BRPI0620318B1 - proteína de fusão endoglicanase, polinucleotídeo isolado, vetor de expressão, célula hospedeira de trichoderma reesei, preparação de enzima, composição detergente, cepa de escherichia coli, e processos para produção de um polipeptídeo endoglicanase, para bioestonagem, para bioacabamento, para tratamento de material têxtil contendo fibra celulósica, para tratamento de polpa ou fibra derivada de madeira, e para aperfeiçoamento de qualidade de alimentação animal - Google Patents

Abstract

enzimas. a presente invenção refere-se a novas enzimas celulase, especialmente novas endoglicanases incluindo proteínas de fusão de endoglicanase, preparações e composições contendo estas enzimas endoglicanases e proteínas de fusão, vetores de expressão, células hospedeiras e processos para sua preparação e usos das celulases, preparações e composições em indústrias têxteis, de detergente e polpa e papel.

Description

Relatório Descritivo da Patente de Invenção para PROTEÍNA DE FUSÃO ENDOGLICANASE, POLINUCLEOTÍDEO ISOLADO, VETOR DE EXPRESSÃO, CÉLULA HOSPEDEIRA DE TRICHODERMA REESEI, PREPARAÇÃO DE ENZIMA, COMPOSIÇÃO DETERGENTE, CEPA DE ESCHERICHIA COLI, E PROCESSOS PARA PRODUÇÃO DE UM POLIPEPTÍDEO ENDOGLICANASE, PARA BIOESTONAGEM, PARA BIOACABAMENTO, PARA TRATAMENTO DE MATERIAL TÊXTIL CONTENDO FIBRA CELULÓSICA, PARA TRATAMENTO DE POLPA OU FIBRA DERIVADA DE MADEIRA, E PARA APERFEIÇOAMENTO DE QUALIDADE DE ALIMENTAÇÃO ANIMAL.

Campo da Invenção [001] A presente invenção refere-se a novas enzimas celulase, especialmente novas endoglicanases incluindo proteínas de fusão endoglicanases, preparações e composições contendo estas enzimas endoglicanases e proteínas de fusão, vetores de expressão, células hospedeiras e processos para sua preparação e usos das celulases, preparações e composições nas indústrias têxteis, de detergentes, e polpa e papel. Antecedentes da Invenção [002] Celulose é o principal componente estrutural de plantas superiores e ocorre naturalmente em forma quase pura somente em fibra de algodão. Ela provê células de plantas com alta resistência à tração auxiliando as mesmas a resistirem à tensão mecânica e pressão osmótica. Celulose é um polissacarídeo linear de resíduos de glicose conectados por ligações β-1,4. Na natureza, celulose está usualmente associada com lignina junto com hemiceluloses, tais como xilanos e glicomananos. Enzimas celulolíticas hidrolisam celulose e são produzidas por uma ampla variedade de bactérias e fungos. Celulases são enzimas industrialmente importantes com um atual valor de mercado de cerca de 190 milhões de dólares. Na indústria têxtil , celulases são

Petição 870180143930, de 24/10/2018, pág. 9/24

2/61 usadas em acabamento de denim para criar uma aparência lavada com pedra da moda em roupas de denim em um processo bioestonagem, e elas também são usadas, por exemplo, para limpar flocos e prevenir formação de pills sobre a superfície de peças de roupas de algodão. Na indústria de detergentes celulases são usadas para intensificar cores e para prevenir acinzentamento e pilling de peças de roupas. Celulases são ainda usadas na indústria de alimentos e fabricação de alimentação animal, e elas têm um grande potencial na indústria de polpa e papel, por exemplo, em retirada de tinta para liberar tinta de superfícies de fibra e em aperfeiçoamento de drenagem de polpa. O amplo espectro de usos industriais para celulases estabeleceu uma necessidade de produtos de celulase comerciais contendo diferentes componentes celulase e funcionando otimamente em diferentes faixas de pH e temperatura.

[003] O uso prático de celulases é dificultado pela natureza das composições de celulase conhecidas, que são freqüentemente misturas de enzimas tendo uma variedade de atividades e especificidades de substrato. Por esta razão, foram feitos esforços para obtenção de celulases tendo somente as atividades desejadas. As únicas propriedades de cada celulase tornam algumas mais apropriadas para certos propósitos que outras. Embora as enzimas difiram em um número de maneiras, uma das mais importantes diferenças é o pH ótimo. Celulases neutras são mais ativas na faixa de pH 6-8 e celulases alcalinas na faixa de pH 7,5-10, enquanto celulases ácidas, tendo o pH ótimo em 4,5-5,5, mostram níveis muito baixos de atividade em maiores valores de pH. Celulases neutras e ácidas são especialmente úteis na indústria têxtil. Em tratamento de tecido celulases atacam as cadeias de moléculas de celulose que formam as fibras de algodão, pelo que afetando as características do tecido.

[004] Em indústria têxtil visual lavado à pedra ou um visual

Petição 870170051579, de 21/07/2017, pág. 13/79

3/61 abrasivado tem sido interesse de produtores de denim em anos recentes. Tradicional lavagem com pedra com pedra-pomes reduz a resistência de tecido e sobrecarregam aparelhos. A tendência tem sido na direção de processos enzimáticos de acabamento de denim e celulases substituíram ou estão sendo usadas junto com pedra-pomes para render ao tecido seu desejado visual usado. Tratamentos controlados com enzima resultam em menos dano para as peças de roupa e máquinas e eliminam a necessidade de disposição de pedras.

[005] Adicionalmente, indústria têxtil usa celulases em bioacabamento, isto é, para criação de permanente aperfeiçoamento de retirada de felpa e aperfeiçoada resistência a formação de felpa, estrutura de superfície limpada através de reduzidos flocos, aperfeiçoado manuseio têxtil, tal como maciez, suavidade e uma sensação sedosa, aperfeiçoada capacidade de ornar e cores mais brilhantes do têxtil e aperfeiçoada capacidade de absorção de umidade.

[006] Celulases aplicadas em tratamento de denim são usualmente divididas em dois grupos principais: celulases ácidas e neutras. Celulases ácidas tipicamente operam em pH 4,0-5,5 e as celulase neutras na faixa de pH 6-8. Celulases ácidas usadas em bioestonagem originam-se principalmente de Trichoderma reesei (forma sexual Hypocrea jecorina) e as celulase neutras originam-se de uma variedade de fungos, incluindo gêneros de Melanocarpus, Humicola, Myceliophthora, Fusarium Acremonium, e Chrysosporium (Haakana et al. 2004). Enzimas T.reesei incluem, por exmeplo, celulases da família glicosídeo 5 (endoglicanase II, EGII), família 7 (celobioidrolase I, CBHI) e família 12 (endoglicanase III, EGIII; Ward et al. 1993), e as celulases neutras, mais freqüentemente endoglicanases, da família 45 e família 7 (Henrissdat, 1991; Henrissat and Bairoch, 1993, 1996).

[007] Celulases compreendem um domínio / núcleo catalítico (CD) expressando atividade celulase. Em adição ao domínio catalítico

Petição 870170051579, de 21/07/2017, pág. 14/79

4/61 a molécula de celulase pode compreender um ou mais domínios de ligação de celulose (CBDs), também chamados como domínios / módulos de ligação de carboidrato (CBD/CBM), que podem estar localizados tanto no término N- como C do domínio catalítico. CBDs têm atividade de ligação de carboidrato e eles mediam a ligação da celulase a celulose cristalina mas têm pequeno ou nenhum efeito sobre atividade hidrolítica de celulase da enzima sobre substratos solúveis. Estes dois domínios estão tipicamente conectados via uma região ligante flexível e altamente glicosilada.

[008] Celulases que atacam primariamente sobre a superfície da fibra são especialmente úteis em lavagem com pedras de denim tingido com corantes índigo, à medida que o corante está localizado sobre a superfície da fibra. Quando usadas para tratamento de tecido de algodão, celulases ácidas geralmente requerem um tempo de lavagem mais curto que celulases neutras. Celulases ácidas são especialmente usadas em bioacabamento (retirada de felpa) e também em tratamento de denim (bioestonagem).

[009] Endoglicanases (Egs) em conexão à presente invenção significam enzimas classificadas como E.C. 3.2.1.4 e são um dos três tipos de celulases geralmente necessários para a conversão biológica de celulose a glicose. Endoglicanases cortam ligações beta-1,4glicosídicas internas, enquanto celobioidrolases cortam o dissacarídeo celobiose da extremidade da cadeia de polímero celulose e beta-1,4glicosidases hidrolisam a celobiose e outros celooligossacarídeos à glicose. Algumas endoglicanases ocorrendo naturalmente têm um domínio de ligação de celulose (CBD), enquanto outras não.

[0010] Também endoglicanases são amplamente usadas em indústria têxtil, de detergente, e polpa e papel. Por exemplo, endoglicanases da família cel45 (Egs fam 45) são descritas, por exemplo, na Patente US 6 001 639, que descreve enzimas tendo atividades endo

Petição 870170051579, de 21/07/2017, pág. 15/79

5/61 glicanase e tendo duas seqüências de aminoácidos conservadas. Usos em aplicações têxteis, detergentes, de polpa e papel são genericamente discutidos e tratamento de material ligno-celulósico é mencionado. WO 2004/053039 é direcionado a aplicações detergentes de endoglicanases. A Patente US 5 958 082 mostra o uso de endoglicanase, especialmente de Thielavia terrestris em aplicações têxteis provendo visual lavado com pedra ou abrasivado de jeans de sarja. EP 0495258 refere-se a composições detergentes contendo Humicola cellulase. A Patente U.S. 5 948 672 descreve uma preparação de celulase contendo endoglicanase, especialmente de Humicola e seu uso em aplicações têxteis e de polpa.

[0011] EG:s e composições enriquecidas com EG e concentrados são também comercialmente disponíveis.

[0012] Entretanto, há uma contínua necessidade de celulases aperfeiçoadas, incluindo endoglicanases que são mais eficientes em tratamento de tecido e em outros campos, onde celulases são tradicionalmente usadas. Em particular, há uma contínua necessidade de celulases mais eficientes para aperfeiçoamento de economias de processo.

[0013] A presente invenção objetiva satisfazer esta necessidade. Breve Descrição da Invenção [0014] Um objetivo da presente invenção é prover novas endoglicanases e proteínas de fusão endoglicanases tendo aperfeiçoadas propriedades hidrolíticas para uso em indústria têxtil, especialmente em processos de acabamento de algodão, tal como em retirada de felpa, e lavagem com pedras de denim, e para uso em composições detergentes assim como em outros campos. As novas endoglicanases e proteínas de fusão de endoglicanases da invenção têm a vantagem de serem ativas em valores de pH ácido e neutro, elas têm performance altamente aperfeiçoada em aplicações têxteis de bioacabamento e bi

Petição 870170051579, de 21/07/2017, pág. 16/79

6/61 oestonagem e em aplicações detergentes. Quando usadas no tratamento de materiais têxteis contendo celulose, as novas endoglicanases e proteínas de fusão endoglicanases proporcionam uma sensação suave, aperfeiçoada aparência a maciez assim como permanente retirada de felpa do têxtil. Com a aperfeiçoada eficiência das endoglicanases da invenção, o uso das enzimas é significantemente mais econômico. Adicionais vantagens também são obtidas em termos de logística e a estocagem dos produtos de enzima, quando menores quantidades do produto enzima são necessárias. Além disso, as novas endoglicanases e proteínas de fusão endoglicanases da presente invenção, quando sendo ácidas, atuam mais rapidamente, rendendo procedimentos de tratamento de custo e tempo efetivos e economias em equipamento assim como instalações de tratamento.

[0015] Ainda um objetivo da presente invenção é prover polinucleotídeos codificando as novas endoglicanases e proteínas de fusão endoglicanases da presente invenção.

[0016] Ainda um objetivo da presente invenção é prover nos plasmídeos ou vetores de expressão contendo tais polinucleotídeos, úteis para a produção das novas endoglicanases e proteínas de fusão endoglicanase da presente invenção, assim como novos hospedeiros transformados com os ditos plasmídeos dse expressão.

[0017] Ainda um objetivo da presente invenção é prover preparações de enzima, que contêm uma ou mais novas endloglicanases e proteínas de fusão endoglicanases tendo aperfeiçoadas propriedades hidrolíticas.

[0018] Ainda um objetivo da presente invenção é prover processos de uso de preparações de enzima e as endoglicanases e proteínas de fusão endoglicanase para acabamento de têxteis, especialmente para bioacabamento e bioestonagem de denim.

[0019] Ainda um objetivo da presente invenção é prover meios pa

Petição 870170051579, de 21/07/2017, pág. 17/79

7/61 ra uso das preparações de enzima da invenção em composições detergentes.

[0020] A presente invenção refere-se a um polipeptídeo endoglicanase compreendendo um fragmento tendo atividade celulolítica e sendo selecionado do grupo consistindo em:

[0021] a) um polipeptídeo compreendendo uma seqüência de aminoácidos tendo pelo menos 78% de identidade de seqüência a SEQ ID NO: 2 ou uma seqüência de aminoiácidos tendo pelo menos 68% de identidade de seqüência a SEQ ID NO: 4;

[0022] b) uma variante de a) compreendendo um fragmento tendo atividade celulolítica; e [0023] c) um fragmento de a) ou b) tendo uma atividade celulolítica.

[0024] A presente invenção ainda refere-se a uma proteína de fusão endoglicanase compreendendo um fragmento ativo celuloliticamente ativo de um polipeptídeo tendo uma seqüência de aminoácidos tendo pelo menos 78% de identidade de seqüência de SEQ ID NO 2 ligada a um domínio de ligação de carboidrato heterólogo (CBD).

[0025] A presente invenção também refere-se a uma proteína de fusão endoglicanase compreendendo uma seqüência de aminoácidos derivada de um polipeptídeo compreendendo uma seqüência de aminoácidos tendo pelo menos 68% de identidade de seqüência a SEQ ID NO:4 ligada a um domínio de ligação de carboidrato. A proteína de fusão adicionalmente pode compreender uma região ligante.

[0026] A presente invenção ainda refere-se a um polinucleotídeo isolado codificando o polipeptídeo ou proteína de fusão endoglicanase definida acima. Especialmente a invenção refere-se a um polipeptídeo selecionado do grupo consistindo em:

[0027] a) uma seqüência de nucleotídeos de SEQ ID NOs.: 1, 3, 16, 18, 20, 36, 37 ou 38;

Petição 870170051579, de 21/07/2017, pág. 18/79

8/61 [0028] b) uma fita complementar de a);

[0029] c) um fragmento de a) ou b) compreendendo pelo menos 20 nucleotídeos; e [0030] d) uma seqüência que é degenerada como um resultado do código genético para qualquer uma das seqüências como definidas em

a), b) ou c).

[0031] A presente invenção ainda refere-se a um vetor de expressão compreendendo a seqüência de polinucleotídeo definida acima.

[0032] A presente invenção ainda refere-se a novos hospedeiros transformados com os vetores da invenção, especialmente hospedeiros que são capazes de alto nível de expressão da endoglicanase ou proteína de fusão endoglicanase da invenção.

[0033] A presente invenção ainda refere-se a uma preparação de enzima, que contem uma ou mais endoglicanases ou proteínas de fusão endoglicanases da invenção.

[0034] A presente invenção ainda refere-se a processos para uso de preparações de enzima da invenção para bioacabamento de têxteis, especialmente para retirada de felpa.

[0035] A presente invenção inda refere-se a processos para uso de preparações de enzima da invenção para o acabamento de têxteis, especialmente para bioestonagem de denim.

[0036] A presente invenção ainda refere-se ao uso das preparações de enzima da invenção em composições detergentes.

[0037] A presente invenção ainda refere-se a uma cepa de Escherichia coli tendo número de acesso DSM 17324 DSM 17323, DSM 18813, DSM 18814, DSM 18815, DSM 18816, ou DSM 18817.

Breve Descrição dos Desenhos [0038] A Figura 1 ilustra o quadro esquemático dos cassetes de expressão usados na transformação de protoplastos de Trichoderma reesei para produção de de celulases Acremonium thermophilum da

Petição 870170051579, de 21/07/2017, pág. 19/79

9/61 invenção. Os genes recombinantes estavam sob controle de promotor cbhl/cel7A de T. reesei (cbhl prom) e terminação de transrição foi assegurada com a adição do terminador cbhl de T. reesei. O gene amdS (amdS) foi incluído para seleção dos transformantes.

[0039] A Figura 2 ilustra a dependência de pH das celulases EG_40 e semelhantes a EG_40 de A. thermophilum produzidas heterologamente através de determinação a partir de sobrenadante de cultura usando CMC como substrato em uma reação de 10 minutos a 50^oC (A). A temperatura ótima de celulases EG_40 e semelhantes a EG_40 foi determinada em pH 5,5 e 5, respectivamente. A reação com CMC como um substrato foi realizada por 60 minutos. BSA (100 mg/mL) foi adicionado como um estabilizador (B).

[0040] A Figura 3 mostra a performance de celulase EG_40 em bioestonagem em diferentes temperaturas avaliada através de medição de cor.

[0041] A Figura 4 mostra o efeito de bioestonagem de uma mistura de EGI enriquecida e concentrados de EG_40 comparada a um concentrado enriquecido com EGII da técnica anterior.

[0042] A Figura 5 mostra séries de fotografias mostrando o efeito de retirada de felpa de uma endoglicanase da invenção.

Descrição Detalhada da Invenção [0043] A presente invenção é baseada em esforços para encontrar celulases ainda aperfeiçoadas para uso em indústria têxtil. Surpreendentemente foi verificado que, partindo de uma espécie Acremonium, novas endoglicanases podem ser isoladas e enzimas recombinantes podem ser produzidas, cujas endoglicanases não somente têm um aceitável perfil de temperatura mas também mostram inesperada performance favorável de retirada de felpa e são pelo menos quatro vezes tão eficientes como uma preparação contendo EG comercial. Adicionalmente, as novas endoglicanases mostraram excelentes propriedaPetição 870170051579, de 21/07/2017, pág. 20/79

10/61 des de bioestonagem comparadas a celulases da técnica anterior.

[0044] Da mesma maneira, a presente invenção refere-se a um polipeptídeo endoglicanase compreendendo um fragmento tendo atividade celulolítica e sendo selecionado do grupo consistindo em:

[0045] a) um polipeptídeo compreendendo uma seqüência de aminoácidos tendo pelo menos 78% de identidade de seqüência a SEQ ID NO: 2 ou uma seqüência de aminoácidos tendo pelo menos 68% de identidade de seqüência a SEQ ID NO:4, [0046] b) uma variante de a) compreendendo um fragmento tendo atividade celulolítica; e [0047] c) um fragmento de a) ou b) tendo atividade celulolítica.

[0048] Em uma modalidade preferida da invenção o dito aminoácido tem pelo menos 80%, preferivelmente 85%, mais preferivelmente 90%, ainda mais preferivelmente 95%, mais preferivelmente 98% de identidade de seqüência a SEQ ID NO: 2.

[0049] Em uma outra modalidade preferida da invenção o dito aminoácido tem pelo menos 70%, preferivelmente 75%, mais preferivelmente 80%, ainda mais preferivelmente 85%, ainda mais preferivelmente 90%, mais preferivelmente 95% de identidade de seqüência a SEQ ID NO: 4.

[0050] Ainda em uma modalidade preferida da invenção o dito aminoácido tem SEQ ID NO: 2 ou SEQ ID NO: 4.

[0051] Ainda em uma outra modalidade preferida da invenção o dito fragmento tem a seqüência de aminoácidos de SEQ ID NO: 17 ou SEQ ID NO: 19.

[0052] Ainda em uma outra modalidade preferida da invenção os polipeptídeos são obteníveis ou originam-se de uma Acremonium sp., preferivelmente de Acremonium thermophilum.

[0053] Os polipeptídeos endoglicanase da presente invenção são preferivelmente polipeptídeos recombinantes. Os polipeptídeos re

Petição 870170051579, de 21/07/2017, pág. 21/79

11/61 combinantes podem ser produzidos em um hospedeiro heterólogo ou em um hospedeiro homólogo geneticamente modificado.

[0054] De acordo com uma modalidade particular da invenção o polipeptídeo endoglicanase é uma modificação de um polipeptídeo tendo pelo menos 78% de identidade de seqüência a SEQ ID NO: 2, onde o domínio de ligação de carboidrato CBD foi substituído por um CBD heterólogo. Em adição a região ligante e/ou seqüência sinal podem ser substituídos por uma região ligante heteróloga e/ou seqüência sinal. Estas endoglicanases modificadas também são aqui abrangidas pelo termo proteína de fusão endoglicanase. Em uma modalidade preferida da invenção, a endoglicanase modificada / fundida tem SEQ ID NO: 39, 40 ou 41.

[0055] Em uma particular modalidade da invenção a proteína de fusão é uma proteína de fusão endoglicanase compreendendo um fragmento celuloliticamente ativo de um polipeptídeo tendo uma seqüência de aminoácidos tendo pelo menos 78% de identidade de seqüência a SEQ ID NO: 2, e um domínio de ligação de carboidrato heterólogo (CBD), onde o CBD heterólogo e a região ligante opcional são derivados de CBHI de Trichoderma reesei, CBHI de Chaetomium termophilum, ou Acremonium sp. xilanase. Heterólogo como usado no presente contexto significa que o CBD e possível parte ligante da proteína de fusão endoglicanase são obtidos a partir de um outro organismo e ligados ao núcleo celuloliticamente ativo da endoglicanase através de modificação de gene. Especialmente a proteína de fusão compreende uma seqüência de aminoácidos que tem pelo menos 71% de identidade de seqüência a SEQ ID NO: 39, pelo menos 69% de identidade de seqüência a SEQ ID NO: 40, ou pelo menos 69% de identidade de seqüência a SEQ ID NO: 41. Especialmente a proteína de fusão compreende uma seqüência de aminoácidos tendo 75, 80, 85, 90, 95 ou 98% de identidade de seqüência a SEQ ID NO: 39, SEQ ID NO: 40 ou

Petição 870170051579, de 21/07/2017, pág. 22/79

12/61

SEQ ID NO: 41.

[0056] Em uma outra modalidade preferida da invenção a dita proteína de fusão compreende uma seqüência de aminoácidos de SEQ ID NO: 4 ligada a um CBD derivado de um polipeptídeo compreendendo uma seqüência de aminoácidos tendo SEQ ID NO: 2.

[0057] Ainda em uma outra modalidade preferida da invenção a dita proteína de fusão endoglicanase tem SEQ ID NO: 21. A presente invenção ainda refere-se a um polinucleotídeo isolado codificando o polipeptídeo endoglicanase definido acima.

[0058] Especificamente em uma modalidade da invenção o polinucleotídeo isolado tem uma seqüência de nucleotídeos selecionada do grupo consistindo em:

[0059] a) uma seqüência de nucleotídeos de SEQ ID NOs: 1, 3, 16, 18, 20, 36, 37 ou 38;

[0060] b) uma fita complementar de a);

[0061] c) um fragmento de a) ou b) compreendendo pelo menos 20 nucleotídeos; e [0062] d) uma seqüência que é degenerada como um resultado do código genético para qualquer uma das seqüências como definidas em

a), b) ou c).

[0063] A presente invenção ainda refere-se a um vetor de expressão compreendendo a seqüência de polinucleotídeos definida acima.

[0064] A presente invenção ainda refere-se a novos hospedeiros transformados com os vetores da invenção, especialmente hospedeiros que são capazes de alto nível de expressão da endoglicanase ou proteína de fusão endoglicanase da invenção. De acordo com uma modalidade preferida da invenção as enzimas são obteníveis de Acremonium thermophilum cepa ALKO4245 depositada como CBS 116240.

[0065] A presente invenção ainda refere-se a uma preparação de

Petição 870170051579, de 21/07/2017, pág. 23/79

13/61 enzima, que contém uma ou mais endoglicanadases ou proteínas de fusão endlglicanases da invenção.

[0066] A presente invenção ainda refere-se a processos para uso de preparações de enzimas da invenção para bioacabamento de têxteis, especialmente para retirada de felpa.

[0067] A presente invenção ainda refere-se a processos para uso de preparações de enzima da invenção para o acabamento de têxteis, especialmente para bioestonagem de denim.

[0068] A presente invenção ainda refere-se ao uso das preparações de enzima da invenção em composições detergentes.

[0069] As preparações de proteína de fusão endoglicanase e endoglicanase da invenção são úteis especialmente na indústria têxtil e de detergente. Elas são especialmente úteis na indústria têxtil para bioacabamento de tecidos ou peças de roupas, por exemplo, retirada de felpa, retirada de cotão, clarificação de cor, redução de aspereza, criação de diferentes acabamentos (por exemplo, um efeito de 'pele de pêssego', 'usado', 'lavado com areia', ou 'visual antigo') e para bioacabamento de fio, por exemplo, redução de formação de pêlos e aperfeiçoamento de suavidade. Adicionais usos incluem o uso de composições detergentes para aperfeiçoamento de propriedades de cuidados de tecido através de antiformação de felpa, antiacinzentamento, clarificação de cor e amaciamento, e para aperfeiçoar efeito de limpeza de têxtil, por exemplo, remoção de sujeira. Adicionais usos incluem o uso em bioestonagem de denim.

[0070] Em tecido de algodão, cotão (microfibras) emerge a partir da superfície, o qual pode embaraçar durante processamento, assim formando felpas. Enzimas enfraquecem as microfibras elevando-se da superfície e forças de cisalhamento do tratamento então as removem (Nierstrasz and Warmoeskerken, 2003). Como usada na presente invenção a expressão bioacabamento (também chamada retirada de

Petição 870170051579, de 21/07/2017, pág. 24/79

14/61 felpa, retirada de cotão, ou biopolimento) refere-se ao uso de enzimas em uma hidrólise controlada de fibras celulósicas de modo a modificar a superfície de fio ou tecido em uma maneira que previne permanentemente formação de felpa, aperfeiçoa manuseio de tecido como maciez e suavidade, limpa a estrutura de superfície através de redução de formação de cotão, que resulta em clarificação de cores, aperfeiçoa a capacidade do tecido de ornamentar do tecido, aperfeiçoa capacidade de absorção de umidade, que pode aperfeiçoar também a capacidade de tingimento. Enzimas celulases são usadas para tratamento ou acabamento de materiais têxteis contendo celulose, como algodão, linho, rami, juta, viscose, modal, liocel e cupro, ou suas combinações.

[0071] Como usada no presente contexto a expressão bioestonagem de tecido ou peças de roupas significa o uso de enzimas no lugar de, ou em adição a, pedras pomes para o tratamento de tecido ou peça de roupa, especialmente denim.

[0072] Como usada no presente contexto a expressão contramanchamento refere-se à tendência de corante liberado redepositar sobre a superfície das fibras de tecido.

[0073] Como usada no presente contexto a expressão detergente refere-se a um agente de limpeza que pode conter agentes tensoativos (tensoativos aniônicos, não-iônicos, catiônicos e anfolíticos), builders e outros ingredientes opcionais tais como agentes antiredeposição e de suspensão de sujeira, abrilhantadores óticos, agentes intensificadores, corantes e pigmentos e hidrolases. Apropriada listagem dos conteúdos de detergentes é dada na Patente US 5 433 750, uma lista apropriada de tensoativos é dada na Patente US 3 664 961.

[0074] A atividade biológica de uma endoglicanase é sua atividade catalítica, e/ou sua habilidade para ligar a material celulósico. Atividade celulolítica de uma endoglicanase é sua atividade hidrolítica.

Petição 870170051579, de 21/07/2017, pág. 25/79

15/61 [0075] Como usada no presente ocntexto, a expressão Acremonium sp. refere-se especialmente a um gênero de fungo filamentoso tendo as características da cepa CBS 116240. Esta cepa é presentemente classificada como A. thermophilum.

[0076] Como usado no presente contexto, polinucleotídeo referese a ambos RNA e DNA, e pode ser de fita simples ou dupla. O polinucleotídeo também pode ser um fragmento de ditos polinucleotídeos compreendendo pelo menos 20 nucleotídeos, por exemplo, pelo menos 25, 30 ou 40 nucleotídeos, De acordo com uma modalidade da invenção ele é de pelo menos 100, 200 ou 300 nucleotídeos em comprimento. Ainda o polinucleotídeo pode ser degenerado como um resultado do código genético para qualquer uma das seqüências como definidas acima. Isto significa que diferentes códons podem codificar o mesmo aminoácido.

[0077] Os novos polipeptídeos também podem ser variantes dos ditos polipeptídeos. Uma variante pode ser um polipeptídeo que ocorre naturalmente, por exemplo, como uma variante alélica dentro da mesma cepa, espécie ou gênero, ou ela pode ser gerada através de mutagênese. Ela pode compreender substituições, supressões ou inserções de aminoácidos, mas ela ainda funciona em uma maneira substancialmente similar às enzimas definidas acima, isto é, ela compreende um fragmento tendo atividade celulolítica.

[0078] Um vetor de expressão é um plasmídeo ou vetor de clonagem capaz de expressar DNA codificando as endoglicanases e proteínas de fusão de endoglicanases da invenção após transformação em um desejado hospedeiro. Quando um hospedeiro fungo é usado, o gene de interesse é preferivelmente provido para um hospedeiro fungo como parte de um veículo de expressão ou clonagem que integra-se no cromossoma de fungo, ou permite o gene de interesse integrar-se no cromossoma hospedeiro, ou como um plasmídeo replicando auto

Petição 870170051579, de 21/07/2017, pág. 26/79

16/61 nomamente. Seqüências que são parte do veículo de clonagem ou veículo de expressão também podem ser integradas com o dito DNA durante o processo de integração. Em adição, em fungos o vetor de expressão ou suas partes podem ser alvejadas em loci predeterminados. [0079] O DNA codificando as endoglicanases e as proteínas de fusão de endoglicanases da invenção é também preferivelmente colocado sob o controle de (isto é, operavelmente ligado a) certas seqüências controles tais como seqüências promotoras providas pelo vetor (que integram com o gene de interesse). Alternativamente, as seqüências controles podem ser aquelas no sítio de inserção.

[0080] As seqüências de controle de expressão de um vetor de expressão variarão dependendo de ser o vetor é desenhado para expressão de um certo gene em um hospedeiro procariótico ou em um eucariótico (por exemplo, um vetor lançador pode prover um gene para seleção em hospedeiros bacterianos). Seqüências de controle de expressão podem conter elementos reguladores transcricionais como promotores, elementos aperfeiçoadores, e seqüências de terminação transcricional, e/ou elementos reguladores transducionais, tais como sítios de iniciação e terminação transducional.

[0081] Uma molécula de polinucleotídeo, tal como DNA, é dita ser capaz de expressar um polipeptídeo se ela contem seqüências de controle de expressão que cotem informação reguladora transcricional e tais seqüências estão operavelmente ligadas à seqüência de nucleotídeos que codifica o polipeptídeo.

[0082] Uma ligação operável é uma ligação na qual uma seqüência está ligada a uma seqüência reguladora (ou seqüências) em uma maneira tal para colocar expressão da seqüência sob a influência ou controle da seqüência reguladora. Duas seqüências de DNA (tal como uma seqüência de região promotora ligada à extremidade 5' da seqüência codificando proteína) são ditas estarem operavelmente ligaPetição 870170051579, de 21/07/2017, pág. 27/79

17/61 das se função de promotor resulta na transcrição.

[0083] Os vetores da invenção ainda podem compreender outros elementos reguladores ligados operavelmente, tais como seqüências aperfeiçoadoras.

[0084] Em uma modalidade preferida, transformantes geneticamente estáveis são construídos pelo que o DNA codificando as endoglicanases ou proteínas de fusão de endoglicanases da invenção é integrado no cromossoma hospedeiro através de transformação com um vetor, que abriga seqüências promovendo integração do dito vetor no cromossoma.

[0085] Células que integraram estavelmente DNA codificando as endoglicanases ou as proteínas de fusão de endoglicanases da invenção em seus cromossomas são selecionadas através de também introdução de um ou mais marcadores, homólogos ou heterólogos, que permitem a seleção de células hospedeiras que contêm o vetor de expressão no cromossoma, por exemplo, o marcador pode prover resistência biocida, por exemplo, resistência antióticos, ou metais pesados, como cobre, ou marcadores complementando uma mutação auxotrófica no cromossoma hospedeiro, e semelhantes. O gene marcador selecionável tanto pode ser diretamente ligado às seqüências de gene de DNA a serem expressas, ou introduzido na mesma célula através de co-transformação.

[0086] Uma vez o vetor ou seqüência de DNA da invenção contendo o construto(s) seja preparado para expressão, o constructo(s) de DNA é introduzido em uma célula hospedeira apropriada através de qualquer um de uma variedade de meios apropriados, incluindo transformação como conhecido na técnica. Após a introdução do vetor, células receptoras são desenvolvidas em um meio seletivo, que seleciona para o crescimento de células transformadas.

[0087] Apropriados sistemas hospedeiros de expressão e produ

Petição 870170051579, de 21/07/2017, pág. 28/79

18/61 ção são, por exemplo, o sistema de produção desenvolvido para o hospedeiro fungo Trichoderma (EP 244 234), ou sistema de produção Aspergillus, tal como, A. oryzae ou A. niger (WO 9708325 e WO 9533386, Patente US 5 843 745, Patente US 5 770 418), ou o sistema de produção desenvolvido para Fusarium, tal como F. oxysporum (Malardier et al., 1989). Apropriados sistemas de produção desenvolvidos para bactérias são sistemas de produção desenvolvidos para Bacillus, por exemplo, B. subtilis ou para E. coli, ou para actinomicetes Streptomyces. Apropriados sistemas de produção desenvolvidos para leveduras são sistemas desenvolvidos para Saccharomyces, Shizosaccharomyces ou Pichia pastoris. Sistemas de produção em alguns micróbios ou em células mamíferas ou em plantas também são possíveis.

[0088] Expressão da seqüência(s) de gene clonada resulta na produção da desejada proteína, ou na produção de um fragmento desta proteína. Esta expressão pode ocorrer em uma maneira contínua nas células transformadas, ou em uma maneira controlada.

[0089] Fragmentos são entendidos serem partes de moléculas de ácido nucléico ou polipeptídeo longas o suficiente para terem as desejadas propriedades enzimáticas ou para codificarem as descritas endoglicanases ou proteínas de fusão endoglicanases ou um seu fragmento biologicamente ativo. O termo degenera significa que a seqüência de nucleotídeos pode variar tanto quanto a seqüência de aminoácidos codificada seja a mesma. Isto assim porque há mais de um tripleto nucleotídeo que codifica um único aminoácido.

[0090] Como usado no presente contexto o termo identidade de seqüência refere-se à identidade global entre duas seqüências de aminoácidos comparadas uma à outra a partir do primeiro aminoácido codificado pelo correspondente gene para o último aminoácido. A identidade das seqüências de inteiro comprimento é medida através de uso de programa de alinhamento global Needleman - Wunsch em

Petição 870170051579, de 21/07/2017, pág. 29/79

19/61

EMBOSS (European Molecular Biology Open Software Suíte; Rice et al., 2000) program package, version 3.0.0, com os seguintes parâmetros: EMBLOSUM62, penalidade de folga de 10,0, penalidade de extensão 0,5. O algoritmo é descrito em Needleman and Wunsch (1970). Aqueles versados na técnica estão cientes do fato de que resultados usando algoritmo de Needleman-Wunsch são somente comparativos quando alinhando domínios correspondentes da seqüência. Conseqüentemente comparação de, por exemplo, seqüências de celulase incluindo CBD ou seqüências sinais com seqüências carecendo daqueles elementos não pode ser feita.

[0091] Enzimas celulolíticas úteis para hidrólise de material celulósico são obteníveis ou originadas de Acremonium sp., preferivelmente A. thermophilum. Obtenível de ou originando de significa que elas podem ser obtidas a partir das ditas espécies, mas não exclui a possibilidade de obtenção das mesmas a partir de outras fontes. Em outras palavras elas podem se originar de qualquer organismo incluindo plantas. Preferivelmente elas se originam de microorganismos, por exemplo, bactérias ou fungos. As bactérias podem ser, por exemplo, de um gênero selecionado de Bacillus, Azospirillum e Streptomyces. Mais preferivelmente a enzima se origina de fungos (incluindo fungos e leveduras filamentosas), por exemplo, de um gênero selecionado do grupo consistindo em Thermoascus, Acremonium, Chaetomium, Achaetomium, Aspergillus, Botrytis, Chrysosporium, Collybia, Fomes, Fusarium, Humicola, Hypocrea, Lentinus, Melnaocarpus, Myceliophthora, Myriococcum, Neurospora, Penicillium, Phanerochaete, Phlebia, Pleurotus, Podospora, Polyporus, Rhizoctonia, Scytalidium, Pycnoporus, Trametes e Trichoderma.

[0092] Como usadas no presente contexto as expressões preparação de enzima, preparação de celulase e preparação de endoglicanase referem-se a qualquer produto de enzima, que contem pelo

Petição 870170051579, de 21/07/2017, pág. 30/79

20/61 menos uma endoglicanase ou proteína de fusão endoglicanase da invenção. Assim, uma tal preparação de enzima pode ser um meio de cultura gasto ou filtrado contendo uma ou mais endoglicanases ou proteínas de fusão endoglicanases ou uma ou mais endoglicanases ou proteínas de fusão endoglicanases e outras enzimas, uma endoglicanase ou proteína de fusão endoglicanase isolada ou uma mistura de uma ou mais endoglicanases ou proteínas de fusão endoglicanases ou uma mistura de uma ou mais endoglicanases ou proteínas de fusão endoglicanases e uma ou mais outras enzimas. Em adição à atividade endoglicanase, uma tal preparação pode conter aditivos, como estabilizadores, tampões, conservantes, tensoativos e/ou componentes de meio de cultura. Aditivos preferidos são tais, que são comumente usados em preparações de enzima pretendidas para a aplicação, onde a preparação de enzima é usada. A preparação de enzima pode estar na forma de líquido, pulverizado ou granulado.

[0093] Por meio de cultura usado é aqui pretendido o meio de cultura do hospedeiro compreendendo as enzimas produzidas. Preferivelmente, as células hospedeiras são separadas do dito meio após a produção.

[0094] A preparação de enzima pode compreender uma ou mais endoglicanases ou proteínas de fusão endoglicanases da presente invenção ou outras enzimas celulases junto com uma ou mais endoglicanases ou proteínas de fusão endoglicanase da presente invenção. Por exemplo, endoglicanases tendo diferentes propriedades podem ser combinadas para tornarem a preparação de enzimas mais útil para diferentes condições.

[0095] Para obtenção de preparações de enzima da invenção, os hospedeiros tendo as desejadas propriedades (ou seja, hospedeiros capazes de expressarem economicamente quantidades exeqüíveis das endoglicanases ou proteínas de fusão endoglicanases da inven

Petição 870170051579, de 21/07/2017, pág. 31/79

21/61 ção) são cultivados sob apropriadas condições, as desejadas enzimas são secretadas dos hospedeiros no meio de cultura, e a preparação de enzima é recuperada do dito meio de cultura através de processos conhecidos na técnica.

[0096] A preparação de enzima pode compreender, em adição à endoglicanase ou proteína de fusão endoglicanase, uma ou mais outras enzimas, que podem ser, por exemplo, amilases, lipases, proteases, pectinases e/ou oxidases, tais como lacases e peroxidases. Alternativamente, antes, durante ou após o tratamento com a endoglicanase ou a proteína de fusão endoglicanase da presente invenção, um outro tratamento com enzima pode ser realizado. O tratamento com enzima pode compreender, por exemplo, um ou mais tratamentos com amilase, um ou mais tratamentos com celulase e/ou um ou mais tratamentos com peroxidase e/ou lacase. Quais outras enzimas são incluídas na preparação de enzimas depende da aplicação.

[0097] A preparação de enzimas pode ser o meio de cultura com ou sem as células hospedeiras transformadas ou nativas, ou é recuperada do mesmo através de processos bem conhecidos na técnica. Entretanto, devido as endoglicanases ou as proteínas de fusão endoglicanase da invenção serem secretadas nos meios de cultura e mostrarem atividade nas condições ambientes do licor celulolítico, é uma vantagem da invenção que as preparações de enzimas da invenção podem ser utilizadas diretamente do meio de cultura sem ainda nenhuma purificação. Se desejado, tais preparações podem ser liofilizadas ou a atividade enzimática de outro modo concentrada e/ou estabilizada para estocagem. As preparações de enzima da invenção são muito econômicas para provimento e uso porque (1) as enzimas podem ser usadas em uma forma bruta; isolamento de uma específica enzima do meio de cultura é desnecessário e (2) devido enzimas serem secretadas no meio de cultura, somente o meio de cultura precisa ser recupe

Petição 870170051579, de 21/07/2017, pág. 32/79

22/61 rado para obtenção de desejada preparação de enzima; não há necessidade de extrair uma enzima de hospedeiros. Preferivelmente o hospedeiro para uma produção é Trichoderma, e especialmente T. reesei.

[0098] As preparações de enzima da invenção podem ser providas como um líquido ou como um sólido, por exemplo, em uma forma líquida, ou granular ou pulverizada seca, especialmente grânulos nãoformadores de poeira, ou um líquido estabilizado, ou a preparação de enzima pode ser de outro modo concentrada ou estabilizada para estocagem ou uso. É imaginado que preparações de enzima contendo uma ou mais das celulases da invenção podem ser ainda enriquecidas ou feitas parcial ou completamente deficientes em específicas atividades enzimáticas, de modo a satisfazer os requisitos de uma utilidade específica em várias aplicações, por exemplo, na indústria têxtil. Uma mistura de atividades de enzima secretada por um hospedeiro e especialmente um hospedeiro fungo, pode ser escolhida para ser vantajosa em uma particular aplicação industrial, por exemplo, bioacabamento e bioestonagem.

[0099] As preparações de enzima da invenção podem ser ajustadas para satisfazerem os requisitos de específicas necessidades em várias aplicações na indústria têxtil, de detergente, ou polpa e papel, [00100] Combinações podem ser preparadas com outras macromoléculas que não são necessariamente todas produzidas a partir do mesmo hospedeiro (por exemplo, outras enzimas tais como endoglicanases, amilases, lipases, proteases, pectinases, e/ou oxidases, tais como lacases e peroxidases) ou compostos químicos que podem aperfeiçoar a performance, estabilidade, ou tamponamento da desejada preparação de enzima. Grânulos não-formadores de poeira podem ser revestidos. Preparações de enzima líquidas podem ser estabilizadas através de adição de um poliol tal como propileno glicol, um açú

Petição 870170051579, de 21/07/2017, pág. 33/79

23/61 car ou álcool de açúcar, ácido lático ou ácido bórico, ou cloreto de sódio, de acordo com processos estabelecidos.

[00101] Formas protegidas das enzimas da invenção podem ser preparadas como descrito na EP 238 216.

[00102] As preparações de enzima da invenção podem conter um tensoativo que pode ser aniônico, não-iônico, catiônico, anfotérico, ou uma mistura destes tipos, especialmente quando usado como uma composição detergente. Composições detergentes úteis são descritas, por exemplo, nos WO 94/07998, Patente US 5 443 750 e Patente US 3 664 961.

[00103] Se requerido, uma desejada enzima pode ser isolada, e ainda purificada de acordo com condições convencionais, tal como extração, precipitação, cromatografia, cromatografia de afinidade, eletroforese, ou semelhantes. Polipeptídeo isolado neste contexto pode simplesmente significar que as células e restos de células foram removidos do meio de cultura contendo o polipeptídeo. Convenientemente os polipeptídeos são isolados, por exemplo, através de adição de polímeros aniônicos e/ou catiônicos ao meio de cultura gasto para aperfeiçoar precipitação de células, restos de células e algumas enzimas que têm indesejadas atividades colaterais. O meio é então filtrado usando um agente de filtração inorgânico e um filtro para remoção de precipitantes formados. Após isto o filtrado é ainda processado usando uma membrana semipermeável para remover excesso de sais, açúcares, e produtos metabólicos.

[00104] As preparações de enzima desta invenção são especialmente úteis em indústria têxtil preferivelmente em bioacabamento e em bioestonagem ou em indústria detergente. Outras áreas úteis estão na indústria de polpa e papel.

[00105] Bioacabamento refere-se ao uso de enzimas em uma hidrólise controlada de fibras celulósicas de modo a modificar a superfí

Petição 870170051579, de 21/07/2017, pág. 34/79

24/61 cie de fio ou tecido em uma maneira que previne permanentemente formação de felpa, aperfeiçoa manuseio de tecido como suavidade e maciez, limpa a estrutura de superfície através de redução de formação de cotão, o que resulta em clarificação de cores, aperfeiçoa a capacidade ornamental do tecido, aperfeiçoa capacidade de absorção de umidade e que pode aperfeiçoar também a capacidade de tingimento. [00106] Retirada de felpa enzimática pode ser realizada em qualquer estágio durante processamento úmido têxtil, preferivelmente após retirada de cola e alvejamento. O processo enzimático requer equipamento com suficientes forças de cisalhamento e mistura tal como um guincho de jato ou máquina de lavagem (Nierstrasz V. A. and Warmoeskerken M.M.C.G., 2003).

[00107] Bioacabamento é tipicamente realizado em pH de cerca de 4,0-6,0. A temperatura da reação pode variar de cerca de 30^oC a 70^oC, e é preferivelmente 50-60^oC. A razão de licor (a razão do volume de líquido por peso de tecido) pode variar de cerca de 3:1 a 20:1, preferivelmente de 5:1 a 10:1. O tempo de incubação é genericamente 15 a 90 minutos, preferivelmente 30 a 60 minutos. A dosagem de enzima depende grandemente do tipo dos tecidos, maquinaria, condições de processo (pH, temperatura, razão de licor, tempo de tratamento, carga de denim, escala de processo) e tipo de preparação de enzima e semelhantes. Uma pessoa versada na técnica é capaz de definir apropriadas dosagens e condições.

[00108] As endoglicanases e proteínas de fusão endoglicanase da invenção são especialmente úteis na indústria têxtil para bioacabamento de tecidos ou peças de roupas, por exemplo, retirada de felpa, retirada de cotão, clarificação de cor, redução de aspereza, a criação de diferentes acabamentos (por exemplo, um efeito de 'pele de pêssego', 'usado', 'lavado com areia', ou 'visual antigo') e bioacabamento de fio (por exemplo, redução de formação de cabelos, aperfeiçoamento

Petição 870170051579, de 21/07/2017, pág. 35/79

25/61 de suavidade). As endoglicanases e proteínas de fusão endoglicanases da presente invenção podem ser usadas em bioacabamento em condições ácidas e neutras.

[00109] As endoglicanases e proteínas de fusão endoglicanases da presente invenção são úteis em composições detergentes para aperfeiçoamento de propriedades de cuidados de tecido através de antiformação de felpa, antiacinzentamento, clarificação de cor e amaciamento, e para aperfeiçoar efeito de limpeza de têxtil, por exemplo, remoção de sujeira.

[00110] Lavagem com pedras tem três etapas: retirada de cola, abrasão e pós-tratamento. A primeira etapa, processo de retirada de cola é normalmente o primeiro tratamento úmido de jeans e significa a remoção de amido ou outros agentes colantes aplicados usualmente aos fios de urdidura para prevenir dano durante o processo de tecedura. Alfa amilases são usadas para remoção de cola baseada em amido para processamento úmido uniforme e aperfeiçoado. Após retirada de cola os jeans são normalmente rinsados com água ou continuados diretamente com a etapa de abrasão.

[00111] A segunda etapa, abrasão, pode ser realizada com enzimas ou pedras-pomes ou ambos. Em todos os casos ação mecânica é necessária para remover o corante, e o tratamento é usualmente realizado em máquinas de lavar, como lavadoras de tambor. O termo abrasivado significa aqui a aparência de tecido denim quando ele foi tratado por enzimas celulases ou pedras, ou ambas. Como um resultado de desigual remoção de corante existem contrastes entre áreas tingidas e áreas das quais corante foi removido. Expressões sinônimas são visual lavado com pedra ou visual usado. Em lavagem com pedras enzimática, ou bioestonagem, abrasão com pedras-pomes é completa ou parcialmente eliminada e celulase é adicionada para facilitar a abrasão de corante índigo da superfície de fibra. O tratamento com

Petição 870170051579, de 21/07/2017, pág. 36/79

26/61 celulase pode ser feito usando celulases ácidas ou neutras ou ambas. [00112] Abrasão é geralmente seguida pela terceira etapa, póstratamento que inclui etapas de lavagem e rinsagem durante as quais detergentes, intensificadores óticos ou amaciantes podem ser usados. Após o tratamento enzimático a reação tem de ser interrompida de modo a prevenir dano dos materiais tratados, por exemplo, através de inativação com temperatura e/ou pH, a última compreendendo inteira rinsagem e/ou lavagem de detergente. Isto assegura que a resistência mecânica da fibra não é ainda comprometida pela continuada presença da enzima.

[00113] Por denim é pretendido, em conexão com esta invenção, tecido denim, usualmente peças de roupas de denim, particularmente jeans. Vantajosamente o denim é denim tingido com índigo. Denim também pode ser tratado com Índigo, com derivados de Índigo ou denim tingido com Índigo junto com algum outro corante, por exemplo, denim tingido com Índigo com fundo de enxofre.

[00114] Tratamento com uma celulase(s) pode substituir completamente tratamento com pedras-pomes (por exemplo, 1 kg de enzima comercial vs. 100 kg de pedras). Entretanto, tratamento com celulase pode ser combinado com tratamento com pedras-pomes quando é desejado produzir um acabamento pesadamente abrasivado. Um efeito de pele de pêssego no qual uma cobertura fina semelhante a cabelo sobressaindo é criada é também obtido através de uma lavagem combinando uma celulase neutra com pedras-pomes. As celulases desta invenção são especialmente úteis para provimento de visual abrasivado e para minimizar contra-manchamento em bioestonagem.

[00115] Bioestonagem é tipicamente realizada em pH de cerca de 3,0-8,0, e preferivelmente em pH 4,0-6,0. A temperatura da reação pode variar de cerca de 30 a 70^oC e está preferivelmente entre 50-60^oC. A razão de licor (a razão do volume de líquido por peso de tecido) po

Petição 870170051579, de 21/07/2017, pág. 37/79

27/61 de variar de cerca de 3:1 a 20:1, preferivelmente 5:1 a 10:1. O tempo de tratamento pode variar entre 15-90 minutos e preferivelmente 30-60 minutos. Deve ser enfatizado que a dosagem de enzima depende grandemente do tipo de tecidos, maquinaria, condições de processo (pH, temperatura, razão de licor, tempo de tratamento, carga de denim, escala de processo) e tipo de preparação de enzima e semelhantes. Se desejado, pedra-pomes podem ser usadas em combinação com as endoglicanases ou proteínas de fusão endoglicanases. A dosagem de enzima requerida então será significantemente menor. Uma pessoa versada na técnica é capaz de definir apropriadas dosagens e condições.

[00116] O material têxtil que é tratado com as preparações de enzima da invenção pode ser fabricado de fibras contendo celulose natural ou fibras contendo celulose feitas pelo homem ou suas misturas. Celulósicos naturais são algodão, linho, cânhamo, juta e rami. Exemplos de celulósicos feitos pelo homem são viscose, acetato de celulose, triacetato de celulose, raion, cupro e lyocell. Os celulósicos mencionados acima também podem ser empregados como combinações de fibras sintéticas tais como poliéster, poliamida ou acrílicas. O material têxtil pode ser fio ou malha ou tecido ou formado através de quaisquer outros meios.

[00117] As endoglicanases e proteínas de fusão endoglicanases da presente invenção, além de serem especialmente úteis para o tratamento de tecido, são úteis geralmente em qualquer área requerendo atividade celulase.

[00118] Na indústria de polpa e papel, celulases podem ser usadas, por exemplo, em retirada de tinta ou modificação de fibra de diferentes papéis e papelões reciclados tendo pH neutro ou alcalino, no aperfeiçoamento de qualidade de fibra, ou aumento de drenagem em fabricação de papel. Outros exemplos incluem a remoção de espessante de

Petição 870170051579, de 21/07/2017, pág. 38/79

28/61 pasta de impressão e excesso de corante após impressão têxtil, e como um tratamento para alimentação animal. Por exemplo, se a aplicação pretendida é aperfeiçoamento da resistência da polpa mecânica, então as preparações de enzima da invenção podem prover uma ou mais destas proteínas de modo a aperfeiçoar ou facilitar a habilidade de fibras de celulose para ligarem-se juntas. Em uma maneira similar, na aplicação de refino de polpa, as preparações de endoglicanases e proteína de fusão endoglicanase da invenção podem prover uma ou mais destas proteínas em um nível que aperfeiçoa ou facilita tal intumescimento.

[00119] As endoglicanases e proteínas de fusão endoglicanases da presente invenção proporcionam inesperadas vantagens quando usadas em indústria têxtil e especialmente em bioacabamento, tal como retirada de felpa, e um bioestonagem. As endoglicanases e proteínas de fusão endoglicanases da presente invenção são consideravelmente mais eficientes que as celulases da técnica anterior. Em bioacabamento dosagens pelo menos quatro vezes menores podem ser usadas. Em outras palavras, maior performance é obtida através de uso de endoglicanases e proteínas de fusão endoglicanases da presente invenção. Na retirada de felpa as endoglicanases e proteínas de fusão endoglicanases da presente invenção foram mais eficientes e produziram uma superfície uniforme estável.

[00120] A invenção é descrita em mais detalhes nos exemplos que se seguem, os quais não são para serem interpretados para estreitamento de escopo da invenção mas somente para clarear o uso da invenção.

Exemplo 1. Cultivo de Acremonium thermophilum ALKO4245 [00121] A Acremonium thermophilum cepa ALKO4245 foi crescida em um bio-reator de 2 litros (Braun Biostat B, Braun, Melsungen, Germany) no seguinte meio, g/L: Solka Floc cellulose 40, pulverizado de

Petição 870170051579, de 21/07/2017, pág. 39/79

29/61 infusão de milho 15, grão usado de destilador 5, xilano usado de aveias 3, goma de feijão alfarroba 3, (NH₄)₂SO₄ 5 e KH₂PO₄ 5. A faixa de pH foi 5,2±0,2 (NH₃/H₂SO₄), aeração 1 vvm, agitação 300-600 rpm, controle antiespuma com Struktol e a temperatura 42^oC. O tempo de cultivo foi de 4 dias. Após cultivo as células e outros sólidos foram coletados por centrifugação e o sobrenadante foi recuperado.

Exemplo 2. Purificação de uma endoglicanase de Acremonium thermophilum ALKO4245 [00122] O sobrenadante de cultura de Acremonium thermophilum ALKO4245, crescido como descrito no Exemplo 1, foi incubado a 70^oC por 24 horas após o que foi concentrado através de ultrafiltração. A endoglicanase pura foi obtida através de purificação seqüencial com interação hidrofóbica e cromatografia de troca de cátions seguida por filtração em gel. A atividade endoglicanase das frações coletadas durante purificação foi determinada usando carboxi metil celulose (CMC) como um substrato (de acordo com o procedimento de IUPAC, 1987).

[00123] O sobrenadante de cultura concentrado foi aplicado coluna de interação hidrofóbica HiPrep 16/10 Butyl FF (GE Healthcare) equilibrada com tampão de fosfato de potássio 20 mM, pH 6,0, contendo (NH₄)₂SO₄ 1 M. Proteínas ligadas foram eluidas com um gradiente linear a partir do tampão acima para fosfato de potássio 5 mM, pH 6,0. Frações foram coletadas e a atividade endoglicanase foi determinada como descrito acima. A atividade endoglicanase eluiu em uma ampla área de condutividade de 120 a 150 mS/cm.

[00124] Frações combinadas foram aplicadas à coluna de troca de cátions HiTrap SP XL (GE Healthcare) equilibrada com acetato de sódio 8 mM, pH 4,5. Proteínas ligadas foram eluídas com um gradiente linear de 0 a 0,25 M de NaCl no tampão de equilíbrio. A proteína contendo atividade endoglicanase eluiu na área de condutividade de 3-7 mS/CM. Cromatografia de troca de cátions foi repetida e o eluato de

Petição 870170051579, de 21/07/2017, pág. 40/79

30/61 proteína foi concentrado por secagem de congelamento.

[00125] A amostra dissolvida foi carregada sobre a coluna de filtração de gel Superdex 75 HR10/30 (Pharmacia) equilibrada com tampão fosfato de sódio 20 mM, pH 7,0, contendo NaCl 0,15 M. A principal fração de proteína eluiu da coluna com o volume de retenção de 13,3 mL. O eluato de proteína foi puro como julgado por eletroforese em gel de poliacrilamida-SDS e o peso molecular foi avaliado ser 40 kDa. A atividade específica da proteína purificada, designada como Acremonium thermophilum EG_40 ou At EG_40 (SEQ ID NO: 2), a 50^oC foi determinada ser 450 nkat/mg (de acordo com o procedimento de IUPAC, 1987, supra, usando CMC como um substrato).

[00126] A estabilidade térmica da endoglicanase purificada foi determinada em diferentes temperaturas. A reação foi realizada na presença de 0,1 mg/mL BSA em pH 5,0 por 60 minutos usando CMC como substrato. EG_40 foi estável até 80^oC. As enzimas referência de T. reesei EGI (Cel7B) e EGII (Cel5A) retiveram 100% de sua atividade até 60^oC e 65^oC, respectivamente.

[00127] Para seqüenciamento de aminoácido interno, a proteína de Acremonium thermophilum ALKO4245 EG_40 (SEQ ID NO:2) foi primeiro alquilada e digerida em peptídeos trípticos. Peptídeos gerados foram dessalinizados e parcialmente separados através de nano cromatografia líquida (fase reversa). Os peptídeos internos foram seqüenciados por ionização de eletrospray combinada a espectrometria de massa tandem (ESI-MS/MS) usando o instrumento Q-TOF1 (Waters Micromass). As seqüências de peptídeo interno assim obtidas são listadas na Tabela 1.

Petição 870170051579, de 21/07/2017, pág. 41/79

31/61

Tabela 1. Seqüências de peptídeo internas determinadas a partir de celulase EG 40 de Acremonium thermophilum

Peptídeo	Seqüência	SEQ ID NO:
Peptídeo 1	QSCSSFFAPUtPGCQWR	5
Peptídeo 2	TAlTraSGPVIGK	6
Peptídeo 3	VQCPSELTSR	7
Peptídeo 4	NQPVFSÇSADWQR	8
Peptídeo 5	YtmccKRSCGWPGK	9
Peptídeo 6	ΡΤΓΤ	10

Exemplo 3. Clonagem de genes ce!45A e ce!45B de Acremonium thermophilum [00128] Processos padrão de biologia molecular foram usados no isolamento e tratamentos com enzima de DNA (plasmídeos, fragmentos de DNA), em transformações de E. coli, etc. Os processos básicos são descritos nos manuais padrão de biologia molecular, por exemplo, Sambrook, J., et al., 1989 e Sambrook J. and Russell, D.W., 2001.

[00129] A biblioteca genômica de Acremonium thermophilum ALKO4245 foi construída em vetor Lambda DASH II (Stratagene, USA) de acordo com as instruções do fabricante. O DNA cromossômico, isolado pelo processo de Raeder and Broda, 1985, foi parcialmente digerido com sau3A. O DNA digerido foi fracionado em tamanho em um gel de agarose e os fragmentos de tamanho escolhido (cerca de 5-23 kb) foram isolados, desfosforilados, e ligados aos braços de vetor lambda digerido com BamHI. A mistura de ligação foi embalados usando Gigapack III Gold packaging extracts de acordo com as instruções do fabricante (Stratagene, USA). O título da biblioteca genômica foi 3,7 x 10⁵ pfu/mL e aquele da biblioteca amplificada foi 4,2x10⁸ pfu/mL.

[00130] As seqüências de peptídeo internas de uma EG_40 de Acremonium thermophilum purificada obtida como descrito no exemplo 2 compartilharam homologia com celulases da família glicosil hidrolase 45, tal como endoglicanase de Thielavia terrestris (GenBank Accessi

Petição 870170051579, de 21/07/2017, pág. 42/79

32/61 on N° CQ827970) e celulase Cel45A de Melanocarpus albomyces (GenBank Accession No. AJ515703). De modo a amplificar uma sonda para seleção do gene codificando EG_40 de A. thermophilum (cel45A; SEQ ID NO: 1) a partir da biblioteca genômica, primers degenerados foram desenhados nas bases das seqüências de peptídeos listadas na Tabela 1 (Exemplo 2). A ordem dos peptídeos na seqüência de proteína e a correspondente natureza sentido ou anti - sentido dos primers foram deduzidos da comparação com a seqüência de Cel45A de M. albomyces homóloga. O iniciador sentido (TAYTGGGAYGYTGYAARCC, SEQ ID NO: 11) é baseado em aminoácidos 1 a 6 de peptídeo 5 (SEQ ID NO: 9) e o iniciador anti-sentido (RTTRTCNGCRTTYTGRAACCA, SEQ ID NO: 12) é baseado em uma seqüência de peptídeo (WFQNADN; SEQ ID NO: 13) da proteína Cel45A de M. albomyces homóloga. As misturas de reação PCR contiveram Tris-HCl 50 mM, pH 9,0, (NH₄)₂SO₄ 15 mM, Triton X-100 0,1%, MgCl₂ 1,5 mM, dNTPs 0,1 mM, 0,5 mg de cada iniciador, 1 unidade de Dynazyme EXT DNA polimerase (Finnzymes, Finland), e aproximadamente 0,5 mg de DNA genômico de Acremonium. As condições para reações PCR foram como se segue: 5 minutos de desnaturação inicial a 95^oC, seguida por 30 ciclos de 1 minuto a 95^oC, 1 minuto de anelamento a 50-60^oC, 2 minutos de extensão em 72^oC e uma extensão final a 72^oC por 10 minutos. Os produtos de extensão foram examinados em um gel de agarose.

[00131] Dois produtos de PCR foram obtidos a partir da reação PCR de Acremonium. Fragmentos de DNA de cerca de 0,6 kb (SEQ ID NO: 14) e 0,8 kb (SEQ ID NO: 15) foram isolados do gel de agarose e clonados no vetor pCR4-TOPO TA (Invitrogen, USA) resultando em plasmídeos pALK1710 e pALK1711, respectivamente. Os produtos de PCR clonados foram caracterizados por seqüenciamento e através de modalidade de hibridizações de Southern blot (como descrito abaixo)

Petição 870170051579, de 21/07/2017, pág. 43/79

33/61 para o DNA genômico de Acremonium digerido com várias enzimas de restrição. Os padrões de hibridização obtidos com os dois fragmentos em condições rigorosas de lavagem sugerem que dois genes endoglicanase putativos podem ser selecionados da biblioteca genômica de Acremonium. As seqüências de aminoácidos deduzidas de ambos produtos de PCR têm homologia a várias seqüências de endoglicanases publicadas de família glicosil hidrolase 45 (BLAST program, National Center for Biotechnology Information; Altschul et al., 1990).

[00132] A inserção a partir de plasmídeo pALK1710 e pALK1711 foi isolada através de digestão com enzima de restrição e marcada com digoxigenina de acordo com as instruções do fabricante (Roche, Germany). Cerca de 1-2x10⁵ placas da biblioteca genômica de Acremonium amplificada foram transferidas sobre filtros de celulose e selecionadas por hibridização usando inserções marcadas com digoxigenina. A temperatura para hibridização foi 68^oC e os filtros foram lavados 2x5 minutos em temperatura ambiente usando 2 x SSC-0,1% SDS seguido por 2 x 15 minutos a 68^oC usando 0,1 x SSC-0,1% SDS. Várias placas positivas foram obtidas, das quais cinco placas hibridizando fortemente foram purificadas de ambas seleções. DNAs fago foram isolados e analisados por hibridização de Southern blot. Fragmentos de restrição de DNAs fago hibridizando para as sondas foram subclonados no vetor pBluescript II KS+ (Stratagene, USA) e as partes relevantes foram seqüenciadas. Em ambos os casos o fragmento de fago subclonado contem o inteiro comprimento de gene de interesse.

[00133] A Tabela 2 resume a informação das sondas usadas para seleção dos genes endoglicanases, clones fagos dos quais os genes foram isolados, fragmentos de restrição escolhidos contendo os genes de inteiro comprimento com suas regiões promotoras e terminadoras, nomes de plasmídeos contendo o fragmento de fago subclonado, e os números de depósito no Deutsche Sammlung von Mikroorganismen

Petição 870170051579, de 21/07/2017, pág. 44/79

34/61 und Zellkulturen GmbH culture collection (DSM) para cepas de E. coli transportando estes plasmídeos. Os depósitos foram feitos sob o Tratado de Budapeste.

Tabela 2. Sondas usadas para clonagem dos genes endoglicanase, clones de fagos e os subclones escolhidos, nomes de plasmídeos e o correspondente número de depósito das cepas de E. coli

Gene	Biblioteca Genômica	Sonda usada em seleção	Clone de fago	Fragmento subclonado	Plasmídeo	No. de depósito de E. coli
< * £ < φ o	A. thermophilum ALKO4245	PALK1710	P24	5,5 kb Smal	pALK1908	DSM 17324
At cel45B	A. thermophilum ALKO4245	pALK1711	P41	6,0 kb Xhol	Palk1904	DSM 17323

[00134] Informação relevante dos dois genes, nomeados como At cel45A (SEQ ID NO: 1) e At cel45B (SEQ ID NO: 3), é resumida na Tabela 3 e das respectivas seqüências de proteína deduzidas, At EG_40 (SEQ ID NO: 2) e semelhantes At EG_40, na Tabela 4. As seqüências de peptídeos da endoglicanase EG_40 de Acremonium purificada foram verificadas na correspondente seqüência de aminoácidos deduzida do gene clonado confirmando que um apropriado gene foi clonado.

[00135] O gene At cel45A de inteiro comprimento (SEQ ID NO: 1) é de 1076 pb em comprimento, interrompido por dois introns de 59 pb e 123 pb, e codifica um polipeptídeo de 297 aminoácidos At EG_40 (SEQ ID NO: 2). O sítio de clivagem de peptídeo sinal putativo é após Ala21, e o terminus-N da proteína madura começa com Leu22, a proteína madura (incluindo CBD) compreendendo aminoácidos 22 a 297 de SEQ ID NO: 2). A celulase EG_40 tem um domínio de ligação de carboidrato de consenso terminal-C abrigando aminoácidos Lys265 a Leu297 do polipeptídeo de inteiro comprimento. A proteína madura

Petição 870170051579, de 21/07/2017, pág. 45/79

35/61 prevista após clivagem de peptídeo sinal tem um peso molecular e pl de 28625 Da e 4,79, respectivamente (predição feita usando o Compute pl/MW tool at ExPASy server, Gasteiger et al., 2003). A proteína tem dois sítios de N-glicosilação putativos N-X-S/T (previstos usando o programa NetNGlyc 1.0, Gupta et al., 2004).

[00136] Correspondentemente, o gene At cel45B de inteiro comprimento (SEQ ID NO: 3) é de 1013 pb em comprimento, interrompido por dois introns de 155 pb e 102 pb, e codifica um polipeptídeo de 251 aminoácidos semelhante a EG_40 (SEQ ID NO: 4). O sítio de clivagem de peptídeo sinal putativo é após Ala20, e o terminus-N da proteína madura começa com Gln21, a proteína madura compreendendo aminoácidos 21 a 251 de SEQ ID NO: 4). A celulase semelhante a EG_40 não tem domínio de ligação de carboidrato consenso terminal-C. A proteína madura prevista após clivagem de peptídeo sinal tem um peso molecular e pl de 23972 Da e 6,11, respectivamente (predição feita usando o Compute pl/MW tool at ExPASy server, Gasteiger et al., 2003). A proteína tem dois sítios de N-glicosilação putativos N-X-S/T (previsto usando o programa NetNGlyc 1.0, Gupta et al., 2004).

Tabela 3. Resumo dos genes endoglicanase isolados de Acremonium thermophilum ALKO4245

Gene endoglicanase	Comprimento com introns (pb)(a	Região codificante (pb)(b	No. de introns	Comprimentos de introns (pb)	SE ID NO:
At cel45A	1076	891	2	59, 123	1
At cel45B	1013	753	2	155, 102	3

^(a O códon de interrupção é incluído.

^(b o códon de interrupção não é incluído.

Petição 870170051579, de 21/07/2017, pág. 46/79

36/61

Tabela 4. Resumo das seqüências de endoglicanases deduzidas de

Acremonium thermophilum ALKO4245.

ss, seqüência sinal

Proteína endoglicanase	N° de aas	Comprimento de ss NN/HMM(a	CBD(b	PM previsto (Da, ss não incluída)(c	pl previsto (ss não incluída)	Sítios de Nglicosilação putativos(d	SEQ ID NO:
At EG_40	297	21/21	Sim; K265 a L297	28625	4,79	2	2
Semelhante At EG 40	251	20/20	Não	23972	6,11	2	4

^(a O previsão sobre a seqüência sinal foi feita usando o programa SignalP V3.0 (Nielsen et al., 1997; Bendtsen et al., 2004); o valor NN foi obtido usando redes neurais e valor HMM usando modelos Markov ocultos.

^(b Presença de um domínio de ligação de carboidrato na proteína, os aminoácidos do CBD terminal-C são indicados (numeração de acordo com o polipeptídeo de inteiro comprimento).

^(c A seqüência sinal prevista não é incluída. Predição foi feita usando o Compute pl/MW tool at ExPASy server (Gasteiger et al., 2003).

^(d Os sítios de N-glicosilação putativos N-X-S/T foram previstos usando o programa NetNGIyc 1.0 (Gupta et al., 2004, em preparação; www.cbs.dtu.dk/services/NetNGIvc/).

[00137] As seqüências de proteínas deduzidas das celulases semelhante a EG_40 e EG_40 de A. thermophilum são similares a celulases de glicosil hidrolase família 45 (Tabela 5). As homologias de seqüências mais próximas encontradas para EG_40/Cel45A e semelhante a EG_40/Cel45B foram seqüências de endoglicanase de Thielavia terrestris (GenBank Accession N° CQ827970) e Myceliophthora thermophila (GenBank Accession N° AR094305), respectivamente. Os alinhamentos foram realizados usando o programa Needle do pacote de

Petição 870170051579, de 21/07/2017, pág. 47/79

37/61 programas EMBOSS.

Tabela 5. Comparação das seqüências de proteína deduzidas das celulases EG 40 e semelhante a EG 40 de Acremonium thermophilum com suas contrapartes homólogas

Organismo, enzima, e número de acesso	Identidade (%)
EG_40 de Acremonium thermophilum EG45 de Thielavia terrestris, CQ827970	77,3
Cel45 de Melanocarpus albomyces, AJ515703	75,3
Neurospora crassa, hipotética XM_324477	68,9
Humicola grisea var thermoidea, EGL3, AB003107	67,5
Humicola insolens EG5, A23635	67,3
Myceliophthora thermophila fam 45, AR094305	57,9
Semelhante a EG 40 de Acremonium thermophilum	53,7
Semelhante EG_40 de Acremonium thermophilum
Myceliophthora thermophila fam 45, AR094305	66,9
Magnaporthe grisea 70-15 hipotética, XM_363402	61,9
Thielavia terrestris EG45, CQ827970	56,8
EG_40 de Acremonium thermophilum	53,7
Melanocarpus albomyces Cel45, AJ515703	52,8

Exemplo 4. Produção de celulases semelhante a EG 40 e EG 40 de

Acremonium thermophilum em Trichoderma reesei [00138] Plasmídeos de expressão foram construídos para produção das celulases semelhante EG_40/Cel45B e EG_40/Cel45A de A. thermophilum recombinantes. Ambos os genes (cel45A ou cel45B), incluindo sua própria seqüência sinal, foram exatamente fundidos ao promotor cbh1 (cel7A) de T. reesei através de PCR (Tabela 6). O promotor cbh1, terminador cbh1 e gene marcador amdS foram incluídos como descrito em Paloheimo et al. 2003, supra. O cassete de expressão linear (Figura 1) foi isolado da cadeia principal de vetor através de digestão com enzima de restrição, transformado em T. reesei A96, e transformantes selecionados com acetamida como a única fonte de nitrogênio. A cepa hospedeira carece de quatro principais celulases endógenas: CBHl/Cel7A, CBHll/Cel6A, EGI/Cel7B e EGII/Cel5A. As

Petição 870170051579, de 21/07/2017, pág. 48/79

38/61 transformações foram realizadas de acordo com Penttila et al., 1987, com as modificações descritas em Karhunen et al., 1993. Os transformantes foram purificados sobre placas de seleção através de conidia simples antes de esporulação dos mesmos sobre agar extrato de batata.

Tabela 6. Os cassetes de expressão construídos para produção de celulases semelhante EG 40 e EG 40 de Acremonium thermophilum em Trichoderma reesei. A estrutura esquemática dos cassetes de expressão é descrita na Figura 1

Endoglicanase	Plasmídeo de expressão	Tamanho de cassete de expressão(a	Terminador heterólogo(b
At EG 40	pALK1920	10,9 kb Notl	156 pb (HindIII)
Semelhante At EG 40	pALK1921	8,6 kb EcoRI	282 pb (Sspl)

^(a O cassete de expressão para transformação de T. reesei foi isolado da cadeia principal de vetor através de digestão com EcoRI ou Notl.

^(b O número de nucleotídeos após o códon de interrupção do gene clonado que são incluídos no cassete de expressão é indicado. O sítio de restrição na região-3' do gene que foi usado em construção do cassete de expressão é indicado em parênteses.

[00139] A produção de endoglicanase dos transformantes foi analisada a partir de sobrenadantes de cultura de cultivos em frascos de agitação (50 mL). Os transformantes foram crescidos por 7 dias em um meio de indução de celulose complexo (Joutsjoki et al., 1993) tamponado com KH₂PO₄ 5% em pH 5,5. A atividade de enzima da proteína recombinante foi medida a partir do sobrenadante de cultura como a liberação de açúcares redutores de carboxi metil celulose (CMC 2%) a 50^oC em tampão Sitrate 50 mM pH 4,8 essencialmente como descrito por Bailey, M.J. e Nevalainen, K.M.H., 1981; Haakana, H. et al., 2004. Produção da proteína recombinante também foi detectada a partir do sobrenadante de cultura por eletroforese de gel de poliacrilamida

Petição 870170051579, de 21/07/2017, pág. 49/79

39/61

- SDS. Anticorpos policlonais específicos para EG_40 foram produzidos em coelhos (University of Helsinki, Finland). A expressão de celulase EG_40 foi verificada por análises de Western blot com anticorpos anti-EG_40 usando o sistema ProtoBlot Western blot AP (Promega). Os genótipos dos transformantes escolhidos foram analisados por Southern blotting usando o cassete de expressão como uma sonda. [00140] O pH ótimo das celulases semelhante EG_40/Cel45B e EG_40/Cel45A produzidas heterologamente foi determinado no tampão de McIIvaine universal dentro de uma faixa de pH de 4,0-8,0 usando CMC como um substrato. Como mostrado na Figura 2A, a faixa de pH de celulase EG_40/Cel45A é relativamente ampla (4,5-6,0), o ótimo estando em pH 5,5. O pH ótimo para semelhante a EG_40/Cel45B foi determinado ser pH 5,0-5,5. A temperatura ótima para atividade enzimática de celulases EG_40/Cel45A e semelhante a EG_40/Cel45B foi determinada ser 75-80^oC e 60^oC, respectivamente (Figura 2B). A estabilidade térmica da celulase EG_40/Cel45A produzida heterologamente é comparável àquela da proteína purificada.

[00141] Os transformantes escolhidos RF6118 (At EG_40) e RF6071 (semelhante a At EG_40) foram cultivados em um bio-reator de 2 litros por quatro dias (28^oC, pH 4,2) para obter material para os testes de aplicação (ver exemplos 8 a 13).

Exemplo 5. Construção e produção de celulases EG 40 modificadas de Acremonium thermophilum [00142] Processos de biologia molecular padrão foram usados como descritos em Exemplo 3. A seqüência sinal de celulase EG_40 foi substituída com aquela de Trichoderma reesei CBHI. O uso da seqüência sinal endógena de hospedeiro foi esperado aperfeiçoar a produção de proteína heteróloga. De modo a amplificar o fragmento 5' do gene At cel45A dois oligonucleotídeos foram desenhados. O iniciador sentido

Petição 870170051579, de 21/07/2017, pág. 50/79

40/61 (ATTAACCGCGGACTGCGCATCATGTATCGGAAGTTGGCCGTCATCTCGG

CCTTCTTGGCCACAGCTCGTGCCCTCGACGGAAAGTCGAC, SEQ ID NO; 22) contém a seqüência sinal de cel7A de T. reesei e o iniciador antisentido (tcgactgcaccaccatggtc, seq id NO: 23) θ específico para At cel45A. O gene de inteiro comprimento foi reconstituído por ligação do produto de PCR amplificado como um fragmento Sacll-Ncol com a extremidade 3' do gene At cel45A.

[00143] Subseqüentemente, o domínio de ligação de carboidrato de EG_40/Cel45A foi modificado: Três construtos foram preparados contendo o domínio catalítico de EG_40/Cel45A (aminoácidos 22-234 de SEQ ID NO: 2) ligado à região ligante e CBD de Trichoderma reesei CBHI/Cel7A (SEQ ID NO: 24), Acremonium thermophilum ALKO4245 XYN60/Xyn10A (SEQ ID NO: 25), ou Chaetomium thermophilum ALKO4265 CBHI/Cel7A (SEQ ID NO: 26). O ligante e região CBD do gene codificando CBHI/Cel7A de T. reesei (cel7A, SEQ ID NO: 27), gene codificando ALKO4245 XYN60/Xyn10A de A. thermophilum (xynlOA, SEQ ID NO: 28), ou gene codificando CBHI/Cel7A ALKO4265 de C. thermophilum (cel7A, SEQ ID NO:29) foi amplificado por PCR usando combinações de oligonucleotídeos de

CGGCGGCAAC (SEQ ID NO: 30) + TAATTCTGCAGTTACAGGCACTGAGAGTAG (SEQ ID NO: 31), w TTGGATCCGATAATTCTGCAGTCACAGGCACTGAGAGTACCAGT (SEQ ID NO: 33), _ou TAATTTACGTACCTGGCCTTGACGGCAG (SEQ ID NO; 34) + attaactgcagttacaggcactgttgagca (seq id NO: 35), respectivamente Os produtos de PCR amplificados foram ligados ao gene cel45A para criação de genes Atcel45SA_Tr cel7AligadorCBD (SEQ ID NO: 36), At cel45A_At xynlOAligadorCBD (SEQ ID NO: 37), ou At cel45A_Ct cel7Aligador CBD (SEQ ID NO: 38). Os plasmídeos resultantes foram denominados como pALK2022, pALK2024, e pALK2026. Os números

Petição 870170051579, de 21/07/2017, pág. 51/79

41/61 de depósitos das correspondentes cepas de E. coli no Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH culture collection são DSM 18815, DSM 18816, e DSM 18817, respectivamente. Os depósitos foram sob o Tratado de Budapeste.

[00144] Plasmídeos de expressão para a produção de proteínas EG_40/Cel45A modificadas foram construídos e as proteínas recombinantes EG_40_TrCBD (SEQ ID NO: 39), EG_40_AtCBD(SEQ ID NO: 40), e EG_40_CtCBD (SEQ ID NO: 41) foram produzidos em Trichoderma como descrito no Exemplo 4. A temperatura e pH ótimos das celulases EG_40/Cel45A modificadas foram similares àqueles da proteína tipo selvagem. Os transformantes escolhidos RF6828 (EG_40_TrCBD), RF6835 (EG_40_AtCBD), e RF6821 (EG_40_CtCBD) foram cultivados em um bio-reator de 2 litros por quatro dias (28^oC, pH 4,2) para obter material para os testes de aplicação (Exemplos 9 e 13).

Exemplo 6. Construção e produção de celulases EG 40 ALKO4245 de Acremonium thermophilum carecendo de domínio de ligação de carboidrato ou domínio de ligação de carboidrato plus a região ligante [00145] Para produzir celulases EG_40 ALKO4245 Acremonium thermophilum carecendo de domínio de ligação de carboidrato (CBD), dois constructos de supressão de cel45A, At cel45A_sem CBD, ou o CBD plus a região ligante, At cel45A_ligante sem CBD foram feitos; a primeira carecendo de região codificando o CBD e a segunda adicionalmente carecendo de região ligante entre o núcleo catalítico e o domínio de ligação de carboidrato.

[00146] Processos padrão de biologia molecular foram usados como descrito no Exemplo 3. Dois fragmentos-3' de diferentes comprimentos do gene cel45A foram amplificados por PCR. Os iniciadores anti-sentido foram desenhados para excluírem o CBD ou a região ligante + CBD a partir do produto. Um produto PCR amplificado com

Petição 870170051579, de 21/07/2017, pág. 52/79

42/61 iniciadores GCAGCAACCAGTTCGACCTC (SEQ ID NO: 42) e TTAACTGCAGTCACTGGGCAGTGCAGCCACCGCCTC (SEQ ID NO: 43) foi ligado como um fragmento Saci-Pstl e um outro fragmento de PCR amplificado com iniciadoires ACTGCTGCAAGCCGTCCTGC (SEQ ID NO: 44) e TTAACTGCAGTCAACCGCTAGGCGGGTTGAAGACGGGATAG (SE IN NO: 45) como um fragmento Ncol-Pstl para o fragmento 5' do gene cel45A para reconstituir inteiro comprimento de genes At cel45A_sem CBD (SEQ ID NO: 16) e At cel45A_ligante sem CBD (SEQ ID NO: 18), respectivamente. Os plasmídeos resultantes foram nomeados como pALK2009 e pALK2014. Os números de depósitos das correspondentes cepas de E. coli no Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen BmbH culture collection são DSM 18813, e DSM 18814, respectivamente. Os depósitos foram feitos sob o Tratado de Budapeste.

[00147] Plasmídeos de expressão para a produção das versões sem CBD e ligante sem CBD de celulase EG_40/Cel45A de A. thermophilum foram construídos e as proteínas recombinantes (SEQ ID NO: 17 e 19, respectivamente) foram produzidas em Trichoderma como descrito no Exemplo 4.

Exemplo 7. Construção e produção da proteína de fusão CBD + semelhante a EG 40 ALKO4245 Acremonium thermophilum recombinante [00148] Para produção de uma proteína de fusão CBD + semelhante EG_40 ALKO4245 Acremonium thermophilum (SEQ ID NO: 21), o domínio de ligação de carboidrato (CBD) da celulase EG_40/Cel45A é ligado à celulase semelhante a EG_40. O constructo contem o domínio catalítico de semelhante a EG_40 (aminoácidos 1-242 do polipeptídeo de inteiro comprimento) ligado à região ligante e CBD de celulase EG_40 (aminoácidos 235-297 do polipeptídeo de inteiro comprimento). [00149] Processos padrão de biologia molecular são usados como descrito no Exemplo 3. Primeiro, um sítio de restrição Nrul único pró

Petição 870170051579, de 21/07/2017, pág. 53/79

43/61 ximo de extremidade terminal-C da seqüência semelhante a EG_40 é introduzido por PCR. Isto permite fusão direta de qualquer DNA de extremidade embotada após aminoácido S242 do polipeptídeo semelhante a EG_40. A região ligante + CBD do gene codificando EG_40 (cel45A) é amplificada por PCR e um seu fragmento de restrição ligado ao gene cel45B (após S242) para criar At cel45B_cel45AligadorCBD (SEQ ID NO: 20). Plasmídeo de expressão para produção da celulase semelhante a EG_40CBD é construído e a proteína recombinante (SEQ ID NO: 21) produzida em Trichoderma como descrito no Exemplo 4.

Exemplo 8. Performance de preparação de celulase EG 40 em acabamento de denim em diferentes temperaturas [00150] Celulase EG_40 de Acremonium thermophilum da cepa RF6118 produzida usando Trichoderma reesei como hospedeiro como descrito no exemplo 4 foi testada para sua habilidade para criar visual abrasivado similar àquele provido por pedras-pomes em bioestonagem de denim em diferentes temperaturas. Uma preparação enriquecida com EGII comercial produzido usando Trichoderma como hospedeiro (US 5 874 293) eficiente em acabamento de denim foi usada para comparação a 50^oC.

[00151] Jeans fabricados de sarja de denim tingido com índigo foram usados como material teste após retirada de cola com alfa amilase ECOSTONE A200. Os tratamentos com celulase foram realizados com extrator lavador Electrolux's Wascator FOM 71 CLS sob as condições descritas na Tabela 7.

[00152] O concentrado de enzima estabilizado enriquecido com EGII foi dosado em 0,23% sobre o peso do tecido, que é uma dosagem típica para a preparação em aplicações industriais. Uma preparação de EG_40 estabilizada e concentrada obtida de uma fermentação piloto foi dosada em 0,18%. Quando calculadas [como proteína] em

Petição 870170051579, de 21/07/2017, pág. 54/79

44/61 termos do teor de proteína, as dosagens foram aproximadamente 0,20 mg e 0,035 mg por g de tecido usando o Bio-Rad Protein Assay Dye Reagent (BioRad, Hercules, CA,USA) e gama globulina bovina como o padrão. A enzima celulase foi inativada após drenagem através de elevação de pH acima de 11 através de uma adição de 5 g de NaOH (10 minutos, 40^oC) e rinsagem três vezes. Os jeans foram secados em uma báscula.

[00153] O efeito de bioestonagem / nível de abrasão foi avaliado através de medição de cor como valores de refletância com espectrofotômetro Minolta CM 2500 usando coordenadas de espaço cor L*a*b* (iluminador D65/2^o). A cor do lado de face e o lado reverso de denim foi medida após retirada de cola (isto é, antes de tratamento com celulase) e após o tratamento com celulase. Cada valor de medição sobre o lado de face de denim foi uma média de aproximadamente 40 medições. Dois pares de jeans foram usados em cada teste e o resultado final foi a média dos mesmos. Os resultados são mostrados na Tabela 8 e Fig. 3.

Tabela 7. As condições de teste / parâmetros de processo usados em tratamentos com celulase

Parâmetro de Processo
Carga de denim	1,3-1,4 kg
Água	19 litros
Controle de pH (pH 5-5,3)	5 mL de ácido acético (80%)
Tempo	45 minutos
Temperatura	40, 50, 60, ou 70oC
Dosagem de celulase	0,18% ou 0,23% sobre o peso do tecido

Petição 870170051579, de 21/07/2017, pág. 55/79

Tabela 8. Medições de cor do lado de face de denim tratado com preparação de EG 40 em diferentes temperaturas

Preparação de enzima	Dosagem, % owfa)	Proteína, mg/g de tecido	Temperatura, oC	Antes de tratamento com celulase	Após tratamento com celulase	Aumento de L*
L*	b*	L*	b*
Conc. Enriquecido com EGII	0,23	0,20	50	22,24	-15,57	30,08	-17,64	7,84
EG 40 conc.	0,18	0,035	70	21,88	-15,54	31,07	-16,76	9,20
EG 40 conc.	0,18	0,035	60	22,21	-15,40	34,16	-16,34	11,95
EG 40 conc.	0,18	0,035	50	22,00	-15,22	30,10	-17,26	8,10
EG 40 conc.	0,18	0,035	40	22,13	-14,98	27,26	-17,50	5,13

^a) sobre o peso do tecido

45/61

Petição 870170051579, de 21/07/2017, pág. 56/79

46/61 [00154] Tratamento com preparação enriquecida com EGII foi usado para comparação em 50^oC. L* indica a suavidade, -b* é a direção azul, +b* é a direção amarela.

[00155] Resultados na Tabela 8 e Fig. 3 mostram que o efeito de bioestonagem de EG_40foi muito bom em uma baixa faixa de dosagem. Com o nível de abrasão similar a preparação de EG_40 (suavidade L*) comparado à preparação enriquecida com EGII foi obtida a 50^oC com uma quantidade de proteína 6 vezes menor.

Exemplo 9. Performance de celulases EG 40 modificadas em acabamento de denim [00156] Celulases EG_40 de Acremonium thermophilum modificadas produzidas em Trichoderma reesei como descrito no Exemplo 5 foram testadas para sua habilidade para criarem visual abrasivado similar àquele provido por pedras pomes em bioestonagem de denim. Proteínas recombinantes EG_40_TrCBD, EG_40_AtCBD, e EG_40_CtCBD foram comparadas a celulase EG_40 tipo selvagem (Exemplo 4).

[00157] Pernas de denim fabricadas de denim tingido com índigo de diferente tipo foram usadas como material teste após retirada de cola com alfa amilase ECOSTONE A200. Os tratamentos com celulase foram realizados com extrator lavador Electrolux's Wascator FOM 71 CLS sob as condições descritas na Tabela 9.

[00158] Preparações de celulase foram dosadas em 200 nkat/g sobre o peso de tecido. A atividade endoglicanase foi medida como no Exemplo 4, exceto que CMC 3% e 60^oC foram usados. A enzima celulase foi inativada após drenagem através de elevação de pH acima de 11 com adição de 4,2 g de NaOH (10 minutos, 40^oC) e rinsando três vezes. As pernas de denim foram secadas em um tambor.

[00159] O efeito de bioestonagem / nível de abrasão foi avaliado através de medição de cor sobre o lado de face de denim como no

Petição 870170051579, de 21/07/2017, pág. 57/79

47/61

Exemplo 8. Cada valor de medição sobre o lado de face de perna de denim foi uma média de aproximadamente 20 medições. O resultado final foi a média de três diferentes denims de Ukos Sport, Belgium (Intrique, Atlanta, Nostalgy). Os resultados são mostrados na Tabela 10.

Tabela 9. As condições de teste / parâmetros de processo usados em tratamentos com celulase

Parâmetro de processo
Carga de denim	1,1 kg
Água	17 litros
Controle de pH (pH 5)	27 g de Na2HPO4 2H2O + 19 g de ácido cítrico
Tempo	55 minutos
Temperatura	60oC
Dosagem de celulase	200 nkat/g de tecido

Petição 870170051579, de 21/07/2017, pág. 58/79

Tabela 10. Medições de cor do lado de face de denim tratado com diferentes celulases EG 40 a 60^oC e pH 5

Celulase	Denim	Dosagem nkat/ga)	Antes de tratamento com celulase	Após tratamento com celulase	Aumento de L*
L*	b	L*	b
EG_40_TrCBD	Intrigue		20,56	-9,88	26,43	-12,22	5,87
Atlanta		21,22	-16,41	25,99	-18,40	4,77
	Nostalgy	19,70	-10,26	24,49	-13,11	4,79
Média	200	20,49	-12,18	25,64	-14,58	5,14
EG_40_AtCBD	Intrigue		20,63	-10,01	27,08	-12,61	6,45
Atlanta		21,26	-16,6	27,11	-18,41	5,85
	Nostalgy	19,56	-10,08	24,18	-13,24	4,62
Média	200	20,48	-12,23	26,12	-14,75	5,64
EG_40_CtCBD	Intrigue		20,58	-9,91	26,97	-11,94	6,39
Atlanta		21,19	-16,45	26,61	-18,06	5,42
	Nostalgy	19,70	-10,17	23,71	-12,53	4,01
Média	200	20,49	-12,18	25,76	-14,18	5,27
EG_40	Intrigue		20,59	-9,76	26,56	-12,24	5,97
Atlanta		21,26	-16,59	26,83	-18,52	5,57
	Nostalgy	19,61	-10,12	24,32	-13,09	4,71
Média	200	20,49	-12,16	25,90	-14,62	5,42

^a) sobre o peso do tecido.

^b) L* indica a suavidade, -b* é a direção azul, +b* é a direção amarela.

48/61

Petição 870170051579, de 21/07/2017, pág. 59/79

49/61 [00160] Os resultados na Tabela 10 mostram que o efeito de bioestonagem das preparações de EG_40 modificada foi comparável àquele obtido através do uso de preparação de EG_40 contendo celulase tipo selvagem.

Exemplo 10. Reforço de performance de lavagem de preparação de enzima enriquecida com EGII com celulase EG 40 em acabamento de denim [00161] O efeito da celulase EG-40 com preparação enriquecida com EGII foi testado em bioestonagem de denim. O denim e sistema de teste para bioestonagem foram como no Exemplo 8, exceto a temperatura, que foi de 50^oC. Também o efeito do tratamento com celulase foi avaliado como no Exemplo 8. Preparações de enzima foram dosadas em 3-5 gramas resultando em 0,22-0,38% sobre o peso do tecido (Tabela 11).

[00162] Os resultados na Tabela 11 e Fig. 4 mostram que EG_40 também pode ser usada para aperfeiçoar o efeito de abrasão de uma preparação enriquecida com EGII. Com a preparação enriquecida com EGII sozinha níveis de suavidade similares àqueles obtidos pela mistura contendo 70% do concentrado enriquecido com EGII e 30% de concentrado de celulase EG_40 não podem ser obtidos mesmo com uma dosagem aumentada.

Petição 870170051579, de 21/07/2017, pág. 60/79

Tabela 11. Medições de cor do lado de face de denim tratado a 50^oC com mistura de preparações de EG 40 e enriquecida com EGII comparado a enriquecida com EGII sozinha

Preparação de enzima	Dosagem, g	Dosagem, % owfa)	Antes de tratamento com celulase	Após tratamento com celulose	Aumento de suavidade
L*	b*	L*	b*
Conc. enriquecido de EGII	5	0,38	22,32	-15,47	31,72	-17,50	9,40
Conc. enriquecido de EGII	3	0,23	22,24	-15,57	30,08	-17,64	7,84
EGII + mistura EG_40 70%+30%	4,3	0,33	22,20	-15,53	32,31	-17,46	10,11
EGII + mistura EG_40 70%+30%	3	0,22	22,18	-15,74	32,03	-17,55	9,85

^a) sobre o peso do tecido ^b) L* indica a suavidade, -b* é a direção azul, +b* é a direção amarelo.

50/61

Petição 870170051579, de 21/07/2017, pág. 61/79

51/61

Exemplo 11. Performance de preparação de celulase semelhante a EG 40 em acabamento de denim [00163] Líquido de fermentação semelhante a EG_40 de cepa RF6071 produzido como descrito no Exemplo 4 a um concentrado enriquecido de EGII em bioestonagem de denim. O denim e sistema de teste para bioestonagem foram como no Exemplo 8, exceto para a temperatura, que foi de 60^oC e a quantidade de denim, que foi nivelada para 1430 g com uma peça extra de denim diferente que não foi incluída nas medições. Também o efeito do tratamento com celulase foi avaliado como no Exemplo 8.

[00164] Os resultados na Tabela 12 mostram que o efeito de abrasão de semelhante a EG_40 foi obtido com menos contramanchamento (redeposição de corante índigo) sobre o lado reverso de denim. Especialmente a suavidade dos bolsos foi maior e eles foram menos azuis.

Petição 870170051579, de 21/07/2017, pág. 62/79

Tabela 12. Medições de cor da face e lado reverso de denim e bolsos tratados a 60^oC com preparação de semelhante a EG 40

Preparações de enzima	Dosagem	Prot., mg/g tecido	Antes de tratamento com celulase	Após tratamento com celulase	DeltaL*	Deltab*
L*	b*	L*	b*
Lado de face:
Semelhante EG 40	100 ml	0,2	23,78	-16,20	31,09	-17,36	7,31	-1,16
Enriquecido EGII	1,5 g	0,095	23,64	-16,28	31,09	-17,39	7,45	-1,11
Lado reverso:
Semelhante EG 40	100 ml	0,32	49,24	-7,34	47,74	-11,39	-1,50	-4,05
Enriquecido EGII	1,5 g	0,095	49,32	-6,97	47,24	-11,78	-2,09	-4,81
Bolsos:
Semelhante EG 40	100 ml	0,32	75,42	-8,78	66,39	-13,20	-9,03	-4,42
Enriquecido EGII	1,5 g	0,095	76,63	-7,95	64,41	-13,91	-12,22	-5,96

52/61

Petição 870170051579, de 21/07/2017, pág. 63/79

53/61

Tratamento com preparação enriquecida de EGII foi usado para comparação. L* indica a suavidade, -b* é a direção azul, +b* é a direção amarelo.

Exemplo 12. Performance de preparação enriquecida de EGII e EG 40 reforçada com EG 40 em bioacabamento (retirada de felpa) [00165] A habilidade da preparação RF6118 EG_40 concentrada e a habilidade de preparação enriquecida de EGII reforçada com EG_40 em retirada de felpa de roupa de malha de algodão foram comparadas a uma preparação enriquecida de EGII comercial, tipicamente usada em formulações de bioacabamento. Os tratamentos com celulase foram realizados com extrator lavador Electrolux's Wacator FOM 71 CLS sob as condições descritas na Tabela 13.

[00166] Peças de dois tipos de suéteres de colarinho pólo azuis de baixa qualidade com superfície penugenta, fabricadas de tecido baseado em jérsei de algodão 100% ou fabricadas com nervura de 95% de algodão e 5% de lycra, foram usadas como material teste. Material de enchimento foi adicionado até 1 kg. Amostras foram primeiro prélavadas por 10 minutos a 60^oC com 1 mL/L tensoativos / agentes umectantes (Sandoclean PCJ de Sandos and Imacol CN de Clariant) e rinsadas 3 vezes. Após isto as malhas de algodão foram tratadas com celulase a 60^oC por 60 minutos na presença dos mesmos auxiliares têxteis usados em pré-lavagem. A enzima foi inativada como descrito no Exemplo 8, exceto para a temperatura que foi 60^oC durante a rinsagem alcalina, e as peças de malha foram rinsadas três vezes e secadas no tambor.

Petição 870170051579, de 21/07/2017, pág. 64/79

54/61

Tabela 13. As condições de teste / parâmetros de processo usados em tratamentos de bioacabamento

Parâmetro de processo
Carga de tecido	1,0 kg
Agua	15 litros
Sandoclean PCJ e Imacol CN	1 mL/L
Tampão / controle de pH (pH 5-5,3)	Aproximadamente 3 mL de ácido acético (80%)
Tempo	60 minutos
Temperatura	60oC
Dosagem de celulase	0,04% a 0,63% sobre o peso do tecido

[00167] O efeito do tratamento com celulase foi avaliado visualmente com o olho nu e com uma lupa. Amostra pré-lavada sem enzima foi usada como controle. Os resultados são mostrados na Tabela 14 e fotos de câmera digital tomadas com uma macroobjetiva são mostradas na Fig. 5.

[00168] A preparação de EG_40 e a preparação enriquecida de EGII reforçada com EG_40 tiveram excelentes propriedades de retirada de felpa comparadas à preparação enriquecida de EGII comercial que foi usada em faixa de dosagem típica para este concentrado de enzima na aplicação de bioacabamento. Com a preparação de EG_40 dosagem pelo menos 8 vezes menor e com a mistura de EG_40 - enriquecida de EGII em dosagens pelo menos 4 vezes menores podem ser usadas que com a preparação de EGII para obter efeito similar.

[00169] Os níveis de proteína no sobrenadante de cultura de bioreator são um pouco menores com a cepa RF6118 que a cepa produtora de Trichoderma da preparação enriquecida de EGII, quando ensaiados com o ensaio de determinação de proteína usado. A despeito disto, o meio de cultura de EG_40 é volumetricamente pelo menos 4-6 vezes mais efetivo em bioacabamento.

Petição 870170051579, de 21/07/2017, pág. 65/79

55/61

Tabela 14. Os resultados de tratamentos de bioacabamento com preparações enriquecidas de EGII e EG 40 reforçadas com EG 40 comparadas com enriquecida de EGII sozinha

Amostra	Dosagem G	Dosagem, % owfa)	Efeito de retirada de felpab)	Prot mg/g tecido
Conc. enriquecido de EGII	6,3	0,63	+++++	0,55
Conc. enriquecido de EGII	3,2	0,32	+++	0,27
Mistura de enriquecido de EGII + EG_40 70%+13%	3,2	0,32	+++++	0,21
Mistura enriquecido de EGII+EG_40 70%+13%	1,6	0,16	+++++	0,10
Mistura enriquecido de EGII+EG_40 70%+13%	0,8	0,08	+++	0,052
Conc. de EG40	1,6	0,16	+++++	0,050
Conc. de EG 40	0,8	0,08	+++++	0,025
Conc. de EG 40	0,4	0,04	+++	0,012
Somente pré-lavada, sem enzima	-	-	-	-

^a) sobre o peso de tecido ^b) +++++ excelente efeito de retirada de felpa, superfície visualmente muito limpa +++ efeito de retida de felpa bom, superfície visualmente relativamente limpa

- densa formação de cotão de superfície / e/ou severa formação de felpa

Exemplo 13. Performance de celulases EG 40 modificadas em bioacabamento (retirada de felpa)

Petição 870170051579, de 21/07/2017, pág. 66/79

56/61 [00170] Celulases EG_40 de Acremonium thermophilum modificadas produzidas em Trichoderma reesei como descrito no exemplo 5 foram testadas para sua habilidade em retirada de felpa de roupa de malha de algodão. Proteínas recombinantes EG_40_TrCBD, EG_40_AtCBD, e EG_40_CtCBD foram comparadas a celulase EG_40 tipo selvagem. Os tratamentos com celulase foram realizados com extrator lavador Electrolux's Wascator FOM 71 CLS sob as condições descritas no exemplo 12, exceto que a enzima foi dosada em 83 nkat/g de tecido. Atividade endoglicanase foi medida como descrito no Exemplo 9.

[00171] Peças de três diferentes roupas de malha com superfície coberta de cotão, fabricadas de 100% algodão ou 95% algodão e 5% lycra, foram usadas como material de teste. Material de enchimento foi adicionado até 1 kg. Amostras foram tratadas como descrito no Exemplo 12. O efeito do tratamento com celulase foi avaliado visualmente com o olho nu e com uma lupa. Amostra pré-lavada sem enzima foi usada como controle. Os resultados são mostrados na Tabela 15.

[00172] Todas as preparações de EG_40 tiveram excelentes propriedades de retirada de felpa conduzindo a extensiva redução em cobertura de cotão e prevenção da formação de felpa. Amostras controles, tratadas sem enzima contiveram densa superfície coberta de cotão e severa formação de felpa.

[00173] Os testes preliminares realizados a 50^oC e 30 minutos usando dosagem de enzima de 42 nkat/g de tecido mostraram que todas as diferentes celulases EG_40 também tiveram considerável efeito de retirada de felpa, quando menores dosagens e/ou tempo de reação menor é usado.

Petição 870170051579, de 21/07/2017, pág. 67/79

57/61

Tabela 15. Os resultados de tratamentos de bioacabamento com diferentes celulases EG 40

Amostra	Dosagem, nkat/g de tecido	Efeito de retirada de felpa
EG 40 TrCBD	83	+++++
EG 40 AtCBD	83	+++++
EG 40 CtCBD	83	+++++
EG 40	83	+++++
Lavada sem enzima	-	-

+++++ excelente efeito de retirada de felpa, superfície visualmente muito limpa

- densa superfície coberta de cotão / e/ou severa formação de felpa Lista de organismos depositados

Acremonium thermophilum ALKO4245 foi depositado no Centralbureau Voor Schimmelcultures at Uppsalalaan 8, 3584 CT, Utrecht, the Netherlands (CBS) em 20 de setembro de 2004 sob CBS 116240.

Escherichia coli ontendo plasmídeo pALK1908 foi depositado em Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH (DSM), Mascheroder Weg 1 b, D-38124 Braunschweig, Germany em 13 de maio de 2005, sob DSM 17324.

Escherichia coli ontendo plasmídeo pALK1904 foi depositado em Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH (DSM), Mascheroder Weg 1 b, D-38124 Braunschweig, Germany em 13 de maio de 2005, sob DSM 17323.

Escherichia coli ontendo plasmídeo pALK2009 foi depositado em Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH (DSM), Mascheroder Weg 1 b, D-38124 Braunschweig, Germany em 24 de novembro de 2006, sob DSM 18813.

Escherichia coli ontendo plasmídeo pALK2014 foi depositado em Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen

Petição 870170051579, de 21/07/2017, pág. 68/79

58/61

GmbH (DSM), Mascheroder Weg 1 b, D-38124 Braunschweig, Germany em 24 de novembro de 2006, sob DSM 18814.

Escherichia coli ontendo plasmídeo pALK2022 foi depositado em Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH (DSM), Mascheroder Weg 1 b, D-38124 Braunschweig, Germany em 24 de novembro de 2006, sob DSM 18815.

Escherichia coli ontendo plasmídeo pALK2024 foi depositado em Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH (DSM), Mascheroder Weg 1 b, D-38124 Braunschweig, Germany em 24 de novembro de 2006, sob DSM 18816.

Escherichia coli ontendo plasmídeo pALK2026 foi depositado em Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH (DSM), Mascheroder Weg 1 b, D-38124 Braunschweig, Germany em 24 de novembro de 2006, sob DSM 18817.

Referências

Altschul SF, W Gish, W Miller, EW Myers and DJ Lipman. 1990. Basic local alignment search tool. J. Mol. Biol. 215:403-410.

Bailey MJ and KMH Nevalainen 1981. Induction, isolation and testing of stable Trichoderma reesei mutants with improved production of solubilization cellulase. Enz. Microbiol Technol. 3:153-157.

Bendtsen JD, H Nielsen, G von Hejine and S Brunak. 2004. Improved prediction of signal peptides: SignalP 3.0. J. Mol. Biol. 340:783-795.

Gasteiger, E, A Gattiker, C Hoogland, I Ivanyl, RD Appel and A Bairoch. 2003. ExPASy: the proteiomics server for in-depth protein knowledge and analysis. Nucleic Acids Res. 31:3784-3788.

Gupta, R., E. Jung and S. Brunak. 2004. Prediction of Nglycosylation sites in human proteins, In preparation. www.cbs.dtu.dk/services/NetNGIyc/

Nierstrasz V.A. and Warmoeskerken M.M.C.G. (2003) Pro

Petição 870170051579, de 21/07/2017, pág. 69/79

59/61 cess engineering and industrial enzyme applications. In: Textile processing with enzymes. A.Cavaco-Paulo and G.M.Gübitz (eds.) Woodhead Publishing Ltd, Cambridge. pp. 120-157.

Haakana H, A Miettinen-Oinonen, V Joutsjoki, A Mantyla, P Suominen, and J Vehmaanpera. 2004. Cloning of cellulase genes from Melanocarpus albomyces and their efficient expression in Trichoderma reesei. Enz Microbiol Technol. 34: 159-167.

Henrissat B. (1991) A classification of glycosyl hydrolases based on amino acid sequence similarities. Biochem. J. 280: 309-316.

Henrissat B. and Bairoch A. (1993) New families in the classification of glycosyl hydrolases bases on amino acid sequence similarities. Biochem. J. 293: 781-788.

Henrissat B. and Bairoch A. (1996). Updating the sequencebased classification of glycosyl hydrolases. Biochem. J. 316:695-696.

IUPAC (International Union of Pure and Applied Chemistry) (1987). Measurement of cellulase activities. Pure and Appl. Chem. 59:257-268.

Joutsjoki, VV, TK Torkkeli and KMH Nevalainen. 1993. Transformation of Trichoderma reesei with the Hormoconis resinae glucoamylase P (gamP) gene: production of a heterologous glucoamylase by Trichoderma reesei. Curr. Genet. 24:223-228.

Karhunen T, A Mantyla, KMH Nevalainen and PL Suominen. 1993. High frequency one-step gene replacement in Trichoderma reesei. I. Endoglucanase I overproduction. Mol. Gen. Genet. 241:515522.

Lowry OH, NJ Reseborough, AL Farr and RJ Randall. 1951. Protein measurement with the Folin phenol reagent. J. Biol. Chem 193: 265-275.

Malardier L, Daboussi MJ, Julien J, Roussel F, Scazzocchio C and Brygoo Y. 1989. Cloning of the nitrate reductase gene (niaD) of

Petição 870170051579, de 21/07/2017, pág. 70/79

60/61

Aspergillus nidulans and its use for transformation of Fusarium oxysporum. Gene 15:147-156.

Needleman S. and Wunsch C. (1970) A general method applicable to the search for similarities in the amino acid sequence of two proteins. Journal of Molecular Biology 48, 443-453.

Nielsen N., J. Engelbrecht, S. Brunak, and G. von Heijne. 1997. Identification of prokaryotic and eukaryotic signal peptides and prediction of their cleavage sites. Prot. Engineering 10:1-6.

Nierstrasz V.A. and Warmoeskerken M.M.C.G. (2003) Process engineering and industrial enzyme applications. In: Textile processing with enzymes. A. Cavaco-Paulo and G.M.Gübitz (eds.) Woodhead Publishing Ltd, Cambridge. pp. 120-157.

Paloheimo M, A Mantyla, J Kallio, and P Suomine. 2003. High-yield production of a bacterial xylanase in the filamentous fungus Trichoderma reesei requires a carrier polypeptide with an intact domain structure. Appl. Env. Microbiol. 69:7073-7082.

Penttila M, H Nevalainen, M Ratto, E Salminen and J Knowles. 1987. A versatile transformation system for the cellulolytic filamentous fungus Trichoderma reesei. Gene 61: 155-164.

Raeder U and P Broda. 1985. Rapid preparation of DNA from filamentous fungi. Lett. Appl. Microbiol. 1:17-20.

Rice P, Longden I and Bleasby A. (2000). EMBOSS: The European Molecular Biology Open Software Suite. Trends in Genetics 16:276-277.

Sambrook J, EF Fritsch and T Maniatis. 1989. Molecular cloning, a laboratory manual. Cold Spring Harbor Laboratory, New York, US.

Sambrook j and DW Russell. 2001. Molecular cloning, a laboratory manual. Cold Spring Harbor Laboratory, New York, US.

Ward M, Shan W. Daunberman J, Weiss G, Larenas E, Bo

Petição 870170051579, de 21/07/2017, pág. 71/79

61/61 wer B, Rey M, Clarkson K and Bott R. (1993) Cloning, sequence and preliminary structural analysis of a small, high pl endoglucanase (EGIII) from Trichoderma reesei. Proceedings of the second TRICEL symposium on TRICHODERMA REESEI CELLULASES AND OTHER HYDROLASES, Espoo, Finland, 1993, ed. by P. Suominen and T. Reinikainen. Foundation for Biotechnical and Industrial Fermentation Research 8 (1993): 153-158.

Claims (13)

1. REIVINDICAÇÕES

   1. Proteína de fusão endoglicanase, caracterizada pelo fato de que compreende o núcleo celuloliticamente ativo de um polipeptídeo tendo SEQ ID NO: 2, ligado a um domínio de ligação de carboidrato (CBD) heterólogo, em que o dito CBD e uma região ligante opcional são derivados de CBHI de Trichoderma reesei, xilanase de Acremonium sp., ou CBHI de Chaetomium thermophilum, e em que a proteína de fusão endoglicanase tem uma sequência de aminoácidos tendo SEQ ID NO:39, SEQ ID NO: 40 ou SEQ ID NO: 41, respectivamente.
2. 2. Polinucleotídeo isolado, caracterizado pelo fato de que possui uma sequência de nucleotídeos de SEQ ID NO: 36, 37 ou 38, em que o referido polinucleotídeo codifica a proteína de fusão endoglicanase como definida na reivindicação 1.
3. 3. Vetor de expressão, caracterizado pelo fato de que compreende a sequência de polinucleotídeo de SEQ ID NO: 36, 37 ou 38.
4. 4. Célula hospedeira de Trichoderma reesei, caracterizada pelo fato de que compreende um vetor de expressão como definido na reivindicação 3.
5. 5. Processo para a produção de um polipeptídeo endoglicanase, sendo um polipeptídeo como apresentado na SEQ ID NO: 2, ou uma proteína de fusão endoglicanase como definida na reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que compreende uma etapa de cultura do microrganismo como definido na reivindicação 4, e de recuperação do referido polipeptídeo.
6. 6. Preparação de enzima, caracterizada pelo fato de que compreende uma proteína de fusão endoglicanase, como definida na reivindicação 1.
7. 7. Processo para bioestonagem, caracterizado pelo fato de que compreende a etapa de adição de um polipeptídeo endoglicanase,

   Petição 870180143930, de 24/10/2018, pág. 10/24

   2/3 sendo um polipeptídeo como apresentado na SEQ ID NO: 2, ou um fragmento de polipeptídeo endoglicanase tendo uma sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 17 ou 19, ou uma proteína de fusão endoglicanase, como definida na reivindicação 1, ou uma preparação como definida na reivindicação 6, a tecido ou peças de roupa contendo algodão, tal como denim.
8. 8. Processo para bioacabamento, caracterizado pelo fato de que compreende a etapa de adição de um polipeptídeo endoglicanase, sendo um polipeptídeo como apresentado na SEQ ID NO: 2, ou um fragmento de polipeptídeo endoglicanase tendo uma sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 17 ou 19, ou uma proteína de fusão endoglicanase, como definida na reivindicação 1, ou uma preparação, como definida na reivindicação 6, a materiais têxteis como tecidos ou peças de roupa ou fio.
9. 9. Composição detergente, caracterizada pelo fato de que compreende um polipeptídeo endoglicanase, sendo um polipeptídeo como apresentado na SEQ ID NO: 2, um fragmento de polipeptídeo endoglicanase tendo uma sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 17 ou 19, ou uma proteína de fusão endoglicanase, como definida na reivindicação 1, ou uma preparação, como definida na reivindicação 6, e auxiliares, tais como agentes tensoativos, agentes alvejantes ou builders.
10. 10. Processo para tratamento de material têxtil contendo fibra celulósica, caracterizado pelo fato de que compreende contato do dito material têxtil com a composição detergente como definida na reivindicação 9.
11. 11. Processo para tratamento de polpa ou fibra derivada de madeira, caracterizado pelo fato de que compreende a etapa de adição de um polipeptídeo endoglicanase, sendo um polipeptídeo como apre

    Petição 870180143930, de 24/10/2018, pág. 11/24

    3/3 sentado na SEQ ID NO: 2, ou um fragmento de polipeptídeo endoglicanase tendo uma sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 17 ou 19, ou uma proteína de fusão como definida na reivindicação 1, ou uma preparação, como definida na reivindicação 6, à fibra secundária ou polpa química ou mecânica derivada de madeira.
12. 12. Processo para aperfeiçoamento de qualidade de alimentação animal, caracterizado pelo fato de que compreende tratamento de material de planta com um polipeptídeo endoglicanase, sendo um polipeptídeo como apresentado na SEQ ID NO: 2, ou um fragmento de polipeptídeo endoglicanase tendo uma sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 17 ou 19, ou uma proteína de fusão endoglicanase como definida na reivindicação 1, ou uma preparação como definida na reivindicação

    6.
13. 13. Cepa de Escherichia coli, caracterizada pelo fato de que apresenta número de acesso DSM 17324, DSM 18813, DSM 18814, DSM 18815, DSM 18816 ou DSM 18817.