID NO: 1 (por ejemplo, nucleótidos 76 a 1380 de la SEC ID NO: 1) o un dominio catalítico codificado por un polinucleótido que tiene al menos 80% de identidad de secuencia con el dominio que codifica la secuencia de la SEC ID NO: 3 (por ejemplo, nucleótidos 76 a 1377 de la SEC ID NO: 3); (c) una variante de un dominio catalítico j que comprende una sustitución, supresión, y/o inserción de uno o más (varios) aminoácidos del dominio catalítico de la SEC ID NO: 2 o SEC ID NO: 4; y (d) un fragmento de un dominio catalítico de (a), (b) , o (c) , el cual tiene actividad celobiohidrolasa .

La presente invención también se refiere a polinucleótidos aislados que codifican los polipéptidos de la presente invención; constructos de ácido nucleico; vectores de expresión recombinantes ; células huéspedes recombinantes que comprenden los polinucleótidos; y métodos para producir los polipéptidos .

La presente invención también se refiere a procesos para degradar un material celulósico, que comprenden: tratar el material celulósico con una composición de enzima en la presencia de un polipéptido que tiene actividad celobiohidrolasa de la presente invención. En un aspecto, los procesos adicionalmente comprenden recuperar el material celulósico degradado o convertido.

La presente invención también se refiere a procesos para producir un producto de fermentación, que comprenden: (a) sacarificar un material celulósico con una composición de enzima en la presencia de un polipéptido que tiene actividad celobiohidrolasa de la presente invención; (b) fermentar el material celulósico sacarificado con uno o más (por ejemplo, varios) microorganismos termentadores para producir' el producto de fermentación; y (c) recuperar el producto de fermentación de la fermentación.

La presente invención también se refiere a procesos para fermentar un material celulósico, que comprenden: fermentar el material celulósico con uno o más (por ejemplo, varios) microorganismos fermentadores , en donde el material celulósico es sacarificado con una composición de enzima en la presencia de un polipéptido que tiene actividad celobiohidrolasa de la presente invención. En un aspecto, la fermentación del material celulósico produce un producto de fermentación. En otro aspecto, los procesos adicionalmente comprenden recuperar el producto de fermentación de la fermentación .

La presente invención también se refiere a un polinucleótido que codifica un péptido señal que comprende o consiste de aminoácidos 1 a 25 de la SEC ID NO: 2, o aminoácidos 1 a 25 de la SEC ID NO: 4, el cual es operativamente enlazado a un gen que codifica una proteína; constructos de ácido nucleico, vectores de expresión, y células huéspedes recombinantes que comprenden los polinucleótidos; y métodos para producir una proteína.

Definiciones Celobiohidrolasa : El término "celobiohidrolasa" significa una 1 , 4-beta-D-glucano celobiohidrolasa (E.C. 3.2.1.91) que cataliza la hidrólisis de los enlaces l 4^beta-D-glucosídicos en celulosa, celooligosacáridos , o cualquier polímero que contiene glucosa beta-1, -enlazada, liberando celobiosa de los extremos reducidos o no reducidos de la cadena (Teeri, 1997, Crystalline cellulose degradation: New insight into the function of cellobiohydrolases , Trends in Biotechnology 15: 160-167; Teeri et al., 1998, Trichoderma reesei cellobiohydrolases: why so efficient on crystalline cellulose?, Biochem. Soc. Trans . 26: 173-178). La actividad celobiohidrolasa se determina de acuerdo con los procedimientos descritos por Lever et al., 1972, Anal. Biochem. 47: 273-279; van Tilbeurgh et al., 1982, FEBS Letters, 149: 152-156; van Tilbeurgh and Claeyssens, 1985, FEBS Letters, 187: 283-288; y Tomme et al., 1988, Eur . J. Biochem. 170: 575-581. En la presente invención, el método de Tomme et al. se puede usar, para determinar la actividad celobiohidrolasa .

En un aspecto, los polipéptidos de la presente invención tienen al menos 20%, por ejemplo, al menos 40%, al menos 50%, al menos 60%, al menos 70%, al menos 80%, al menos 90%, al menos 95%, o al menos 100% de la actividad celobiohidrolasa del polipéptido maduro de la SEC ID NO: 2, o SEC ID NO: .

Acetilxilano esterasa: El término "acetilxilano esterasa" significa una carboxilesterasa (EC 3.1.1.72) que cataliza la hidrólisis de los grupos acetilo de xilano polimérico, xilosa acetilada, glucosa acetilada, alfa-naftil acetato, y p-nitrofenil acetato. Para propósitos de la presente invención, la actividad de acetilxilano esterasa se determina usando p-nitrofenilacetato 0.5 mM como sustrato en acetato de sodio 50 mM pH 5.0 que contiene 0.01 % TWEEN™ 20 (monolaurato de polioxietilen sorbitan) . Una unidad de acetilxilano esterasa se define como la cantidad de enzima capaz de liberar 1 pmol de anión p-nitrofenolato por minuto a pH 5, 25°C.

Variante alélica: El término "variante alélica" significa cualquiera de dos o más formas alternativas de un gen que ocupa el mismo locus cromosómico. La variación alélica surge naturalmente mediante mutación, y puede resultar en polimorfismo dentro de las poblaciones. Las mutaciones genéticas pueden ser silentes (sin cambio en el polipéptido codificado) o pueden codificar los polipéptidos que tienen secuencias de aminoácidos alteradas. Una variante alélica de un polipéptido es un polipéptido codificado por una variante alélica de un gen.

Alfa-L-arabinofuranosidasa : El término "alfa-L-arabinofuranosidasa" significa una alfa-L-arabinofuranósido arabinofuranohidrolasa (EC 3.2.1 .55) que cataliza la hidrólisis de residuos alfa-L-arabinofuranósido no reductores terminales en alfa-L-arabinósidos . La enzima actúa en alfa-L-arabinofuranósidos , alfa-L-araninanos que contienen (1,3)-y/o ( 1 , 5 ) -enlaces , arabinoxilanos , y arabinogalactanos .. La alfa-L-arabinofuranosidasa también se conoce · como arabinosidasa , alfa-arabinosidasa , alfa-L-arabinosidasa, alfa-arabinofuranosidasa, polisacárido alfa-L-arabinofuranosidasa, alfa-L-arabinofuranósido hidrolasa, L-arabinosidasa, o alfa-L-arabinanasa . Para propósitos de la presente invención, la actividad de alfa-L-arabinofuranosidasa se determina usando 5 mg de arabinoxilano de trigo de media viscosidad (Megazyme International Ireland, Ltd., Bray, Co. Wicklow, Irlanda) por mi de acetato de sodio 100 mM pH 5 en un volumen total de 200 µ? por 30 minutos a 40°C seguido por análisis de arabinosa por cromatogragia de columna AMINEX® HPX-87H (Bio-Rad Laboratories, Inc., Hercules, CA, USA) .

Alfa-glucuronidasa: El término "alfa-glucuronidasa" significa un a alfa-D-glucosiduronato glucuronohidrolasa (EC 3.2.1.139) que cataliza la hidrólisis de un alfa-D-glucuronósido a D-glucuronato y un alcohol. Para propósitos de la presente invención, la actividad de alfa-glucuronidasa se determina de acuerdo con de Vries, 1998, J. Bacteriol. 180: 243-249. Una unidad de alfa-glucuronidasa iguala la cantidad de enzima capas de liberar 1 pmol de ácido glucurónico o 4-O-metilglucurónico por minuto a pH 5, 40°C.

Beta-glucosidasa: El término "beta-glucosidasa" significa una beta-D-glucósido glucohidrolasa (E. C. 3.2.1;.21 ) que cataliza la hidrólisis de residuos beta-D-glucosa no reductores terminales con la liberación de beta-D-glucosa. Para propósitos de la presente invención, la actividad de beta-glucosidasa se determina usando p-nitrofenil-beta-D-glucopiranósido como sustrato de acuerdo con el procedimiento de Venturi et al., 2002, Extracellular beta-D-glucosidase from Chaetomium thermophilum var. coprophilum: production, purification and sorae biochemical properties, J. Basic Microbiol. 42: 55-66. Una unidad de beta-glucosidasa se define como 1.0 µp??? de anión p-nitrofenolato producido por minuto a 25°C, pH 4.8 a partir de p-nitrofenil-beta-D-glucopiranósido 1 mM como sustrato en citrato de sodio 50 mM que contiene 0.01 % TWEEN® 20.

Beta-xilosidasa: El término "beta-xilosidasa" significa una beta-D-xilósido xilohidrolasa (E.C. 3.2.1.37) que cataliza la exo-hidrólisis de beta (1-4)-xilooligosacáridos cortos para remover los residuos D-xilosa sucesivos de términos no reductores. Para propósitos de la presente invención, una unidad de beta-xilosidasa se define como 1.0 µp??? de anión p-nitrofenolato producido por minuto a 40°C, pH 5 a partir de p-nitrofenil-beta-D-xilósido 1 mM como sustrato en citrato de sodio "100 mM que contiene 0.01 % TWEEN® 20. cADN : El término "cADN" significa una molécula de ADN que se puede preparar por transcripción inversa de una molécula de mARN empalmada, madura obtenida de una célula eucariota o procariota. El cADN carece de secuencias de intrones que pueden estar presentes en el ADN genómico correspondiente. El transcripto de ARN primario inicial es un precursor al mARN que se procesa mediante · una serie de etapas, incluyendo empalme, antes de aparecer como mARN empalmado maduro.

Material celulósico: El término "material celulósico" significa cualquier material que contiene celulosa. El polisacárido predominante en la pared celular primaria de la biomasa es celulosa, el segundo más abundantes es hemicelulosa, y el tercero es pectina. La pared celular secundaria, producida después de que la célula ha parado de crecer, también contiene polisacáridos y se fortalece por la lignina polimérica covalentemente reticulada a hemicelulosa. La celulosa es un homopolimero de anhidrocelobiosa y por consiguiente un beta- ( 1-4 ) -D-glucano lineal, mientras que las hemicelulosas incluyen una variedad de compuestos, tales como xilanos, xiloglucanos , arabinoxilanos , y mananos en estructuras ramificadas complejas con un espectro de sustituyentes . Aunque generalmente es polimorfa, la celulosa se encuentra en tejidos de plantas principalmente como una matriz cristalina insoluble de cadenas de glucano paralelas. Las hemicelulosas usualmente enlazan el hidrógeno a celulosa, asi como también a otras hemicelulosas, que ayudan a estabilizar la matriz de pared celular.

La celulosa generalmente se encuentra, por ejemplo, en los tallos, hojas, cortezas, cáscaras, y mazorcas de plantas u hojas, ramas y madera de árboles. El material celulósico puede ser, pero no se limita a, residuo agrícola, material herbáceo (incluyendo cultivos energéticos) , residuos sólidos municipales, residuos de molino de papel y pulpa, papel residual, y madera (incluyendo residuos forestales) (ver, por ejemplo, Wiselogel et al., 1995, en Handbook on Bioethanol (Charles E. Wyman, editor), pp.105-1 18, Taylor & Francis, Washington D.C.; Wyman, 1994, Bioresource Technology 50: 3-16; Lynd, 1990, Applied Biochemistry and Biotechnology 24/25: 695-719; Mosier et al., 1999, Recent Progress in Bioconversion of Lignocellulosics, in Advances in Biochemical Engineering/Biotechnology, T. Scheper, managing editor, Volume 65, pp. 23-40, Springer-Verlag, New York). Se entiende aquí que la celulosa puede estar en la forma de lignocelulosa, un material de pared celular de plantas que contiene lignina, celulosa y hemicelulosa en una matriz mezclada .

En un aspecto preferido, el material celulósico es cualquier material de biomasa. En otro aspecto preferido, el material celulósico es lignocelulosa, la cual comprende celulosa, hemicelulosa y lignina.

En un aspecto, el material celulósico es residuo agrícola. En otro aspecto, el material celulósico es material herbáceo (incluyendo cultivos energéticos). En otro aspecto, el material celulósico es residuos sólidos municipales. En otro aspecto, el material celulósico es residuos de molino de papel y pulpa. En otro aspecto, el material celulósico es papel residual. En otro aspecto, el material celulósico es madera (incluyendo residuos forestales).

En otro aspecto, el material celulósico es arundo. En otro aspecto, el material celulósico es bagazo. En otro aspecto, el material celulósico es bambú. En otro aspecto, el material celulósico es mazorca de maíz. En otro aspecto, el material celulósico es fibra de maíz. En otro aspecto, el material celulósico es rastrojo de maiz. En otro aspecto, el material celulósico es miscanto. En otro aspecto, el material celulósico es cascara de naranja. En otro aspecto, el material celulósico paja de arroz. En otro aspecto, el material celulósico es pasto aguja. En otro aspecto, el material celulósico es paja de trigo.

En otro aspecto, el material celulósico es álamo temblón. En otro aspecto, el material celulósico es eucalipto. En otro aspecto, el material celulósico es abeto. En otro aspecto, el material celulósico es pino. En otro aspecto, el material celulósico es álamo. En otro aspecto, el material celulósico es picea. En otro aspecto, el material celulósico es sauce. 1 En otro aspecto, el material celulósico es celulosa de alga. En otro aspecto, el material celulósico es celulosa bacteriana. En otro aspecto, el material celulósico es borra de algodón. En otro aspecto, el material celulósico es papel filtro. En otro aspecto, el material celulósico es celulosa microcristalina . En otro aspecto, el material celulósico es celulosa tratada con ácido fosfórico.

En otro aspecto, el material celulósico es' . una biomasa acuática. Como se usa en la presente, el término "biomasa acuática" significa biomasa producida en un ambiente acuático por un proceso de fotosíntesis. La biomasa acuática puede ser algas, plantas emergentes, plantas de hoja flotante, o plantas sumergidas.

El material celulósico se puede usar como esta o se puede someter a pretratamiento, usando métodos convencionales conocidos en la técnica, como se describe en la presente. En un aspecto preferido, el material celulósico es pretratado.

Enzima celulolitica o celulasa: El término "enzima celulolitica" o "celulasa" significa una o más (por ejemplo, varias) enzimas que hidrolizan un material celulósico. Tales enzimas incluyen endoglucanasa ( s ) , celobiohidrolasa ( s ) , beta-glucosidasa ( s ) , o combinaciones de las mismas. Los dos procedimientos básicos para medir la actividad celulolitica incluyen: (1) medir la actividad celulolitica total, y (2) medir las actividades celulolíticas individuales (endoglucanasas, celobiohidrolasas , y beta-glucosidasas) como se revisa en Zhang et al., Outlook for cellulase improvement: Screening and selection strategies, 2006, Biotechnology Advances 24: 452-481. La actividad celulolitica 'total usualmente se mide usando sustratos insolubles, incluyendo papel filtro hatman N° 1, celulosa microcristalina , celulosa bacteriana, celulosa de algas, algodón, lignocelulosa pretratada, etc. El ensayo de actividad celulolitica total más común es el ensayo de papel filtro usando papel filtro Whatman N° 1 como el sustrato. El ensayo se estableció por la Unión Internacional de Química Pura y Aplicada (IUPAC) (Ghose, 1987, Measurement of cellulase activities, Puré Appl . Chem. 59: 257-68) .

Para propósitos de la presente invención, la actividad de enzima celulolítica se determina midiendo el incremento en la hidrólisis de un material celulósico por enzima (s) celulolíticas bajo las siguientes condiciones: 1-50 mg de proteína de enzima celulolítica/g de celulosa en PCS (u otro material celulósico pretratado) por 3-7 días a una temperatura adecuada, por ejemplo, 50°C, 55°C, o 60°C, en comparación con una hidrólisis de control sin adición de proteína de enzima celulolítica. Las condiciones típicas son reacciones de 1 mi, PCS lavado o no lavado, 5% sólidos insolubles, acetato de sodio 50 mM pH 5, MnS04 1 mM, 50°C, 55°C, o 60°C, 72 horas, análisis de azúcar por columna AMINEX® HPX-87H (Bio-Rad Laboratories, Inc., Hercules, CA, USA) .

Secuencia codificante: El término "secuencia codificante" significa un polinucleótido, el cual directamente especifica la secuencia de aminoácidos de un polipéptido. Los límites de la secuencia codificante generalmente se determinan por un marco de lectura abierto, el cual comienza con un codón de inicio tal como ATG, GTG, o TTG y finaliza con un codón de terminación tal como TAA, TAG, o TGA. La secuencia codificante puede ser un ADN genómico, cADN, ADN sintético, o una combinación de los mismos.

Secuencias de control: El término "secuencias de control" significa secuencias de ácido nucleico necesarias para la expresión de un polinucleótido que codifica un polipéptido maduro de la presente invención. Cada secuencia de control puede ser nativa (es decir, del mismo gen) o extraña (es decir, de un diferente gen) al polinucleótido que codifica el polipéptido o nativa o extraña entre sí. Tales secuencias de control incluyen, pero no se limitan a, una secuencia guía, secuencia de poliadenilación, secuencia de propéptido, secuencia promotora, secuencia de péptido señal, y terminador de transcripción. A un mínimo, las secuencias de control incluyen un promotor, y señales de terminación transcripcionales y traduccionales . Las secuencias de control se pueden proporcionar con enlazantes para el propósito de introducir sitios de restricción específicos que facilitan la ligación de las secuencias de control con la región codificante del polinucleótido que codifica un polipéptido.

Endoglucanasa: El término "endoglucanasa" signi'fica una endo-1 , 4- ( 1 , 3 ; 1 , 4 ) -beta-D-glucano -glucanohidrolasa (E.C. 3.2.1.4) que cataliza la endohidrólisis de enlaces 1,4-beta-D-glicosídicos en celulosa, derivados de celulosa (tales como carboximetil celulosa e hidroxietil celulosa) , liquenina, enlaces beta-1,4 en beta-1,3 glucanos mezclados tales como beta-D-glucanos o xiloglucanos de cereales, y otro material vegetal que contiene componentes celulósicos. La actividad de endoglucanasa se puede determinar midiendo la reducción de la viscosidad del sustrato o incremento de los extremos reductores determinados por un ensayo de azúcar reductor (Zhang et al., 2006, Biotechnology Advances 24: 452-481). Para propósitos de la presente invención, la actividad de endoglucanasa se determina usando carboximetil celulosa (CMC) como sustrato de acuerdo con el procedimiento de Ghose, 1987, Puré and Appl . Chem. 59: 257-268, a pH 5, 40°C.

Expresión: El término "expresión" incluye cualquier etapa involucrada en la producción de un polipéptido incluyendo, pero no limitado a, transcripción, modificación post-transcripcional, traducción, modificación post-traduccional , y secreción.

Vector de expresión: El término "vector de expresión" significa una molécula de ADN lineal o circular que comprende un polinucleótido que codifica un polipéptido y se enlaza operativamente a secuencias de control que proporcionan su expresión.

Familia 61 de glicósido hidrolasa: El término "Familia 61 de glicósido hidrolasa" o "Familia GH61" o "GH61" significa un polipéptido que cae en la Familia 61 de glicósido hidrolasa de acuerdo con Henrissat, 1991, A classification of glycosyl hydrolases based on amino-acid sequence similarities , Biochem. J. 280: 309-316, y Henrissat and Bairoch, 1996, Updating the sequence-based classification of glycosyl hydrolases, Biochem. J. 316: 695-696. Las enzimas en esta familia originalmente se clasificaron como una familia de glicósido hidrolasa basada en la medición de la actividad de endo-1, 4-beta-D-glucanasa muy débil en un miembro de la familia. La estructura y modo de acción de estas enzimas no son canónicos y no se pueden considerar como glicosidasas auténticas. Sin embargo, se mantienen en la clasificación CAZy sobre la base de su capacidad para mejorar la descomposición de linocelulosa cuando se usa en conjunto con una celulosa o una mezcla de celulasas.

Feruloilo esterasa: El término "feruloilo esterasa" significa una 4-hidroxi-3-metoxicinamoil-azúcar hidrolasa (EC 3.1.1.73) que cataliza la hidrólisis de grupos 4-hidroxi-3-metoxicinamoilo (feruloilo) a partir de azúcar esterificado, que usualmente es arabinosa en sustratos "naturales", para producir ferulato ( 4-hidroxi-3-metoxicinamato) . La feruloilo esterasa también es conocida como ácido ferúlico esterasa, hidroxicinamoilo esterasa, FAE-III, éster de cinamoilo hidrolasa, FAEA, cinnAE, FAE-I, o FAE-II. Para propósitos de la presente invención, la actividad de feruloilo esterasa se determina usando p-nitrofenilferulato 0.5 mM como sustrato en acetato de sodio 50 mM pH 5.0. Una unidad de feruloilo esterasa iguala la cantidad de enzima capaz de liberar 1 ymol de anión p-nitrofenolato' por minuto a pH 5, 25°C.

Fragmento: El término "fragmento" significa un polipéptido que tiene uno o más (por ejemplo, varios) aminoácidos ausentes del término amino y/o carboxilo de un polipéptido maduro; en donde el fragmento tiene actividad celobiohidrolasa . En un aspecto, un fragmento contiene al menos 20 residuos aminoácidos, por ejemplo, al menos 30 a 460 residuos aminoácidos o al menos 50 a 450, 80 a 400, 100 a 350, 150 a 300, o 200 a 250, o cualquier número intermedio, residuos aminoácidos de la SEC ID NO: 2. En un aspecto, un fragmento contiene al menos 20 residuos aminoácidos, por ejemplo, al menos 30 a 459 residuos aminoácidos o al menos 50 a 450, 80 a 400, 100 a 350, 150 a 300, o 200 a 250, o cualquier número intermedio, residuos aminoácidos de la SEC ID NO: 4. Más particularmente, en una modalidad un fragmento significa un polipéptido que comprende o consiste de aminoácidos 26 a 460 de la SEC ID NO: 2. En una modalidad adicional un fragmento puede incluir el enlazante, aminoácidos 461 a 496 de la SEC ID NO: 2, o una parte del mismo. En otra modalidad, un fragmento significa un polipéptido que comprende o consiste de aminoácidos 26 a 459 de la SEC ID NO: 4. En una modalidad adicional un fragmento puede incluir el enlazante, aminoácidos 460 a 496 de la SEC ID NO: 4, o una parte del mismo.

Enzima hemicelulolitica o hemicelulasa : El término "enzima hemicelulolitica" o "hemicelulasa" significa una o más (por ejemplo, varias) enzimas que hidrolizan un material hemicelulósico . Ver, por ejemplo, Shallom and Shoham, 2003, Microbial hemicellulases . Current Opinión In Microbiology 6(3): 219-228. Las hemicelulosas son componentes clave en la degradación de biomasa de plantas. Los ejemplos de hemicelulasas incluyen, pero no se limitan a, una acetilmanano esterasa, una acetilxilano esterasa, una arabinanasa, una arabinofuranosidasa , una ácido cumárico esterasa, una feruloilo esterasa, una galactosidasa , una glucuronidasa, una glucuronoilo esterasa, una mananasa, una manosidasa, una xilanasa, y una xilosidasa. Los sustratos de estas enzimas, las hemicelulosas, son un grupo heterogéneo de polisacáridos ramificados y lineales que se unen vía enlaces de hidrógeno a los microfibrilos de celulosa en la pared celular de la planta, reticulándolos en una red sólida. Las hemicelulosas también se unen covalentemente a lignina, formando conjuntamente con la celulosa una estructura altamente compleja. La estructura variable y organización de las hemicelulosas requieren la acción concertada de muchas enzimas para su degradación completa. Los módulos catalíticos de hemicelulasas son ya sea glicósido hidrolasas (GHs) ' que hidrolizan enlaces glicosídicos, o carbohidrato esterasas (CEs), que hidrolizan los enlaces de éster de grupos laterales acetato o ácido ferúlico. Estos módulos catalíticos, basados en la homología de su secuencia primaria, se pueden asignar en familias de GH y CE. Algunas familias, con un pliegue similar total, se pueden agrupar adicionalmente en clanes, marcados alfabéticamente (por ejemplo, GH-A) . Una clasificación más informativa y actualizada de estas y otras enzimas activas en carbohidrato está disponible en la base de datos de Enzimas Activas en Carbohidrato (CAZy) . Las actividades de enzima hemicelulolitica se pueden medir de acuerdo con Ghose and Bisaría, 1987, Puré & Appl. Chem. 59: 1739-1752, a una temperatura adecuada, por ejemplo, 50°C, 55°C, o 60°C, y pH, por ejemplo, 5.0 o 5.5.

Condiciones de alta severidad: El término "condiciones de alta severidad" significa sondas de al menos 100 nucleótidos de longitud, prehibridación e hibridación a 42°C en 5X SSPE, 0.3% SDS, 200 microgramos/ml de ADN de esperma de salmón fragmentado y desnaturalizado, y 50% formamida, siguiendo los procedimientos de análisis Southern blot estándares por 12 a 24 horas. El material portador finalmente se lava tres veces cada 15 minutos usando 2X SSC, 0.2% SDS a 65°C.

Célula huésped: El término "célula huésped" significa cualguier tipo celular que es susceptible a la transformación, transíección, transducción, o similar con un constructor de ácido nucleico o vector de expresión que comprende un polinucleótido de la presente invención. El término "célula huésped" abarca cualquier progenie de una célula precursora que no es idéntica a la célula precursora debido a las mutaciones que ocurren durante la replicación.

Aislado: El término "aislado" significa una sustancia en una forma o ambiente que no ocurre en la naturaleza. Los ejemplos no limitantes de sustancias aisladas incluyen (1) cualquier sustancia que no se presenta naturalmente, (2) cualquier sustancia incluyendo, pero no limitado a, cualquier enzima, variante, ácido nucleico, proteina, péptido o cofactor, que es al menos parcialmente removido de uno o más o todos los constituyentes que se presentan naturalmente con los cuales se asocia en la naturaleza; (3) cualquier sustancia modificada por la mano del hombre con relación a aquella sustancia encontrada en la naturaleza; o (4) cualquier sustancia modificada incrementando la cantidad de la sustancia con relación a otros componentes con los cuales se asocia naturalmente : i(por ejemplo, múltiples copias de un gen que codifica la sustancia; uso de un promotor más fuerte que el promotor naturalmente asociado con el gen que codifica la sustancia). Una sustancia aislada puede estar presente en una muestra de caldo de fermentación.

Condiciones de baja severidad: El término "condiciones de baja severidad" significa sondas de al menos 100 nucleótidos de longitud, prehibridación e hibridación a 42°C en 5X SSPE, 0.3% SDS, 200 microgramos/ml de ADN de esperma de salmón fragmentado y desnaturalizado, y 25% formamida, siguiendo los procedimientos de análisis Southern blot estándares por 12 a 24 horas. El material portador finalmente se lava tres veces cada 15 minutos usando 2X SSC, 0.2% SDS a 50°C.

Polipéptido maduro: El término "polipéptido maduro" significa un polipéptido en su forma final después de la traducción y cualquiera de las modificaciones post-traduccionales, tal como procesamiento N-terminal, truncado C-terminal, glicosilación, fosforilación, etc. En un aspecto, el polipéptido maduro es aminoácidos 26 a 532 de la SEC ID NO: 2 con base en el programa SignalP (Nielsen et al., 1997, Protein Engineering 10:1-6) que predice que los aminoácidos 1 a 25 de la SEC ID NO: 2 son un péptido señal. En otro aspecto, el polipéptido maduro es aminoácidos 26 a 532 de la SEC ID NO: 4 con base en el programa SignalP que predice que los aminoácidos 1 a 25 de la SEC ID NO: 4 son un péptido señal. Se sabe en la técnica que una célula huésped puede producir una mezcla de dos o más diferentes polipéptidos maduros (es decir, con un diferente aminoácido C-terminal y/o N-terminal) expresados por el mismo polinucleótido .

Secuencia codificante de polipéptido maduro: El término "secuencia codificante de polipéptido maduro" significa un polinucleótido que codifica un polipéptido maduro que tiene actividad celobiohidrolasa . En un aspecto, la secuencia codificante de polipeptido maduro es nucleótidos 76 a 1596 de la SEC ID NO: 1 o la secuencia de cADN del mismo basada en el programa SignalP (Nielsen et al., 1997, supra) que predice los nucleótidos 1 a 75 de la SEC ID NO: 1 codifica un péptido señal. En otro aspecto, la secuencia codificante de polipéptido maduro es nucleótidos 76 a 1596 de la SEC ID NO: 3 o la secuencia de cADN del mismo basada en el programa SignalP que predice los nucleótidos 1 a 75 de la SEC ID NO: 3 codifica un péptido señal.

Dominio catalítico: El término "dominio catalítico" significa la porción de una enzima que contiene la maquinaría catalítica de la enzima. En una modalidad, el dominio catalítico es aminoácidos 26-460 de la SEC ID NO: 2. En otra modalidad, el dominio catalítico es aminoácidos 26-459 de la SEC ID NO: 4.

Dominio de enlace de celulosa: El término "dominio de enlace de celulosa" significa la porción de una enzima que media el enlace de la enzima a regiones amorfas de un sustrato de celulosa. El dominio de enlace de celulosa (CBD, por sus siglas en inglés) se encuentra ya sea en la extremidad N-terminal o C-terminal de una enzima. Un- CBD también es referido como un módulo de enlace' de celulosa o CBM. En una modalidad, el CBM es aminoácidos 497 a 532 de la SEC ID NO: 2. En una modalidad, el CBM es aminoácidos 497 a 532 de la SEC ID NO: 4. El CBM se separa del dominio catalítico por una secuencia de enlazante. El enlazante en una modalidad es aminoácidos 461 a 496 de la SEC ID NO: 2. El enlazante en una modalidad es aminoácidos 460 a 496 de la SEC ID NO: 4.

Condiciones de media severidad: El término "condiciones de media severidad" significa sondas de al menos 100 nucleótidos de longitud, prehibridación e hibridación a 42°C en 5X SSPE, 0.3% SDS, 200 microgramos/ml de ADN de esperma de salmón fragmentado y desnaturalizado, y 35% formamida, siguiendo los procedimientos de análisis Southern blot estándares por 12 a 24 horas. El material portador finalmente se lava tres veces cada 15 minutos usando 2X SSC, 0.2% SDS a 55°C.

Condiciones de media-alta severidad: El término "condiciones de media-alta severidad" significa sondas de al menos 100 nucleótidos de longitud, prehibridación e hibridación a 42°C en 5X SSPE, 0.3% SDS, 200 microgramos/ml de ADN de esperma de salmón fragmentado y desnaturalizado, y ya sea 35% formamida, siguiendo los procedimientos de análisis Southern blot estándares por 12 a 24 horas. El material portador finalmente se lava tres veces cada 15 minutos usando 2X SSC, 0.2% SDS a 60°C.

Constructo de ácido nucleico: El término "constructo de ácido nucleico" significa una molécula de ácido nucleico, ya sea de hebra única o doble, la cual se aisla de un gen que se presenta naturalmente o se modifica para contener segmentos de ácidos nucleicos en una manera que no existiría de otra manera en la naturaleza o la cual es sintética, que comprende una o más secuencias de control.

Operativamente enlazado: El término "operativamente enlazado" significa una configuración en la cual una secuencia de control se coloca en una posición apropiada con relación a la secuencia codificante de un polinucleótido de modo que la secuencia de control dirige la expresión de la secuencia codificante.

Polipéptido que tiene actividad mejoradora celulolitica: El término "polipéptido que tiene actividad mejoradora celulolitica" significa un polipéptido GH61 que cataliza el mejoramiento de la hidrólisis de un material celulósico por enzima que tiene actividad celulolitica. Para propósitos de la presente invención, la actividad mejoradora celulolitica se determina midiendo el incremento de azúcares reductores o el incremento del total de celobiosa y glucosa de la hidrólisis de un material celulósico por enzima celulolitica bajo las siguientes condiciones: 1-50 mg de proteína total/g de celulosa en PCS, en donde la proteína total está comprendida de 50-99.5% p/p de proteína de enzima celulolitica y 0.5-50% p/p de proteína de un polipéptido GH61 que tiene actividad mejoradora celulolitica por 1-7 días a una temperatura adecuada, por ejemplo, 50°C, 55°C, o 60°C, y pH, por ejemplo, 5.0 o 5.5, en comparación con una hidrólisis de control con igual carga de proteina total sin actividad mejoradora celulolitica (1-50 mg de proteina celulolitica/g de celulosa en PCS) . En un aspecto preferido, una mezcla de CELLUCLAST® 1.5L (Novozymes A/S, Bagsvaerd, Dinamarca) en la presencia de 2-3% de peso de proteina total beta-glucosidasa de Aspergillus oryzae (recombinantemente producida en Aspergillus oryzae de acuerdo con WO 02/095014) o 2-3% de peso de proteina total beta-glucosidasa de Aspergillus fumigatus (recombinantemente producida en Aspergillus oryzae como se describe en WO 2002/095014) de carga de proteina celulasa se usa como la fuente de la actividad celulolitica.

Los polipéptidos GH61 que tienen actividad mejoradora celulolitica mejoran la hidrólisis de un material celulósico catalizado por enzima que tiene actividad celulolitica reduciendo la cantidad de enzima celulolitica requerida para alcanzar el mismo grado de hidrólisis, preferiblemente al menos 1.10 veces, al menos 1.25 veces, al menos 1.5 veces, al menos 2 veces, al menos 3 veces, al menos 4 veces, al menos 5 veces, al menos 10 veces, o al menos 20 veces . : ; : Rastrojo de maiz pretratado: El término "PCS" o "Rastrojo de Maíz Pretratado" significa un material celulósico derivado de rastrojo de maiz por tratamiento con calor y ácido sulfúrico diluido, pretratamiento alcalino, o pretratamiento neutral.

Identidad de secuencia: La relación entre dos secuencias de aminoácidos o entre dos secuencias de nucleótidos se describe por el parámetro "identidad de secuencia" .

Para propósitos de la presente invención, la identidad de secuencia entre dos secuencias de aminoácidos se determina usando el algoritmo de Needleman-Wunsch (Needleman and Wunsch, 1970, J. Mol. Biol. 48: 443-453) como se implementa en el programa Needle del paquete EMBOSS (EMBOSS: The European Molecular Biology Open Software Suite, Rice et al., 2000, Trends Genet . 16: 276-277), preferiblemente versión 5.0.0 o más reciente. Los parámetros usados son penalización de espacio abierto de 10, penalización de extensión de espacio de 0.5, y la matriz de sustitución EBLOSUM62 (EMBOSS versión de BLOSUM62) . La salida de, la "identidad más larga" etiquetada de Needle (obtenida usando la opción -nobrief) se usa como el porcentaje de identidad y se calcula como sigue: (Residuos Idénticos x 100) / (Longitud de Alineación - Número Total de Espacios en la Alineación) Para propósitos de la presente invención, la identidad de secuencia entre dos secuencias de desoxirribonucleótidos se determina usando el algoritmo' de Needleman-Wunsch (Needleman and Wunsch, 1970, supra) como se implementa en el programa Needle del paquete EMBOSS (EMBOSS: The European Molecular Biology Open Software Suite, Rice et al., 2000, supra), preferiblemente versión 5.0.0 o más reciente. Los parámetros usados son penalización de espacio abierto de 10, penalización de extensión de espacio de 0.5, y la matriz de sustitución EDNAFULL (EMBOSS versión de NCBI NUC4.4). La salida de la "identidad más larga" etiquetada de Needle (obtenida usando la opción -nobrief) se usa como el porcentaje de identidad y se calcula como sigue: ( Desoxirribonucleótidos Idénticos x 100) / (Longitud de Alineación - Número Total de Espacios en la Alineación) Subsecuencia: El término "subsecuencia" significa un polinucleótido que tiene uno o más (por ejemplo, varios) nucleótidos ausentes del extremo 5' y/o 3' de una secuencia codificante de polipéptido maduro; en donde la subsecuencia codifica un fragmento que tiene actividad celobiohidrolasa. En un aspecto, una subsecuencia codifica un polipéptido que tiene actividad celobiohidrolasa, por ejemplo, un dominio catalítico de acuerdo con la invención. En una modalidad, una subsecuencia comprende o consiste de nucleótidos 76 a 1380 de la SEC ID NO: 1. En otra modalidad, una subsecuencia comprende o consiste de nucleótidos 76 a 1377 de la SEC ID NO: 3.

Variante: El término "variante" significa un polipéptido que tiene actividad celobiohidrolasa ' que comprende una alteración, es decir, una sustitución, inserción, y/o supresión, en una o más (por ejemplo, varias) posiciones. Una sustitución significa el remplazo del aminoácido que ocupa una posición con un diferente aminoácido; una supresión significa la remoción del aminoácido que ocupa una posición; y una inserción significa agregar un aminoácido adyacente a e inmediatamente después del aminoácido que ocupa una posición.

Condiciones de muy alta severidad: El término "condiciones de muy alta severidad" significa sondas de al menos 100 nucleótidos de longitud, prehibridación e hibridación a 42°C en 5X SSPE, 0.3% SDS, 200 microgramos/ml de ADN de esperma de salmón fragmentado y desnaturalizado, y 50% formamida, siguiendo los procedimientos de análisis Southern blot estándares por 12 a 24 horas. El material portador finalmente se lava tres veces cada 15 minutos usando 2X SSC, 0.2% SDS a 70°C.

Condiciones de muy baja severidad: El término "condiciones de muy baja severidad" significa sondas de al menos 100 nucleótidos de longitud, prehibridación e hibridación a 42°C en 5X SSPE, 0.3% SDS, 200 microgramos/ml de ADN de esperma de salmón fragmentado y desnaturalizado, y 25% formamida, siguiendo los procedimientos de análisis Southern blot estándares por 12 a 24 horas. El material portador finalmente se lava tres veces cada 15 minutos usando 2X SSC, 0.2% SDS a 45°C.

Material que contiene xilano: El término "material que contiene xilano" significa cualquier material que comprende un polisacárido de pared celular de planta que contiene un esqueleto de residuos de xilosa beta- (1-4)-enlazados. Los xilanos de plantas terrestres son heteropolimeros que poseen un esqueleto de beta- ( 1-4 ) -D-xilopiranosa, que se ramifica por cadenas cortas de carbohidrato. Comprenden ácido D-glucurónico o su 4-O-metil éter, L-arabinosa, y/o varios oligosacáridos, compuestos de D-xilosa, L-arabinosa, D- o L-galactosa, y D-glucosa. Los polisacáridos tipo xilano se pueden dividir en homoxilanos y heteroxilanos , los cuales incluyen glucuronoxilanos, (arabino) glucuronoxilanos, (glucurono) arabinoxilanos, arabinoxilanos, y heteroxilanos complejos. Ver, por ejemplo, Ebringerova et al., 2005, Adv. Polym. Sci. 186: 1-67.

En los procesos de la presente invención, se puede usar cualquier material que contiene xilano. En un aspecto preferido, el material que contiene xilano es lignocelulosa .

Actividad degradante de xilano o actividad xilanolitica: El término "actividad degradante de xilano" o "actividad xilanolitica" significa una actividad biológica que hidroliza el material que contiene xilano. Los dos procedimientos básicos para medir la actividad xilanolitica incluyen: (1) medir la actividad xilanolitica total, y (2) medir las actividades xilanoliticas individuales (por ejemplo, ' endoxilanasas, beta-xilosidasas, arabinofuranosidasas, alfa-glucuronidasas , acetilxilano esterasas, feruloilo esterasas, y alfa-glucuronilo esterasas) . El progreso reciente en ensayos de enzimas xilanoliticas se resumió en diversas publicaciones incluyendo Biely and Puchard, Recent progress in the assays of xylanolytic enzymes, 2006, Journal of the Science of Food and Agriculture 86(11): 1636-1647; Spanikova and Biely, 2006, Glucuronoyl esterase - Novel carbohydrate esterase produced by Schizophyllum commune, FEBS Letters 580(19): 4597-4601; Herrmann, Vrsanska, Jurickova, Hirsch, Biely, and Kubicek, 1997, The beta-D-xylosidase of Trichoderma reesei is a multifunctional beta-D-xylan xylohydrolase , Biochemical Journal 321:375-381.

La actividad degradante de xilano total se puede medir determinando los azúcares reductores formados de varios tipos de xilano, incluyendo, por ejemplo, xilanos de avena, espelta, madera de haya y alerce, o por determinación fotométrica de fragmentos de xilano teñidos liberados de varios xilanos covalentemente teñidos. El ensayo de actividad xilanolitica total más común se basa en la producción de azúcares reductores de 4-0-metil glucuronoxilano polimérico como se describe en Bailey et al., 1992, Interlaboratory testing of methods for assay of xylanase activity, Journal of Biotechnology 23(3): 257-270. La actividad de xilanasa también se puede determinar con 0.2 % AZCL-arabinoxilano como sustrato en 0.01 % TRITON® X-100 (4-(l, 1,3,3-tetrametilbutil) fenil-polietilenglicol ) y amortiguador de fosfato de sodio 200 mM pH 6 a 37°C. Una unidad de actividad de xilanasa se define como 1.0 µ?t??? de azurina producida por minuto a 37 °C, pH 6 a partir de 0.2 % AZCL-arabinoxilano como sustrato en amortiguador de fosfato de sodio 200 mM pH 6.

Para propósitos de la presente invención, la actividad degradante de xilano se determina midiendo el incremento en la hidrólisis de xilano de madera de abidul (Sigma Chemical Co . , Inc., St. Louis, MO, USA) por enzimas degradantes de xilano bajo las siguientes condiciones típicas: reacciones de 1 mi, 5 mg/ml de sustrato (sólidos totales), 5 mg de proteína xilanolítica/g de sustrato, acetato de sodio 50 mM pH 5, 50°C, 24 horas, análisis de azúcar usando ensayo de hidrazida de ácido hidroxibenzpico (PHBAH) como se describe por Lever, 1972, A new reaction for colorimetric determination of carbohydrates, Anal. Biochem 47: 273-279.

Xilanasa: El término "xilanasa" significa una 1,4-beta-D-xilano-xilohidrolasa (E.C. 3.2.1.8) que cataliza la endohidrólisis de enlaces 1 , -beta-D-xilosídicos en xilanos. Para propósitos de la presente invención, la actividad de xilanasa se determina con 0.2% AZCL-arabinoxilano .corno sustrato en 0.01 % TRITON® X-100 y amortiguador de fosfato de sodio 200 mM pH 6 a 37°C. Una unidad de actividad de xilanasa se define como 1.0 pmol de azurina producida por minuto a 37°C, pH 6 a partir de 0.2% AZCL-arabinoxilano como sustrato en amortiguador de fosfato de sodio 200 mM pH 6.

Descripción Detallada de la Invención Polipéptidos Que Tienen Actividad celobiohidrolasa En una modalidad, la presente invención se refiere a polipéptidos aislados que tienen una identidad de secuencia con el polipéptido maduro de la SEC ID NO: 2 de al menos 84%, por ejemplo, al menos 85%, al menos 86%, al menos 87%, al menos 88%, al menos 89%, al menos 90%, al menos 91 %, al menos 92%, al menos 93%, al menos 94%, al menos 95%, al menos 96%, al menos 97%, al menos 98%, al menos 99%, o 100%, los cuales tienen actividad celobiohidrolasa. En una modalidad, la presente invención se refiere a polipéptidos aislados que tienen una identidad de secuencia con el polipéptido maduro de la SEC ID NO: 4 de al menos 81 %, por ejemplo, al menos 82%, al menos 83%, al menos 84%, al menos 85%, al menos 87%, al menos 90%, al menos 91 %, al menos 92%, al menos 93%, al menos 94%, al menos 95%, al menos 96%, al menos 97%, al menos 98%, al menos 99%, o 100%, los cuales tienen actividad celobiohidrolasa. Los polipéptidos de la presente invención tienen al menos 20%, por ejemplo, al menos 40%, al menos 50%, al menos 60%, al menos 70%, al menos 80%, al menos 90%, al menos 95%, o al menos 100% de la actividad celobiohidrolasa del polipéptido maduro de la SEC ID NO: 2, o SEC ID NO: 4.

En un aspecto, los polipéptidos difieren por no más de 10 aminoácidos, por ejemplo, 1 , 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, o 9, del polipéptido maduro de la SEC ID NO: 2, o SEC ID NO: 4.

Un polipéptido de la presente invención preferiblemente comprende o consiste de la secuencia de aminoácidos de la SEC ID NO: 2, o SEC ID NO: 4 o una variante alélica del mismo; o es un fragmento del mismo que tiene actividad celobiohidrolasa. En otro aspecto, el polipéptido comprende o consiste del polipéptido maduro de la SEC ID NO: 2, o SEC ID NO: 4. En otro aspecto, el polipéptido comprende o consiste de aminoácidos 26 a 532 de la SEC ID NO: 2, o aminoácidos 26 a 532 de la SEC ID NO: 4.

En otra modalidad, la presente invención se refiere a un polipéptido aislado que tiene actividad celobiohidrolasa codificada por un polinucleótido que se híbrida bajo condiciones de media severidad, o condiciones de media-alta severidad, o condiciones de alta severidad, o condiciones de muy alta severidad con (i) la secuencia codificante de polipéptido maduro de la SEC ID NO: 1, o SEC ID NO: 3, (ii) la secuencia de cADN del mismo, o (iii) el componente de longitud completa de (i) o (ii) (Sambrook et al, 1989, Molecular Cloning, A Laboratory Manual, 2d edition, Cold Spring Harbor, New York) .

El polinucleótido de la SEC ID NO: 1, o SEC ID NO: 3, o una subsecuencia del mismo, asi como también el polipéptido de la SEC ID NO: 2, o SEC ID NO: 4, o un fragmento del mismo, se puede usar para diseñar sondas de ácido nucleico para identificar y clonar ADN que codifican polipéptidos que tienen actividad celobiohidrolasa de cepas de diferentes géneros o especies de acuerdo con los métodos bien conocidos en la técnica. En particular, tales sondas se pueden usar para hibridación con el ADN genómico o cADN de una célula de interés, siguiente procedimientos estándares de análisis Southern blot, para identificar y aislar el gen correspondiente aquí. Tales sondas pueden ser considerablemente más cortas que la secuencia completa, pero deben ser de al menos 15, por ejemplo, al menos 25, al menos 35, o al menos 70 nucleótidos de longitud. Preferiblemente, la sonda de ácido nucleico es de al menos 100 nucleótidos de longitud, por ejemplo, al menos 200 nucleótidos, al mentís 300 nucleótidos, al menos 400 nucleótidos, al menos 500 nucleótidos, al menos 600 nucleótidos, al menos 700 nucleótidos, al menos 800 nucleótidos, o al menos 900 nucleótidos de longitud. Se pueden usar sondas tanto de ADN como AR . Las sondas típicamente se etiquetan para detectar el gen correspondiente (por ejemplo, con 2P, 3H, 35S, biotina, o avidina) . Tales sondas se abarcan por la presente invención.

Una biblioteca de cADN o ADN genómico preparada de tales otras cepas se puede seleccionar para ADN que se híbrida con las sondas descritas anteriormente y codifica un polipéptido que tiene actividad celobiohidrolasa . El ADN genómico u otro de tales otras cepas se puede separar por electroforesis en gel de poliacrilamida o agarosa, u otras técnicas de separación. El ADN de las bibliotecas o el ADN separado se puede transferir e inmovilizar en nitrocelulosa u otro material portador adecuado. Para identificar un clon o ADN que se híbrida con la SEC ID NO: 1, o SEC ID NO: 3 o una subsecuencia del mismo, el material portador se usa en un análisis Southern blot .

Para propósitos de la presente invención, la hibridación indica que el polinucleótido se híbrida a una sonda de ácido nucleico etiquetada correspondiente a (i) SEC ID NO: 1, o SEC ID NO: 3; (ii) la secuencia codificante de polipéptido maduro de la SEC ID NO: 1, o SEC ID NO: 3; (iii) el complemento de longitud completa del mismo; o (iv) una subsecuencia del mismo; bajo condiciones de media a muy alta severidad. Las moléculas a las cuales la sonda de ácido nucleico híbrida bajo estas condiciones se pueden detectar usando, por ejemplo, película de rayos X o cualquier otro medio de detección conocido en la técnica.

En un aspecto, la sonda de ácido nucleico es un polinucleótido que codifica el polipéptido de la SEC ID NO: 2, o SEC ID NO: 4; el polipéptido maduro del mismo; o un fragmento del mismo. En otro aspecto, la sonda de ácido nucleico es la SEC ID NO: 1, o SEC ID NO: 3.

En otra modalidad, la presente invención se refiere a un polipéptido aislado que tiene actividad celobiohidrolasa codificada por un polinucleótido que tiene una identidad de secuencia con la secuencia codificante de polipéptido maduro de la SEC ID NO: 1, o SEC ID NO: 3, de al menos 60%, por ejemplo, al menos 65%, al menos 70%, al menos 75%, al menos 80%, al menos 85%, al menos 90%, al menos 91 %, al menos 92%, al menos 93%, al menos 94%, al menos 95%, al menos 96%, al menos 97%, al menos 98%, al menos 99%, o 100%.

En otra modalidad, la presente invención se refiere a variantes del polipéptido maduro de la SEC ID NO: 2, o SEC ID NO: 4 que comprende una sustitución, supresión, y/o inserción en una o más (por ejemplo, varias) posiciones. En una modalidad, el número de sustituciones, supresiones y/o inserciones de aminoácidos introducidas en el polipéptido maduro de la SEC ID NO: 2, o SEC ID NO: 4 no es más de 10, por ejemplo, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8 o 9. Los cambios de aminoácidos pueden ser de una naturaleza menor, es decir sustituciones o inserciones conservadoras de aminoácidos que no afectan significativamente el plegado y/o actividad de la proteína; supresiones pequeñas, típicamente de 1-30 aminoácidos; extensiones pequeñas de amino- o carboxilo- terminal, tal como un residuo metionina amino-terminal ; un péptido enlazante pequeño de hasta 20-25 residuos; o una extensión pequeña que facilita la purificación cambiando la carga neta u otra función, tal como un tramo de poli-histidina, un epitope antigénico o un dominio de enlace.

Los ejemplos de sustituciones conservadoras están dentro de los grupos de aminoácidos básicos (arginina, lisina e histidina), aminoácidos ácidos (ácido glutámico y ácido aspártico) , aminoácidos polares (glutamina y asparagina) , aminoácidos hidrofóbicos (leucina, isoleucina y valina) , aminoácidos aromáticos ( fenilalanina, triptofano y tirosina) , y aminoácidos pequeños (glicina, alanina, serina, treonina y metionina) . Las sustituciones de aminoácidos que generalmente no alteran la actividad especifica son conocidas en la técnica y se describen, por ejemplo, por H. Neurath and R.L. Hill, 1979, en, The Proteins, Academic Press, New York. ' Las sustituciones comunes son Ala/Ser, Val/Ile, Asp/Glu, Thr/Ser, Ala/Gly, Ala/Thr, Ser/Asn, Ala/Val, Ser/Gly, Tyr/Phe, Ala/Pro, Lys/Arg, Asp/Asn, Leu/Ile, Leu/Val, Ala/Glu, y Asp/Gly.

Alternativamente, los cambios de aminoácidos son de tal naturaleza que las propiedades fisico-quimicas de los polipéptidos se alteran. Por ejemplo, los cambios.' de aminoácidos pueden mejorar la estabilidad térmica del polipéptido, alterar la especificidad del sustrato, cambiar el pH óptimo, y similares.

Los aminoácidos esenciales en un polipéptido se pueden identificar de acuerdo con los procedimientos conocidos en el arte, tal como mutagénesis dirigida al sitio o mutagénesis de ¦ exploración de alanina (Cunningham and Wells, 1989, Science 244: 1081 -1085). En la última técnica, las únicas mutaciones de alanina se introducen en cada residuo en la molécula, y las moléculas mutantes resultantes se prueban para actividad celobiohidrolasa para identificar residuos aminoácidos que son críticos para la actividad de la molécula. Ver también, Hilton et al., 1996, J. Biol. Chem. 271:4699-4708. El sitio activo de la enzima u otra interacción biológica también se puede determinar por análisis físico de la estructura, como se determina por tales técnicas como resonancia magnética nuclear, cristalografía, difracción de electrones, o etiquetado por fotoaf inidad, en conjunto con la mutación de aminoácidos de sitio de contacto putativo. Ver, por ejemplo, de Vos et al., 1992, Science 255: 306-312; Smith et al., 1992, J. Mol. Biol. 224: 899-904; Wlodaver et al., 1992, FEBS Lett. 309: 59-64. La identidad de aminoácidos esenciales también puede ser inferida de una alineación con un polipéptido relacionado.

Las sustituciones, supresiones, y/o inserciones de aminoácidos múltiples o simples se pueden hacer y analizar usando métodos conocidos de mutagénesis, recombinación, y/o transposición, seguido por un procedimiento de selección relevante, tales como aquellos descritos por Reidhaar-Olson and Sauer, 1988, Science 241:53-57; Bowie and Sauer, 1989, Proc. Nati. Acad . Sci . USA 86: 2152-2156; WO 95/17413; o WO 95/22625. Otros métodos que se pueden usar incluyen PCR propensa a errores, expresión en fagos (por ejemplo, Lowman et al., 1991, Biochemistry 30: 10832-10837; Patente de Estados Unidos No. 5,223,409; WO 92/06204), y mutagénesis dirigida a la región (Derbyshire et al., 1986, Gene 46: 145; Ner et al., 1988, DNA 7: 127).

Los métodos de mutagénesis/transposición se pueden combinar con métodos de selección automatizados de alto rendimiento para detectar la actividad de polipéptidos mutagenizados clonados expresados por células huéspedes (Ness et al., 1999, Nature Biotechnology 17: 893-896). Las moléculas de ADN mutagenizado que codifican polipéptidos activos se pueden recuperar de las células huéspedes y rápidamente secuenciadas usando métodos estándares en la técnica. Estos métodos permiten la rápida determinación de la importancia de residuos aminoácidos individuales en un polipéptido .

El polipéptido puede ser un polipéptido híbrido en el cual una región de un polipéptido se fusiona en el N-terminal o el C-terminal de una región de otro polipéptido.

El polipéptido puede ser un polipéptido de fusión o polipéptido de fusión escindible en el cual otro polipéptido se fusiona en el N-terminal o el C-terminal del polipéptido de la presente invención. Un polipéptido de fusión se produce fusionando un polinucleótido que codifica otro polipéptido a un polinucleótido de la presente invención. Las técnicas para producir polipéptidos de fusión se conocen en la técnica, e incluyen ligar las secuencias codificantes que codifican los polipéptidos de modo que están en armazón y que la expresión del polipéptido de fusión está bajo control de los mismos promotores y terminador. Los polipéptidos de fusión también se pueden construir usando tecnología de inteína en la cual los polipéptidos de fusión se crean post-traduccionalmente (Cooper et al., 1993, EMBO J. 12: 2575-2583; Dawson et al, 1994, Science 266: 776-779).

Un polipéptido de fusión puede comprender adicionalmente un sitio de escisión entre los '' dos polipéptidos .

En la secreción de la proteína de fusión, el sitio se escinde liberando los dos polipéptidos. Los ejemplos de sitios de escisión incluyen, pero no se limitan a, los sitios descritos en Martin et al., 2003, J. Ind. Microbiol.

Biotechnol. 3: 568-576; Svetina et al., 2000, J. Biotechnol. 76: 245-251; Rasmussen-Wilson et al., 1997, Appl . Environ.

Microbiol. 63: 3488-3493; Ward et al., 1995, Biotechnology 13: 498-503; y Contreras et al, 1991, Biotechnology 9: 378- 381; Eaton et al, 1986, Biochemistry 25: 505-512; Collins-Racie et al., 1995, Biotechnology 13: 982-987; Cárter et al., 1989, Proteins: Structure, Function, and Genetics 6: 240-248; y Stevens, 2003, Drug Discovery World 4: 35-48.

Fuentes de Polipéptidos que Tienen Actividad Celobiohidrolasa Un polipéptido que tiene actividad celobiohidrolasa de la presente invención se puede obtener de microorganismos de cualquier género. Para propósitos de la presente invención, el término "obtenido de" como se usa en la presente en conexión con una fuente dada debe significar que el polipéptido codificado por un polinucleótido se produce por la fuente o por una cepa en la cual el polinucleótido de la fuente se ha insertado. En un aspecto, el polipéptido obtenido de una fuente dada se secreta extracelularmente .

El polipéptido puede ser un polipéptido de Talaromyces .

En otro aspecto, el polipéptido es un polipéptido de Talaromyces leycettanus, por ejemplo, un polipéptido obtenido de la Cepa CBS398.68 de Talaromyces leycettanus.

Se entenderá que para las especies mencionadas antes, la invención abarca los estados tanto perfecto como imperfecto, y otros equivalentes taxonómicos, por ejemplo, anamorfos, sin considerar el nombre de la especie por el cual se conocen. Aquellos expertos en el arte fácilmente reconocerán la identidad de equivalentes apropiados.

Las cepas de estas especies fácilmente son accesibles al público en un número de colecciones de cultivo, tal como la Colección de Cultivo Tipo Americano (ATCC, por sus siglas en inglés), Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH (DSMZ), Centraalbureau Voor Schimmelcultures (CBS) , y Colección de Cultivo de Patente de Servicio de Investigación Agrícola, Centro de Investigación Regional del Norte (NRRL) .

El polipéptido se puede identificar y obtener de otras fuentes incluyendo microorganismos aislados de la naturaleza (por ejemplo, tierra, abono, agua, etc.) o muestras de ADN obtenidas directamente de materiales naturales (por ejemplo, tierra, abono, agua, etc.) usando las sondas mencionadas anteriormente.

Las técnicas para aislar microorganismos y ' ADN directamente de hábitats naturales son bien conocidas en el arte. Un polinucleótido que codifica el polipéptido luego se puede obtener seleccionando de manera similar una biblioteca de cADN o ADN genómico de otro microorganismo o muestra de ADN mezclado. Una vez que un polinucleótido que codifica un polipéptido se ha detectado con las sondas, el polinucleótido se puede aislar o clonar utilizando técnicas que son conocidas por aquellos de experiencia ordinaria en la técnica (ver, por ejemplo, Sambrook et al., 1989, supra) .

Dominios Catalíticos La presente invención también se refiere a polipéptidos aislados que comprenden un dominio catalítico seleccionado del grupo que consiste de: (a) un dominio catalítico que tiene al menos 80% de identidad de secuencia con el dominio catalítico de la SEC ID NO: 2 (por ejemplo, aminoácidos 26 a 460 de la SEC ID NO: 2) o un dominio catalítico que tiene al menos 80% de identidad de secuencia con el dominio catalítico de la SEC ID NO: 4 (por ejemplo, aminoácidos 26 a 459 de la SEC ID NO: 4); (b) un dominio catalítico codificado por un polinucleótido que tiene al menos 60% de identidad de secuencia con la secuencia codificante de dominio catalítico de la SEC ID NO: 1 (por ejemplo, nucleótidos 76 a 1380 de la SEC ID NO: 1) o un dominio catalítico codificado por un polinucleótido que tiene al menos 60% de identidad de secuencia con la secuencia codificante de dominio catalítico de la SEC ID NO: 3 (por ejemplo, nucleótidos 76 a 1377 de la SEC ID NO: 3) ; (c) una variante de un dominio catalítico que comprende una sustitución, supresión, y/o inserción de uno o más (varios) aminoácidos del dominio catalítico de la SEC ID NO: 2 o SED ID NO: 4; y (d) un fragmento de un dominio catalítico de (a) , (b) , o (c) , el cual tiene actividad celobiohidrolasa .

El dominio catalítico preferiblemente tiene un grado de identidad de secuencia con el dominio catalítico de la' SEC ID NO: 2 o SEC ID NO: 4 de al menos 80%, al menos 85%, al menos 90%, al menos 91 %, al menos 92%, al menos 95%, al menos 96%, al menos 97%, al menos 98%, al menos 99%, o 100%. En un aspecto, el dominio catalítico comprende una secuencia de aminoácido que difiere por diez aminoácidos, por ejemplo, por cinco aminoácidos, por cuatro aminoácidos, por tres aminoácidos, por dos aminoácidos, y por un aminoácido del dominio catalítico de la SEC ID NO: 2 o SEC ID NO: 4.

El dominio catalítico preferiblemente comprende o consiste del dominio catalítico de la SEC ID NO: 2 o una variante alélica del mismo; o es un fragmento del mismo que tiene actividad celobiohidrolasa . En otro aspecto preferido, el dominio catalítico comprende o consiste de aminoácidos 26 a 460 de la SEC ID NO: 2.

El dominio catalítico preferiblemente comprende o consiste del dominio catalítico de la SEC ID NO: 4 o una variante alélica del mismo; o es un fragmento del mismo que tiene actividad celobiohidrolasa. En otro aspecto preferido, el dominio catalítico comprende o consiste de aminoácidos 26 a 459 de la SEC ID NO: 4.

En una modalidad, el dominio catalítico se puede codificar por un polinucleótido que se híbrida bajo condiciones de media severidad, o condiciones de media-alta severidad, o condiciones de alta severidad, o condiciones de muy alta severidad (como se definió anteriormente) con (i) la secuencia codificante de dominio catalítico de la SEC ID NO: 1 o SEC ID NO: 3, o (ii) la hebra complementaria de longitud completa de (i) (J. Sambrook et al., 1989, supra) .

El dominio catalítico se puede codificar por un polinucleótido que tiene un grado de identidad de secuencia con la secuencia codificante de dominio catalítico de la SEC ID NO: 1 o SEC ID NO: 3 de al menos 60%, por ejemplo al menos 70%, al menos 75%, al menos 80%, al menos 85%, al menos 90%, al menos 91 %, al menos 92%, al menos 95%, al menos 96%, al menos 97%, al menos 98%, al menos 99%, o 100%, que codifica un polipéptido que tiene actividad celobiohidrolasa.

En un aspecto, el polinucleótido que codifica el dominio catalítico comprende o consiste de nucleótidos 76 a 1380 de la SEC ID NO: 1 o la secuencia de cADN del mismo..

En un aspecto, el polinucleótido que codifica el dominio catalítico comprende o consiste de nucleótidos 76 a 1377 de la SEC ID NO: 3 o la secuencia de cADN del mismo.

Polinucleótidos La presente invención también se refiere a polinucleótidos aislados que codifican un polipéptido de la presente invención, como se describió en la presente.

Las técnicas usadas para aislar o clonar un polinucleótido se conocen en la técnica e incluyen aislamiento del cADN o ADN genómico, o una combinación de los mismos. La clonación de los polinucleotidos del ADN genómico se puede efectuar, por ejemplo, usando la reacción en cadena de polimerasa (PCR, por sus siglas en inglés) bien conocida o selección de anticuerpo de bibliotecas de expresión para detectar fragmentos de ADN clonados con características estructurales compartidas. Ver, por ejemplo, Innis et al., 1990, PCR: A Guide to Methods and Application, Academic Press, New York. Otros procedimientos de amplificación de ácido nucleico tales como reacción en cadena de ligasa (LCR, por sus siglas en inglés) , transcripción activada por ligación (LAT, por sus siglas en inglés) y amplificación basada en polinucleótido (NASBA) se pueden usar. Los polinucleotidos se pueden clonar de una cepa de Talaromyces, o un organismo relacionado y por consiguiente, por ejemplo, pueden ser una variante de especie o alélica del polipéptido que codifica la región del polinucleótido.

La modificación de un polinucleótido que codifica un polipéptido de la presente invención puede ser necesaria para sinterizar los polipéptidos sustancialmente similares al polipéptido. El término "sustancialmente similar" al polipéptido se refiere a .formas que no se presentan naturalmente del polipéptido. Estos polipéptidos pueden diferir en alguna manera genéticamente modificada del polipéptido aislado de su fuente nativa, por ejemplo, variantes que difieren de la actividad especifica, termoestabilidad, pH óptimo, o similares. Las variantes se pueden construir sobre la base del polinucleótido presentado como la secuencia codificante de polipéptido maduro de la SEC ID NO: 1, o SEC ID NO: 3, o la secuencia de cADN del mismo, por ejemplo, una subsecuencia del mismo, y/o por introducción de sustituciones de nucleótido que no resultan en un cambio en la secuencia de aminoácidos del polipéptido, pero que corresponden al uso de codón del organismo huésped propuesto para la producción de la enzima, o por introducción de sustituciones de nucleótido que pueden causar una secuencia de aminoácidos diferente. Para una descripción general de la sustitución de nucleótido, ver, por ejemplo, Ford et al., 1991, Protein Expression and Purification 2: 95-107.

Constructos de Ácido Nucleico La presente invención también se refiere a constructos de ácido nucleico que comprenden un polinucleótido de la présente invención operativamente enlazado a una o más secuencias de control que dirigen la expresión de la secuencia codificante en una célula huésped adecuada bajo condiciones compatibles con las secuencias de control .

Un polinucleótido se puede manipular en , , una variedad de formas para proporcionar la expresión del •polipéptido. La manipulación del polinucleótido previo a su inserción en un vector puede ser deseable o necesaria dependiendo del vector de expresión. Las técnicas para modificar polinucleótidos utilizando métodos de ADN recombinantes son bien conocidas en la técnica.

La secuencia de control puede ser un promotor, un polinucleótido que se reconoce por una célula huésped para expresión de un polinucleótido que codifica un polipéptido de la presente invención. El promotor contiene secuencias de control transcripcionales que median la expresión del polipéptido. El promotor puede ser cualquier polinucleótido que muestra actividad transcripcional en la célula huésped incluyendo promotores mutantes, truncados, e híbridos, y se puede obtener de genes que codifican polipéptidos extracelulares o intracelulares ya sea homólogos o heterólogos a la célula huésped.

Los ejemplos de promotores adecuados para dirigir la transcripción de los constructos de ácido nucleico de la presente invención en una célula huésped bacteriana son los promotores obtenidos del gen alfa-amilasa de Bacillus amyloliquefaciens (amyQ) , gen alfa-amilasa de Bacillus licheniformis (amyL) , gen penicilinasa de Bacillus licheniformis (penP) , gen amilasa maltogénica de Bacillus stearothermophilus (amyM) , gen levansucrasa de Bacillus subtilis (sacB), genes xylA y xylB de Bacillus subtilis, gen crylllA de Bacillus thuringiensis (Agaisse and Lereclus, 1994, Molecular Microbiology 13: 97-107), operón lac de E. coli, promotor trc de E. coli (Egon et al., 1988, Gene 69: 301-315) , gen agarasa de Streptomyces coelicolor (dagA) , y gen beta-lactamasa procariota (Villa-Kamaroff et al., 1978, Proc. Nati. Acad. Sci. USA 75: 3727-3731), asi como también el promotor tac (DeBoer et al., 1983, Proc. Nati. Acad. Sci. USA 80: 21-25). Los promotores adicionales se describen en "Useful proteins from recombinant bacteria" en Gilbert et al., 1980, Scientific American- 242: 74-94; y en Sambrook et al., 1989, supra. Los ejemplos de promotores en tándem se describen en WO 99/43835.

Los ejemplos de promotores adecuados para dirigir la transcripción de los constructos de ácido nucleico de la presente invención en una célula huésped fúngica filamentosa son promotores obtenidos de los genes para acetamidasa de Áspergillus nidulans, alfa-amilasa neutral de Aspergillus niger, alfa-amilasa estable en ácido de Aspergillus niger, glucoamilasa de Aspergillus niger o Aspergillus awamori (glaA) , amilasa TAKA de Aspergillus oryzae, proteasa alcalina de Aspergillus oryzae, triosa fosfato isomerasa de Aspergillus oryzae, proteasa tipo tripsina de Fusarium oxysporum (WO 96/00787), amiloglucosidasa de Fusarium venenatum (WO 00/56900) , Fusarium venenatum Daría (WO 00/56900), Fusarium venenatum Quinn (WO 00/56900), lipasa de Rhizomucor miehei, proteinasa aspártica de Rhizomucor miehei, beta-glucosidasa de Trichoderma reesei, celobiohidrolasa I de Trichoderma reesei, celobiohidrolasa II de Trichoderma reesei, endoglucanasa I de Trichoderma reesei, endoglucanasa II de Trichoderma reesei, endoglucanasa III de Trichoderma reesei, endoglucanasa IV de Trichoderma reesei, endoglucanasa V de Trichoderma reesei, xilanasa I de Trichoderma reesei, xilanasa II de Trichoderma reesei, beta-xilosidasa de Trichoderma reesei, asi como también el promotor NA2-tpi (un promotor modificado de un gen alfa-amilasa neutral de Aspergillus en el cual la guia no traducida se ha remplazado por una guia no traducida de un gen triosa fosfato isomerasa de Aspergillus; los ejemplos no limitantes incluyen promotores modificados de un gen alfa-amilasa neutral de Aspergillus niger en el cual la guia no traducida se ha remplazado por una guia no traducida de un gen triosa fosfato isomerasa de Aspergillus nidulans o Aspergillus oryzae) ; y promotores mutantes, truncados, e híbridos de los mismos.

En un huésped de levadura, los promotores útiles se obtienen de los genes para enolasa de Saccharomyces cerevisiae (ENO-1) , galactocinasa de Saccharomyces cerevisiae (GAL1) , alcohol deshidrogenasa/gliceraldehído-3-fosfato deshidrogenasa de Saccharomyces cerevisiae (ADH1, ADH2/GAP) , triosa fosfato isomerasa de Saccharomyces cerevisiae (TPI), metalotioneína de Saccharomyces cerevisiae (CUP1), y 3-fosfoglicerato cinasa de Saccharomyces cerevisiae . Otros promotores útiles para células huéspedes de levadura se describen por Romanos et al., 1992, Yeast 8: 423-488.

La secuencia de control también puede ser un terminador de transcripción, el cual se reconoce por una célula huésped para terminar la transcripción. El terminador se enlaza operativamente al 3' -terminal del polinucleótido que codifica el polipéptido. Cualquier terminador que es funcional en la célula huésped se puede usar en la presente invención .

Los terminadores preferidos para células huéspedes bacterianas se obtienen de los genes de proteasa alcalina de Bacillus clausii [aprH) , alfa-amilasa de Bacillus licheniformis {amyL) , y ARN ribosomal de Escherichia coli (rrnS) .

Los terminadores preferidos para células huéspedes fúngicas filamentosas se obtienen de los genes de antranilato sintasa de Aspergillus nidulans, glucoamilasa de ñspergillus niger, alfa-glucosidasa de Aspergillus niger, TAKA amilasa de Aspergillus oryzae, y proteasa tipo tripsina de Fusarium oxysporum.

Los terminadores preferidos para células huéspedes de levadura se obtienen de los genes de enolas de Saccharomyces cerevisiae, citocromo C de Saccharo yces cerevisiae (CYC1), y gliceraldehido-3-fosfato deshidrogenasa de Saccharomyces cerevisiae . Otros terminadores útiles para células huéspedes de levadura se describen por Romanos et al., 1992, supra.

La secuencia de control también puede ser una región estabilizadora de mARN cadena abajo de un promotor y cadena arriba de la secuencia codificante de un gen que incrementa la expresión del gen.

Los ejemplos de regiones estabilizadoras de mARN adecuadas se obtienen de un gen crylllA de Bacillus thuringiensis (WO 94/25612) y un gen SP82 de Bacillus subtilis (Hue et al, 1995, Journal of Bacteriology 177: 3465-3471) .

La secuencia de control también puede ser una guia, una región no traducida de un mARN que es importante para la traducción por la célula huésped. La guia se enlaza operativamente al 5' -término del polinucleótido que codifica el polipéptido. Se puede usar cualquier guia que es funcional en la célula huésped.

Las guias preferidas para células huéspedes fúngicas filamentosas se obtienen de los genes para amilasa TAKA de Aspergillus oryzae y triosa fosfato isomerasa de Aspergillus nidulans .

Las guias adecuadas para células huéspedes de levadura se obtienen de los genes de enolasa de Saccharomyces cerevisiae (ENO-1), 3-fosfoglicerato cinasa de Saccharomyces cerevisiae, alfa-factor de Saccharomyces cerevisiae, y alcohol deshidrogenasa/gliceraldehido-3-fosfato deshidrogenasa de Saccharomyces cerevisiae (ADH2/GAP) .

La secuencia de control también puede ser una secuencia de poliadenilación, una secuencia operativamente enlazada al 3' -terminal del polinucleótido y, cuando se transcribe, se reconoce por la célula huésped como una señal para agregar residuos poliadenosina a mARN transcrito. Se puede usar cualquier secuencia de poliadenilación que es funcional en la célula huésped.

Las secuencias de poliadenilación preferidas para células huéspedes fúngicas filamentosas se obtienen de los genes de antranilato sintasa de Aspergillus nidulans, glucoamilasa de Aspergillus niger, alfa-glucosidasa de Aspergillus niger, amilasa TAKA de Aspergillus oryzae, y proteasa tipo tripsina de Fusarium oxysporum.

Las secuencias de poliadenilación útiles para células huéspedes de ' levadura se describen por Gup and Sherman, 1995, Mol. Cellular Biol. 15: 5983-5990.

La secuencia de control también puede ser una región codificante de péptido señal que codifica un péptido señal enlazado al N-terminal de un polipéptido y dirige el polipéptido en la trayectoria secretora de la célula. El extremo 5' de la secuencia codificante del polinucleótido puede contener inherentemente una secuencia codificante de péptido señal naturalmente enlazada en el marco de lectura de traducción con el segmento de la secuencia codificante que codifica el polipéptido. Alternativamente, el extremo 5' de la secuencia codificante puede contener una secuencia codificante de péptido señal que es extraña a la secuencia codificante. Una secuencia codificante de péptido señal extraña se puede requerir donde la secuencia codificante no contiene naturalmente una secuencia codificante de péptido señal. Alternativamente, una secuencia codificante de péptido señal extraña puede remplazar simplemente la secuencia codificante de péptido señal natural para mejorar la secreción del polipéptido. Sin embargo, se puede usar cualquier secuencia codificante de péptido señal que dirige el polipéptido expresado en la trayectoria secretoria de una célula huésped.

Las secuencias codificantes de péptido señal efectivas para células huéspedes bacterianas son las secuencias codificantes de péptido señal obtenidas de los genes para amilasa maltogénica de Bacillus NCIB 11837, subtilisina de Bacillus licheniformis, beta-lactamasa de Bacillus licheniformis, alfa-amilasa de Bacillus stearothermophiluSf proteasas neutrales de Bacillus stearothermophilus (nprT, nprS, nprM) , y prsA de Bacillus subtilis . Los péptidos señales adicionales se describen por Simonen and Palva, 1993, Microbiological Reviews 57: 109-137.

Las secuencias codificantes de péptido señal efectivas para células huéspedes fúngicas filamentosas son las secuencias codificantes de péptido señal obtenidas de los genes de amilasa neutral de Aspergillus niger, glucoamilasa de Aspergillus niger, amilasa TAKA de Aspergillus oryzae, celulasa de Humicola insolens, endoglucanasa V de Humicola insolens, lipasa de Humicola lanuginosa, y proteinasa aspártica de Rhizomucor miehei.

Los péptidos de señal útiles para células huéspedes de levadura se obtienen de los genes de alfa-factor de Saccharomyces cerevisiae e invertasa de Saccharomyces cerevisiae . Otras secuencias codificantes de péptido señal útiles se describen por Romanos et al., 1992, supra.

La secuencia de control también puede ser una secuencia codificante de propéptido que codifica un propéptido posicionado en el N-terminal de un polipéptido. El polipéptido resultante se conoce como una proenzima o propolipéptido (o un zimógeno en algunos casos) . Un propolipéptido generalmente es inactivo y se puede convertir a un polipéptido activo por escisión catalítica o autocatalítica del propéptido del propolipéptido. La secuencia codificante de propéptido se puede obtener de los genes de proteasa alcalina de Bacillus subtilis {aprE) , proteasa neutral de Bacillus subtilis {nprT) , laccasa de Myceliophthora thermophila (WO 95/33836) , proteinasa aspártica de Rhizomucor miehei, y alfa-factor de Saccharomyces cerevisiae.

Donde las secuencias tanto de propéptido como péptido señal están presentes, la secuencia de propéptido se posiciona siguiente al N-terminal de un polipéptido y la secuencia de péptido señal se posiciona siguiente al N-terminal de la secuencia de propéptido.

También puede ser deseable agregar secuencias regulatorias que regulan la expresión del polipéptido con relación al crecimiento de la célula huésped. Los ejemplos de sistemas regulatorios son aquellos que causan la expresión del gen para ser activado o desactivado en respuesta a un estimulo químico o físico, incluyendo la presencia de un compuesto regulatorio. Los sistemas regulatorios en sistemas procariotas incluyen los sistemas de operadores lac, tac, y trp. En la levadura, se puede usar el sistema de ADH2 o sistema de GAL1. En hongos filamentosos, se puede usar el promotor de glucoamilasa de Aspergillus niger, promotor de alfa-amilasa TAKA de Aspergillus oryzae, y promotor de glucoamilasa de Aspergillus oryzae. Otros ejemplos de secuencias regulatorias son aquellos que permiten, la amplificación de genes. En sistemas eucariotas, estas secuencias regulatorias incluyen el gen dihidrofolato reductasa que se amplifica en la presencia de metotrexato, y los genes metalotioneína que se amplifican con metales pesados. En estos casos, el polinucleótido que codifica el polipéptido sería operativamente enlazado con la secuencia regulatoria .

Vectores de Expresión La presente invención también se refiere a vectores de expresión recombinantes que comprenden un polinucleótido de la presente invención, enlazado a una o más secuencias de control, por ejemplo, un promotor, y señales de terminación transcripcionales y traduccionales , que dirigen la producción del polipéptido en un huésped de expresión. Las diversas secuencias de control y nucleótido se pueden unir conjuntamente para producir un vector de expresión recombinante que puede incluir uno o más sitios de restricción convenientes para permitir la inserción o sustitución del polinucleótido que codifica el polipéptido en tales sitios. Alternativamente, el polinucleótido se puede expresar insertando el polinucleótido o un constructo de ácido nucleico que comprende el polinucleótido en un vector apropiado para la expresión. Al crear el vector de expresión, la secuencia codificante se ubica en el vector de modo que la secuencia codificante se enlaza operativamente con las secuencias de control apropiadas para la expresión.

El vector de expresión recombinante puede ser cualquier vector (por ejemplo, un plásmido o virus) que se puede someter convenientemente a procedimientos de , ADN recombinante y puede causar expresión del polinucleótido. La elección del vector típicamente dependerá de la compatibilidad del vector con la célula huésped en la cual el vector será introducido. El vector puede ser un plásmido circular lineal o cerrado.

El vector puede ser un vector de replicación autónoma, es decir, un vector que existe como una entidad extracromosómica , la replicación del cual es independiente de la replicación cromosómica, por ejemplo, un plásmido, un elemento extracromosómico, un minicromosoma, o un cromosoma artificial. El vector puede contener cualquier medio para asegurar la auto-replicación . Alternativamente, el vector puede ser uno que, cuando se introduce en la célula huésped, se integra en el genoma y se replica con untamente con los cromosomas en los cuales se ha integrado. Además, se puede usar un plásmido o vector único o dos o más vectores o plásmidos que conjuntamente contienen el ADN total' 'S1' ser introducido en el genoma de la célula huésped, .o. un transposón .

El vector preferiblemente contiene uno o más marcadores seleccionables que permiten la fácil selección de células transformadas, transíectadas, transducidas,. o similares. Un marcador seleccionable es un gen, el producto del cual proporciona resistencia a biocidas o viral, resistencia a metales pesados, prototrofía a auxótrofos, y similares.

Los ejemplos de marcadores selecciónateles bacterianos son genes dal de Bacillus licheniformis o Bacillus subtilis, o marcadores que confieren resistencia antibiótica tal como resistencia a ampicilina, cloranfenicol , canamicina, neomicina, espectinomicina, o tetraciclina . Los marcadores adecuados para células huéspedes de levadura incluyen, pero no se limitan a, ADE2, HIS3, LEU2, LYS2, MET3, TRP1, y URA3. Los marcadores selecciónateles para el uso en una célula huésped fúngica filamentosa incluyen, pero no se limitan a, amdS (acetamidasa) , argB (ornitina carbamoiltransferasa) , bar ( fosfinotricina acetiltransferasa) , hph (higromicina fosfotransferasa ) , niaD (nitrato reductasa) , y G (orotidina-51 -fosfato descarboxilasa) , sC (sulfato adeniltransferasa) , y trpC (antranilato sintasa) , asi como también equivalentes de los mismos. Preferidos para el uso en una célula Aspergillus son genes amdS y pyrG de Aspergillus nidulans o Aspergillus oryzae y un gen bar de Streptomyces hygroscopicus .

El vector preferiblemente contiene unos elementos que permiten la integración del vector en el genoma de la célula huésped o replicación autónoma del vector en la célula independiente del genoma.

Para la integración en el genoma de la célula huésped, el vector puede situarse en la secuencia del polinucleótido que codifica el polipéptido o cualquier; otro elemento del vector para la integración en el genoma por recombinación homologa o no homologa. Alternativamente, el vector puede contener polinucleótidos adicionales para dirigir la integración por recombinación homologa en el genoma de la célula huésped en unas ubicaciones precisas en los cromosomas. Para incrementar la probabilidad de integración en una ubicación precisa, los elementos de integración deben contener un número suficiente de ácidos nucleicos, tales como 100 a 10,000 pares de base, 400 a 10,000 pares de base, y 800 a 10,000 pares de base, los cuales tienen un alto grado de identidad de secuencia con la secuencia objetivo correspondiente para mejorar la probabilidad de recombinación homologa. Los elementos de integración pueden ser cualquier secuencia que es homologa con la secuencia objetivo en el genoma de la célula huésped. Además, los elementos de integración pueden ser polinucleótidos no codificante o codificantes. Por,, otra parte, el vector se puede integrar en el genoma de la célula huésped por recombinacion no homologa.

Para replicación autónoma, el vector adicionalmente puede comprender un origen de replicación que habilita el vector para la replicación autónoma en la célula huésped en cuestión. El origen de replicación puede ser cualquier replicador de plásmido que media la replicación autónoma que funciona en una célula. El término "origen de replicación" o "replicador de plásmido" significa un polinucleótido que hace posible que un plásmido o vector se replique in vivo.

Los ejemplos de orígenes bacterianos de replicación son los orígenes de replicación de los plásmidos pBR322, pUC19, pACYC177, y pACYC184 que permiten la replicación en E. coli, y pUBUO, pE194, pTA1060, y ???ß? que permiten la replicación en Bacillus .

Los ejemplos de los orígenes de replicación para el uso en una célula huésped de levadura son el origen de replicación de 2 mieras, ARS1, ARS4, la combinación de ARS1 y CEN3, y la combinación de ARS4 y CEN6.

Los ejemplos de orígenes de replicación útiles en una célula fúngica filamentosa son AMA1 y ANSI (Gems et al., 1991, Gene 98: 61-67; Cullen et al, 1987, Nucleic Acids Res. 15:9163-9175; WO 00/24883). El aislamiento del gen AMA1 y construcción de plásmidos o vectores que comprenden el gen se pueden realizar de acuerdo con los métodos descritos en WO 00/24883.

Más de una copia de un polinucleótido de la presente invención se puede insertar en una célula huésped para incrementar la producción de un polipéptido. Un incremento del número de copias del polinucleótido se puede obtener integrando al menos una copia adicional de la secuencia en el genoma de célula huésped o incluyendo un gen de marcador seleccionable amplificable con el polinucleótido donde las células que contienen copias amplificadas del gen de marcador seleccionable , y copias adicionales del polinucleótido, se pueden seleccionar para cultivar las células en la presencia del agente seleccionable apropiado.

Los procedimientos usados para ligar los elementos descritos anteriormente para construir los vectores de expresión recombinantes de la presente invención son bien conocidos por un experto en la técnica (ver, por ejemplo, Sambrook et al., 1989, supra) .

Células Huéspedes La presente invención también se refiere a células huéspedes recombinantes, que comprenden un polinucleótido de la presente invención operativamente enlazado a una o más secuencias de control que dirige la producción de un polipéptido de la presente invención. Un constructo o vector que comprende un polinucleótido se introduce en una célula huésped de modo que el constructo o vector se mantiene como un integrante cromosómico o como un vector extra-cromosómico auto-replicante como se describe antes. El término "célula huésped" abarca cualquier progenie de una célula precursora que no es idéntica a la célula precursora debido a las mutaciones que ocurren durante la replicacion. La elección de una célula huésped a un gran grado dependerá del gen que codifica el polipéptido y su fuente.

La célula huésped puede ser cualquier célula útil en la producción recombinante de un polipéptido de la presente invención, por ejemplo, una procariota o una eucariota .

La célula huésped procariota puede ser cualquier bacteria Gram-positiva o Gram-negativa . Las bacterias Gram-positivas incluyen, pero no se limitan a, Bacillus , Clostridium , Enterococcus, Geobacillus , Lactobacillus , Lactococcus , Oceanobacillus , Staphylococcus , Streptococcus , y Streptomyces .

Las bacterias Gram-negativas incluyen, pero no se limitan a, Campylobacter, E. coli, Flavobacterium , Fusobacterium , Helicobacter, llyobacter, Neisseria , Pseudomonas , Salmonella, y Ureaplasma.

La célula huésped bacteriana puede ser cualquier célula de Bacillus que incluye, pero no se limita a, células de Bacillus alkalophilus , Bacillus amyloliquefaciens, Bacillus brevis , Bacillus circulans , Bacillus clausii, Bacillus coagulans , Bacillus firmus, Bacillus lautus, Bacillus lentus, Bacillus licheniformis, Bacillus megaterium, Bacillus pumilus, Bacillus stearothermophilus , Bacillus subtilis , y Bacillus thuringiensis .

La célula huésped bacteriana también puede ser cualquier célula de Streptococcus incluyendo, pero no limitado a, células de Streptococcus equisiwilis , Streptococcus pyogenes, Streptococcus uberis, y Streptococcus equi subsp. Zooepidemicus .

La célula huésped bacteriana también puede ser cualquier célula de Streptomyces incluyendo, pero no lirnitaod a, células de Streptomyces achromogenes , Streptomyces avermitilis , Streptomyces coelicolor, Streptomyces griseus, y Streptomyces lividans .

La introducción de ADN en una célula de Bacillus se puede efectuar por transformación de protoplastos (ver, por ejemplo, Chang and Cohén, 1979, Mol. Gen. Genet . 168:111-115), transformación de células competentes (ver, por ejemplo, Young and Spizizen, 1961, J. Bacteriol. 81:823-829, o Dubnau and Davidoff-Abelson, 1971, J. Mol. Biol. 56:209-221), electroporación (ver, por ejemplo, Shigekawa and Dower, 1988, Biotechniques 6:742-751), o conjugación (ver, por ejemplo, Koehler and Thorne, 1987, J. Bacteriol. 169: 5271-5278). La introducción de ADN en una célula de E. coli se puede efectuar por transformación de protoplastos (ver,, por ejemplo, Hanahan, 1983, J. Mol. Biol. 166: 557-580) o electroporación (ver, por ejemplo, Dower et al., 1988, Nucleic Acids Res. 16: 6127-6145). La introducción de ADN en una célula de Streptomyces se puede efectuar por transformación de protoplastos, electroporación (ver, por ejemplo, Gong et al., 2004, Folia Microbiol . (Praha) 49:399-405), conjugación (ver, por ejemplo, Mazodier et al., 1989, J. Bacteriol. 171:3583-3585), o transducción (ver, por ejemplo, Burke et al., 2001, Proc. Nati. Acad. Sci. USA 98:6289-6294). La introducción de ADN en una célula de Pseudomonas se puede efectuar por electroporación (ver, por ejemplo, Choi et al., 2006, J. Microbiol. ethods 64:391-397) o conjugación (ver, por ejemplo, Pinedo and Smets, 2005, Appl. Environ. Microbiol. 71:51-57). La introducción de ADN en una célula de Streptococcus se puede efectuar por competencia natural (ver, por ejemplo, Perry and Kuramitsu, 1981, Infect. Immun. 32:1295-1297), transformación de protoplastos (ver, por ejemplo, Ca-tt and Jollick, 1991, Microbios 68:189-207), electroporación (ver, por ejemplo, Buckley et al., 1999, Appl. Environ. Microbiol. 65:3800-3804), o conjugación (ver, por ejemplo, Clewell, 1981, Microbiol. Rev. 45: 409-436). Sin embargo, se puede usar cualquier método conocido en la técnica para introducir ADN en una célula huésped.

La célula huésped también puede ser una eucariota, tal como una célula de mamífero, de insecto, de planta, o fúngica. La célula huésped puede ser una célula fúngica. "Hongos" como se usa en la presente incluye los filos Ascomicetos, Basidiomicetos, Quitridiomicetos, y Zigomicetos así como también Oomicetos y todos los hongos mitospóricos (como se define por Hawksworth et al., en, Ainsworth and Bisby's Dictionary of The Fungi, 8th edition, 1995, CAB International, University Press, Cambridge, UK) .

La célula huésped fúngica puede ser una célula de levadura. "Levadura" como se usa en la presente incluye levadura ascosporogenosa ( Endomicetales ) , levadura basidiosporogenosa, y levadura que pertenece a Hongos Imperfectos (Blastomicetos ) . Puesto que la clasificación de levadura puede cambiar en el futuro, para los propósitos de esta, invención, la levadura se debe definir como se describe en Biología y Actividades de Levadura (Skinner, Passmore, and Davenport, editors, Soc. App. Bacteriol. Symposium Series No. 9, 1980) .

La célula huésped de levadura puede ser una célula de Candida , Hansenula , Kluyveromyces , Pichia, Saccharomyces , Schizosaccharomyces, o Yarrowia , tal como una célula de Kluyveromyces lactis, Saccharomyces carlsbergensis , Saccharomyces cerevisiae, Saccharomyces diastaticus , Saccharomyces douglasii , Saccharomyces kluyveri , Saccharomyces norbensis , Saccharomyces oviformis, o Yarrowia lipolytica .

La célula huésped fúngica puede ser una célula fúngica filamentosa. "Hongos filamentosos" incluyen todas las formas filamentosas de la subdivisión Eumicetos y Oomicetos (como se define por Hawksworth et al., 1995, supra) . Los hongos filamentos generalmente se caracterizan por una pared micelial compuesta de quitina, celulosa, glucano, quitosan, mañano, y otros polisacáridos complejos. El crecimiento vegetativo es por elongación hifal y el catabolismo de carbono es obligadamente aeróbico. En contraste, el crecimiento vegetativo por levaduras tal como Saccharomyces cerevisiae es por brote de un tallo unicelular y el catabolismo de carbono puede ser fermentativo.

La célula huésped fúngica filamentosa puede ser una célula de Acremonium , Aspergillus , Aureobasidium , Bj erkandera , Ceriporiopsis , Chrysosporium, Coprinus , Coriolus , Cryptococcus , Filibasidium , Füsarium, Hu icola , Magnaporthe, Muco , Myceliophthora , Neocallimastix , Neurospora , Paecilomyces , Penicillium, Phanerochaete, Phlebia, Piromyces, Pleurotus, Schizophyllum , Talaromyces , Thermoascus , Thielavia , Tolypocladium, Trametes , o Trichoderma .

Por ejemplo, la célula huésped fúngica filamentosa puede ser una célula de Aspergillus awamori, Aspergillus foetidus , Aspergillus fumigatus , Aspergillus japonicus , Aspergillus nidulans , Aspergillus niger, Aspergillus oryzae, Bjerkandera adusta, Ceriporiopsis aneirina, Ceriporiopsis caregiea , Ceriporiopsis gilvescens , Ceriporiopsis pannocinta , Ceriporiopsis rivulosa , Ceriporiopsis subrufa, Ceriporiopsis subvermispora , Chrysosporium inops , Chrysosporium keratinophilum, Chrysosporium lucknowense, Chrysosporium merdarium , Chrysosporium pannicola , Chrysosporium queenslandicum , Chrysosporium tropicum , Chrysosporium zonatum, Coprinus cinereus , Coriolus hirsutus, Fusarium bactridioides , Fusarium cerealis , Fusarium crookwellense, Fusarium culmorum, Fusarium graminearum, Fusarium graminum, Fusarium heterosporum , Fusarium negundi, Fusarium oxysporu , Fusarium reticulatum, Fusarium roseum, Fusarium sambucinum , Fusarium sarcochroum, Fusarium sporotrichioides , Fusarium sulphureum , Fusarium torulosum , Fusarium trichothecioides , Fusarium venenatum , Humicola insolens , Humicola lanuginosa , Mucor miehei, Myceliophthora thermophila , Neurospora crassa, Penicillium purpurogenum , Phanerochaete chrysosporium , Phlebia radiata, Pleurotus eryngii, Thielavia terrestris , Trametes villosa, Trametes versicolor, Trichoderma harzianum, Trichoderma koningii , Trichoderma longibrachiatum , Trichoderma reesei, o Trichoderma viride.

Las células fúngicas se pueden transformar por un proceso que involucra formación de protoplastos, transformación de los protoplastos, y regeneración de la pared celular en una manera conocida per se. Los procedimientos adecuados para la transformación de células huéspedes de Aspergillus y Trichoderma se describen en la EP 238023, Yelton et al, 1984, Proc. Nati. Acad. Sci . USA 81:1470-1474, y Christensen et al., 1988, Bio/Technology 6: 1419-1422. Los métodos adecuados para transformar especies Fusarium se describen por Malardier et al, 1989, Gene 78:147-156, y WO 96/00787. La levadura se puede transformar usando los procedimientos descritos por Becker and Guarente, en Abelson, J.N. and Simón, M.I., editors, Guide to Yeast Genetics and Molecular Biology, Methods in Enzymology, Volume 194, pp 182-187, Academic Press, Inc., New York; Ito et al., 1983, J. Bacteriol. 153: 163; y Hinnen et al., 1978, Proc. Nati. Acad. Sci. USA 75: 1920.

Métodos de Producción La presente invención también se refiere a métodos para producir un polipéptido de la presente invención, que comprenden (a) cultivar una célula, la cual en su forma tipo silvestre produce el polipéptido, bajo condiciones conducentes para la producción del polipéptido; y (b) recuperar el polipéptido. En un aspecto preferido, la célula es una célula de Talaromyces . En un aspecto más preferido, la célula es una célula de Talaromyces leycettanus . En un aspecto más preferido, la célula es la cepa CBS398.68 de Talaromyces leycettanus .

La presente invención también se refiere a métodos para producir un polipéptido de la presente invención, que comprenden (a) cultivar una célula huésped recombinante de la presente invención bajo condiciones conducentes para la producción del polipéptido; y (b) recuperar el polipéptido.

Las células huéspedes se cultivan en un medio de nutrientes adecuado para la producción del polipéptido usando métodos conocidos en la técnica. Por ejemplo, la célula se puede cultivar por cultivo en matraz de agitación, o fermentación a pequeña escala o gran escala (incluyendo fermentaciones continuas, en lote, de alimentación por lote, o estado sólido) en fermentadores de laboratorio o industriales en un medio adecuado y bajo condiciones que permiten que el polipéptido sea expresado y/o aislado. El cultivo toma lugar en un medio de nutrientes adecuado que comprende fuentes de carbono y nitrógeno y sales inorgánicas, usando procedimientos conocidos en la técnica. Los medios adecuados están disponibles de proveedores comerciales o se pueden preparar de acuerdo con las composiciones publicadas (por ejemplo, en catálogos de la Colección de Cultivo Tipo Americano) .

Si el polipéptido se secreta en el medio de nutrientes, el polipéptido se puede recuperar directamente del medio. Si el polipéptido no se secreta, se puede recuperar de Usados de células.

El polipéptido se puede detectar usando métodos conocidos en la técnica que son específicos para los polipéptidos . Estos métodos de detección incluyen, pero no se limitan a, el uso de anticuerpos específicos, formación de un producto de enzima, o desaparición de un sustrato de enzima.

Por ejemplo, un ensayo de enzima se puede usar para determinar la actividad del polipéptido.

El polipéptido se puede recuperar usando métodos conocidos en la técnica. Por ejemplo, el polipéptido se puede recuperar del medio de nutrientes por procedimientos convencionales incluyendo, pero no limitado a, colección, centrifugación, filtración, extracción, secado por pulverización, evaporación, o precipitación.

El polipéptido se puede purificar por una variedad de procedimientos conocidos en la técnica incluyendo, pero no limitado a, cromatografía (por ejemplo, intercambio iónico, afinidad, hidrofóbica, cromatoenfoque, y exclusión por tamaño) , procedimientos electroforáticos (por ejemplo, enfoque isoeléctrico preparativo) , solubilidad diferencial (por ejemplo, precipitación por sulfato de amonio) , SDS-PAGE, o extracción (ver, por ejemplo, Protein Purification, Janson and Ryden, editors, VCH Publishers, New York, 1989) para obtener polipéptidos sustancialmente puros.

En un aspecto alternativo, el polipéptido no' se recupera, sino más bien una célula huésped de la presente invención que expresa el polipéptido se usa como una fuente del polipéptido.

Plantas La presente invención también se refiere a plantas aisladas, por ejemplo, una planta transgénica, partes de la planta, o célula de planta, que comprenden un polinucleótido de la presente invención para expresar y producir un polipéptido o dominio en cantidades recuperables. El polipéptido o dominio se puede recuperar de la planta o parte de la planta. Alternativamente, la planta o parte de la planta que contiene el polipéptido o dominio se puede usar como tal para mejorar la calidad de un alimento o pienso, por ejemplo, mejorar el valor nutricional, apetencia, y propiedades reológicas, o para destruir un factor antinutritivo .

La planta transgénica puede ser dicotiledónea (una dicot) o monocotiledonea (una monocot). Los ejemplos de plantas monocot son pastos, tal como grama de los prados (pasto azul, Poa), pasto de forraje tal como Festuca, Lolium, pasto de clima templado, tal como Agrostis, y cereales, por ejemplo, trigo, avena, centeno, cebada, arroz, sorgo, y maiz (grano) .

Los ejemplos de plantas dicot son tabaco, legumbres, tales como altramuces, papa, remolacha azucarera, chícharo, frijol y soja, y las plantas cruciferas (familia Brassicaceae) , tales como coliflor, semilla de colza, y el organismo modelo estrechamente relacionado Arabidopsis thaliana.

Los ejemplos de partes de plantas son tallos, callos, hojas, raíces, frutos, semillas, y tubérculos así como también los tejidos individuales que comprenden estas partes, por ejemplo, epidermis, mesófilo, parénquima, tejidos vasculares, meristemas. Los compartimientos de células de plantas específicos, · tales como cloroplastos, apoplastos, mitocondria, vacuolas, peroxisomas y citoplasma también se consideran como una parte de planta. Además, cualquier célula de planta, cualquiera que sea el origen del tejido, se considera que es una parte de planta. Igualmente, las partes de planta tales como tejidos específicos y células aisladas para facilitar la utilización de la invención también se consideran partes de plantas, por ejemplo, embriones, endospermas, aleuronas y cubiertas seminales.

También se incluye dentro del alcance de la presente invención la progenie de tales plantas, partes de planta, y células de planta.

La planta transgénica o célula de planta que expresa el polipéptido o dominio se puede construir de acuerdo con los métodos conocidos en la técnica. En breve, la planta o célula de planta se construye incorporando uno o más constructos de expresión que codifican el polipéptido o dominio en el genoma del huésped de planta o genoma de cloroplasto y propagando la célula de planta o planta modificada resultante en una célula de planta o planta transgénica .

El constructo de expresión convenientemente es un constructo de ácido nucleico que comprende un polinucleótido que codifica un polipéptido o dominio operativamente enlazado con secuencias regulatorias apropiadas requeridas para la expresión del polinucleótido en la planta o parte de planta de elección. Además, el constructo de expresión puede comprender un marcador seleccionable útil para identificar las células de planta en las cuales el constructo de expresión se ha integrado y secuencias de ADN necesarias para la introducción del constructo en la planta en cuestión (lo último depende del método de introducción de ADN a ser usado) .

La elección de las secuencias regulatorias, tales como secuencias de promotor y terminador y opcionalmente secuencias de señal o tránsito, se determina, por ejemplo, sobre la base de cuando, donde, y cómo el polipéptido o dominio se desea que sea expresado. Por ejemplo, la expresión del gen que codifica un polipéptido o dominio puede ser constitutiva o inducible, o puede ser especifica del desarrollo, etapa o tejido, y el producto genético se puede dirigir a una parte de planta o tejido especifico tales como semillas u hojas. Las secuencias regulatorias son, por ejemplo, descritas por Tague et al. , 1988, Plant Physiology 86: 506.

Para la expresión constitutiva, el promotor 35S-CaMV, de la ubiquitina 1 de maíz, o la actina 1 de arroz se puede usar (Franck et al., 1980, Cell 21:285-294; Christensen et al., 1992, Plant Mol. Biol . 18:675-689; Zhang et al'., 1991, Plant Cell 3:1155-1165). Los promotores específicos de órganos pueden ser, por ejemplo, un promotor de tejidos sumideros de almacenamiento tales como semillas, tubérculos de papa, y frutos (Edwards and Coruzzi, 1990, Ann. Rev. Genet. 24: 275-303), o de tejidos sumideros metabólicos tales como meristemas (Ito et al., 1994, Plant Mol. Biol. 24: 863-878), un promotor especifico de semillas tal como el promotor de glutelina, prolamina, globulina, o albúmina del arroz (Wu et al., 1998, Plant Cell Physiol. 39: 885-889), un promotor de Vicia faba de la legumina B4 y el gen de proteina de semilla desconocido de Vicia faba (Conrad et al., 1998, J. Plant Physiol. 152: 708-711), un promotor de un cuerpo proteico de aceite de semilla (Chen et al., 1998, Plant Cell Physiol. 39:935-941), el promotor napA de proteina de almacenamiento de Brassica napus, o cualquier otro promotor especifico de semillas conocido en la técnica, por ejemplo, como se describe en O 91/14772. Además, el promotor puede ser un promotor especifico de hojas tal como el promotor rbcs de arroz o tomate (Kyozuka et al., 1993, Plant Physiol. 102:991-1000), el promotor de gen adenina metiltransferasa de virus chlorella (Mitra and Higgins, 1994, Plant Mol. Biol. 26: 85-93), el promotor de gen aldP de arroz (Kagaya et al., 1995, Mol. Gen. Genet. 248: 668-674), o un promotor inducible por lesiones tal como el promotor pin2 de papa (Xu et al., 1993, Plant Mol. Biol. 22: 573-588). Igualmente, el promotor se puede inducir por tratamientos abióticos tales como temperatrura, sequía, o alteraciones en la salinidad o inducido por sustancias exogenamente aplicadas que activan el promotor, por ejemplo, etanol, estrógenos, hormonas de plantas tal como etileno, ácido abscísico, y ácido gibberélico, y metales pesados.

Un elemento mejorador de promotor también se puede usar para lograr la mayor expresión de un polipéptido o dominio en la planta. Por ejemplo, el elemento mejorador de promotor puede ser un intrón que se coloca entre el promotor y el polinucleótido que codifica un polipéptido o dominio. Por ejemplo, Xu et al., 1993, supra, describen el uso del primer intrón del gen actina 1 de arroz para mejorar la expresión .

El gen de marcador seleccionable y cualquier otra parte del constructo de expresión se puede elegir de aquellos disponibles en la técnica.

El constructo de ácido nucleico se incorpora en el genoma de planta de acuerdo con las técnicas convencionales conocidas en la técnica, incluyendo la transformación mediada por Agrobacterium, transformación mediada por virus, microinyección, bombardeo de partículas, transformación biolística, y electroporación (Gasser et al., 1990, Science 244:1293; Potrykus, 1990, Bio/Technology 8: 535; Shimamoto et al., 1989, Nature 338: 274).

La transferencia de genes mediada por Agrobacterium tumefaciens es un método para generar dicots transgénicas (para una revisión, ver Hooykas and Schilperoort, 1992, Plant Mol. Biol. 19: 15-38) y para transformar monocots, aunque otros métodos de transformación se pueden usar para estas plantas. Un método para generar monocots transgénicas es bombardeo de partículas (partículas microscópicas de oro o tungsteno revestidas con el ADN transformante) de embriones de desarrollo o callos embriónicos (Christou, 1992, Plant J. 2: 275-281; Shimamoto, 1994, Curr. Opin. Biotechnol . 5:158-162; Vasil et al., 1992, Bio/Technology 10:667-674). Un método alternativo para la transformación de monocots se basa en la transformación de protoplastos como se describe por Omirulleh et al., 1993, Plant Mol. Biol. 21:415-428. Los métodos de transformación adicionales incluyen aquellos descritos en las Patentes de Estados Unidos Nos. 6,395,966 y 7,151,204 (ambas se incorporan en la presente para referencia en su totalidad) .

Después de la transformación, los transformantes que tienen incorporado el constructo de expresión se seleccionan y regeneran en plantas completas de acuerdo con los métodos bien conocidos en la técnica. Con frecuencia el procedimiento de transformación se diseña para la eliminación selectiva de genes de selección ya sea durante la regeneración o en las siguientes generaciones usando, por ejemplo, co-transformación con dos constructos de T-ADN separados o extirpación de sitio especifico del gen de selección por una recombinasa especifica.

Además de dirigir la transformación de un genotipo de planta particular con un constructo de la presente invención, las plantas transgénicas se pueden producir cruzando una planta que tiene el constructo con una segunda planta que carece del constructo. Por ejemplo, un constructo que codifica un polipéptido o dominio se puede introducir en una variedad de planta particular por cruzamiento, sin la necesidad de transformar directamente una planta de esta variedad dada. Por lo tanto, la presente invención abarca no solamente una planta directamente regenerada de células las cuales se han transformado de conformidad con la presente invención, sino también la progenie de tales plantas. Como se usa en la presente, la progenie puede referirse a la descendencia de cualquier generación de una planta precursora preparada de conformidad con la presente invención. Tal progenie puede incluir un constructo de ADN preparado de conformidad con la presente invención. La cruza resulta en la introducción de un transgen en una linea de planta por polinización cruzada de una linea de partida con una linea de planta donante. Los ejemplos no limitantes de tales etapas se describen en la Patente de Estados Unidos No. 7,151,204.

Las plantas se pueden generar mediante un proceso de conversión por retrocruzamiento . Por ejemplo, las plantas incluyen plantas referidas como un genotipo, linea, endogamo o híbrido convertido por retrocruzamiento .

Los marcadores genéticos se pueden usar para asistir en la introgresión de uno o más transgenes de la invención de un antecedente genético en otro. La selección asistida por marcador ofrece ventajas con relación a la reproducción convencional porque se puede usar para evitar errores causados por variaciones fenotípicas. Además, los marcadores genéticos pueden proporcionar datos con respecto al grado relativo del germoplasma de élite en la progenie individual de una cruza particular. Por ejemplo, cuando una planta con un rasgo deseado el cual de otra manera tiene un antecedente genético no agronómicamente deseable se cruza con un precursor de élite, los marcadores genéticos se pueden usar para seleccionar la progenie la cual no solamente posee el rasgo de interés, sino también tiene una proporción relativamente grande del germoplasma deseado. De esta manera, se minimiza el número de generaciones requerido para' la introgresión de uno o más rasgos en un antecedente genético particular .

La presente invención también se refiere a los métodos para producir un polipéptido o dominio de la presente invención que comprenden (a) cultivar una planta transgénica o una célula de planta que comprende un polinucleótido que codifica el polipéptido o dominio bajo condiciones conducentes para la producción del polipéptido o dominio; y (b) recuperar el polipéptido o dominio.

A continuación se dan ejemplos de usos preferidos de las composiciones de polipéptido de la invención. La dosificación de la composición de polipéptido de la invención y otras condiciones bajo las cuales la composición se usa se pueden determinar sobre la base de los métodos conocidos en la técnica.

La presente invención también se dirige a los siguientes procesos para usar los polipéptidos que tienen actividad celobiohidrolasa, o composiciones de los mismos.

La presente invención también se refiere a procesos para degradar un material celulósico, que comprenden: tratar el material celulósico con una composición de enzima en la presencia de un polipéptido que tiene actividad celobiohidrolasa de la presente invención. En un aspecto, los procesos adicionalmente comprenden recuperar el material celulósico convertido o degradado. Los productos solubles de degradación o conversión del material celulósico se pueden separar del material celulósico insoluble usando un método conocido en la técnica tal como, por ejemplo, centrifugación, filtración, o asentamiento por gravedad.

La presente invención también se refiere a procesos para producir un producto de fermentación, que comprenden: (a) sacarificar un material celulósico con una composición de enzima en la presencia de un polipéptido que tiene actividad celobiohidrolasa de la presente invención; (b) fermentar el material celulósico sacarificado con uno o más (por ejemplo, varios) microorganismos termentadores para producir el producto de fermentación; y (c) recuperar el producto de fermentación de la fermentación.

La presente invención también se refiere a procesos para fermentar un material celulósico, que comprenden: fermentar el material celulósico con uno o más (por ejemplo, varios) microorganismos termentadores, en donde el material celulósico es sacarificado con una composición de enzima en la presencia de un polipéptido que tiene actividad celobiohidrolasa de la presente invención. En un aspecto, la fermentación del material celulósico produce un producto de fermentación. En otro aspecto, los procesos adicionalmente comprenden recuperar el producto de fermentación de la fermentación.

Los procesos de la presente invención se pueden usar para sacarificar el material celulósico a azúcares fermentables y convertir los azúcares fermentables a muchos productos de fermentación útiles, por ejemplo, combustible, etanol potable, y/o sustancias químicas de plataforma (por ejemplo, ácidos, alcoholes, cetonas, gases, y similares) . La producción de un producto de fermentación deseado del material celulósico típicamente involucra pretratamiento, hidrólisis enzimática (sacarificación), y fermentación.

El procesamiento del material celulósico de acuerdo con la presente invención se puede realizar usando métodos convencionales en la técnica. Además, los procesos de la presente invención se pueden implementar usando cualquier aparato de procesamiento de biomasa convencional configurado para operar de conformidad con la invención.

La hidrólisis (sacarificación) y fermentación, separada o simultánea, incluyen, pero no se limitan a, hidrólisis y fermentación separadas (SHF, por sus siglas en inglés); sacarificación y fermentación simultáneas (SSF, por sus siglas en inglés); sacarificación y co-fermentación simultáneas (SSCF, por sus siglas en inglés) ; hidrólisis y fermentación híbridas (HHF, por sus siglas en inglés); hidrólisis y co-fermentación separadas (SHCF, por sus siglas en inglés); hidrólisis y co-fermentación híbridas (HHCF, por sus siglas en inglés); y conversión microbiana directa · (D C, por sus siglas en inglés) , también algunas veces llamadas bioprocesamiento consolidado (CBP, por sus siglas en inglés) .

SHF usa etapas de proceso separadas para primero hidrolizar enzimáticamente el material celulósico a azúcares fermentables , por ejemplo, glucosa, celobiosa, y monómeros de pentosa, y luego fermentar los azúcares fermentables a etanol. En SSF, la hidrólisis enzimática del material celulósico y la fermentación de azúcares a etanol se combinan en una etapa (Philippidis, G. P., 1996, Cellulose bioconversion technology, en Handbook on Bioethanol: Production and Utilization, Wyman, C. E., ed. , Taylor & Francis, Washington, DC, 179-212). SSCF involucra la co-fermentación de múltiples azúcares (Sheehan, J. , and Himmel, M., 1999, Enzymes, energy and the environment: A strategic perspective on the U.S. Department of Energy's research and development activities for bioethanol, Biotechnol. Prog. 15: 817-827). HHF involucra una etapa de hidrólisis separada, y además una etapa de sacarificación e hidrólisis simultáneas, gue se puede realizar en el mismo reactor. Las etapas en un proceso de HHF se pueden realizar a diferentes temperaturas, es decir, sacarificación enzimática a alta temperatura seguida por SSF a una temperatura menor que la cepa de fermentación puede tolerar. DMC combina todos los tres procesos (producción de enzima, hidrólisis, y fermentación) en una o más (por ejemplo, varias) etapas donde el mismo organismo se usa para producir las enzimas para la conversión del material celulósico a azúcares fermentables y convertir los azúcares fermentables en un producto final (Lynd et al, 2002, Microbial cellulose utilization: Fundamentáis and biotechnology, Microbiol. Mol. Biol. Revie s 66: 506-577). Se entiende en la presente que cualquier método conocido en la técnica que comprende pretratamiento, hidrólisis enzimática (sacarificación), fermentación, o una combinación de. los mismos, se puede usar en la práctica de los procesos de la presente invención.

Un aparato convencional puede incluir un reactor agitado de alimentación por lote, un reactor agitado por lote, un reactor agitado de flujo continuo con ultrafiltración, y/o un reactor de columna de flujo pistón continuo (Corazza et al., 2003, Optimal control in fed-batch reactor for the cellobiose hydrolysis, Acta Scientiarum. Technology 25: 33-38; Gusakov and Sinitsyn, 1985, Kinetics of the enzymatic hydrolysis of cellulose: 1. A mathematical model for a batch reactor process, Enz. Microb. Technol. 7:346-352), un reactor de agotamiento ( yu and Lee, 1983, Bioconversion of waste cellulose by using an attrition bioreactor, Biotechnol. Bioeng. 25: 53-65), o un reactor con agitación intensiva inducida por un campo electromagnético (Gusakov et al., 1996, Enhancement of enzymatic cellulose hydrolysis using a novel type of bioreactor with intensive stirring induced by electromagnetic field, Appl. Biochem. Biotechnol. 56: 141-153). Los tipos de reactores adicionales incluyen, reactores tipo lecho fluidizado, de manto de flujo ascendente, inmovilizados, y extrusor para hidrólisis y/o fermentación .

Pretratamiento . En la práctica de los procesos de la presente invención, cualquier proceso de pretratamiento conocido en la técnica se puede usar para alterar los componentes de la pared celular de planta del material celulósico (Chandra et al., 2007, Substrate pretreatment: The key to effective enzymatic hydrolysis of lignocellulosics?, Adv. Biochem. Engin . /Biotechnol . 108:67-93; Galbe and Zacchi, 2007, Pretreatment of lignocellulosic materials for efficient bioethanol production, Adv. Biochem. Engin . /Biotechnol . 108:41-65; Hendriks and Zeeman, 2009, Pretreatments to enhance the digestibility of lignocellulosic biomass, Bioresource Technol . 100:10-18; osier et al., 2005, Features of promising technologies for pretreatment of lignocellulosic biomass, Bioresource Technol. 96: 673-686; Taherzadeh and Karimi, 2008, Pretreatment of lignocellulosic wastes to improve ethanol and biogas production: A review, Int. J. of Mol. Sci. 9: 1621-1651; Yang and Wyman, 2008, Pretreatment: the key to unlocking low-cost cellulosic ethanol, Biofuels Bioproducts and Biorefining-Biofpr . 2:26-40).

El material celulósico también se puede someter a reducción de tamaño de partícula, tamizado, pre-remojo, humedecimiento, lavado y/o acondicionamiento previo al pretratamiento usando métodos conocidos en la técnica.

Los pretratamientos convencionales incluyen, pero no se limitan a, pretratamiento con vapor (con o sin explosión) , pretratamiento con ácido diluido, pretratamiento con agua caliente, pretratamiento alcalino, pretratamiento con cal, oxidación húmeda, explosión húmeda, explosión con fibra de amoníaco, pretratamiento con organosolv, y pretratamiento biológico. Los pretratamientos adicionales incluyen pretratamientos de precolación con amoníaco, ultrasonido, electroporación, microondas, C02 supercrítico, H2O supercrítica, líquido iónico, e irradiación gamma.

El material celulósico se puede pretratar antes de la hidrólisis y/o fermentación. El pretratamiento preferiblemente se realiza previo a la hidrólisis. Alternativamente, el pretratamiento se puede realizar simultáneamente con hidrólisis de enzima para liberar azúcares fermentables , tales como glucosa, xilosa, y/o celobiosa. En la mayoría de los casos, la etapa de pretratamiento por si sola resulta en alguna conversión de biomasa a azúcares fermentables (aún en la ausencia de enzimas ) .

Pretratamiento con Vapor. En el pretratamiento con vapor, el material celulósico se calienta para alterar los componentes de la pared celular de planta, incluyendo lignina, hemicelulosa, y celulosa para producir la celulosa y otras fracciones, por ejemplo, hemicelulosa, accesible a las enzimas. El material celulósico se pasa a o a través de un recipiente de reacción donde se inyecta vapor para incrementar la temperatura a la temperatura y presión regueridas y se retiene en este por el tiempo de reacción deseado. El pretratamiento con vapor preferiblemente se realiza a 140-250°C, por ejemplo, 160-200°C o 170-190°C, donde el intervalo de temperatura óptimo depende de la adición de un catalizador químico. El tiempo de residencia para el pretratamiento con vapor preferiblemente es 1-60 minutos, por ejemplo, 1-30 minutos, 1-20 minutos, 3-12 minutos, o 4-10 minutos, donde el tiempo de residencia óptimo depende del intervalo de temperatura y adición de un catalizador químico. El pretratamiento con vapor permite cargas de sólidos relativamente altas, de modo que el material celulósico generalmente solo es humedecido durante el pretratamiento. El pretratamiento con vapor frecuentemente se combina con una descarga explosiva del material después del pretratamiento, la cual se conoce como explosión de vapor, es decir, rápido destello a presión atmosférica y flujo turbulento del material para incrementar el área de superficie accesible por fragmentación (Duff and Murray, 1996, Bioresource Technology 855: 1-33; Galbe and Zacchi, 2002, Appl. Microbiol. Biotechnol. 59: 618-628; Solicitud de Patente de Estados Unidos No. 2002/0164730) . Durante el pretratamiento con vapor, los grupos acetilo de hemicelulosa se escinden y el ácido resultante autocataliza la hidrólisis parcial de la hemicelulosa a monosacáridos y oligosacáridos . La lignina se remueve a solo un grado limitado.

Pretratamiento Químico: El término "tratamiento químico" se refiere a cualquier pretratamiento químico' que promueve la separación y/o liberación de celulosa, hemicelulosa, y/o lignina. Tal pretratamiento puede convertir la celulosa cristalina a celulosa amorfa. Los ejemplos de procesos de pretratamiento químico adecuados incluyen, por ejemplo, pretratamiento con ácido diluido, pretratamiento con cal, oxidación húmeda, explosión por fibra de amoniaco/congelación (AFEX, por sus siglas en inglés), percolación por amoníaco (APR, por sus siglas en inglés), líquido iónico, y pretratamientos con organosolv.

Un catalizador tal como H2S04 o S02 (típicamente 0.3 a 5% p/p) frecuentemente se agrega previo al pretratamiento con vapor, el cual disminuye el tiempo y temperatura, incrementa la recuperación, y mejora la hidrólisis enzimática (Ballesteros et al., 2006, Appl . Biochem. Biotechnol. 129-132:496-508; Varga et al., 2004, Appl. Biochem. Biotechnol. 113-116:509-523; Sassner et al., 2006, Enzyme Microb. Technol. 39: 756-762). En el pretratamiento con ácido diluido, el material celulósico se mezcla con ácido diluido, típicamente H2S04, y agua para formar una pasta aguada, se calienta con vapor a la temperatura deseada, y después de un tiempo de residencia se destella a presión atmosférica. El pretratamiento con ácido diluido se puede realizar con un número de diseños de reactores, por ejemplo, reactores de flujo pistón, reactores de contracorriente, o reactores' de lecho de contracción de contracorriente continua (Duff and urray, 1996, supra; Schell et al., 2004, Bioresource Technol. 91:179-188; Lee et al., 1999, Adv. Biochem. Eng. Biotechnol. 65: 93-115).

También se pueden usar diversos métodos de pretratamiento bajo condiciones alcalinas. Estos pretratamientos alcalinos incluyen, pero no se limitan a, hidróxido de sodio, cal, oxidación húmeda, percolación con amoniaco (APR) , y explosión con fibra de amoniaco/congelación (AFEX) .

El pretratamiento con cal se realiza con óxido de calcio o hidróxido de calcio a temperaturas de 85-150°C y tiempos de residencia desde 1 hora a varios días (Wyman et al., 2005, Bioresource Technol. 96:1959-1966; Mosier et al., 2005, Bioresource Technol. 96:673-686). WO 2006/110891, WO 2006/110899, WO 2006/110900, y WO 2006/110901 describen métodos de pretratamiento que usan amoniaco. ' ;;: La oxidación húmeda es un pretratamiento térmico realizado típicamente a 180-200°C por 5-15 minutos con la adición de un agente oxidante tal como peróxido de hidrógeno o sobrepresión de oxígeno (Schmidt and Thomsen, 1998, Bioresource Technol. 64:139-151; Palonen et al., 2004, Appl. Biochem. Biotechnol. 117:1-17; Varga et al., 2004, Biotechnol. Bioeng. 88:567-574; Martin et al., 2006, J. Chem. Technol. Biotechnol. 81:1669-1677). El pretratamiento se realiza preferiblemente a 1-40% de materia seca, por ejemplo, 2-30% de materia seca o 5-20% de materia secar, y con frecuencia el pH inicial se incrementa por la adición de álcalis tal como carbonato de sodio.

Una modificación del método de pretratamiento de oxidación húmeda, conocido como explosión húmeda (combinación de oxidación húmeda y explosión de vapor) puede manejar materia seca hasta 30%. En la explosión húmeda, el agente oxidante se introduce durante el pretratamiento después de un cierto tiempo de residencia. El pretratamiento luego se finaliza por destello a presión atmosférica (WO 2006/032282) .

La explosión por fibra de amoniaco (AFEX) involucra tratar el material celulósico con amoniaco liquido o gaseoso a temperaturas moderadas tal como 90-150°C y alta presión tal como 17-20 bar por 5-10 minutos, donde el contenido de materia seca puede ser tan alto como 60% (Gollapalli et al., 2002, Appl. Biochem. Biotechnol. 98:23-35; Chundawat et al., 2007, Biotechnol. Bioeng. 96:219-231; Alizadeh et al., 2005, Appl. Biochem. Biotechnol. 121:1133-1141; Teymouri et al., 2005, Bioresource Technol . 96:2014-2018). Durante el pretratamiento de AFEX la celulosa y hemicelulosas permanecen intactas. Los complejos de lignina-carbohidrato se escinden.

El pretratamiento con organosolv deslignifica el material celulósico por extracción usando etanol acuoso (40-60% etanol) a 160-200°C por 30-60 minutos (Pan et al., 2005, Biotechnol. Bioeng. 90:473-481; Pan et al., 2006, Biotechnol.

Bioeng. 94:851-861; urabi et al., 2005, Appl. Biochem. Biotechnol. 121:219-230). El ácido sulfúrico usualmente se agrega como un catalizador. En el pretratamiento con organosolv, la mayoría de la hemicelulosa y lignina se remueve .

Otros ejemplos de métodos de pretratamiento adecuados se describen por Schell et al., 2003, Appl. Biochem. and Biotechnol. 105-108:69-85, and Mosier et al., 2005, Bioresource Technology 96:673-686, y Solicitud Publicada de Estados Unidos No. 2002/0164730.

En un aspecto, el pretratamiento químico preferiblemente se realiza como un tratamiento con ácido diluido, y más preferiblemente como un tratamiento con ácido diluido continuo. El ácido típicamente es ácido sulfúrico, pero también se pueden usar otros ácidos, tales como ácido acético, ácido cítrico, ácido nítrico, ácido fosfórico, ácido tartárico, ácido succínico, cloruro ácido, o mezclas de los mismos. El tratamiento con ácido débil se conduce en el intervalo de pH de preferiblemente 1-5, por ejemplo, 1-4 o 1-2.5. En un aspecto, la concentración del ácido está en el intervalo desde preferiblemente 0.01 a 10% en peso de ácido, por ejemplo, 0.05 a 5% en peso de ácido o 0.1 a 2% en peso de ácido. El ácido se pone en contacto con el material celulósico y se mantiene a una temperatura en el intervalo de preferiblemente 140-200°C, por ejemplo, 165-190°C, por períodos que varían desde 1 a 60 minutos.

En otro aspecto, el pretratamiento toma lugar en una pasta aguada acuosa. En aspectos preferidos, el material celulósico está presente durante el pretratamiento en cantidades preferiblemente entre 10-80% en peso, por ejemplo, 20-70% en peso o 30-60% en peso, tal como alrededor de 40% en peso. El material celulósico pretratado se puede no lavar o lavar usando cualquier método conocido en la técnica, por ejemplo, se lava con agua.

Pretratamiento Mecánico o Pretratamiento Físico: El término "pretratamiento mecánico" o "pretratamiento físico" se refiere a cualquier pretratamienot que promueve la reducción de tamaño de partículas. Por ejemplo, tal pretratamiento puede involucrar varios tipos de trituración o molienda (por ejemplo, molienda seca, molienda húmeda, o molienda con bolas vibratorias).

El material celulósico se puede pretratar tanto físicamente (mecánicamente) como químicamente. El pretratamiento mecánico o físico se puede acoplar con vaporización/explosión de vapor, hidrotermólisis , tratamiento con ácido diluido o débil, alta temperatura, tratamiento con alta presión, irradiación (por ejemplo, irradiación de microondas) , o combinaciones de los mismos. En un aspecto, alta presión significa presión en el intervalo ..,„...de preferiblemente aproximadamente 100 a aproximadamente 400 psi, por ejemplo, aproximadamente 150 a aproximadamente 250 psi. En otro aspecto, alta temperatura significa temperaturas en el intervalo de aproximadamente 100 a aproximadamente 300°C, por ejemplo, aproximadamente 140 a aproximadamente 200°C. En un aspecto preferido, el pretratamiento mecánico o físico se realiza en un proceso en lotes usando un sistema hidrolizador de pistola de vapor que usa alta presión y alta temperatura como se definió anteriormente, por ejemplo, un Hidrolizador Sunds disponible de Sunds Defibrator AB, Suecia. Los pretratamientos físicos y químicos se pueden realizar consecutivamente o simultáneamente, como se desee.

Por consiguiente, en un aspecto preferido, el material celulósico se somete a pretratamiento físico (mecánico) o químico, o cualquier combinación de los mismos, para promover la separación y/o liberación de celulosa, hemicelulosa , y/o lignina.

Pretratamiento Biológico: El término "pretratamiento biológico" se refiere a cualquier pretratamiento biológico que promueve la separación y/o liberación de celulosa, hemicelulosa, y/o lignina del material celulósico. Las técnicas de pretratamiento biológico pueden involucrar la aplicación de enzimas y/o microorganismos solubilizantes de lignina (ver, por ejemplo, Hsu, T.-A., 1996, Pretreatment of biomass, in Handbook on Bioethanol: Production and Utilization, Wyman, C. E., ed., Taylor & Francis, Washington, DC, 179-212; Ghosh and Singh, 1993, Physicochemical and biological treatments for enzymatic/microbial conversión of cellulosic biomass, Adv. Appl. Microbiol. 39:295-333; Mc illan, J. D . , 1994, Pretreating lignocellulosic biomass: a review, in Enzymatic Conversión of Biomass for Fuels Production, Himmel, M. E., Baker, J. O., and Overend, R. P., eds . , ACS Symposium Series 566, American Chemical Society, Washington, DC, chapter 15; Gong, C. S., Cao, N. J. , Du, J. , and Tsao, G. T., 1999, Ethanol production from renewable resources, in Advances in Biochemical Engineering/Biotechnology, Scheper, . , ed. , Springer-Verlag Berlín Heidelberg, Germany, 65:207-241; Olsson and Hahn-Hagerdal, 1996, Fermentation of lignocellulosic hydrolysates for ethanol production, Enz. Microb. Tech. 18:312-331; and Vallander and Eriksson, 1990, Production of ethanol from lignocellulosic materials: State of the art, Adv. Biochem. Eng . /Biotechnol . 42: 63-95).

Sacarificación . En la etapa de hidrólisis, también conocida como sacarificación, el material celulósico, por ejemplo, pretratado, se hidroliza para descomponer la celulosa y/o hemicelulosa a azúcares fermentables , tales como glucosa, celobiosa, xilosa, xilulosa, arabinosa, mañosa, galactosa, y/u oligosacáridos solubles. La hidrólisis se realiza enzimáticamente por una composición de enzima en la presencia de un polipéptido que tiene actividad celobiohidrolasa de la presente invención. Las enzimas de las composiciones se pueden agregar simultáneamente o consecutivamente .

La hidrólisis enzimática preferiblemente se realiza en un ambiente acuoso adecuado bajo condiciones que se pueden determinar fácilmente por un experto en la técnica. En un aspecto, la hidrólisis se realiza bajo condiciones adecuadas para la actividad de las enzimas, es decir, óptimas para las enzimas .

La hidrólisis se puede realizar como un proceso continuo o de alimentación por lote donde el material celulósico se alimenta gradualmente, por ejemplo, a una solución de hidrólisis que contiene enzima.

La sacarificación generalmente se realiza en reactores de tanque agitado o termentadores bajo condiciones controladas de pH, temperatura, y mezclado. Las condiciones adecuadas de tiempo de proceso, temperatura y pH fácilmente se pueden determinar por un experto en la técnica. Por ejemplo, la sacarificación puede durar hasta 200 horas, pero típicamente se realiza por preferiblemente aproximadamente 12 a aproximadamente 120 horas, por ejemplo, aproximadamente 16 a aproximadamente 72 horas o aproximadamente 24' a aproximadamente 48 horas. La temperatura está en el intervalo de preferiblemente aproximadamente 25 °C a aproximadamente 70°C, por ejemplo, aproximadamente 30°C a aproximadamente 65°C, aproximadamente 40°C a aproximadamente 60°C, o aproximadamente 50°C a aproximadamente 55°C. El pH está en el intervalo de preferiblemente aproximadamente 3 a aproximadamente 8, por ejemplo, aproximadamente 3.5 a aproximadamente 7, aproximadamente 4 a aproximadamente 6, o aproximadamente 5.0 a aproximadamente 5.5. El contenido de sólidos secos está en el intervalo de preferiblemente aproximadamente 5 a aproximadamente 50% en peso, por ejemplo, aproximadamente 10 a aproximadamente 40% en peso o aproximadamente 20 a aproximadamente 30% en peso.

La presente invención también se refiere a composiciones que comprenden un polipéptido de la presente invención. Preferiblemente, las composiciones se enriquecen en tal polipéptido. El término "enriquecido" indica que la actividad celobiohidrolasa de la composición se ha incrementado, por ejemplo, con un factor de enriquecimiento de al menos 1.1.

La composición puede comprender un polipéptido de la presente invención como el componente enzimático principal, por ejemplo, una composición de mono-componente . Alternativamente, la composición puede comprender múltiples actividades enzimáticas, tal como una o más (por ejemplo, varias) enzimas seleccionadas del grupo que consiste de una células, una hemicelulasa, un polipéptido GH61, ¦ una expansina, una esterasa, una lacasa, una enzima ligninolitica, una pectinasa, una peroxidasa, una proteasa, y una swolenina.

En una modalidad preferida, la composición de enzima comprende al menos la celobiohidrolasa de la invención, al menos una endoglucanasa, al menos una beta-glucosidasa y al menos un polipéptido GH61 que tiene actividad mejoradora celulolítica .

Las composiciones de polipéptido se pueden preparar de conformidad con los métodos conocidos en la técnica y pueden estar en la forma de un liquido o una composición seca. Por ejemplo, la composición de polipéptido puede estar en la forma de un granulado o un microgranulado . El polipéptido que se incluye en la composición se puede estabilizar de conformidad con los métodos conocidos en la técnica.

Las composiciones de enzima pueden comprender cualquier proteina útil en la degradación del material celulósico .

En un aspecto, la composición de enzima comprende o adicionalmente comprende una o más (por ejemplo, varias) proteínas seleccionadas del grupo que consiste de una celulasa, un polipéptido GH61 que tiene actividad mejoradora celulolítica, una hemicelulasa, una esterasa, una expansina, una lacasa, una enzima ligninolitica, una pectinasa, una peroxidasa, una proteasa, y una swolenina. En otro aspecto, la celulasa preferiblemente es una o más (por ejemplo, varias) enzimas seleccionadas del grupo que consiste de una endoglucanasa, una celobiohidrolasa adicional, y una beta-glucosidasa. En otro aspecto, la hemicelulasa preferiblemente es una o más (por ejemplo, varias) enzimas seleccionadas del grupo que consiste de una acetilmanano esterasa, una acetilxilano esterasa, una arabinanasa, una arabinofuranosidasa, un ácido cumárico esterasa, una feruloil esterasa, una galactosidasa, una glucuronidasa, una glucuronoilo esterasa, una mananasa, una manosidasa, una xilanasa, y una xilosidasa.

En otro aspecto, la composición de enzima comprende una o más (por ejemplo, varias) enzimas celuloliticas . En otro aspecto, la composición de enzima comprende o adicionalmente comprende una o más (por ejemplo, varias) enzimas hemiceluloliticas . En otro aspecto, la composición de enzima comprende una o más (por ejemplo, varias) enzimas celuloliticas y una o más (por ejemplo, varias) enzimas hemiceluloliticas. En otro aspecto, la composición de enzima comprende una o más (por ejemplo, varias) enzimas seleccionadas del grupo de enzimas celuloliticas y enzimas hemiceluloliticas. En otro aspecto, la composición de enzima comprende una endoglucanasa. En otro aspecto, la composición de enzima comprende una celobiohidrolasa. En otro aspecto, la composición de enzima comprende una beta-glucosidasa . En otro aspecto, la composición de enzima comprende un polipéptido que tiene actividad mejoradora celulolítica. En otro aspecto, la composición de enzima comprende una endoglucanasa y un polipéptido que tiene actividad mejoradora celulolítica. En otro aspecto, la composición de enzima comprende una celobiohidrolase y un polipéptido que tiene actividad mejoradora celulolítica. En otro aspecto, la composición de enzima comprende una beta-glucosidasa y un polipéptido que tiene actividad mejoradora celulolítica. En otro aspecto, la composición de enzima comprende una endoglucanasa y una celobiohidrolasa . En otro aspecto, la composición de enzima comprende una endoglucanasa y una beta-glucosidasa. En otro aspecto, la composición de enzima comprende uña celobiohidrolasa y una beta-glucosidasa. En otro aspecto, la composición de enzima comprende una endoglucanasa, una celobiohidrolasa, y un polipéptido que tiene actividad mejoradora celulolítica. En otro aspecto, la composición de enzima comprende una endoglucanasa, una beta-glucosidasa, y un polipéptido que tiene actividad mejoradora celulolítica. En otro aspecto, la composición de enzima comprende una celobiohidrolasa, una beta-glucosidasa, y un polipéptido que tiene actividad mejoradora celulolítica. En otro aspecto, la composición de enzima comprende una endoglucanasa, una celobiohidrolasa, y una beta-glucosidasa. En otro aspecto, la composición de enzima comprende una endoglucanasa, una celobiohidrolasa, una beta-glucosidasa , y un polipéptido que tiene actividad mejoradora celulolitica .

En otro aspecto, la composición de enzima comprende una acetilmanano esterasa. En otro aspecto, la composición de enzima comprende una acetilxilano esterase. En otro aspecto, la composición de enzima comprende una arabinanasa (por ejemplo, alfa-L-arabinanasa ) . En otro aspecto, la composición de enzima comprende una arabinofuranosidasa (por ejemplo, alfa-L-arabinofuranosidasa ) . En otro aspecto, la composición de enzima comprende una ácido cumárico esterasa. En otro aspecto, la composición de enzima comprende una feruloilo esterasa. En otro aspecto, la composición de enzima comprende una galactosidasa (por ejemplo, alfa-galactosidasa y/o beta-galactosidasa ) . En otro aspecto, la composición de enzima comprende una glucuronidasa (por ejemplo, alfa-D-glucuronidasa) . En otro aspecto, la composición de enzima comprende una glucuronoilo esterasa. En otro aspecto, la composición de enzima comprende una mananasa. En otro aspecto, la composición de enzima comprende una manosidasa (por ejemplo, beta-manosidasa) . En otro aspecto, la composición de enzima comprende una xilanasa. En un aspecto preferido, la xilanasa es una xilanasa de la Familia 10. En otro aspecto, la composición de enzima comprende una xilosidasa (por ejemplo, beta-xilosidasa) .

En otro aspecto, la composición de enzima comprende una esterasa. En otro aspecto, la composición de enzima comprende una expansina. En otro aspecto, la composición de enzima comprende una lacasa. En otro aspecto, la composición de enzima comprende una enzima ligninolitica . En un aspecto preferido, la enzima ligninolitica es una manganeso peroxidasa. En otro aspecto preferido, la enzima ligninolitica es una lignina peroxidasa. En otro aspecto preferido, la enzima ligninolitica es una enzima que produce H2O2. En otro aspecto, la composición de enzima comprende una pectinasa. En otro aspecto, la composición de enzima comprende una peroxidasa. En otro aspecto, la composición de enzima comprende una proteasa. En otro aspecto, la composición de enzima comprende una swolenina.

En los procesos de la presente invención, las enzimas se pueden agregar previo a o durante la fermentación, por ejemplo, durante la sacarificación o durante o después de la propagación de los microorganismos fermentadores .

Uno o más (por ejemplo, varios) componentes de la composición de enzima pueden ser proteínas tipo silvestre, proteínas recombinantes, o una combinación de proteínas tipo silvestre y proteínas recombinantes. Por ejemplo, uno o más (por ejemplo, varios) componentes pueden ser proteínas nativas de una célula, la cual se usa como una célula huésped para expresar recombinantemente uno o más (por ejemplo, varios) otros componentes de la composición de enzima. Uno o más (por ejemplo, varios) componentes de la composición de enzima se pueden producir como monocomponentes , los cuales luego se combinan para formar la composición de enzima. La composición de enzima puede ser una combinación de preparaciones de proteína de multicomponentes y monocomponente .

Las enzimas usadas en los procesos de la presente invención pueden estar en cualquier forma adecuada para el uso, tal como, por ejemplo, un caldo de fermentación crudo con o sin células removidas, un lisado de célula con o sin residuos celulares, una preparación de enzima semi-purificada o purificada, o una célula huésped como una fuente de las enzimas. La composición de enzima puede ser un granulado o polvo seco, un granulado no polvoriento, un líquido, un líquido estabilizado, o una enzima protegida estabilizada. Las preparaciones de enzima líquidas, por ejemplo, se pueden estabilizar agregando estabilizadores tales como un azúcar, un alcohol de azúcar u otro poliol, y/o ácido láctico u. otro ácido orgánico de acuerdo con los procesos establecidos.

Las cantidades óptimas de las enzimas y polipéptidos que tienen actividad celobiohidrolasa dependen de varios factores incluyendo, pero no limitado a, la mezcla de enzima celulolíticas componentes, el material celulósico, la concentración de material celulósico, los pretratamientos del material celulósico, temperatura, tiempo, pH, e inclusión del organismo fermentador (por ejemplo, levadura para Sacarificación y Fermentación Simultáneas) .

En un aspecto, una cantidad efectiva de enzima celulolitica o hemicelulolitica para el material celulósico es aproximadamente 0.5 a aproximadamente 50 mg, por ejemplo, aproximadamente 0.5 a aproximadamente 40 mg, aproximadamente 0.5 a aproximadamente 25 mg, aproximadamente 0.75 a aproximadamente 20 mg, aproximadamente 0.75 a aproximadamente 15 mg, aproximadamente 0.5 a aproximadamente 10 mg, o aproximadamente 2.5 a aproximadamente 10 mg per g del material celulósico.

En otro aspecto, una cantidad efectiva de un polipéptido que tiene actividad celobiohidrolasa para el material celulósico es aproximadamente 0.01 a aproximadamente 50.0 mg, por ejemplo, aproximadamente 0.01 a aproximadamente 40 mg, aproximadamente 0.01 a aproximadamente 30. mg, aproximadamente 0.01 a aproximadamente 20 mg, aproximadamente 0.01 a aproximadamente 10 mg, aproximadamente 0.01 a aproximadamente 5 mg, aproximadamente 0.025 a aproximadamente 1.5 mg, aproximadamente 0.05 a aproximadamente 1.25 mg, aproximadamente 0.075 a aproximadamente 1.25 mg, aproximadamente 0.1 a aproximadamente 1.25 mg, aproximadamente 0.15 a aproximadamente 1.25 mg, o aproximadamente 0.25 a aproximadamente 1.0 mg per g ..del material celulósico.

En otro aspecto, una cantidad efectiva de un polipéptido que tiene actividad celobiohidrolasa para enzima celulolitica o hemicelulolitica es aproximadamente 0.005 a aproximadamente 1.0 g, por ejemplo, aproximadamente 0.01 a aproximadamente 1.0 g, aproximadamente 0.15 a aproximadamente 0.75 g, aproximadamente 0.15 a aproximadamente 0.5 g, aproximadamente 0.1 a aproximadamente 0.5 g, aproximadamente 0.1 a aproximadamente 0.25 g, o aproximadamente 0.05 a aproximadamente 0.2 g per g de enzima celulolitica o hemicelulolitica.

Los polipéptidos que tienen actividad de enzima celulolitica o actividad de enzima hemicelulolitica asi como también otras proteinas/polipéptidos útiles en la degradación del material celulósico, por ejemplo, polipéptidos GH61 que tienen actividad mejoradora celulolitica (colectivamente después "polipéptidos que tienen actividad de enzima") se pueden derivar u obtener de cualquier origen adecuado, incluyendo, origen bacteriano, fúngico, de levadura, de planta, o mamífero. El término "obtenido" también significa aquí que la enzima se puede producir recombinantemente en un organismo huésped que emplea los métodos descritos en la presente, en donde la enzima recombinantemente producida ya sea es nativa o extraña al organismo huésped o tiene una secuencia de aminoácidos modificada, por ejemplo, tiene uno o más (por ejemplo, varios) aminoácidos que se suprimen, insertan y/o sustituyen, es decir, una enzima recombinantemente producida que es mutante y/o un fragmento de una secuencia de aminoácidos nativa o una enzima producida por procesos de transposición de ácido nucleico conocidos en la técnica. Dentro del significado de una enzima nativa se abarcan las variantes naturales y dentro del significado de una enzima extraña están las variantes obtenidas recombinantemente, tal como por transposición o mutagénesis dirigida al sitio.

Los mutantes diseñados por ingeniería de la proteína o químicamente modificados de polipéptidos que tienen actividad enzimática también pueden ser usados.

Uno o más (por ejemplo, varios) componentes de la composición enzimática pueden ser un componente recombinante, es decir, producido por clonación de una secuencia de ADN que codifica el componente único y célula subsecuente transformada con la secuencia de ADN y expresada en un hospedero (véase, por ejemplo, documento WO 91/17243 y WO 91/17244). El hospedero es preferiblemente un hospedero heterólogo (la enzima es extraña al hospedero) , pero el hospedero puede bajo ciertas condiciones también ser un hospedero homólogo (la enzima es nativa al hospedero) . Las proteínas celulolíticas monocomponentes también pueden ser preparadas purificando tal proteína a partir de un caldo de fermentación.

En un aspecto, una o más (por ejemplo, varias) enzimas celuloliticas comprenden una preparación de enzima celulolitica comercial. Ejemplos de preparaciones de enzimas celuloliticas comerciales adecuadas para uso en para uso en la presente invención incluyen, por ejemplo, CELLIC™ CTec (Novozymes A/S) , CELLIC™ CTec2 (Novozymes A/S), CELLUCLAST™ (Novozymes A/S) , NOVOZYM™ 188 (Novozymes A/S) , CELLÜZYME™ (Novozymes A/S), CEREFLO™ (Novozymes A/S), y ULTRAFLO™ (Novozymes A/S), ACCELERASE™ (Genencor Int.), LAMINEX™ (Genencor Int.), SPEZYME™ CP (Genencor Int.), FILTRASE® NL (DSM); METHAPLUS® S/L 100 (DSM). ROHAMENT™ 7069 W (Rohm GmbH), FIBREZYME® LDI (Dyadic International, Inc.), FIBREZY E® LBR (Dyadic International, Inc.), o VISCOSTAR® 150L (Dyadic International, Inc.). Las enzimas de celulasa son agregadas en cantidades efectivas desde aproximadamente 0.001 hasta aproximadamente 5.0% en peso de sólidos, por ejemplo, aproximadamente 0.025 hasta aproximadamente 4.0% en peso de sólidos o aproximadamente 0.005 hasta aproximadamente 2.0% en peso de sólidos.

Ejemplos de endoglucanasas bacterianas que pueden ser usadas en los procesos de la presente invención, incluyen, pero no se limitan a, una endoglucanasa de Acidothermus cellulolyticus (documentos WO 91/05039; WO 93/15186; Patente Estadounidense No. 5,275,944; WO 96/02551; Patente Estadounidense No. 5,536,655, WO 00/70031, WO 05/093050); Endoglucanasa III de Thermobifida fusca (documento WO 05/093050) ; y endoglucanasa V de Thermobifida fusca (documento WO 05/093050) .

Ejemplos de endoglucanasas fúngicas que pueden ser usadas in la presente invención, incluyen, pero no se limitan a, una endoglucanasa I de Trichoderma reesei (Penttila et al., 1986, Gene 45: 253-263, endoglucanasa I de Trichoderma reesei Cel7B (GENBANK™ no. de acceso M15665) , endoglucanasa II de Trichoderma reesei (Saloheimo, et al., 1988, Gene 63:1 1-22), endoglucanasa II de Trichoderma reesei Cel5A (GENBANK™ no. de acceso M19373) , endoglucanasa III de Trichoderma reesei (Okada et al., 1988, Appl. Environ. Microbiol. 64: 555-563, GENBANK™ no. de acceso AB003694), endoglucanasa V de Trichoderma reesei (Saloheimo et al., 1994, Molecular Microbiology 13: 219-228, GENBANK™ no. de acceso Z33381), endoglucanasa de Aspergillus aculeatus (Ooi et al., 1990, Nucleíc Acids Research 18: 5884), endoglucanasa de Aspergillus awachii (Sakamoto et al., 1995, Current Genetics 27: 435-439), endoglucanasa de Erwinia carotovara (Saarilahti et al., 1990, Gene 90: 9-14), endoglucanasa de Fusarium oxysporum (GENBANK™ no. de acceso L29381 ) , endoglucanasa de Humicola grísea var. thermoidea (GENBANK™ no. de acceso AB003107), endoglucanasa de Melanocarpus albomyces (GENBANK™ no. de acceso MAL515703) , endoglucanasa de Neurospora crassa ( GENBANK™ no. de acceso XM_324477 ) , endoglucanasa V de Humicola insolens, endoglucanasa de Myceliophthora thermophila CBS 117.65, endoglucanasa de basidiomiceto CBS 495.95, endoglucanasa de basidiomiceto CBS 494.95, endoglucanasa de Thielavia terrestris NRRL 8126 CEL6B, endoglucanasa de Thielavia terrestris NRRL 8126 CEL6C, endoglucanasa de Thielavia terrestris NRRL 8126 CEL7C, endoglucanasa de Thielavia terrestris NRRL 8126 CEL7E, endoglucanasa de Thielavia terrestris NRRL 8126 CEL7F, endoglucanasa de Cladorrhinum foecundissimum ATCC 62373 CEL7A, y endoglucanasa de Trichoderma reesei cepa No. VTT-D-80133 (GENBANK™ no. de acceso M15665) .

Ejemplos de celobiohidrolasas útiles en la presente invención incluyen, pero no se limitan a, celobiohidrolasa II de Aspergillus aculeatus (documento WO 2011/059740), celobiohidrolasa I de Chaetomium ther ophilum, : ' -¦ -.'?<· celobiohidrolasa II de Chaetomium thermophilum, celobiohidrolasa I de Humicola insolens, celobiohidrolasa II de Myceliophthora thermophila (documento WO 2009/042871), celobiohidrolasa II de Thielavia hyrcanie (documento WO 2010/141325), celobiohidrolasa II de Thielavia terrestris (CEL6A, documento WO 2006/074435), celobiohidrolasa I de Trichoderma reesei, celobiohidrolasa II de Trichoderma reesei, y celobiohidrolasa II de Trichophaea saccata (documento WO 2010/057086) .

Ejemplos de beta-glucosidasas útiles en la presente invención incluyen, pero no se limitan a, beta-glucosidasas de Aspergillus aculeatus (Kawaguchi et al., 1996, Gene 173: 287-288), Aspergillus fumigatus (documento WO 2005/047499), Aspergillus niger (Dan et al., 2000, J. Biol . Chem. 275: 4973-4980), Aspergillus oryzae (documento WO 2002/095014), Penicillium brasilianum IBT 20888 (documentos WO 2007/019442 y WO 2010/088387), Thielavia terrestris (documento WO 2011/035029), y Trichophaea saccata (documento WO 2007/019442) .

Las beta-glucosidasas pueden ser una proteina de fusión. En un aspecto, la beta-glucosidasa es una proteina de fusión BG variante de beta-glucosidasa de Aspergillus oryzae (documento WO 2008/057637) o una proteina de fusión de beta-glucosidasa de Aspergillus oryzae (documento WO 2008/057637).

Otras endoglucanasa útiles, celobiohidrolasas , y beta-glucosidasas son descritas en numerosas familias de Glicosil Hidrolasas usando la clasificación de conformidad con Henrissat, 1991, A classification of glycosyl hydrolases based on amino-acid sequence similarities , Biochem. J. 280: 309-316, y Henrissat y Bairoch, 1996, Updating the sequence-based classification of glycosyl hydrolases, Biochem. J. 316: 695-696.

Otras enzimas celuloliticas que pueden ser usadas en la presente invención se describen en los documentos WO 98/13465, WO 98/015619, WO 98/015633, WO 99/06574,'' WO 99/10481, WO 99/025847, WO 99/031255, WO 2002/101078, WO 2003/027306, WO 2003/052054, WO 2003/052055, WO 2003/052056, WO 2003/052057, WO 2003/052118, WO 2004/016760, WO 2004/043980, WO 2004/048592, WO 2005/001065, WO 2005/028636, WO 2005/093050, WO 2005/093073, WO 2006/074005, WO 2006/117432, WO 2007/071818, WO 2007/071820, WO 2008/008070, WO 2008/008793, Patente Estadounidense No. 5,457,046, Patente Estadounidense No. 5,648,263, y Patente Estadounidense No. 5, 686, 593.

En los procesos de la presente invención, cualquier polipéptido GH61 que tiene actividad potenciadora celulolitica puede ser usado.

Ejemplos de polipéptidos GH61 que tienen actividad potenciadora celulolitica útiles en los procesos de la presente invención incluyen, pero no se limitan a, polipéptidos GH61 de Thielavia terrestris (documento WO 2005/074647, WO 2008/148131, y WO 2011/035027), Thermoascus aurantiacus (documentos WO 2005/074656 y WO 2010/065830), Trichoder a reesei (documento WO 2007/089290), Myceliophthora thermophila (documentos WO 2009/085935, WO 2009/085859, WO 2009/085864, WO 2009/085868), Aspergillus fumigatus (documento WO 2010/138754), polipéptidos GH61 de Penicillium pinophilum (documento WO 2011/005867), Thermoascus sp. (documento WO 2011/039319), Penicillium sp. (documento WO 2011/0 1397), y Thermoascus crustaceous (documento WO 2011/041504) .

En un aspecto, el polipéptido GH61 que tiene actividad potenciadora celulolitica es usado en la presencia de un catión de metal divalente de activación soluble de conformidad con el documento WO 2008/151043, por ejemplo, sulfato de manganeso.

En un aspecto, el polipéptido GH61 que tiene actividad potenciadora celulolitica es usado en la presencia de un compuesto dioxi, un compuesto biciclico, un compuesto heterociclico, un compuesto que contiene nitrógeno, un compuesto de quinona, un compuesto que contiene azufre, o un licor obtenido de un material celulósico pretratado tal como rastrojo de maíz pretratado (PCS, por sus siglas en inglés).

El compuesto dioxi puede incluir cualquier compuesto adecuado que contiene dos o más átomos de oxigeno. En algunos aspectos, los compuestos dioxi contienen una porción arilo sustituida como se describe en la presente.. Los compuestos dioxi pueden comprender uno o más (por ejemplo, varios) hidroxilo y/o derivados de hidroxilo, pero también incluyen porciones sustituidas que carecen de hidroxilo y derivados de hidroxilo. Ejemplos no limitantes de los compuestos dioxi incluyen pirocatecol o catecol; ácido cafeico; ácido 3 , 4-dihidroxibenzoico; 4-terc-butil-5-metoxi-1 , 2-bencenodiol ; pirogalol; ácido gálico; metil-3,4,5-trihidroxibenzoato; 2, 3, -trihidroxibenzofenona; 2,6- dimetoxifenol ; ácido sinapínico; ácido 3, 5-dihidroxibenzoico; 4-cloro-l, 2-bencenodiol; 4-nitro-l , 2-bencenodiol ; ácido tánico; galato de etilo; glicolato de metilo; ácido dihidroxifumárico; 2-butin-l , 4-diol ; (ácido crocónico; 1,3-propandiol; ácido tartárico; 2 , -pentanodiol ; 3-etoxi-l,2-propandiol; 2 , 4 , ' -trihidroxibenzofenona ; cis-2-buten-l , 4-diol; 3, -dihidroxi-3-ciclobuten-l , 2-diona; dihidroxiacetona ; acrolein acetal; metil-4-hidroxibenzoato; ácido 4-hidroxibenzoico; y metil-3, 5-dimetoxi-4-hidroxibenzoato; o una sal o solvato de los mismos.

El compuesto biciclico puede incluir cualquier sistema de anillo fusionado sustituido adecuado como se describe en la presente. Los compuestos pueden comprender uno o más (por ejemplo, varios) anillos adicionales, y no están limitados a un número especifico de anillos a menos que se declare de otro modo. En un aspecto, el compuesto biciclico es un flavonoide. En otro aspecto, el compuesto biciclico es un isoflavonoide opcionalmente sustituido. En otro aspecto, el compuesto biciclico es un ión de flavilio opcionalmente sustituido, tal como una antocianidina opcionalmente sustituida o antocianina opcionalmente sustituida, o derivado de las mismas. Ejemplos no limitantes de compuestos tebiciclicos incluyen epicatequina; quercetina; miricetina; taxifolina; canferol; morina; acacetina; naringenina; isoramnetina ; apigenina; cianidina; cianina; curomanina; ceracianina; o una sal o solvato de los mismos.

El compuesto heterociclico puede ser cualquier compuesto adecuado, tal como un anillo aromático o no aromático opcionalmente sustituido que comprende un heteroátomo, como se describe en la presente. En un aspecto, el heterociclico es un compuesto que comprende una porción heterocicloalquilo opcionalmente sustituido o una porción heteroarilo opcionalmente sustituido. En otro aspecto, la porción heterocicloalquilo opcionalmente sustituido o porción heteroarilo opcionalmente sustituido es un heterocicloalquilo de 5 elementos opcionalmente sustituido o una porción heteroarilo de 5 elementos opcionalmente sustituido. En otro aspecto, la porción heteroarilo opcionalmente sustituido o heterocicloalquilo opcionalmente sustituido es una porción opcionalmente sustituida seleccionada de pirazolilo, furanilo, imidazolilo, isoxazolilo, oxadiazolilo, oxazólilo, pirrolilo, piridilo, pirimidilo, piridazinilo, tiazolilo, triazolilo, tienilo, dihidrotieno-pirazolilo, tianaftenilo, carbazolilo, bencimidazolilo, benzotienilo, benzofuranilo, indolilo, quinolinilo, benzotriazolilo, benzotiazolilo, benzooxazolilo, bencimidazolilo, isoquinolinilo, isoindolilo, acridinilo, benzoisazolilo, dimetilhidantoina, pirazinilo, tetrahidrofuranilo, pirrolinilo, pirrolidinilo, morfolinilo, indolilo, diazepinilo, azepinilo, tiepinilo, piperidinilo, y oxepinilo. En otro aspecto, la porción heterocicloalquilo opcionalmente sustituido o porción heteroarilo opcionalmente sustituido es un furanilo opcionalmente sustituido. Ejemplos no limitantes de los compuestos heterociclicos incluyen (1,2-dihidroxietil ) -3, -dihidroxifuran-2 (5H) -ona; 4-hidroxi-5-metil-3-furanona; 5-hidroxi-2 (5H) -furanona; [1,2-dihidroxietil ] furan-2, 3, 4 (5H) -triona; a-hidroxi-?-butirolactona; ?-lactona ribónica; ?-lactona de ácido aldohexuronicaldohexurónico ; d-lactona de ácido glucónico 4-hidroxicumarina; dihidrobenzofurano ; 5- (hidroximetil) furfural; furoina 2 (5H) -furanona; 5,6-dihidro-2H-piran-2-ona ; y 5 , 6-dihidro-4 -hidroxi- 6-me il-2H-piran-2-ona; o una sal o solvato de los mismos.

El compuesto que contiene nitrógeno puede ser cualquier compuesto adecuado con uno o más átomos de nitrógeno. En un aspecto, el compuesto que contiene nitrógeno comprende una porción amina, imina, hidroxilaminá, o nitróxido. Ejemplos no limitantes de compuestos que tienen nitrógeno incluyen oxima de acetona; ácido violúrico; piridin-2-aldoxima; 2-aminofenol ; 1 , 2-bencenodiamina; 2 , 2 , 6, 6-tetrametil-l-piperidiniloxi ; 5,6,7,8-tetrahidrobiopterina; 6, 7-dimetil-5, 6, 7, 8-tetrahidropterina; y ácido malámico; o una sal o solvato de los mismos.

El compuesto de quinona puede ser cualquier compuesto adecuado que comprende una porción de quinona como se describe en la presente. Ejemplos no limitantes de los compuestos de quinona incluyen 1 , 4-benzoquinona; 1,4-naftoquinona; 2-hidroxi-l, 4-naftoquinona; 2 , 3-dimetoxi-5-metil-1, -benzoquinona o coenzima Qo; 2, 3, 5, 6-tetrametil-l, -benzoquinona o duroquinona; 1, 4-dihidroxiantraquinona; 3-hidroxi-l-metil-5, 6-indolindiona o adrenocromo; 4-terc-butil-5-metoxi-l, 2-benzoquinona; pirroloquinolin quinona; o una sal o solvato de los mismos.

El compuesto que contiene azufre puede ser cualquier compuesto adecuado que comprende uno o más átomos de azufre. En un aspecto, el compuesto que contiene azufre comprende una porción seleccionada de tionilo, tioéter, sulfinilo, sulfonilo, sulfamida, sulfonamida, ácido sulfónico, y éster sulfónico. Ejemplos no limitantes de los compuestos que contienen azufre incluyen etantiol; 2-propantiol; 2-propen-l-tiol ; ácido 2-mercaptoetansu.lfónico; bencenotiol; benceno-1 , 2-ditiol ; cisterna; metionina; glutationa; cisterna; o una sal o solvato de los mismos.

En un aspecto, una cantidad efectiva de tal compuesto descrito anteriormente a material celulósico como una relación molar a unidades glicosilo de celulosa es aproximadamente 10~6 hasta aproximadamente 10, por ejemplo, aproximadamente 10"5 hasta aproximadamente 7.5, aproximadamente 10~6 hasta aproximadamente 5, aproximadamente 10"6 hasta aproximadamente 2.5, aproximadamente 10~6 hasta aproximadamente 1, aproximadamente 10~5 hasta aproximadamente 1, aproximadamente 10~5 hasta aproximadamente 10"1, aproximadamente 10"4 hasta aproximadamente 10_1, aproximadamente 10"3 hasta aproximadamente 10" \ o aproximadamente 10 3 hasta aproximadamente io-2. En otro aspecto, una cantidad efectiva de tal compuesto descrito anteriormente es aproximadamente 0.1 µ? hasta aproximadamente 1 M, por ejemplo, aproximadamente 0.5 µ? hasta aproximadamente 0.75 M, aproximadamente 0.75 µ? hasta aproximadamente 0.5 M, aproximadamente 1 µ? hasta aproximadamente 0.25 M, aproximadamente 1 µ? hasta aproximadamente 0.1 M, aproximadamente 5 µ? hasta aproximadamente 50 mM, aproximadamente 10 µ? hasta aproximadamente 25 mM, aproximadamente 50 µ? hasta aproximadamente 25 mM, aproximadamente 10 µ? hasta aproximadamente 10 mM, aproximadamente 5 µ? hasta aproximadamente 5 mM, o aproximadamente 0.1 mM hasta aproximadamente 1 mM.

El término "licor" significa que la fase de solución, ya sea acuosa, orgánica o una combinación de la misma, que se origina del tratamiento de una material de lignocelulosa y/o hemicelulosa en una suspensión, o monosacáridos de los mismos, por ejemplo, xilosa, arabinosa, ma osa , etc . , bajo condiciones como se describe en . la presente, y los contenidos solubles de los mismos. Un licor para mejoramiento celulolitico de un polipéptido GH61 puede ser producido tratando un material de lignocelulosa o hemicelulosa (o materia prima) aplicando calor y/o presión, opcionalmente en la presencia de un catalizador, por ejemplo, ácido, opcionalmente en la presencia de un solvente orgánico, y opcionalmente en combinación con rompimiento físico del material, y después separación de la solución de los sólidos residuales. Tales condiciones determinan el grado de mejoramiento celulolitico obtenible a través de la combinación del licor y un polipéptido GH61 durante la hidrólisis de un sustrato celulósico por una preparación de celulasa. El licor puede ser separado del material tratado usando un método estándar en la técnica, tal como filtración, sedimentación, o centrifugación.

En un aspecto, una cantidad efectiva del licor a celulosa es aproximadamente 10~6 hasta aproximadamente 10 g por g de celulosa, por ejemplo, aproximadamente 10~6' hasta aproximadamente 7.5 g, aproximadamente 10"6 hasta aproximadamente 5, aproximadamente 10~6 hasta aproximadamente 2.5 g, aproximadamente 10"6 hasta aproximadamente 1 g, aproximadamente 10 "5 hasta aproximadamente 1 aproximadamente 10" 5 hasta aproximadamente 10"1 aproximadamente 10" 4 hasta aproximadamente 10"1 aproximadamente 10"3 hasta aproximadamente 10-1 g., aproximadamente 10"3 hasta aproximadamente 102 g por [ q celulosa .

En un aspecto, una o más (por ejemplo, varias) enzimas hemiceluloliticas comprenden una preparación comercial de enzima hemicelulolitica. Ejemplos de preparaciones comerciales de enzima hemicelulolitica adecuadas para uso en la presente invención incluyen, por ejemplo, SHEARZYME™ (Novozymes A/S), CELLIC™ HTec (Novozymes A/S), CELLIC™ HTec2 (Novozymes A/S), VISCOZYME® (Novozymes A/S), ULTRAFLO® (Novozymes A/S), PULPZYME® HC (Novozymes A/S), MULTIFECT® Xylanase (Genencor) , ACCELLERASE® XY (Genencor) , ACCELLERASE® XC (Genencor) , ECOPULP® TX-200A (AB Enzymes) , HSP 6000 xilanasa (DSM), DEPOL™ 333P (Biocatalysts Limit, Wales, UK) , DEPOL™ 740L. (Biocatalysts Limit, Wales, UK) , y DEPOL™ 762P (Biocatalysts Limit, Wales, UK) .

Ejemplos de xilanasas útiles en los procesos de la presente invención incluyen, pero no se limitan a, xilanasas de Aspergillus aculeatus (GeneSeqP : AAR63790 ; WO 94/21785), Aspergillus fu igatus (documento WO 2006/078256) , Penicillium pinophilum (documento WO 2011/041405), Penicillium sp. (documento WO 2010/126772), Thielavia terrestris NRRL 8126 (documento WO 2009/079210), y . Trichophaea saccata GH10 (documento WO 2011/057083) .

Ejemplos de beta-xilosidasas útiles en los procesos de la presente invención incluyen, pero no se limitan a, beta-xilosidasas de Neurospora crassa (SwissProt número de acceso Q7SOW4), Trichoderma reesei (UniProtKB/TrEMBL numero de acceso Q92458), y Talaromyces emersonii (SwissProt número de acceso Q8X212) .

Ejemplos de acetilxilano esterasas útiles en los procesos de la presente invención incluyen, pero no se limitan a, acetilxilano esterasas de Aspergillus aculeatus (documento WO 2010/108918), Chaetomium globosum (Uniprot número de acceso Q2GWX4), Chaetomium gracile (GeneSeqP número de acceso AAB82124), Humicola insolens DSM 1800 (documento WO 2009/073709), Hypocrea jecorina (documento WO 2005/001036), Myceliophtera thermophila (documento WO 2010/014880), Neurospora crassa (UniProt número de acceso q7s259), Phaeosphaeria nodorum (Uniprot número de acceso Q0UHJ1 ) , y Thielavia terrestris NRRL 8126 (documento WO 2009/042846) .

Ejemplos de feruloil esterasas (esterasas de ácido ferúlico) útiles en los procesos de la presente invención incluyen, pero no se limitan a, feruloil esterasas de Humicola insolens DSM 1800 (documento WO 2009/076122), Neosartorya fischeri (UniProt Número de acceso A1D9T4), Neurospora crassa (UniProt número de acceso Q9HGR3), Penicillium aurantiogriseum (documento WO 2009/127729), y Thielavia terrestris (documento WO 2010/053838 y WO 2010/065448) .

Ejemplos de arabinofuranosidasas útiles en los procesos de la presente invención incluyen, pero no se limitan a, arabinofuranosidasas de Aspergillus niger (GeneSeqP número de acceso AAR94170), Humicola insolens DSM 1800 (documento WO 2006/114094 y WO 2009/073383), y M. giganteus (documento WO 2006/114094) .

Ejemplos de alfa-glucuronidasas útiles en los procesos de la presente invención incluyen, pero no se limitan a, alfa-glucuronidasas de Aspergillus clavatus (UniProt número de acceso alccl2) , Aspergillus fumigatus (SwissProt número de acceso Q4WW45), Aspergillus niger (Uniprot número de acceso Q96WX9), Aspergillus terreus (SwissProt número de acceso Q0CJP9) , Humicola insolens (documento WO 2010/014706) , Penicillium aurantiogriseum (documento WO 2009/068565), Talaromyces emersonii (UniProt número de acceso Q8X211), y Trichoderma reesei (Uniprot número de acceso Q99024).

Los polipéptidos que tienen actividad enzimática usados en los procesos de la presente invención pueden ser producidos por fermentación de las cepas microbianas indicadas anteriormente en un medio nutriente que contiene fuentes de carbono y nitrógeno adecuadas y sales inorgánicas, usando procedimientos conocidos en la técnica (véase, por ejemplo, Bennett, J.W. and LaSure, L. (eds. ) , More Gene Manipulations in Fungí, Academic Press, CA, 1991). Los medios adecuados son disponibles de proveedores comerciales o pueden ser preparados de conformidad con composiciones publicadas (por ejemplo, en catálogos de la American Type Culture Collection) . Intervalos de temperatura y otras condiciones adecuadas para crecimiento y producción de enzima se conocen en la técnica (véase, por ejemplo, Bailey, J.E., y Ollis, D.F., Biochemical Engineering Fundamentáis, McGraw-Hill Book Company, NY, 1986) .

La fermentación puede ser cualquier método de cultivación de una célula que resulta en la expresión o aislamiento de una enzima o proteina. La fermentación puede, por lo tanto, ser entendida mientras comprende cultivación en matraz agitado, o fermentación a grande o menor escala (que incluye fermentaciones continuas, de lote, lote alimentado o de estado sólido), en termentadores industriales o de laboratorio realizados en un medio adecuado y bajo condiciones que permiten a la enzima ser expresada o aislada. Las enzimas resultantes producidas por los métodos descritos anteriormente pueden ser recuperadas del medio de fermentación y purificadas por procedimientos convencionales.

Fermentación . Los azúcares fermentables obtenidos del material celulósico hidrolizado pueden ser fermentados por uno o más (por ejemplo, varios) microorganismos de fermentación capaces de fermentar los azúcares directamente o indirectamente en un producto de fermentación deseado. "Fermentación" o "proceso de fermentación" se refiere a cualquier proceso de fermentación o cualquier proceso que comprende una etapa de fermentación. Los procesos de fermentación también incluyen procesos de fermentación usados en la industria de alcohol consumible (por ejemplo, cerveza y vino) , industria láctea (por ejemplo, productos lácteos fermentados), industria del cuero e industria del tabaco. Las condiciones de fermentación dependen del producto de fermentación deseado y organismo fermentante y pueden ser fácilmente determinadas por un experto en la técnica.

En la etapa de fermentación, los azúcares, liberados del material celulósico como un resultado del pretratamiento etapas de hidrólisis enzimáticas, son fermentados a un producto, por ejemplo, etanol, por un organismo de fermentación, tal como levadura. La hidrólisis (sacarificación) y fermentación pueden ser separadas o simultáneas, como se describe en la presente.

Cualquier material celulósico hidrolizado adecuado puede ser usado en la etapa de fermentación en la práctica de la presente invención. El material es en general seleccionado con base en el producto de fermentación deseado, es decir, la sustancia a obtenerse de la fermentación, y el proceso empleado, como es bien conocido en la técnica.

El término "medio de fermentación" se entiende en la presente por referirse a un medio antes de que el (los) microorganismo (s ) de fermentación es (son) agregado (s), tal como, un medio que resulta de un proceso de sacarificación, así como también un medio usado en un proceso de sacarificación y fermentación simultáneo (SSF) .

"Microorganismo de fermentación" se refiere a cualquier microorganismo, que incluye organismos fúngicos y bacterianos, adecuados para uso en un proceso de fermentación deseado para producir un producto de fermentación. El organismo de fermentación puede ser organismos de fermentación de hexosa y/o pentosa, o una combinación de los mismos. Organismos de fermentación tanto hexosa como pentosa son bien conocidos en la técnica. Microorganismos de fermentación adecuados son capaces de fermentar, es decir, convertir azúcares tales como glucosa, xilosa, xilulosa, arabinosa, maltosa, mañosa, galactosa, y/u oligosacáridos, directamente o indirectamente en el producto de fermentación deseado. Ejemplos de organismos de fermentación bacterianos y fúngicos que producen etanol se describen por Lin et al., 2006, ñppl. Microbiol. Biotechnol. 69: 627-642.

Ejemplos de microorganismos de fermentación que pueden fermentar azúcares de hexosa incluyen organismos fúngicos y bacterianos, tales como levadura. La levadura preferida incluye cepas de Candida, Kluyveromyces, y Saccharomyces, por ejemplo, Candida sonorensis, Kluyveromyces marxianus , y Saccharomyces cerevisiae .

Ejemplos de organismos de fermentación que pueden fermentar azúcares de pentosa en su estado nativo incluyen organismos bacterianos y fúngicos, tales como algunas levaduras. Levaduras de fermentación de xilosa preferidas incluyen cepas de Candida, preferiblemente C. sheatae o C. sonorensis; y cepas de Pichia, preferiblemente P. stipitis, tales como P. stipitis CBS 5773. Levaduras de fermentación de pentosa preferidas incluyen cepas de Pachysolen, preferiblemente P. tannophílus . Organismos no capaces de fermentar azúcares de pentosa tales como xilosa y arabinosa, pueden ser genéticamente modificados para hacerlo por métodos conocidos en la técnica.

Ejemplos de bacterias que pueden fermentar eficientemente hexosa y pentosa a etanol incluyen, por ejemplo, Bacillus coagulans, Clostridium acetobutylicum, Clostridium thermocellum, Clostridium phytofermentans, Geobacillus sp., Thermoanaerobacter saccharolyticum, y Zymomonas mobilis ( Philippidis , 1996, supra) .

Otros organismos de fermentación incluyen cepas de Bacillus, tales como Bacillus coagulans; Candida, tales como C. sonorensis, C. methanosorbosa , C. diddensiae, C. parapsilosis, C. naedodendra , C. blankii, C. entomophilia , C. brassicae, C. pseudotropicalis, C. boidinii, C. utílis, y C. scehatae; Clostridium, tales como C. acetobutylicum, C. thermocellum, y C. phytofermentans; E. coli, especialmente cepas de E. coli que han sido genéticamente modificadas para mejorar el rendimiento de etanol; Geobacillus sp.; Hansenula, tales como Hansenula anómala; Klebsiella, tales como K. oxytoca; Kluyveromyces, tales como K. marxianus , K. lactis, K. thermotolerans, y K. fragilis; Schizosaccharomyces, tales como S. pombe; Thermoanaerobacter, tales como Thermoanaerobacter saccharolyticum; y Zymomonas, tales como Zymomonas mobilis.

En un aspecto preferido, la levadura es una Bretannomyces . En un aspecto más preferido, la levadura es Bretannomyces clausenii. En otro aspecto preferido, la levadura es una Candida. En otro aspecto más preferido, la levadura es Candida sonorensis . En otro aspecto más preferido, la levadura es Candida boidinii. En otro aspecto más preferido, la levadura es Candida blankii. En otro aspecto más preferido, la levadura es Candida brassicae . En otro aspecto más preferido, la levadura es Candida diddensii . En otro aspecto más preferido, la levadura es Candida entomophiliia . En otro aspecto más preferido, la levadura es Candida pseudotropicalis . En otro aspecto más preferido, la levadura es Candida scehatae . En otro aspecto más preferido, la levadura es Candida utilis. En otro aspecto preferido, la levadura es una Clavispora. En otro aspecto más preferido, la levadura es Clavispora lusitaniae . En otro aspecto más preferido, la levadura es Clavispora opuntiae. En otro aspecto preferido, la levadura es una Kluyveromyces . En otro aspecto más preferido, la levadura es Kluyveromyces fragilis .

En otro aspecto más preferido, la levadura es Kluyveromyces marxianus . En otro aspecto más preferido, la levadura es Kluyveromyces thermotolerans . En otro aspecto preferido, la levadura es una Pachysolen. En otro aspecto más preferido, la levadura es Pachysolen tannophilus . En otro aspecto preferido, la levadura es una Pichia. En otro aspecto más preferido, la levadura es una Pichia stipitis . En otro aspecto preferido, la levadura es una Saccharomyces spp. En un aspecto más preferido, la levadura es Saccharomyces cerevisiae. En otro aspecto más preferido, la levadura es Saccharomyces distaticus . En otro aspecto más preferido, la levadura es Saccharomyces uvarum.

En un aspecto preferido, la bacteria es un Bacillus . En un aspecto más preferido, la bacteria es Bacillus coagulans . En otro aspecto preferido, la bacteria es una Clostridium. En otro aspecto más preferido, la bacteria es Clostridium acetobutylicum . En otro aspecto más preferido, la bacteria es Clostridium phytofermentans. En otro aspecto más preferido, la bacteria es Clostridium thermocellum: En otro aspecto más preferido, la bacteria es Geobacilus sp. En otro aspecto más preferido, la bacteria es una Thermoanaerobacter. En otro aspecto más preferido, la bacteria es Thermoanaerobacter saccharolyticum . En otro aspecto preferido, la bacteria es una Zymomonas . En otro aspecto más preferido, la bacteria es Zymomonas mobilis .

Levaduras comercialmente disponibles adecuadas para producción de etanol incluyen, por ejemplo, BIOFERM™ AFT y XR (NABC - North American Bioproducts Corporation, GA, USA) , levadura ETANOL RED™ ( Fermentis/Lesaffre, USA), FALI™ (Levadura de Fleischmann, USA), FERMIOL™ (DSM Specialties ) , GERT STRAND™ (Gert Strand AB, Sweden) , y SUPERSTART™ y levadura fresca THERMOSACC™ (Etanol Technology, WI, USA) .

En un aspecto preferido, el microorganismo de fermentación ha sido genéticamente modificado para proporcionar la capacidad para fermentar azúcares de pentosa, tales como utilizando xilosa, utilizando arabinosa, y xilosa, y co-utilizando microorganismos de arabinosa.

La clonación de genes heterólogos en varios microorganismos de fermentación ha conducido a la construcción de organismos capaces de convertir hexosas y pentosas a etanol (co-fermentación) (Chen and Ho, > ?993, Cloning and improving the expression of Pichia stipitis xylose reductase gene in Saccharomyces cerevisiae, Appl. Biochem. Biotechnol . 39-40: 135-147; Ho et al., 1998, Genetically engineered Saccharomyces yeast capable of effectively cofermenting glucose and xylose, Appl. Environ. Microbiol . 64: 1852-1859; Kotter and Ciriacy, 1993, Xylose fermentation by Saccharomyces cerevisiae, Appl. Microbiol. Biotechnol. 38: 776-783; Walfridsson et al., 1995, Xylose-metabolizing Saccharomyces cerevisiae strains overexpressing the TKLl y TALl genes encoding the pentose phosphate pathway enzymes transketolase and transaldolase, Appl. Environ. Microbiol. 61: 4184-4190; Kuyper et al., 2004, Minimal metabolic engineering of Saccharomyces cerevisiae for efficient anaerobic xylose fermentation : a proof of principie, FEMS Yeast Research 4: 655-664; Beall et al., 1991, Parametric studies of etanol production from xylose y other sugars by recombinant Escherichia coli, Biotech. Bioeng. 38: 296-303; Ingram et al., 1998, Metabolic engineering of bacteria for ethanol production, Biotechnol. Bioeng. 58: 204-214; Zhang et al., 1995, Metabolic engineering of a pentose metabolism pathway in etanologenic Zymomonas mobilis, Science 267: 240-243; Deanda et al., 1996, Development of an arabinose-fermenting Zymomonas mobilis strain by metabolic pathway engineering, Appl. Environ. Microbiol. 62: 4465-4470; WO 2003/062430, xylose isomerase) .

En un aspecto preferido, el microorganismo de fermentación genéticamente modificado es Candida sonorensis . En otro aspecto preferido, el microorganismo de fermentación genéticamente modificado Escherichia coli. En otro aspecto preferido, el microorganismo de fermentación genéticamente modificado es Klebsiella oxytoca. En otro aspecto preferido, el microorganismo de fermentación genéticamente modificado es Kluyveromyces marxianus . En otro aspecto preferido, el microorganismo de fermentación genéticamente modificado es Saccharomyces cerevisiae. En otro aspecto preferido, el microorganismo de fermentación genéticamente modificado es Zymomonas mobilis.

Es bien conocido en la técnica que los organismos descritos anteriormente también se pueden usar para producir otras sustancias, como se describe en la presente.

El microorganismo de fermentación se adiciona típicamente al material celulósico degradado o hidrolizado y la fermentación se realiza por aproximadamente 8 a aproximadamente 96 horas, por ejemplo, aproximadamente 24 a aproximadamente 60 horas. La temperatura está típicamente entre aproximadamente 26°C a aproximadamente 60°C, por ejemplo, aproximadamente 32°C o 50°C, y aproximadamente pH 3 a aproximadamente pH 8, por ejemplo, pH 4-5, 6, o 7.

En otro aspecto, la levadura y/u otros microorganismos se aplican al material celulósico degradado y la fermentación se realiza por aproximadamente 12 a aproximadamente 96 horas, tal como típicamente 24-60 horas. En otro aspecto, la temperatura está preferiblemente entre aproximadamente 20°C a aproximadamente 60°C, por ejemplo, aproximadamente 25 °C a aproximadamente 50 °C, aproximadamente 32 °C a aproximadamente 50 °C, o aproximadamente 32 °C a aproximadamente 50 °C, y el pH generalmente es desde aproximadamente pH 3 a aproximadamente pH 7, por ejemplo, aproximadamente pH 4 a aproximadamente pH 7. Sin embargo, algunos organismos de fermentación, por ejemplo, bacterias, tienen temperatura de fermentación elevada óptima. La levadura u otros microorganismos se aplican de manera preferible en cantidades de aproximadamente 105 a 1012, de manera preferible desde aproximadamente 107 a 1010, de forma especial aproximadamente 2 x 108 conteo de células viables por mi de caldo de fermentación. La guia adicional con respecto al uso de levadura para fermentación se puede encontrar en, por ejemplo, "The Alcohol Textbook" (Editores K. Jacques, T.P. Lyons and D.R. Kelsall, Nottinghamm University Press, Reino Unido 1999) , la cual se incorpora en la presente como referencia.

Para la producción de etanol, seguido de la fermentación la pasta aguada fermentada se destila para extraer el etanol. El etanol obtenido de acuerdo con los procesos de la invención se puede usar como, por ejemplo, etanol carburante, etanol potable, es decir, . bebida espirituosa neutral potable, o etanol industrial.

Un estimulador de fermentación se puede usar en combinación con cualquiera de los procesos descritos en la presente para mejorar adicionalmente el proceso de fermentación, y en particular, el rendimiento del microorganismo de fermentación, tal como, mejora de la velocidad y rendimiento de etanol. Un "estimulado^ de fermentación" se refiere a estimuladores para el- crecimiento de los microorganismos de fermentación, en particular, levadura. Los estimuladores de fermentación preferidos para el crecimiento incluyen vitaminas y minerales. Los ejemplos de vitaminas incluyen multivitaminas, biotina, pantotenato, ácido nicotinico, meso-inositol , tiamina, piridoxina, ácido para-aminobenzoico, ácido fólico, riboflavina, y Vitaminas A, B, C, D, y E. Véase, por ejemplo, Alfenore et al., Improving etanol production and viability of Saccharomyces cerevisiae by a vitamin feeding strategy during fed-batch process, Springer-Verlag (2002), el cual se incorpora en la presente como referencia. Los ejemplos de minerales incluyen minerales y sales minerales que pueden suplir nutrientes que comprenden P, K, Mg, S, Ca, fe, Zn, Mn, y Cu.

Productos de fermentación: Un producto de fermentación puede ser cualquier sustancia derivada de la fermentación. El producto de fermentación puede ser, sin limitación, un alcohol (por ejemplo, arabinitol, n-butanol, isobutanol, etanol, glicerol, metanol, etilenglicol , 1,3-propanodiol [propilenglicol] , butanodiol, glicerina, sorbitol, y xilitol) ; un alcano (por ejemplo, pentano, hexano, heptano, octano, nonano, decano, undecanú, y dodecano) , un cicloalcano (por ejemplo, ciclopentano, ciclohexano, cicloheptano, y ciclooctano) , un alqueno (por ejemplo, penteno, hexeno, hepteno, y octeno) ; un aminoácido (por ejemplo, ácido aspártico, ácido glutámico, glicina, lisina, serina, y treonina) un gas (por ejemplo, metano, hidrógeno (H2) , dióxido de carbono (C02) , y monóxido de carbono (CO) ) ; isopreno; una cetona (por ejemplo, acetona) ; un ácido orgánico (por ejemplo, ácido acético, ácido acetónico, ácido adipico, ácido ascórbico, ácido cítrico, ácido 2, 5-diceto-D-glucónico, ácido fórmico, ácido fu árico, ácido glucárico, ácido glucónico, ácido glucurónico, ácido glutárico, ácido 3-hidroxipropiónico, ácido itacónico, ácido láctico, ácido málico, ácido malónico, ácido oxálico, ácido oxaloacético, ácido propiónico, ácido succínico, y ácido xilónico) ; y policeturo. El producto de fermentación también puede ser proteína como un producto de alto valor.

En un aspecto preferido, el producto de fermentación es un alcohol. Se entenderá que el término "alcohol" incluye una sustancia que contiene una o más porciones hidroxilo. En un aspecto más preferido, el alcohol es n-butanol. En otro aspecto más preferido, el alcohol es isobutanol. En otro aspecto más preferido, el alcohol es etanol. En otro aspecto más preferido, el alcohol es metanol. En otro aspecto más preferido, el alcohol es arabinitol . En otro aspecto más preferido, el alcohol es butanodiol. En otro aspecto más preferido, el alcohol es etilenglicol . En otro aspecto más preferido, el alcohol es glicerina. En otro aspecto más preferido, el alcohol es glicerol. En otro aspecto más preferido, el alcohol es 1 , 3-propanodiol . En otro aspecto más preferido, el alcohol es sorbitol. En otro aspecto más preferido, el alcohol es xilitol. Véase, por ejemplo, Gong, C. S., Cao, N. J. , Du, J. , and Tsao, G. T . , 1999, Ethanol production from renewable resources, en Advances in Biochemical Engineering/Biotechnology, Scheper, T., ed., Springer-Verlag Berlín Heidelberg, Germany, 65: 207-241; Silveira and Joñas, 2002, The biotechnological production of sorbitol, Appl. Microbiol. Biotechnol . 59: 400-408; Nigam and Singh, 1995, Processes for fermentative production of xylitol - a sugar ,substitute, Process Biochemistry 30(2): 117-124; Ezeji et al., 2003, Production of acetone, butanol and ethanol by Clostridium beij erinckii BA101 and in situ recovery by gas stripping, World Journal of Microbiology and Biotechnology 19(6): 595-603.

En otro aspecto preferido, el producto de fermentación es un alcano. El alcano puede ser un alcanó no ramificado o ramificado. En otro aspecto más preferido,' el alcano es pentano. En otro aspecto más preferido, el alcano es hexano. En otro aspecto más preferido, el alcano es heptano. En otro aspecto más preferido, el alcano es octano. En otro aspecto más preferido, el alcano es nonano. En otro aspecto más preferido, el alcano es decano. En otro aspecto más preferido, el alcano es undecano. En otro aspecto más preferido, el alcano es dodecano.

En otro aspecto preferido, el producto de fermentación es un cicloalcano. En otro aspecto más preferido, el cicloalcano es ciclopentano . En otro aspecto más preferido, el cicloalcano es ciclohexano. En otro aspecto más preferido, el cicloalcano es cicloheptano . En otro aspecto más preferido, el cicloalcano es ciclooctano.

En otro aspecto preferido, el producto de fermentación es un alqueno. El alqueno puede ser un alqueno no ramificado o ramificado. En otro aspecto más preferido, el alqueno es penteno. En otro aspecto más preferido, el alqueno es hexeno. En otro aspecto más preferido, el alqueno es hepteno. En otro aspecto más preferido, el alqueno es octeno.

En otro aspecto preferido, el producto de fermentación es un aminoácido. En otro aspecto más preferido, el ácido orgánico es ácido aspártico. En otro aspecto más preferido, el aminoácido es ácido glutámico. En otro aspecto más preferido, el aminoácido es glicina. En otro aspecto más preferido, el aminoácido es lisina. En otro aspecto más preferido, el aminoácido es serina. En otro aspecto más preferido, el aminoácido es treonina. Véase, por ejemplo, Richard and Margaritis, 2004, Empirical modeling of batch fermentation kinetics for poly ( glutamic acid) production and other microbial biopolymers, Biotechnology and Bioengineering 87(4): 501-515.

En otro aspecto preferido, el producto de fermentación es un gas. En otro aspecto más preferido, el gas es metano. En otro aspecto más preferido, el gas es H2. En otro aspecto más preferido, el gas es C02. En otro aspecto más preferido, el gas es CO. Véase, por ejemplo, Kataoka et al., 1997, Studies on hydrogen production by continuous culture system of hydrogen-producing anaerobic bacteria, Water Science and Technology 36(6-7): 41-47; y Gunaseelan, 1997, Biomass and Bioenergy 13(1-2): 83-1 14, Anaerobic digestión of biomass for methane production: A review.

En otro aspecto preferido, el producto de fermentación es isopreno.

En otro aspecto preferido, el producto de fermentación es una cetona. Se entenderá que el término "cetona" incluye una sustancia que contiene una o más porciones cetona. En otro aspecto más preferido, la cetona es acetona. Véase, por ejemplo, Qureshi and Blaschek, 2003, supra .

En otro aspecto preferido, el producto de fermentación es un ácido orgánico. En otro aspecto más preferido, el ácido orgánico es ácido acético. En otro aspecto más preferido, el ácido orgánico es ácido acetónico. En otro aspecto más preferido, el ácido orgánico es ácido adipico. En otro aspecto más preferido, el ácido orgánico es ácido ascórbico. En otro aspecto más preferido, el ácido orgánico es ácido cítrico. En otro aspecto más preferido, el ácido orgánico es ácido 2 , 5-diceto-D-glucónico . En otro aspecto más preferido, el ácido orgánico es ácido fórmico. En otro aspecto más preferido, el ácido orgánico es ácido fumárico. En otro aspecto más preferido, el ácido orgánico es ácido glucárico. En otro aspecto más preferido, el ácido orgánico es ácido glucónico. En otro aspecto más preferido, el ácido orgánico es ácido glucurónico. En otro aspecto más preferido, el ácido orgánico es ácido glutárico. En otro aspecto preferido, el ácido orgánico es ácido 3-hidroxipropiónico . En otro aspecto más preferido, el ácido orgánico es ácido itacónico. En otro aspecto más preferido, el ácido orgánico es ácido láctico. En otro aspecto más preferido, el ácido orgánico es ácido málico. En otro aspecto más preferido, el ácido orgánico es ácido malónico. En otro aspecto más preferido, el ácido orgánico es ácido oxálico. En otro aspecto más preferido, el ácido orgánico es ácido propiónico. En otro aspecto más preferido, el ácido orgánico es ácido succinico. En otro aspecto más preferido, el ácido orgánico es ácido xilónico. Véase, por ejemplo, Chen and Lee, 1997, Membrane-mediated extractive fermentation for lactic acid production from cellulosic biomass, Appl. Biochem. Biotechnol. 63-65: 435-448.

En otro aspecto preferido, el producto 1 de fermentación es policeturo.

Recuperación . El producto (s) de fermentación se puede recuperar de manera opcional del medio de fermentación usando cualquier método conocido en la técnica incluyendo, pero sin estar limitado a, cromatografía, procedimientos electroforéticos , solubilidad diferencial, destilación, o extracción. Por ejemplo, el alcohol es separado del material celulósico fermentado y purificado por métodos convencionales de destilación. Se puede obtener etanol con una pureza de hasta aproximadamente 96 % en vol., el cual se puede usar como, por ejemplo, etanol carburante, etanol potable, es decir, bebidas espirituosas neutrales potables, o etanol industrial.

Péptido Señal La presente invención también se refiere a un polinucleótido aislado que codifica un péptido señal o que consiste de aminoácidos 1 a 25 de SEC ID NO: 2, o aminoácidos 1 a 25 de SEC ID NO: 4. El polinucleótido puede comprender además un gen que codifica una proteína, la cual está operativamente enlazada al péptido señal. La proteína es preferiblemente extraña al péptido señal. En un aspecto, el polinucleótido que codifica el péptido señal es nucleótidos 1 a 75 de SEC ID NO: 1. En otro aspecto, el polinucleótido que codifica el péptido señal es nucleósidos 1 a 75 de SEC ID NO: 3.

La presente invención también se refiere a construcciones de ácido nucleico, vectores de expresión y células huésped recombinantes que comprenden tales polinucleótidos .

La presente invención también se refiere a métodos para producir una proteína, que comprende (a) cultivar una célula huésped recombinante que comprende tal polinucleótido; y (b) recuperar la proteína.

La proteína puede ser nativa o heteróloga a una célula huésped. El término "proteína" no se entiende en la presente que se refiera a una longitud específica del producto codificado y, por consiguiente, incluye péptidos, oligopéptidos, y polipéptidos . El término "proteína" también incluye dos o más polipéptidos combinados para formar el producto codificado. Las proteínas también incluyen polipéptidos híbridos y polipéptidos fusionados.

Preferiblemente, la proteína es una hormona, enzima, receptor o porción del mismo, anticuerpo o porción del mismo, o reportero. Por ejemplo, la proteína puede ser una hidrolasa, isomerasa, ligasa, liasa, oxidorreductasa , o transferasa, por ejemplo, una aminopeptidasa , amilasa, carbohidrasa , carboxipeptidasa, catalasa, celobiohidrolasa , celulasa, chitinasa, cutinasa, ciclodextrina glicosiltransferasa , desoxirribonucleasa, endoglucanasa, esterasa, alfa-galactosidasa, beta-galactosidasa, glucoamilasa, alfa-glucosidasa, beta-glucosidasa, invertasa, lacasa, lipasa, manosidasa, mutanasa, oxidasa, enzima pectinolítica, peroxidasa, fitasa, polifenoloxidasa, enzima proteolítica, ribonucleasa , transglutaminasa, xilanasa, o beta-xilosidasa.

El gen se puede obtener de cualquier procariota, eucariota, u otra fuente.

Lista de modalidades preferidas Modalidad 1. Un polipéptido aislado que tiene actividad celobiohidrolasa, seleccionado del grupo que consiste de: (a) un polipéptido que tiene al menos 84%, por ejemplo, al menos 85%, al menos 86%, al menos 87%, al menos 88%, al menos 89%, al menos 90%, al menos 91 %, al menos 92%, al menos 93%, al menos 94%, al menos 95%, al menos 96%, al menos 97%, al menos 98%, al menos 99%, o 100% de identidad de secuencia al polipéptido maduro de SEC ID NO: 2, o un polipéptido que tiene al menos 81 %, por ejemplo, al menos 82%, al menos 83%, al menos 84%, al menos 85%, al menos .87%, al menos 90%, al menos 91%, al menos 92%, al menos 93%, al menos 94%, al menos 95%, al menos 96%, al menos 97%, al menos 98%, al menos 99%, o 100% identidad de secuencia al polipéptido maduro de SEC ID NO: 4; (b) un polipéptido codificado por un polinucleótido que híbrida bajo condiciones de baja rigurosidad, o condiciones de media rigurosidad, o condiciones de media-alta rigurosidad, o condiciones de alta rigurosidad, o condiciones de muy alta rigurosidad con (i) la secuencia codificante de polipéptido maduro de SEC ID NO: 1, o SEC ID NO: 3, (ii) la secuencia de cADN del mismo, o (iii) el complemento de longitud completa de (i) o (ii) ; (c) un polipéptido codificado por un polinucleotido que tiene al menos 60%, por ejemplo, al menos 65%, al menos 70%, al menos 75%, al menos 80%, al menos 85%, al menos 85%, al menos 90%, al menos 91 %, al menos 92%, al menos 93%, al menos 94%, al menos 95%, al menos 96%, al menos 97%, al menos 98%, al menos 99%, o 100% identidad de secuencia con la secuencia codificante del polipéptido maduro de SEC ID NO: 1, o SEC ID NO: 3; o la secuencia de cADN del mismo; (d) una variante del polipéptido maduro de SEC ID NO: 2, o SEC ID NO: 4 que comprende una sustitución, supresión, y/o inserción a una o más posiciones; y (e) un fragmento del polipéptido de (a) , (b) , (c) , o (d) que tiene actividad celobiohidrolasa .

Modalidad 2. El polipéptido de la modalidad 1, que tiene al menos 84%, al menos 85%, al menos 86%, al menos 87%, al menos 88%, al menos 89%, al menos 90%, al menos 91%, al menos 92%, al menos 93%, al menos 94%, al menos 95%, al menos 96%, al menos 97%, al menos 98%, al menos 99% o 100% de identidad de secuencia al polipéptido maduro de SEC ID NO: 2, o al menos 81%, al menos 82%, al menos 83%, al menos 84%, al menos 85%, al menos 87%, al menos 90%, al menos 91%, al menos 92%, al menos 93%, al menos 94%, al menos 95%, al menos 96%, al menos 97%, al menos 98%, al menos 99%, o 100% de identidad de secuencia con el polipéptido maduro de SEC ID NO: 4.

Modalidad 3. El polipéptido de la modalidad 1 o 2, el cual es codificado por un polinucleótido que híbrida bajo condiciones de baja rigurosidad, o condiciones de baja-media rigurosidad, o condiciones de media rigurosidad, o condiciones de media-alta rigurosidad, o condiciones de alta rigurosidad, o condiciones de muy alta rigurosidad con (i) la secuencia codificante del polipéptido maduro de SEC ID NO: 1, o SEC ID NO: 3, (ii) la secuencia de cADN del mismo, o (iii) el complemento de longitud completa de (i) o (ii) ; Modalidad 4. El polipéptido de cualquiera de las modalidades 1-3, el cual se codifica por un polinucleótido que tiene al menos 60%, al menos 65%, al menos 70%, al menos 75%, al menos 80%, al menos 85%, al menos 90%, al menos 91%, al menos 92%, al menos 93%, al menos 94%, al menos 95%, al menos 96%, al menos 97%, al menos 98%, al menos 99% o 100% de secuencia de identidad con la secuencia codificanté del polipéptido maduro de SEC ID NO: 1, o SEC ID NO: 3 o la secuencia de cADN del mismo.

Modalidad 5. El polipéptido de cualquiera de las modalidades 1-4, que comprende o consiste de SEC ID NO:' 2, o SEC ID NO: 4 o el polipéptido maduro de SEC ID NO: 2, o SEC ID NO: 4.

Modalidad 6. El polipéptido de la modalidad 5, en donde el polipéptido maduro es aminoácidos 26 a 532 de SEC ID NO: 2, o aminoácidos 26 a 532 de SEC ID NO: 4.

Modalidad 7. El polipéptido de cualquiera de las modalidades 1-4, el cual es una variante del polipéptido maduro de SEC ID NO: 2 o SEC ID NO: 4 que comprende una sustitución, supresión, y/o inserción a una o más posiciones.

Modalidad 8. El polipéptido de la modalidad 1, el cual es un fragmento de SEC ID NO: 2, o SEC ID NO: 4, en donde el fragmento tiene actividad celobiohidrolasa .

Modalidad 9. Un polipéptido aislado que comprende un dominio catalítico seleccionado del grupo que consiste de: (a) un dominio catalítico que tiene al menos 60% de identidad de secuencia con el dominio catalítico de SEC ID NO: 2 o SEC ID NO: 4 ; (b) un dominio catalítico codificado por un polinucleótido que tiene al menos 60% de identidad de secuencia con la secuencia codificante de dominio catalítico de SEC ID NO: 1 o SEC ID NO: 3; (c) una variante de dominio catalítico que comprende una sustitución, supresión, y/o inserción de uno o más (varios) aminoácidos del dominio catalítico de SEC ID NO: 2 o SEC ID NO: 4; y (d) un fragmento de un dominio catalítico de (a) , (b) , o (c) , el cual tiene actividad celobiohidrolasa.

Modalidad 10. El polipéptido de la modalidad 9, que comprende o consiste del dominio catalítico de SEC ID NO: 2 o SEC ID NO: .

Modalidad 11. El polipéptido de la modalidad 10, en donde el dominio catalítico es aminoácidos 26 a 460 de SEC ID NO: 2 o aminoácidos 26 a 459 de SEC ID NO: 4.

Modalidad 12. El polipéptido de cualqueira de las modalidades 9-11, además comprende un dominio de enlace de celulosa .

Modalidad 13. El polipéptido de cualquiera de las modalidades 1-12, el cual se codifica por el polinucleótido contenido en la cepa Talaromyces leycettanus CBS398.68.

Modalidad 14. Una composición que comprende el polipéptido de cualquiera de las modalidades 1-13.

Modalidad 15. Un polinucleótido aislado que codifica el polipéptido de cualquiera de las modalidades 1-13.

Modalidad 16. Un vector de expresión o un constructo de ácido nucleico que comprende el polinucleótido de la modalidad 15 operativamente enlazado a una o más secuencias de control que dirigen la producción · del polipéptido en un huésped de expresión.

Modalidad 17. Una célula huésped recombinante que comprende el polinucleótido de la modalidad 15 operativamente enlazado a una o más secuencias de control que dirigen la producción del polipéptido.

Modalidad 18. Un método para producir el polipéptido de cualquiera de las modalidades 1-13, que comprende : (a) cultivar una célula, la cual en su forma de tipo silvestre produce el polipéptido, bajo condiciones conducentes para la producción del polipéptido; y (b) recuperar el polipéptido.

Modalidad 19. Un método para producir un polipéptido que tiene actividad celobiohidrolasa , que comprende: (a) cultivar la célula huésped de la modalidad 17 bajo condiciones conducentes para la producción del polipéptido; y (b) recuperar el polipéptido.

Modalidad 20. Una planta transgénica, parte de la planta o célula de la planta transformada con un polinucleótido que codifica el polipéptido de cualquiera de las modalidades 1-13.

Modalidad 21. Un método para producir un polipéptido que tiene actividad celobiohidrolasa, que comprende : (a) cultivar la planta transgénica o célula ^de la planta de la modalidad 20 bajo condiciones conducentes, para la producción del polipéptido; y (b) recuperar el polipéptido.

Modalidad 22. Un polinucleótido aislado que codifica un péptido señal que comprende o que consiste de aminoácidos 1 a 25 de SEC ID NO: 2, o aminoácidos 1 a 25 de SEC ID NO: 4.

Modalidad 23. Un vector de expresión o constructo de ácido nucleico que comprende un gen que codifica una proteína operativamente enlazada al polinucleótido de la modalidad 22, en donde el gen es extraño al polinucleótido que codifica el péptido señal.

Modalidad 24. Una célula huésped recombinante que comprende un gen que codifica una proteína operativamente enlazada al polinucleótido de la modalidad 22, en donde el gen es extraño al polinucleótido que codifica el péptido señal .

Modalidad 25. Un método para producir una proteína, que comprende: (a) cultivar una célula huésped recombinante que comprende un gen que codifica una proteína operativamente enlazada al polinucleótido de la modalidad 22, en donde el gen es extraño al polinucleótido que codifica el péptido señal, bajo condiciones conducentes para la producción de la proteína; y (b) recuperar la proteína.

Modalidad 26. Un proceso para degradar un material celulósico, que comprende: tratar el material celulósico con una composición de enzima en la presencia del polipéptido que tiene actividad celobiohidrolasa de cualquiera de las modalidades 1-13.

Modalidad 27. El proceso de la modalidad 26, en donde el material celulósico es pretratado.

Modalidad 28. El proceso de la modalidad 26 o 27, en donde la composición de enzima comprende una o más enzimas seleccionadas del grupo que consiste de una celulasa, un polipéptido GH61 que tiene actividad mejoradora celulolitica, una hemicelulasa, una esterasa, una expansina, una lacasa, una enzima ligninolitica, una pectinasa, una peroxidasa, una proteasa, y una swolenina.

Modalidad 29. El proceso de la modalidad 28, en donde la celulasa es una o más enzimas seleccionadas del grupo que consiste de una endoglucanasa, una celobiohidrolasa, y una beta-glucosidasa .

Modalidad 30. El proceso de la modalidad 28, en donde la hemicelulasa es una o más enzimas seleccionadas del grupo que consiste de una xilanasa, una acetilxilano esterasa, una feruloilo esterasa, una arabinofuranosidasa, una xilosidasa, y una glucuronidasa .

Modalidad 32. El proceso de cualquiera de las modalidades 26-30, que adicionalmente comprende recuperar el material celulósico degradado.

Modalidad 32. El proceso de la modalidad 31, en donde el material celulósico degradado es un azúcar.

Modalidad 33. El proceso de la modalidad 32, en donde el azúcar se selecciona del grupo que consiste de glucosa, xilosa, mañosa, galactosa, y arabinosa.

Modalidad 34. Un proceso para producir un producto de fermentación, que comprende: (a) sacarificar un material celulósico con una composición de enzima en la presencia del polipéptido que tiene actividad celobiohidrolasa de cualquiera de las modalidades 1-13; (b) fermentar el material celulósico sacarificado con uno o más microorganismos fermentadores para producir el producto de fermentación; y (c) recuperar el producto de fermentación de la fermentación.

Modalidad 35. El proceso de la modalidad 34·, en donde el material celulósico es pretratado.

Modalidad 36. El proceso de la modalidad 34 o 35, en donde la composición de enzima comprende una o más enzimas seleccionadas del grupo que consiste de una celulasa, un polipéptido GH61 que tiene actividad mejoradora celulolitica, una hemicelulasa, una esterasa, una expansina, una lacasa, una enzima ligninolitica, una pectinasa, una peroxidasa, una proteasa, y una swolenina.

Modalidad 37. El proceso de la modalidad 36, en donde la celulasa es una o más enzimas seleccionadas del grupo que consiste de una endoglucanasa, una celobiohidrolasa, y una beta-glucosidasa .

Modalidad 38. El proceso de la modalidad 36, en donde la hemicelulasa es una o más enzimas seleccionadas del grupo que consiste de una xilanasa, una acetilxilano esterasa, una feruloilo esterasa, una arabinofuranosidasa, una xilosidasa, y una glucuronidasa .

Modalidad 39. El proceso de cualquiera de las modalidades 34-38, en donde las etapas (a) y (b) se realizan simultáneamente en una sacarificación y fermentación simultáneas .

Modalidad 40. El proceso de cualquiera de las modalidades 34-39, en donde el producto de fermentación es un alcohol, un alcano, un cicloalcano, un alqueno, un aminoácido, un gas, isopreno, una cetona, un ácido orgánico, o policeturo.

Modalidad 41. Un proceso para fermentar un material celulósico, que comprende: fermentar el material celulósico con uno o más microorganismos termentadores, en .donde el material celulósico es sacarificado con una composición de enzima en la presencia del polipéptido que tiene actividad celobiohidrolasa de cualquiera de las modalidades 1-13.

Modalidad 42. El proceso de la modalidad 41, en donde la fermentación del material celulósico produce un producto de fermentación.

Modalidad 43. El proceso de la modalidad 42, que adicionalmente . comprende recuperar el producto de fermentación de la fermentación.

Modalidad 44. El proceso de cualquiera de las modalidades 41-43, en donde el material celulósico es pretratado antes de la sacarificación.

Modalidad 45. El proceso de cualquiera de las modalidades 41-44, en donde la composición de enzima comprende una o más enzimas seleccionadas del grupo que consiste de una celulasa, un polipéptido GH61 que tiene actividad mejoradora celulolitica, una hemicelulasa, una esterasa, una expansina, una lacasa, una enzima ligninolitica, una pectinasa, una peroxidasa, una proteasa, y una swolenina.

Modalidad 46. El proceso de la modalidad 45, en donde la celulasa es una o más enzimas seleccionadas del grupo que consiste de una endoglucanasa, una celobiohidrolasa, y una beta-glucosidasa .

Modalidad 47. El proceso de la modalidad 45, en donde la hemicelulasa es una o más enzimas seleccionadas del grupo que consiste de una xilanasa, una acetilxilano esterasa, una feruloilo esterasa, una arabinofuranosidasa, una xilosidasa, y una glucuronidasa .

Modalidad 48. El proceso de cualquiera de las modalidades 41-47, en donde el producto de fermentación es un alcohol, un alcano, un cicloalcano, un alqueno, un aminoácido, un qas, isopreno, una cetona, un ácido orgánico, o policeturo.

La invención descrita y reivindicada en la presente no será limitada en alcance por los aspectos específicos descritos aquí, puesto que estos aspectos se proponen como ilustraciones de varios aspectos de la invención. Cualquiera de los aspectos equivalentes se propone que estén dentro del alcance de esta invención. En efecto, varias modificaciones de la invención además de aquellas mostradas y descritas aquí llegarán a ser evidentes para aquellos expertos en la técnica a partir de la descripción anterior. Tales modificaciones también se propone que caigan dentro del alcance de las reivindicaciones anexas. En el caso de conflicto, la presente descripción incluyendo las definiciones lo controlará.

Ejemplos Materiales Los químicos usados como amortiguadores y sustratos fueron productos comerciales de al menos grado reactivo.

Cepas Se usó la cepa Talaromyces leycettanus CBS398.68 como la fuente de un polipéptido que tiene actividad celobiohidrolasa . Se usó la cepa de Aspergillus oryzae MT3568 para expresión del gen de Talaromyces leycettanus que codifica el polipéptido que tiene actividad celobiohidrolasa . A. oryzae MT3568 es un derivado de gen alterado amds (acetamidasa) de Aspergillus oryzae JaL355 (documento WO 2002/40694) en el cual la auxotrofia de pyrG se restauró alterando el gen acetamidasa de A. oryzae (amdS) .

Medios y soluciones El medio de glucosa YP+2% está compuesto de 1% de extracto de levadura, 2% de peptona y 2% de glucosa.

Las placas de agar PDA están compuestas de infusión de papa (la infusión de papa se hizo hirviendo 300 g de papas rebanadas (lavadas pero sin cáscaras) en agua por 30 minutos y después decantando o colando el caldo a través de una gasa. El agua destilada se agregó entonces hasta que el volumen total de la suspensión fue un litro, seguido por 20 g de dextrosa y 20 g de polvo de agar. El medio se esterilizó por sometimiento en autoclave a 15 psi por 15 minutos ( Bacteriological Analytical Manual, 8th Edition, Revisión A, 1998).

Las placas de LB están compuestas de 10 g de Bacto-Triptona, 5 g de extracto de levadura, 10 g de cloruro de sodio, 15 g de Bacto-agar, y agua desionizada a 1 litro. El medio se esterilizó por sometimiento a autoclave a 15 psi por 15 minutos (Bacteriological Analytical Manual, 8th Edition, Revisión A, 1998 ) .

Pacas de sacarosa COVE están compuestas de 342 g de Sacarosa (Sigma S-9378), 20 g de Polvo de agar, 20 mi de solución de sal Cove (26 g de MgS04.7H20, 26 g de KC1, 26 g de KH2P04, 50 mi de solución de metales traza de Cove) y agua desionizada a 1 litro) . El medio se esterilizó por sometimiento a autoclave a 15 psi por 15 minutos (Bacteriological Analytical Manual, 8th Edition, Revisión A, 1998). El medio se enfrió a 60°C y agregó 10 mM de acetamida, 15 mM de CsCl, Tritón X-100 (50 µ1/500 mi)).

La solución de metales traza de Cove está compuesta de 0.04 g de Na2B407 · 10H2O, 0.4 g de CuS04«5H20, 1.2 g FeSO H20, 0.7 g de MnS04«H20, 0.8 g de Na2Mo04 · 2H20, 10 g de ZnS0 *7H20, y agua desionizada a 1 litro.

El medio Dap-4C está compuesto de 20 g de Dextrosa, 10 g de Maltosa, 11 g de MgS04«7H20, 1 g de KH2P04, 2 g de ácido cítrico, 5.2 g de ?3?04·?20, 0.5 g de extracto de levadura (Difco), 1 mi de Dowfax 63N10 (Dow -Chemical Company) , 0.5 mi de solución de metales traza KU6, 2.5 g de CaC03, y agua desionizada a 1 litro. El medio se esterilizó por sometimiento en autoclave a 15 psi por 15 minutos (Bacteriological Analytical Manual, 8th Edition, Revisión A, 1998). Antes del uso, se agregó medio Dap-4C 3.5 mi estéril al 50% (NH4)2HP04 y 5 mi de ácido láctico al 20% estéril por 150 mi de medio.

La solución de materiales traza de KU6 está compuesta de 0.13 g de NiCl2, 2.5 g de CuS0 »5H20, 13.9 g de FeS04.7H20, 8.45 g de MnS0 .H20, 6.8 g de ZnCl2, 3g de ácido cítrico, y agua desionizada a 1 litro.

Ejemplo 1: Fuente de información de secuencia de ADN para Talaromyces leycettanus Cepa CBS398.68 La información de secuencia genómica se generó por secuenciamiento de ADN illumina en el Beijing Genome Institute (BGI) en Beijing, China a partir de ADN aislado de Talaromyces leycettanus Cepa CBS398.68. Un montaje preliminar del genoma se analizó usando la Serie de Análisis de Secuencia Pedant-Pro™ (Biomax Informatics AG, Martinsried, Germany) . Los modelos del gen construidos por el software se usaron como un punto de partida para detectar homógolos de GH7 en un genoma. Los modelos de gen más precisos se construyeron manualmente usando secuencias de proteina GH7 conocidas múltiples como una guía.

Ejemplo 2 : Extracción de ADN genómico de Talaromyces leycettanus Cepa CBS398.68 Para generar ADN genómico para amplificación por PCR, Talaromyces leycettanus Cepa CBS398.68 se propagó %n las placas de agar PDA creciendo a 26°C por 7 días. Las esporas recolectadas de las placas de PDA se usaron para inocular 25 mi de medio de glucosa YP+2% en un matraz sacudido aforado e incubó a 30°C por 72 horas con agitación a 85 rpm.

El ADN genómico se aisló de conformidad con un protocolo de kit modificado DNeasy Plant Maxi (Qiagen Danmark, Copenhagen, Denmark) . El material fúngico a partir del cultivo anterior se recolectó por filtración a 14,000 x g por 2 minutos. El sobrenadante se removió y 0.5 g de la pelotilla se congelaron en nitrógeno liquido con arena de cuarzo y se trituró a un polvo fino en un mortero pre-enfriado. El polvo se transfirió a un tubo centrifugo de 15 mi y agregó 5 mi de amortiguador API (precalentó a 65 °C) y 10 µ? de solución base RNase A (100 mg/ml) seguido por sacudimiento vigoroso. Después de la incubación por 10 minutos a 65 °C con inversión regular del tubo, 1.8 mi de amortiguador AP2 se agregaron al lisado por mezclado uniforme seguido por incubación en hielo por 10 min. El lisado se centrifugó entonces a 3000 x g por 5 minutos a temperatura ambiente y el sobrenadante se decantó en una columna de centrifugación QIAshredder maxi colocada en un tubo de recolección de 50 mi. Esto se siguió por centrifugación a 3000 x g por 5 minutos a temperatura ambiente. El flujo que pasa se transfirió en un nuevo tubo de 50 mi y se agregaron 1.5 volúmenes de amortiguador AP3/E seguido por sacudimiento. 15 mi de la muestra se transfirieron en una columna de centrifugación DNeasy Maxi colocada en un tubo de recolección de 50 mi y se centrifugó a 3000 x g por 5 minutos a temperatura ambiente. El flujo que pasa se desechó y 12 mi de amortiguador A se agregaron a la columna de centrifugación DNeasy Maxi colocada en un tubo de recolección de 50 mi y se centrifugó a 3000 x g por 10 minutos a temperatura ambiente. Después de desechar el flujo que pasa, la centrifugación se repitió para disponer del alcohol restante. La columna de centrifugación DNeasy Maxi se transfirió a un nuevo tubo de 50 mi y se agregaron 0.5 mi de amortiguador AE (precalentó a 70°C) . Después de la incubación por 5 minutos a temperatura ambiente, la muestra se eluyó por centrifugación a 3000 x g por 5 minutos a temperatura ambiente. La elución se repitió con unos 0.5 mi adicionales de amortiguador AE y los eluatos se combinaron. La concentración del ADN recolectado se midió por un espectrofotómetro a 260 nm.

Ejemplo 3: Construcción de un vector de expresión de Aspergillus oryzae que contiene la secuencia genómica de Talaromyces leycettaxms Cepa CBS398.68 que codifica un polipéptido de la Familia GH7 que tiene actividad celobiohidrolasa Dos cebadores de oligonucleótido sintético mostrados abajo se diseñaron para amplificar por PCR al' gen de Talaromyces leycettanus Cepa CBS398.68 P23YSY a partir del ADN genómico preparado en el Ejemplo 2. Se usó un Kit de Clonación IN-FUSION™ (BD Biosciences, Palo Alto, CA, USA) para clonar el fragmento directamente en el vector de expresión pDaul09 (documento WO 2005/042735) .

F-P23YSY 5' -ACACAACTGGGGATCCACCATGGCCAGCCTCTTCTCTTTCA-3 ' (SEC ID NO: .5) R-P23YSY 5 ' -CCCTCTAGATCTCGAGGTCCTCCCCGTTAGGGACAA-3 ' (SEC ID NO: 6) Las letras negritas representan la secuencia del gen. La secuencia subrayada es homologa a los sitios de inserción de pDaul09.

Un motor de ADN MJ Research PTC-200 se usó para realizar la reacción de PCR. Un kit de PCR de alta fidelidad Phusion® (Finnzymes Oy, Espoo, Finland) se usó para la amplificación por PCR. La reacción de PCR está compuesta de 5 µ? de amortiguador HF 5X (Finnzymes Oy, Espoo, Finland), 0.5 µ? de dNTPs (10 mM) , 0.5 µ? de polimerasa de ADN Phusion® (0.2 unidades/µ?) (Finnzymes Oy, Espoo, Finland), 1 µ? de cebador F-P23YSY (5 µ?) , 1 µ? de cebador R-P23YSY (5 µ?) , 0.5 µ? de ADN genómico de Talaromyces leycettanus (100 ng/µ?) , y 16.5 µ? de agua desionizada en un volumen total de 25 µ? . Las condiciones de PCR fueron 1 ciclo a 95°C por 2 minutos. 35 ciclos cada uno a 98°C por 10 segundos, 60°C por 30 segundos, y 72°C por 2 minutos; y 1 ciclo a 72°C por 10 minutos. La muestra entonces se mantuvo a 12°C hasta removerla de la máquina de PCR.

Los productos de reacción se aislaron por 1.0% de electroforesis en gel de agarosa usando 40 mM de base Tris, 20 mM de acetato de sodio, 1 mM de amortiguador de EDTA disódico (TAE) donde una banda de producto de 1657 pb' se escindió del gel y purificó usando un Kit de Purificación de Banda de Gel y ADN por PCR illustra GFX® (GE Healthcare Life Sciences, Brondby, Denmark) de conformidad con las instrucciones del fabricante. El fragmento entonces se clonó en pDaul09 digerido con Bam HI y Xho I usando un Kit de Clonación IN-FUSION™ resultando en el plásmido pP23YSY. La clonación del gen P23YSY en pDaul09 digerido con Bam HI-X o I resultó en la transcripción del gen de Talaromyces leycettanus P23YSY bajo el control de un promotor doble NA2-tpi. El NA2-tpi es un promotor modificado a partir del gen que codifica la alfa-amilasa neutral de Aspergillus niger en la cual el lider no traducido a ha sido reemplazado por un líder no traducido a partir del gen que codifica la triosa fosfato isomerasa de Aspergillus nidulans .

Se realizó el protocolo de clonación de conformidad con las instrucciones del Kit de Clonación IN-FUSION™ generando un constructo P23YSY GH7. El plásmido tratado e inserto se transformaron en células de E. coli químicamente competentes One Shot® TOP10F (Invitrogen, Carlsbad, CA, USA) de conformidad con el protocolo del fabricante y colocaron en placas LB suplementadas con 0.1 mg de ampicilina por mi. Después de la incubación a 37 °C durante la noche, las colonias fueron vistas crecer bajo selección en las placas de ampicilina LB. Cuatro colonias transformadas con1 el constructo P23YSY GH7 se cultivaron en medio LB suplementado con 0.1 mg de ampicilina por mi y el plásmido se aisló con un Kit Miniprep Spin QIAprep (QIAGEN Inc., Valencia, CA, USA) de conformidad con el protocolo del fabricante.

Los plásmidos aislados fueron secuenciados con cebadores del vector y cebadores específicos del gen P23YSY con el fin de determinar un clon de expresión de plásmido representativo que está libre de errores de PCR.

Ejemplo 4: Caracterización de la secuencia genómica de Talaromyces leycettanus CBS398.68 que codifica un polipéptido P23YSY GH7 (SEC ID NO: 4) que tiene actividad celobiohidrolasa El secuenciamiento de ADN del clon genómico de Talaromyces leycettanus CBS398.68 P23YSY GH7 se realizó con un Secuenciador de ADN Automatizado Applied Biosystems Modelo 3700 usando la química terminadora versión 3.1 de BIG-DYE™ (Applied Biosystems, Inc., Foster City, CA, USA) y estrategia de marcha de cebador. Los datos de secuencia de nucleótido se escrutinizaron para determinar la calidad y todas las secuencias se compararon entre sí con la ayuda de- software PHRED/PHRAP (University of Washington, Seattle, WA, USA) . La secuencia obtenida fue idéntica a la secuencia del BGI.

La secuencia de nucleótido y secuencia de aminoácido deducida del gen de Talaromyces leycettanus P23YSY se muestra en la SEC ID NO: 3 y SEC ID NO; 4, respectivamente. La secuencia codificante es de 1599 pb incluyendo el codón de detención. La proteina pronosticada codificada es de 532 aminoácidos. Usando el programa SignalP (Nielsen et al., 1997, Protein Engineering 10:1-6), se predijo un péptido señal de 25 residuos. La proteina madura pronosticada contiene 507 aminoácidos con una masa molecular pronosticada de 53 kDa y un pH isoeléctrico de 4.31.

Una alineamiento global en forma de pares comparativo de secuencias de aminoácido se determinó usando el algoritmo de Needleman y Wunsch (Needleman and unsch, 1970, J. Mol. Biol. 48: 443-453) con una penalización de apertura de hueco de 10, penalización de extensión de hueco de 0.5, y la matriz EBLOSUM62. El alineamiento mostró que la secuencia de aminoácido deducida del gen de Talaromyces leycettanus que codifica el polipéptido P23YSY GH7 que tiene actividad celobiohidrolasa porta 78.3% de identidad (excluyendo huecos) a la secuencia de aminoácido deducida de una proteina de la familia GH7 pronosticada de Aspergillus fumigatus (número de acceso GENESEQP : AZH96970 ) con actividad celobiohidrolasa .

Ejemplo 5: Expresión de la celobiohidrolasa P23YSY de Talaromyces leycettanus GH7 El plásmido de expresión pP23YSY se transformó en Aspergillus oryzae MT3568. Aspergillus oryzae MT3568 es un derivado alterado de AMDS (acetamidasa ) de JaL355 (documento WO 2002/40694) en el cual la auxotrofia de pyrG se restauró en el proceso de bloqueamiento del gen de acetamidasa de A. oryzae. Los protoplastos MT3568 se prepararon de conformidad con el método de la Patente Europea, EP0238023, páginas 14-15, las cuales se incorporan en la presente por referencia.

Los transformantes se purificaron en placas de selección de sacarosa COVE a través de conidios únicos previo a la esporulación de los mismos en placas de PDA. La producción del polipéptido de Talaromyces leycettanus GH7 por los transformantes se analizó a partir de sobrenadantes de cultivo de cultivaciones estacionarias de 96 cavidades profundas de 1 mi a 30 °C en medio de glucosa YP+2%. La expresión se verificó en un gel de 40 cavidades SDS-PAGE de E-Page al 8% (Tnvitrogen, Carlsbad, CA, USA) por teñido de Coomassie. Un transformante se seleccionó para trabajo adicional y designó Aspergillus oryzae 80.8.

Para producción a gran escala, esporas' de Aspergillus oryzae 80.8 se dispersaron sobre una placa; '. PDA e incubaron por cinco días a 37°C. La placa de esporas confluente se lavó dos veces con 5 mi de 0.01 % de TWEEN® 20 para maximizar el número de esporas recolectadas. La suspensión de esporas entonces se usó para inocular veinticinco matraces de 50 mi que contienen 100 mi de medio Dap-4C. El cultivo se incubó a 30°C con sacudimiento constante a 100 rpm. A cuatro días posteriores a la inoculación, el caldo del cultivo se recolectó por filtración a través de un filtro PES de 0.2 µp? de tapa de botella F75 Supor MachV (Thermos Fisher Scientific, Roskilde, Denmark) . El caldo de cultivo fresco de este transformante produce una banda de proteína GH7 de aproximadamente 72 kDa. La identidad de esta banda como el polipéptido de Talaromyces leycettanus GH7 se verificó por secuenciamiento peptidico.

Ejemplo 6: Método alternativo para producir la celobiohidrolasa P23YSY de Talaromyces leycettanus GH7 Con base en la secuencia de nucleótido identificada como SEC ID NO: 3, se puede obtener un gen sintético a partir de un número de vectores tales como Gene Art (GENEART AG BioPark, Josef-Engert-Str . 11, 93053, Regensburg, Germany) o ADN 2.0 (DNA2.0, 1430 O'Brien Drive, Suite E, Menlo Park, CA 94025, USA) . El gen sintético puede ser diseñado para incorporar secuencias de ADN adicionales tales como sitios de restricción o regiones de recombinación homologa para facilitar la clonación en un vector de expresión.

Usando los dos cebadores de oligonucleótido sintético F-P23YSY y F-P23YSY descritos anteriormente, se puede usar una reacción de PCR simple para amplificar el marco lector abierto de longitud completa a partir del gen sintético. El gen puede entonces ser clonado en un vector de expresión por ejemplo como se describe anteriormente y expresado en una célula hospedera, por ejemplo en Aspergillus oryzae como se describe anteriormente.

Ejemplo 7: Purificación de la celobiohidrolasa P23YSY de Talaromyces leycettanus GH7 1000 mi de caldo de la cepa de expresión de Aspergillus oryzae 80.8 se ajustaron a pH 7.0 y filtraron en filtro PES de 0.22 µ?? (Thermo Fisher Scientific, Roskilde, Denmark) . Después, a lo filtrado se agregó 1.8 M de sulfato de amonio. Lo filtrado se cargó en una columna de Flujo Rápido de Fenilo Sepharose™ (sub alto) (GE Healthcare, Piscataway, NJ, USA) (con un volumen de columna de 60 mL) equilibrado con 1.8 M de sulfato de amonio a pH 7.0. Después de la aplicación la columna se lavó con 3 volúmenes de columna de amortiguador de equilibrio seguido por 7 volúmenes de columna de fosfato de amonio 1M (la proteina se mantuvo unida a la columna) y la proteina se eluyó después con 5 volúmenes de columna de 25 mM de HEPES a pH 7.0 a una velocidad de flujo de 15 ml/min. Las fracciones de 10 mL se recolectaron y analizaron por SDS-page. Las fracciones se combinaron y aplicaron a una columna G-25 (medio) de Sephadex™ (GE Healthcare, Piscataway, NJ, USA) equilibrada en 25 mM de HEPES pH 7.0. Las fracciones se aplicaron a una columna 15Q de SOURCE™ (GE Healthcare, Piscataway, NJ, USA) equilibrada en 25 mM de HEPES pH 7.0 (volúmenes de columna 60 mL) . Después de la aplicación la columna se lavó con 3 volúmenes de columna de equilibrio de amortiguador y las proteínas unidas se eluyeron con un gradiente lineal sobre 10 volúmenes de columna de 0-500 mM de cloruro de sodio. Las fracciones de 10 mi se recolectaron y analizaron por SDS-page, y las fracciones con la proteina se trazaron. La concentración de la proteina se determinó por absorbancia de A280/A260.

Ejemplo 8: Ensayo de hidrólisis de rastrojo de maíz pretratado El rastrojo de maíz se pretrató en el Laboratorio Nacional de Energía Renovable del Departamento de Energía Estadounidense (NREL, por sus siglas en inglés) usando 1.4% en peso de ácido sulfúrico a 165°C y 107 psi 7.52 kg/cm2) por 8 minutos. Los sólidos insolubles en agua en el rastrojo de maíz pretratado (PCS) contienen 56.5% de celulosa, 4.6% de hemicelulosa y 28.4% de lignina. La celulosa y hemicelulosa se determinaron por una hidrólisis de ácido sulfúrico de dos etapas con análisis subsecuente de azúcares por cromatografía líquida de alta resolución usando el Procedimiento Analítico Estándar de NREL #002. La lignina se determinó gravimétricamente después de hidrolizar las fracciones de celulosa y hemicelulosa con ácido sulfúrico usando el Procedimiento Analítico Estándar de NREL #003.

PCS (PCS de suspensión completa) no lavados, no triturados, se prepararon ajustando el pH de PCS a 5.0 por adición de 10M de NaOH con mezclado extensivo, y después sometimiento a autoclave por 20 minutos a 120°C. El peso seco de PCS de suspensión completa fue 29%. El PCS se usó no lavado o lavado con agua. El PCS no lavado triturado (peso seco 32.35%) se preparó moliendo todo el PCS de suspensión en un triturador multi-utilidad húmedo Cosmos ICMG 40 (EssEmm Corporation, Tamil Nadu, India) . El PCS lavado molido (peso seco 32.35%) se preparó en la misma manera, con lavado subsecuente con agua desionizada y se decantó la fracción de sobrenadante repetidamente.

La hidrólisis del PCS se condujo usando placas de cavidad profunda de 2.2 mi (Axygen, Union City, CA, USA) en un volumen de reacción total de 1.0 mi. La hidrólisis se realizó con 50 mi de sólidos PCS insolubles por mi de 50 mM de amortiguador de acetato de sodio a pH 5.0 que contiene 1 mM de sulfato de manganeso y varias cargas de proteina de varias composiciones enzimáticas (expresadas como mg de proteina por gramo de celulosa) . Se prepararon composiciones enzimáticas y después agregaron .simultáneamente a todas las cavidades en un volumen que varia desde 50 µ? hasta 200 µ?, para un volumen final de 1 mi en cada reacción. La placa entonces se selló usando un sellador por calor de placa ALPS-300™ (Abgene, Epsom, United Kingdom) , se mezcló completamente, e incubó a una temperatura especifica por 72 horas. Todos los experimentos reportados se realizaron por triplicado.

Después de la hidrólisis, las muestras se filtraron usando una placa de filtro de 96 cavidades de 0.45 pm MULTISCREEN® (Millipore, Bedford, A, USA) y los filtrados se analizaron para determinar el contenido de azúcar corno se describe abajo. No se usaron inmediatamente, las alícuotas filtradas se congelaron a -20°C. Las concentraciones de azúcar de las muestras diluidas en 0.005 M de H2S04 se midieron usando una columna HPX-87H de 4.6 x 250 mm de AMINEX® (Bio-Rad Laboratories, Inc., Hercules, CA, USA) por elución con 0.05% en p/p de ácido benzoico -0.005 M de H2SO4 a 65°C a una velocidad de flujo de 0.6 mi por minuto, y cuantificación por integración de la glucosa, celobiosa, y señales de xilosa a partir de la detección del índice de refracción (CHEMSTATION®, AGILENT® 1100 HPLC, Agilent Technologies, Santa Clara, CA, USA) calibrado por muestras de azúcar puro. Los equivalentes de glucosa y celobiosa resultantes se usaron para calcular el porcentaje de conversión de celulosa para cada reacción.

La glucosa, celobiosa y xilosa se midieron individualmente. Las concentraciones de azúcar medida se ajustaron por el factor de dilución apropiado. Las concentraciones puras de los azúcares enzimáticaméhte producidos de PCS no lavados se determinaron ajusfando las concentraciones de azúcar medida por las concentraciones de azúcar antecedente correspondientes en PCS no lavados en punto de tiempo cero. Todos los procesamientos de datos de HPLC se realizaron usando software MICROSOFT EXCEL™ (Microsoft, Richland, WA, USA) .

El grado de conversión de celulosa a glucosa se calculó usando la siguiente ecuación: i de conversión = (concentración de glucosa/concentración de glucosa en una digestión limite) x 100. Con el fin de calcular el % de conversión, un punto de conversión de 100% se ajustó con base en un control de celulasa (100 mg de celulasa de Trichoderma reesei por gramo de celulosa) , y todos los valores se dividieron por este número y después multiplicaron por 100. Los puntos de datos triplicados se promediaron y se calculó la desviación estándar.

Ejemplo 9: Preparación de una composición de enzima Preparación de celobiohidrolasa II de Aspergillus fumigatus NN055679. La celobiohidrolasa II de Aspergillus fumigatus GH6A (SEC ID NO: 7 [Secuencia de ADN] y SEC ID NO: 8 [secuencia de aminoácido deducida] ) se prepararon recombinantemente en Aspergillus oryzae como se describe en el documento WO 2011/057140. El caldo filtrado de celobiohidrolasa II de Aspergillus fumigatus GH6A se intercambió de amortiguador en 20 mM de Tris pH 8.0 usando una columna G-25 de 400 mi de SEPHADEX™ (GE Healthcare, United Kingdom) de conformidad con las instrucciones del fabricante. Las fracciones se combinaron y ajustaron a 1.2 M de sulfato de amonio-20 mM de Tris a pH 8.0. La proteina equilibrada se cargó en una columna de Flujo Rápido de PHENYL SEPHAROSE™ 6 (alto sub) (GE Healthcare, Piscataway, NJ, USA) equilibrada en 20 mM de Tris a pH 8.0 con 1.2 M de sulfato de amonio, y las proteínas unidas se eluyeron con 20 mM de Tris a pH 8.0 sin sulfato de amonio. Las fracciones se combinaron. La concentración de proteína se determinó usando un Kit de Ensayo de Proteína de Microplaca BCA™ con albúmina de suero bovino como una proteína estándar.

Preparación de polipéptido de Penicillium sp. (emersonii) GH61A que tiene actividad potenciadora celulolítica . El polipéptido de Penicillium sp. (emersonii) GH61A (SEC ID NO: 9 [Secuencia de ADN] y SEC ID NO: 10 [secuencia de aminoácido deducida] ) se preparó recombinantemente de conformidad con el documento WO 2011/041397. El polipéptido de Penicillium sp. (emersonii) GH61A se purificó de conformidad con el documento WO 2011/041397.

Preparación de endoglucanasa II de Tríchoderma reesei GH5. La endoglucanasa II de Tríchoderma reesei GH5 (SEC ID NO: 11 [Secuencia de ADN] y SEC ID NO: 12 [secuencia de aminoácido deducida] ) se preparó recombinantemente de conformidad con el documento WO 2011/057140 usando Aspergillus oryzae como un hospedero. El caldo filtrado1 de la endoglucanasa II de Tríchoderma reesei GH5 se desaló e intercambió el amortiguador en 20 mM de Tris a pH 8.0 usando flujo tangencial (membrana 10K, Pall Filtron, Northborough, A, USA) de conformidad con las instrucciones del fabricante.

Preparación de xilanasa dé Aspergillus fumigatus NN055679 GH10. La xilanasa de Aspergillus fumigatus GH10 (xyn3) (SEC ID NO: 13 [Secuencia de ADN] y SEC ID NO: 14 [secuencia de aminoácido deducida] ) se preparó recombinantemente de conformidad con el documento WO 2006/078256 usando Aspergillus oryzae BECh2 (documento WO 2000/39322) como un hospedero. El caldo filtrado de xilanasa (xyn3) de Aspergillus fumigatus NN055679 GH10 se desaló e intercambió amortiguador en 50 mM de acetato de sodio a pH 5.0 usando una Columna de Desalación HIPREP® 26/10 (GE Healthcare, Piscataway, NJ, USA) de conformidad con las instrucciones del fabricante.

Preparación de beta-glucosidasa de Aspergillus fumigatus NN055679 Cel3A (SEC ID NO: 15 [Secuencia de ADN] y SE CID NO: 16 [secuencia de aminoácido deducida]) se preparó recombinantemente de conformidad con el documento WO 2005/047499 usando Aspergillus oryzae como un hospedero. El caldo filtrado se ajustó a pH 8.0 con 20% de acetato de sodio, el cual hizo a la solución turbia. Para eliminar la turbidez, la solución se centrifugó (20000 x g, 20 minutos) , y el sobrenadante se filtró a través de una unidad de filtración de 0.2 pm (Nalgene, Rochester, NY, USA). Lo filtrado se diluyó con agua desionizada para alcanzar la misma conductividad como 50 mM de Tris/HCl, pH 8.0. La solución de enzima ajustada se aplicó a una columna de Flujo Rápido de Q SEPHAROSE™ (GE Healthcare, Piscataway, NJ, USA) equilibrada en 50 mM de Tris-HCl, pH 8.0 y eluida con un gradiente lineal de 0 a 50 mM de cloruro de sodio. Las fracciones se combinaron y trataron con 1 % (p/v) de carbono activado para remover el color de la combinación de beta-glucosidasa. El carbono se eliminó por filtración de la suspensión a través de una unidad de filtración de 0.2 pm (Nalgene, Rochester, NY, USA). Lo filtrado se ajustó a pH 5.0 con 20% de ácido acético y diluyó 10 veces con agua desionizada. Lo filtrado ajustado se aplicó a una columna de Flujo Rápido de SP SEPHAROSE™ (GE Healthcare, Piscataway, NJ, USA) equilibrada en 10 mM de ácido succinico, pH 5.0 y eluyó con un gradiente lineal de 0 a 500 mM de cloruro de sodio.

Preparación de beta-xilosidasa de Aspergillus fumigatus NN051616 GH3. La beta-xilosidasa de Aspergillus fumigatus GH3 (SE CID NO: 17 [Secuencia de ADN] y SE CID NO: 18 [secuencia de aminoácido deducida]) se preparó recombinantemente en Aspergillus oryzae como se describe en el documento WO 2011/057140. El caldo filtrado de beta-xilosidasa de Aspergillus fumigatus NN051616 GH3 se desaló e intercambió de amortiguador en 50 mM de acetato de sodio pH 5.0 usando una Columna de Desalación HIPREP® 26/10 (GE Healthcare, Piscataway, NJ, USA) de conformidad con las instrucciones del fabricante.

La concentración de proteina para cada uno de los monocomponentes descritos anteriormente se determinó usando un Kit de Ensayo de Proteina de Microplaca BCA™ (Thermo Fischer Scientific, Waltham, MA, USA) en el cual la albúmina de suero bovino se usó como una proteina estándar. Una composición enzimática está compuesta de cada monocomponente, preparado como se describe anteriormente, como sigue: 25% de celobiohidrolasa II de Aspergillus fumigatus Cel6A, 15% de polipéptido de Penicillium emersonii GH61A que tiene actividad potenciadora celulolitica, 10% de endoglucanasa II de Trichoderma reesei GH5, 5% de xilanasa de Aspergillus fumigatus GH10, 5% de beta-glucosidasa de Aspergillus fumigatus, y 3% de beta-xilosidasa de Aspergillus fumigatus . La composición enzimática es designada en la presente como "composición enzimática sin celobiohidrolasa".

Ejemplo 10: Preparación de celobiohidrolasa I de Aspergillus fumigatus La celobiohidrolasa I de Aspergillus fumigatus GH7A (SE CID NO: 19 [Secuencia de ADN] y SE CID NO: 20 [secuencia de aminoácido deducida] ) se preparó recombinantemente en Aspergillus oryzae como se describe en el documento O 2011/057140. El caldo filtrado de la celobiohidrolasa I de Aspergillus fumigatus GH7A se concentró e intercambió de amortiguador usando un concentrador de flujo tangencial (Pall Filtron, Northborough, MA, USA) equipado con una membrana de poliétersulfona de 10 kDa (Pall Filtron, Northborough, MA, USA) con 20 mM de Tris-HCl a pH 8.0. El caldo desalado de celobiohidrolasa I de Aspergillus fumigatus GH7A se purificó sobre una columna de cromatografía de intercambio iónico de Q SEPHAROSE™ (GE Healthcare, Piscataway, NJ, USA)) en 20 mM de Tris-HCl a pH 8 , sobre un gradiente lineal de NaCl de 0 a 1 M. Las fracciones se recolectaron y las fracciones que contienen la celulasa de celobiohidrolasa I se combinaron con base en el SDS-PAGE libre de teñido al 8-16% de CRITERION® (Bio-Rad Laboratories, Inc., Hercules, CA, USA). La concentración de proteína se determinó usando un Kit de Ensayo de Proteína de Microplaca BCA™ en el cual la albúmina de suero bovino se usó como un estándar de proteína .

Ejemplo 11: Efecto de celobiohidrolasa I (P23YSY) de la Familia GH7 de Tala.romy. ces leycettanus en la hidrólisis de PCS no lavado triturado a 50-65° C por una composición enzimática .

La celobiohidrolasa I (P23YSY) de la Familia GH7 de Talaromyces leycettanus se evaluó en una composición enzimática sin celobiohidrolasa I a 50°C, 55°C, 60°C, y 65°C usando PCS no lavado triturado como un sustrato. La composición enzimática sin celobiohidrolasa I (Ejemplo 9) se agregó a reacciones de hidrólisis de PCS a 1.9 mg de proteína total por g de celulosa, y los resultados de hidrólisis se compararon con los resultados para una composición enzimática similar con y sin celobiohidrolasa I de GH7 agregada (3.0 mg de proteína por g de celulosa).

El ensayo se realizó como se describe en el Ejemplo 8. Las reacciones de 1 mi con PCS no lavado molido (5% de sólidos insolubles) se condujeron por 72 horas en 50 mM de amortiguador de acetato de sodio a pH 5.0 que contiene 1 mM de sulfato de manganeso. Todas las reacciones se realizaron por triplicado e involucran mezclado único al comienzo de la hidrólisis.

Como se muestra en la Tabla 1, abajo, la composición enzimática que incluye la celobiohidrolasa I (P23YSY) de la Familia GH7 de Talaromyces leycettanus supera significantemente la composición enzimática sin celobiohidrolasa I (1.9 mg proteina/g de celulosa y 3.0 mg de proteína/g de celulosa) a 50°C, 55°C, 60°C, y 65°C (como el grado de conversión de celulosa a glucosa para celobiohidrolasa (P23YSY) de la Familia GH7 de Talaromyces leycettanus fue superior que la composición enzimática que contiene la celobiohidrolasa I de la Familia GH7 de Aspergillus fumigatus a 50°C, 55°C, 60°C, y 65°C) . Los resultados en la Tabla 1, abajo, muestran que la composición enzimática que incluye celobiohidrolasa I (P23YSY) de la Familia GH7 de Talaromyces leycettanus se desempeñó ligeramente mejor que la composición enzimática que incluye la celobiohidrolasa I de la Familia GH7 de Aspergillus fumigatus a 50°C y superó la celobiohidrolasa I de la Familia GH7 de Aspergillus fumigatus a 55°C, 60°C, y 65°C.

Tabla 1.

Ejemplo 12 : Evaluación de dos celobiohidrolasas I en PCS lavadas trituradas a 50-65°C Se evaluaron dos celobiohidrolasas I a 1 mg de proteina por g de celulosa a 50°C, 55°C, 60°C, y 65°C usando PCS lavado triturado como un sustrato con 1 mg de proteina por g de celulosa de beta-glucosidasa de la Familia GH3 de Aspergillus fumigatus . Las siguientes celobiohidrolasas · I se probaron: celobiohidrolasa I (P23YSY) de Talaromyces leycettanus GH7 y celobiohidrolasa I de Aspergillus fumigatus GH7A.

El ensayo se realizó como se describe en el Ejemplo 8. Las reacciones de 1 mi con PCS lavado triturado (5% de sólidos insolubles) se condujeron por 72 horas en 50 mM de amortiguador de acetato de sodio a pH 5.0 que contiene 1 mM de sulfato de manganeso. Todas las reacciones se realizaron por triplicado e involucraron mezclado único al comienzo de la hidrólisis.

Los resultados mostrados en la Tabla 2, abajo, demuestran que a 50°C, 55°C, 60°C, y 65°C la celobiohidrolasa I (P23YSY) de Talaromyces leycettanus GH7 tiene conversión significantemente superior de celulosa a glucosa que aquella de la celobiohidrolasa I de Aspergillus fumigatus GH7.

Tabla 2.

Se hace constar que con relación a esta fecha, el mejor método conocido por la solicitante para llevar a la práctica la citada invención, es el que resulta claro de la presente descripción de la invención.

Claims (26)

REIVINDICACIONES Habiéndose descrito la invención como antecede se reclama como propiedad lo contenido en las siguientes reivindicaciones :

1. Un polipéptido aislado caracterizado porque tiene actividad celobiohidrolasa, seleccionado del grupo que consiste de: (a) un polipéptido que tiene al menos 84%, por ejemplo, al menos 85%, al menos 86%, al menos 87%, al menos 88%, al menos 89%, al menos 90%, al menos 91 %, al menos 92%, al menos 93%, al menos 94%, al menos 95%, al menos 96%, al menos 97%, al menos 98%, al menos 99%, o 100% de identidad de secuencia al polipéptido maduro de SEC ID NO: 2, o un polipéptido que tiene al menos 81%, por ejemplo, al menos 82%, al menos 83%, al menos 84%, al menos 85%, al menos 87%, al menos 90%, al menos 91%, al menos 92%, al menos 93%, al menos 94%, al menos 95%, al menos 96%, al menos 97%, al menos 98%, al menos 99%, o 100% de identidad de secuencia al polipéptido maduro de SEC ID NO: 4 ; (b) un polipéptido codificado por un polinucleótido que híbrida bajo condiciones de baja rigurosidad, o condiciones de media rigurosidad, o condiciones de media-alta rigurosidad, o condiciones de alta rigurosidad, o condiciones de muy alta rigurosidad con (i) la secuencia codificante del polipéptido maduro de SEC ID NO: 1, o SEC ID NO: 3, (ii) la secuencia de cADN del mismo, o (iii) el complemento de longitud completa de (i) o (ii) ; (c) un polipéptido codificado por un polinucleótido que tiene al menos 60%, por ejemplo, al menos 65%, al menos 70%, al menos 75%, al menos 80%, al menos 85%, al menos 85%, al menos 90%, al menos 91%, al menos 92%, al menos 93%, al menos 94%, al menos 95%, al menos 96%, al menos 97%, al menos 98%, al menos 99%, o 100% de identidad de secuencia con la secuencia codificante del polipéptido maduro de SEC ID NO: 1, o SEC ID NO: 3; o la secuencia de cADN del mismo; (d) una variante del polipéptido maduro de SEC ID NO: 2, o SEC ID NO: 4 que comprende una sustitución, supresión, y/o inserción en una o más posiciones; y (e) un fragmento del polipéptido de (a) , (b) , (c) , o (d) que tiene actividad celobiohidrolasa .

2. El polipéptido de conformidad cqn la reivindicación 1, caracterizado porque tiene al menos 84%, al menos 85%, al menos 86%, al menos 87%, al menos 88%,. al. menos 89%, al menos 90%, al menos 91%, al menos 92%, al menos 93%, al menos 94%, al menos 95%, al menos 96%, al menos 97%, al menos 98%, al menos 99% o 100% de identidad de secuencia con el polipéptido maduro de SEC ID NO: 2, o al menos 81%, al menos 82%, al menos 83%, al menos 84%, al menos 85%, al menos 87%, al menos 90%, al menos 91%, al menos 92%, al menos 93%, al menos 94%, al menos 95%, al menos 96%, al menos 97%, al menos 98%, al menos 99%, o 100% de identidad de secuencia con el polipéptido maduro de SEC ID NO: 4.

3. El polipéptido de conformidad con la reivindicación 1 o 2, caracterizado porque comprende o consiste de SEC ID NO: 2, o SEC ID NO: 4 o el polipéptido maduro de SEC ID NO: 2, o SEC ID NO: 4.

4. El polipéptido de conformidad con la reivindicación 3, caracterizado porque el polipéptido maduro es aminoácidos 26 a 532 de SEC ID NO: 2, o aminoácidos 26 a 532 de SEC ID NO: 4.

5. El polipéptido de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado porque es un fragmento de SEC ID NO: 2, o SEC ID NO: 4, en donde el fragmento tiene actividad celobiohidrolasa .

6. Un polipéptido aislado caracterizado porque comprende un dominio catalítico seleccionado del grupo que consiste de: (a) un dominio catalítico que tiene al menos 60% de identidad de secuencia con el dominio catalítico de SEC ID NO: 2 o SEC ID NO: 4; (b) un dominio catalítico codificado por un polinucleótido que tiene al menos 60% de identidad de secuencia con la secuencia codificante de dominio catalítico de SEC ID NO: 1 o SEC ID NO: 3 ; (c) una variante de dominio catalítico que comprende una sustitución, supresión, y/o inserción de uno o más (varios) aminoácidos del dominio catalítico de SEC ID NO: 2 o SEC ID NO: 4; y (d) un fragmento de un dominio catalítico de (a) , (b) , o (c), el cual tiene actividad celobiohidrolasa .

7. El polipéptido de conformidad con la reivindicación 6, caracterizado porque comprende o consiste del dominio catalítico de SEC ID NO: 2 o SEC ID NO: 4.

8. El polipéptido de conformidad con la reivindicación 7, caracterizado porque el dominio catalítico es aminoácidos 26 a 460 de SEC ID NO: 2 o aminoácidos 26 a 459 de SEC ID NO: 4.

9. El polipéptido de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 6-8 , caracterizado porque además comprende un dominio de enlace de celulosa.

10. Una composición caracterizada porque comprende el polipéptido de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1-9.

11. Un polinucleótido aislado caracterizado porque codifica el polipéptido de conformidad con cualquiera de las modalidades 1-9.

12. Un vector de expresión o constructo de ácido nucleico caracterizado porque comprende el polinucleótido de conformidad con la reivindicación 11, operativamente enlazado a una o más secuencias de control que dirigen la producción del polipéptido en un huésped de expresión.

13. Una célula huésped recombinante caracterizada porque comprende el polinucleótido de conformidad con la reivindicación 11, operativamente enlazado a una o más secuencias de control que dirigen la producción del polipéptido .

14. Un método para producir un polipéptido que tiene actividad celobiohidrolasa, caracterizado porque comprende: (a) cultivar la célula huésped de conformidad con la reivindicación 13, bajo condiciones conducentes para la producción del polipéptido; y (b) recuperar el polipéptido.

15. Un polinucleótido aislado caracterizado porque codifica un péptido señal que comprende o que consiste de aminoácidos 1 a 25 de SEC ID NO: 2, o aminoácidos 1 a 25 de SEC ID NO: 4.

16. Un vector de expresión o constructo de . ácido nucleico caracterizado porque comprende un gen que codifica una proteina operativamente enlazada al polinucleótido de conformidad con la reivindicación 15, en donde el gen es extraño al polinucleótido que codifica el péptido señal.

17. Una célula huésped recombinante caracterizada porque comprende un gen que codifica una proteina operativamente enlazada al polinucleótido de conformidad con la reivindicación 15, en donde el gen es extraño al polinucleótido que codifica el péptido señal.

18. Un método para producir una proteina, caracterizado porque comprende: (a) cultivar una célula huésped recombinante que comprende un gen que codifica una proteina operativamente enlazada al polinucleótido de conformidad con la reivindicación 15, en donde el gen es extraño al polinucleótido que codifica el péptido señal, bajo condiciones conducentes para la producción de la proteina; y (b) recuperar la proteina.

19. Un proceso para degradar un material celulósico, caracterizado porque comprende: tratar el material celulósico con una composición de enzima en la presencia del polipéptido que tiene actividad celobiohidrolasa de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1-9.

20. El proceso de conformidad con la reivindicación 19, caracterizado · porque el material celulósico es pretratado.

21. El proceso de conformidad con la reivindicación 19 o 20, caracterizado porque adicionalmente comprende recuperar el material celulósico degradado.

22. El proceso de conformidad con la reivindicación 21, caracterizado porque el material celulósico degradado es un azúcar.

23. Un proceso para producir un producto de fermentación, caracterizado porque comprende: (a) sacarificar un material celulósico con una composición de enzima en la presencia del polipéptido que tiene actividad celobiohidrolasa de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1-9; (b) fermentar el material celulósico sacarificado con uno o más microorganismos fermentadores para producir el producto de fermentación; y (c) recuperar el producto de fermentación de la fermentación .

24. El proceso de conformidad con la reivindicación 23, caracterizado porgue las etapas (a) y (b) se realizan simultáneamente en una sacarificación y fermentación simultáneas .

25. El proceso de conformidad con las reivindicaciones 23 o 24, caracterizado porque el producto de fermentación es un alcohol, un alcano, un cicloalcano, un alqueno, un aminoácido, un gas, isopreno, una cetona, un ácido orgánico, o policeturo.

26. Un proceso para fermentar un material celulósico, caracterizado porque comprende: fermentar el material celulósico con uno o más microorganismos fermentadores , en donde el material celulósico es sacarificado con una composición de enzima en la presencia del polipéptido que tiene actividad celobiohidrolasa de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1-9.