PT763115E - Lacases purificadas de scytalidium e acidos nucleicos que as codificam - Google Patents

Description

MEMÓRIA DESCRITIVA

LACASES PURIFICADAS DE SCYTALIDIUM E ÁCIDOS NUCLÉICOS QUE AS CODIFICAM

Campo da invenção A presente invenção refere-se a fragmentos de ácidos nucléicos isolados que codificam uma enzima fúngica de óxido-reductase e às enzimas purificadas que se produzem desse modo. Mas particularmente, a invenção refere-se a fragmentos de ácidos nucléicos que codificam uma oxidase de fenol, concretamente uma lacase, de um fungo termófilo, Scytalidium.

Estado da técnica

As lacases (óxido-reductases de benzenodiol: oxigeno) são enzimas que contém cobre múltiplo que catalisa a oxidação de fenóis. As oxidações mediante lacase dão como resultado a produção de intermediários de radical ariloxi a partir de um substrato fenólico adequado; o acoplamento definitivo dos intermediários que se obtêm desta maneira fornece uma combinação de produtos de reação diméricos, oligoméricos, e poliméricos. Estes reações são de natureza importante para os meios biosintéticos que conduzem a formação de melanina, alcaloides, toxinas, ligninas e ácidos húmicos. As lacases obtém-se a partir de uma ampla variedade de fungos, entre os quais se incluem os ascomicetes como Aspergillus, Neurospora e Podospora, o deuteromiceto Botrytis, e basidiomicetes como Collybia, Fomes, Lentinus, Pleurotus, Trametes, e formas perfeitas de Rhizoctonia. A lacase mostra uma ampla margem de especificidade de substrato e normalmente cada lacase fúngica diferente só se diferencia quantitativamente de outras na sua capacidade 1 para oxidar substratos fenólicos. Devido à diversidade de substratos, geralmente encontrou-se múltiplas aplicações industriais potenciais para as lacases. Entre estas encontra-se a modificação de lignina, reforço do papel, inibição da transferência de côr em detergentes, polimerização de fenol, produção de sumo, produção de resina de fenol e tratamento de águas residuais.

Ainda que as possibilidades catalíticas sejam similares, as lacases obtidas por diferentes espécies fúngicas têm de facto uma temperatura diferente e um ph óptimo e estes também podem variar dependendo do substrato específico. Isolou-se uma quantidade destas lacases fúngicas e clonaram-se os genes para algumas destas. Por exemplo, Choi et al. (Mol. Plant-Microbe Interactions 5: 119-128, 1992) descreve a caracterização molecular e a clonação do gene que codifica a lacase do fúngo que danifica o castanheiro, Cryphonectriaparasitica. Kojima et al. (J. Biol. Chem. 265: 15224-15230,1990; JP 2-238885) proporciona uma descrição de duas formas de alelo da lacase de podridão branca do basidiomicete Coriolus hirsutus. Germann e Lerch (Experientia 41: 801,1985; PNAS USA 83: 8854-8858, 1986) escreveram sobre a clonação e sequenciação parcial do gene de lacase Neurospora crassa. Saloheimo et al. (J. Gen. Microbiol. 137: 1537-1544, 1985; WO 92/01046) descreveu uma análise estrutural do gene de lacase a partir do fungo Phlebia radiata.

As tentativas por expressar os genes de lacase em sistemas fúngicos heterólogos dão com frequência muito baixos rendimentos (Kojima et al., supra; Saloheimo et al., Bio/Technol. 9: 987-990,1991). Por exemplo, a expressão heteróloga da lacase Phlebia radiata em Trichoderma reesei só deu como resultado 20 mg por litro de enzima activo (Saloheimo, 1991, supra). Ainda que as lacases possuem um grande 2 potencial comercial, a capacidade de expressar a enzima em quantidades significativas é fundamental para seu emprego comercial. Na actualidade não existem lacases que se expressem a elevados níveis em hóspedes empregados comercialmente como o Aspergillus. Assim, dá-se a necessidade de uma lacase que se possa produzir em quantidades comercialmente úteis (ou seja, um grama por litro ou mais). Este objectivo obtém-se através da presente invenção.

Resumo da invenção A presente invenção refere-se a uma construção de ADN que contém uma sequência de ácido nucléico que codifica uma lacase Scytalidium. A invenção também se refere a uma lacase isolada codificada pela sequência de ácido nucléico. Preferentemente, a lacase é substancialmente pura. Por "substancialmente pura" entende-se uma lacase que se encontra essencialmente (concretamente 90%) livre de outras proteínas que não são de lacase.

Com o objectivo de facilitar a produção da nova lacase, a invenção também fornece vectores e células hóspedes que incluem o fragmento de ácido nucléico que se reivindica; estes vectores e células hóspedes resultam úteis na produção recombinante da lacase. O fragmento de ácido nucléico é ligado de maneira funcional com sinais de transcrição e translação capazes de dirigir a expressão da proteína de lacase na célula hóspede selecionada. Uma célula hóspede preferida é uma célula fúngica, ainda mais preférentemente se é do gênero Aspergillus. A produção recombinante da lacase da invenção obtém-se mediante o cultivo de uma célula hóspede transformada ou modificada com o fragmento de ácido nucléico da invenção ou derivados destes, sobre condições adequadas para a expressão da proteína de lacase e mediante a recuperação da proteína de lacase do cultivo. 3

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As lacases da presente invenção são úteis em vários processos industriais nos que se requere a oxidação de fenóis. Estes processos incluem a manipulação de lignina, a produção de sumo, a polimerização de fenol e a produção de resina de fenol.

Breve descrição das figuras A figura 1 mostra a sequência de nucleótidos (SEQ ID n°: 1) e de aminoácidos (SEQ ID n°: 2) da lacase Scytalidium thermophila. As letras sem os aminoácidos correspondentes na sequência de nucleótidos indicam a posição dos intrones. A figura 2 mostra a construção do plásmido pShThl5. A figura 3 mostra o mapa de restrição de um inserto de Xhol em pShThó que contém o gene da lacase S. thermophilum (lccS). A posição aproximada da zona de codificação da lccS indica-se só através de uma sólida linha negra. A figura 4 ilustra os perfis de pH da atividade de lacase com siringaldazina (quadrados) e ácido 2,2"-azinobis(3-etilbenzotiazolino-6-sulfónico) (círculos) como substrato. A figura 5 mostra a termo estabilidade em tampões B&R da lacase com pH 2.7, 6.1 e 9.0. Os tempos de pré-incubação são de 1 hora. As atividades são ensaiadas mediante oxidação de ABTS a 20° C em tampão B&R, pH 4.1. 4

complexo Torula-Humicola que são reconhecidos como espécies dominantes em os fertilizantes fúngicos. Outros membros do complexo são Humicola grisea Traaen var. thermoidea Cooney & Emerson, H. insolens Cooney & Emerson e Torula thermophila Cooney & Emerson. Austwick retomou a vincular esta última com Scytalidium thermophilum (N.Z. J. Agric. Res. J_9: 25-33, 1976). Straatsma e Samson (Mycol. Res. 97: 321-328, 1993) estabeleceram recentemente que tanto H. grisea var. thermoides como H. insolens se considerariam também exemplos das espécies Scytalidium thermophilum. S. indonesiacum (Hedger et al., Trans. Brit Mycol.Soc. 78: 366-366, 1982) também poderia ser análogo de S. thermophilum. Sabe-se, que os membros do complexo são produtores de celulase termoestável e de enzimas β-glucosidases (Rao e Murthy, Ind. J. Biochem. Biophys. 25: 687-694, 1988; Hayashida e Yoshioka, Agric. Biol. Chem. 44: 1721-1728, 1980). Mas, não existem relatórios prévios da produção de uma lacase por meio da Scytalidium, ou qualquer das espécies análogas que foram citadas. Actualmente estabeleceu-se não só que o Scytalidium produz uma lacase, senão que além disso o gene que codifica esta lacase pode ser empregado para obter grandes rendimentos da enzima em sistemas de hóspede convenientes como o Aspergillus.

Para identificar a presença de um gene de lacase em Scytalidium, uma porção 5' do gene da lacase Neurospora crassa (lccl) é empregado como uma sonda, sob condições de rigor moderado, usando a técnica de hibridação de Southern de todo o ADN genómico de diferentes espécies fúngicas. Detectamos uma sequência específica de lacase de aproximadamente 3 kb no ADN de Scytalidium. O fragmento de N. crassa é empregado então para filtrar umas 12.000 placas de uma 5

biblioteca genómica de ADN de S. thermophilum em um vector de clonação bacteriófago λΕΜΒΙΑ Hibridam-se fortemente nove placas com a sonda; destas nove placas, isola-se o ADN de quatro. Cada um destes clones contém um fragmento de BamHI de 3kb correspondente àquele que foi identificado inicialmente usando a técnica de hibridação de Southern do ADN genómico. Um dos fragmentos é subclonado em um vector pBluescript; mas, a sequenciação de ADN mostra só uma porção do gene que estará neste fragmento. Um fragmento de Xhol de 6kb do mesmo fago contém todo o gene lccS, com o que este é subclonado a continuação em pBluescript para derivar um plásmido pShThó. Na figura 3 mostra-se um mapa de restrição do inserto 6 kb.

Uma vez que foi determinada a sequência, destinam-se às posições de intrones e extrones dentro do gene em base a alienação da sequência de aminoácidos deduzida para o produto de gene de lacase N. crassa correspondente. Desta comparação observamos que o gene (lccS) de S. thermophilum se compõe de sete exones (243, 91, 70, 1054 e 390 nucleótidos) ponteados por quatro pequenos intrones (63, 58, 55 e 65 nucleótidos). A zona de codificação, excluindo as sequências de intervenção, é muito rica em GC (60,8 % G+C) e codifica uma pré-proenzima de 616 aminoácidos: um péptido sinal de 21 aminoácidos e um propéptido de 24 aminoácidos. A sequência do gene S. thermophilum e a sequência de aminoácidos anteriormente mencionadas são mostradas na figura 1 (Sequência ID N°: 1 e 2). O gene de lacase é empregado então para criar um vector de expressão para a transformação de células hóspede de Aspergillus. O vector, pShThl5 contém as regiões do promotor de TAKA-amilasa de A. oryzae e do terminador glaA de A. 6 niger. Na figura 2 mostra-se um esquema da construção de pShThl5. As células de Aspergillus transformam-se conjuntamente com o vector de expressão e um plásmido que contém o marcador selecionável de pyrG ou amdS. Os transformantes são seleccionados no meio selectivo apropriado contendo ABTS. As colónias que produzem lacase mostram um halo verde e podem ser isoladas facilmente. Os transformantes seleccionados são cultivados em frascos de agitação e avalia-se a actividade de lacase dos caldos de cultivo através do método da siringaldacina. Os cultivos do frasco de agitação podem chegar a produzir 50 ou mais mg/litro de lacase e nos fermentos observam-se rendimentos superiores a 1,6 g/Iitro.

Segundo a invenção, pode-se obter um gene de Scytalidium que codifica uma lacase através dos métodos que foram descritos anteriormente ou através de qualquer método alternativo conhecido na técnica e utilizando a informação que se subministra aqui. O gene pode ser expresso, em forma activa, utilizando um vector de expressão. Um vector de expressão útil contém um elemento que permite uma integração estável do vector no genoma da célula hóspede ou permite a réplica autónoma do vector numa célula hóspede independente do genoma da célula hóspede e preferentemente um ou mais marcadores fenotípicos que admitem uma selecção fácil de células hóspede transformadas. O vector de expressão também pode incluir sequências de controle que codificam um promotor, lugar de união do ribossoma, sinal de início da translação, e, opcionalmente, um gene repressor ou vários genes activadores. Para permitir a secreção da proteína expressada, pode-se inserir nucleotídeos que codificam uma sequência de sinal antes que a sequência de codificação do gene. Para uma expressão sob a direcção das sequências de controle, um gene de lacase que vai ser usado segundo a invenção é ligado de 7 maneira funcional as sequências de controle na moeda alemã de leitura apropriada. Entre as sequências do promotor que se podem incorporar em vectores de plásmidos e que podem dirigir a transcrição do gene de lacase encontram-se os promotores de lactamasa procarióticos (Villa-Kamaroff, et al., 1978, Proc. Natl. Acad. Sei. U.S.A. 75:3727-3731) e o promotor tac (De, et al., 1983, Proc. Natl. Acad. Sei. U.S.A. 80:21-25) ainda que não se limita a estes. Pode-se encontrar mais referências em "Useful proteins ffom recombinant bactéria" em Scientific American, 1980, 242:74-94; e em Sambrook et al., Molecular Cloning, 1989. O vector de expressão que leva a construção de ADN da invenção pode ser qualquer vector que possa ser submetido convenientemente a procedimentos de ADN recombinante e a escolha do vector dependerá, por regra geral, da célula hóspede na que será introduzido. Assim, o vector pode ser um vector de replicação autónomo, ou seja um vector que existe como uma entidade extra cromossómica, cuja réplica é independente da réplica cromossómica, por exemplo um plásmido, ou um elemento extra cromossómico, minicromossoma ou um cromossoma artificial. Altemativamente, o vector pode ser um vector que ao ser introduzido numa célula hóspede se integra no genoma de dita célula hóspede e se replica, junto com o cromossoma(s) onde foi integrado.

No vector, a sequência de ADN deveria ser ligada de maneira funcional a uma sequência de promotor adequado. O acelerador pode ser qualquer sequência de ADN que mostre actividade transcripcional na célula hóspede escolhida e pode derivar de genes que codificam proteínas homólogas ou heterólogas a célula hóspede. Exemplos de promotores adequados para desenvolver a transcrição da construção do ADN da invenção, especialmente em um hóspede bacteriano, são o 8 promotor do operón lac de E.coli, os promotores do gene de agarasa dagA de Streptomyces coelicolor, os promotores do gene de α-amilasa (amyL) de Bacillus licheniformis, os promotores do gene de amilasa maltogénico (amyM) de Bacillus stearothermophilus, os promotores da α-amilasa (amyQ) de Bacillus amyloliquefaciens ou os promotores dos genes xylA e xylB de Bacillus sub. Em um hóspede de levedura, um promotor útil é o promotor eno-1. Para a transcrição em um hóspede fúngico, exemplos de promotores úteis são os derivados do gene que codifica a TAKA amilase de A. oryzae, a proteinase aspártica de Rhizomucor miehei, a α-amilase neutra de A. niger, a α-amilase estável ao ácido de A. niger, a glucoamilasa (glaA) de A. niger ou A. awamori, a lípase de Rhizomucor miehei, a protease alcalina de A. oryzae, a isomerare de fosfato de triose de A. oryzae ou a acetamidase de A. nidulans. Preferem-se os promotores TAKA-amilase e glaA. O vector de expressão da invenção também pode compreender um terminador de transcrição adequado e, em eucariotes, sequências de poliadenilação que se conectam de maneira funcional a sequência de ADN que codifica a lacase da invenção. As sequências de terminação e de poliadenilação podem provir de forma idónea das mesmas fontes que o promotor. O vector pode compreender além disso uma sequência de ADN que permita a replicação do vector na célula hóspede em questão. Exemplos de tais sequências são as origens de replicação dos plásmidos pUC19, pACYC177, pUBl 10, pE194, pAMBl e pIJ702. O vector também pode compreender um marcador seleccionável, por exemplo, um gene cujo produto complementa um defeito na célula hóspede, como os genes dal de B.subtilis ou B. licheniformis, ou o que confere resistência antibiótica como ampicilina, canamicina, cloranfenicol ou resistência à tetraciclina. Entre os 9

S*· exemplos de marcadores de seleção de Aspergillus encontram-se amdS, pyrG, argB, niaD, sC, e hygB, um marcador que produz uma elevada resistência a higromicina. Preferem-se os marcadores amdS e pyrG de A. nidulans ou A. oryzae para seu emprego em uma célula hóspede de Aspergillus. Um marcador mamífero que se emprega com frequência é o gene de reductase de dihidrofolato (DHFR). Além disso, a seleção pode ser realizada mediante co-transformação, por exemplo como se descreve em WO 91/17243.

Geralmente prefere-se que a expressão origine um produto que seja extra celular. As lacases da presente invenção podem compreender uma pré-região que permite a secreção da proteína expressada no meio de cultivo. Se se desejar, esta pré região pode ser nativa da lacase da invenção ou pode ser substituída por uma pré-região diferente ou uma sequência de sinal, que se realiza convenientemente mediante substituição das sequências de ADN que codificam as respectivas pré-regiões. Por exemplo, a pré-região pode provir de uma glucoamilasa ou de um gene de amilase de uma espécie de Aspergillus, um gene de amilase de uma espécie de Bacillus, uma lípase ou gene de proteinase de Rhizomucor miehei, ou gene para o factor de Sacaromices cerevisiae ou o gene de preproquimosina de bezerro. Concretamente, quando o hóspede é uma célula fúngica prefere-se a pré-região para a TAKA amilase de A. oryzae, amilase neutra de A. niger, a forma de amilase maltogénica de Bacillus NCIB 11837, α-amilase de B. stearothermophilus, ou subtilisina de Bacillus licheniformis. Uma sequência de sinal eficaz é o sinal da TAKA amilase de A. oryzae, o sinal de proteinase aspártica de Rhizomucor miehei e o sinal de lipase de Rhizomucor miehei. 10

Os procedimentos empregados para enlaçar a construção de ADN da invenção, o promotor, o terminador e outros elementos, respectivamente, e para inserir nos vectores adequados que contém a informação necessária para a replicação são bem conhecidos pelos expertos na matéria (cf., por exemplo, Sambrook et al. Molecular Cloning, 1989). A célula da invenção que inclui ou uma construção de ADN ou um vector de expressão da invenção tal como foi definido anteriormente emprega-se de maneira vantajosa como uma célula hóspede na produção recombinante de uma enzima da invenção. A célula pode ser transformada com a construção de ADN da invenção mediante a integração conveniente da construção de ADN no cromossoma hóspede. Está integração considera-se geralmente uma vantagem, já que é mais provável que a sequência de ADN se mantenha estável na célula. A integração das formações de ADN no cromossoma hóspede pode-se levar a cabo segundo os métodos convencionais, por exemplo, através de recombinação homóloga ou heteróloga. Altemativamente, a célula pode ser transformada com um vector de expressão como se descreve acima em conexão com os diferentes tipos de células hóspedes. A célula hóspede pode ser seleccionada das células procarióticas, como células bacterianas. Alguns exemplos de bactérias adequadas são bactérias gram positivas como Bacillus subtilis, Bacillus licheniformis, Bacillus lentus, Bacillus brevis, Bacillus stearothermophilus, Bacillus alkalophilus, Bacillus amyloliquejadens, Bacillus coagulans, Bacillus circulans, Bacillus lautus, Bacillus megaterium, Bacillus thuringiensis, ou Streptomyces lividans ou Streptomyces murinus, ou bactérias gram negativas como E.coli. A transformação das bactérias pode realizar- 11 se por exemplo mediante transformação de protoplastos ou utilizando células competentes de uma forma conhecida per se. A célula hóspede também pode ser um eucarionte, como células mamíferas, células de inseto, células de planta ou preferentemente células fúngicas, entre as que se incluem fungos de levedura e filamentosos. Por exemplo, entre as célulás mamíferas úteis encontram-se as células CHO ou COS. Uma célula hóspede de levedura pode ser selecionada de uma espécie de Sacaromices ou Schizosacaromices, por exemplo, Sacaromices cerevisiae. Os fungos filamentosos úteis podem ser selecionados de uma espécie de Aspergillus, por exemplo de Aspergillus oryzae ou Aspergillus niger. Altemativamente, pode-se empregar cómo célula hóspede uma cepa de uma espécie Fusarium, por exemplo F. oxysporum. As células fúngicas podem ser transformadas mediante um processo que implica a formação de protoplastos e a transformação dos protoplastos contínuo da regeneração da membrana celular de uma forma conhecida per se. Em EP 238 023 descreve-se um procedimento adequado para a transformação de , células hóspedes de Aspergillus. Malardier et al., 1989 descrevem um método adequado de transformação de espécies Fusarium.

Assim, a presente invenção fornece um método de produção de uma lacase recombinante da invenção, onde dito método compreende o cultivo de uma célula hóspede como se descreve acima, sob condições que propiciam a produção da enzima e sua recuperação das células e/ou do meio de cultivo. O meio empregado para cultivar as células pode ser qualquer meio convencional adequado para cultivar a célula hóspede e para obter a expressão da lacase da invenção. Os meios adequados podem ser obtidos através dos provedores comerciais ou podem ser 12 preparados segundo as fórmulas publicadas (por exemplo nos catálogos de American Type Culture Collection). A enzima resultante pode ser recuperada do meio através dos procedimentos habituais entre os que se encontram a separação das células do meio, por centrifugação ou filtração, o precipitado dos componentes proteínicos do sobrenadante ou o filtrado mediante um sal, por exemplo sulfato de amónio, contínuo de purificação através de diversos procedimentos cromatográficos, como por exemplo cromatografia de câmbio de íon, cromatografía de filtração de gel, cromatografia de afinidade ou similar. Preferentemente, a proteína isolada é praticamente pura em 90% como se determina através do sistema de diluição simples por electroforese em gel de poliacrimida, já que a pureza é mais importante em alimentos, sumos ou aplicações detergentes.

Em uma forma de realização particularmente preferida, a expressão de lacase obtém-se numa célula hóspede fúngica, como Aspergillus. Como se descreve mais detalhadamente nos exemplos seguintes, o gene de lacase liga-se num plásmido que contém o promotor de TAKA α-amilase de Aspergillus oryzae e o marcador seleccionável amdS de Aspergillus nidulans. Altemativamente, o amdS pode encontrar-se num plásmido separado e pode-se empregar em co-transformação. O plásmido (ou plásmidos) são empregados para transformar uma célula hóspede da espécie Aspergillus, como A. oryzae ou A. niger segundo os métodos descritos em Yelton et al. (PNAS usa 81: 1470-1474,1984).

Os expertos na matéria reconhecerão que a invenção não se limita ao emprego dos fragmentos de ácido nucléico que se descrevem especificamente na presente 13 invenção, por exemplo, na figura 1. Também é evidente que a invenção compreende as sequências de nucleotídeos que codificam as mesmas sequências de aminoácido que se mostram na figura 1, sendo porém diferentes das sequências de nucleotídeos descritas em virtude da degeneração do código genético. Deste modo entende-se que a referência da figura 1 que se faz na descrição e nas reivindicações compreende tanto a sequência genómica descrita nestas como as correspondentes sequências de ADNc e ARN e entende-se que as frases "construção de ADN" e "sequências de ácidos nucléicos" de acordo ao seu emprego no presente documento incluem todas estas variações. Geralmente "construção de ADN" faz referência a uma molécula de ADN, bem única ou bicatenaria que pode ser parcialmente isolada a partir de um gene que se obtém de maneira natural ou que foi modificado para conter segmentos de ADN que se combinam e superpõem de uma maneira que de outro modo não poderia dar-se de maneira natural.

Além disso, a invenção também compreende outras lacases de Scytalidium, entre as quais se encontram formas alternadas de lacase que se podem encontrar em S. thermophilum assim como lacases que se podem encontrar em outros fungos que são sinónimos ou entram dentro da definição de Scytalidium thermophilum segundo Straatsma e Samson, 1993, supra. Entre estes encontram-se S. indonesiacum, Torula thermophila, Humicola brevis var. thermoidea, Humicola brevispora, H grisea var. thermoidea, Humicola insolens e Humicola lanuginosa (também conhecida como Thermomyces lanuginosus). A invenção também fornece os meios para o isolamento de genes de lacase de outras espécies de Scytalidium, como S. acidophilum, S. álbum, S. aurantiacum, S. circinatum, S. flaveobrunneum, S. hyalinum, S. lignicola, e S. uredinicolum. Pode-se conseguir a identificação e o isolamento de genes de lacase de outras fontes que não sejam as que foram 14 exemplificadas aqui de forma específica mediante o emprego da metodologia dos exemplos, com cepas de Scytalidium publicamente disponíveis. Altemativamente, a sequência que se descreve na presente invenção pode ser empregada para desenhar cebadores e/ou sondas úteis para o isolamento de genes de lacase através de PCR Standard ou mediante técnicas de hibridação de Southern, utilizando as mesmas cepas que se encontram publicamente disponíveis. Entre alguns exemplos destas cepas que foram postas à disposição pública encontram-se: do American Type Culture Collection, ATCC 16463, 28085, 36346, 48409, 66938 {S. thermophilum); 24569 (S. acidophilum); 16675 (S. album); 22477 (S. aurantiacum); 66463 (S. circinatum); 13212 (S. flavo-brunneum); 52297 (S. fulvum); 38906 (S. hyalinum); 46858 (S. indonesiacum); 18984 (S. indonesiacum); 32382 (S. uredinaolum); do Internacional Mycological Institute (IMI; Reino unido), IMI 243 118 (S. thermophilum)', do Centraalbureau voor Schimmelcultures (CBS; Países Baixos) CBS 183.81, 671.88 (S. thermophilum) 367.72 (S. acidophilum); 372.65 (S. album); 374.6 5 (S. aurantiacum); 654.89 (S. circinatum); 244.59 (S. flavo-brunneum); 145.78 (S. hyalinum); 259.81 (S. indonesiacum); 233.57 (S. lignicola); 171.40 (S. terminale); 616.84 (S. muscorum); do De Sammlung von Mikroorganismenn und Zellkulturen (DSM; Alemanha) DSM 2842 (S. thermophilum); DSM 2695 {S. lignicola). A invenção também compreende qualquer sequência de nucleotídeos variante e a proteína codificada através desta; esta proteína apresenta ao menos um 80%, preferentemente um 85% e mais preferentemente ao menos um 90-95% de homologia com a sequência de aminoácidos que se mostra na figura 1 e que qualitativamente mostra a actividade de lacase da sequência que foi descrita nesta solicitude. Entre as variantes úteis dentro das categorias definidas anteriormente encontra-se por exemplo, aquelas que foram levadas a cabo por substituições conservadoras de aminoácido, onde 15 ditas substituições não afectam de forma significativa a actividade da proteína. Por substituição conservadora entende-se que os aminoácidos da mesma classe podem ser substituídos por qualquer outro dessa mesma classe. Por exemplo, os resíduos alifáticos não polares Ala, Vai, Leu, e Ile podem ser intercambiados, como também podem ser os resíduos básicos Lys e Arg, ou os resíduos ácidos Asp e Glu. De forma semelhante, Ser e Thr são substituições conservadoras entre si, como o são Asn e Gin. Resultará evidente para os expertos que este tipo de substituições podem ser realizadas fora das regiões fundamentais para a função da molécula e ainda assim dar como resultado uma enzima activa. A retenção da actividade desejada pode ser determinada rapidamente levando a cabo um método de oxidação ABTS Standard, como se descreve nos exemplos. A proteína pode ser empregada em diversos processos industriais. Estes processos incluem a polimerização da lignina, de Kraft e de lignosulfatos numa solução com o objetivo de produzir uma lignina com um peso molecular mais elevado. Uma lacase neutra/alcalina resultado especialmente vantajoso porque a lignina de Kraft é mais solúvel com pHs mais elevados. Tais métodos estão descritos em, por exemplo, Jin et al., Holzforschung 45(6): 467-468, 1991; patente US Núm. 4,432,921; EP 0 275 544; PCT/DK93/00217, 1992. A lacase também é útil na co-polimerização da lignina com compostos de peso molecular baixo, tal e como se descreve em Appl. Microbiol. Biotechnol. 40: 760-767. A lacase da presente invenção também pode ser empregada para a depolimerização in situ de lignina em pasta de papel Kraft com o que se produz uma pasta de papel com baixo conteúdo de lignina. Este emprego da lacase supõe uma melhora com respeito ao emprego actual do cloro na despolimerização da lignina, que conduz à produção de compostos aromáticos clorados, que constituem subprodutos das 16 fábricas de papel que prejudicam o meio ambiente. Este tipo de empregos está descrito, por exemplo, em Current opinion in Biotechnology: 3: 261-266, 1992; J. Biotechnol. 25: 333-339, 1992; Hiroi et al., Svensk papperstidning 5: 162-166, 1976. Dado que o ambiente numa fábrica de papel é tipicamente alcalino, a presente lacase é mais útil para este objetivo que qualquer outra lacase conhecida, cuja função é melhor sob condições ácidas. A oxidação de cores ou de precursores da cor assim como de outros compostos cromofóricos conduzem à descoloração dos compostos. Pode-se empregar a lacase com este objectivo, que pode ser particularmente vantajoso numa situação em que não se deseja uma transferência de cor entre tecidos, por exemplo, na indústria têxtil e na indústria dos detergentes. Pode-se encontrar métodos para a inibição da transferência da cor e oxidação da cor em WO 92/01406; WO 92/18683; EP 0495836; Calvo, Mededelingen van de Faculteit Landbouw-wetenscappen/Rijiksuniversitet Gent. 56: 1565-1567, 1991; Tsujino et al., J. Soc. Chem. 42: 273-282,1991. Na patente U.S. N° 3,251,742 descreve-se o emprego de lacase na oxidação de precursores da cor para a coloração capilar. A presente lacase também pode ser empregada para a polimerização a oxidação de compostos fenólicos presentes em líquidos. Um exemplo deste emprego é o tratamento de sucos, como o sumo de maçã, de modo que a lacase acelerará uma precipitação dos compostos fenólicos presentes no sumo, desse modo produz-se um sumo mais estável. Estes tipos de aplicações foram descritos em Stutz, Fruit Processing 7/93, 248-252, 1993; Mayer et al., Dt. Lebensmittel-rindscau 86(5): 137-142,1990; Dietrich et al., Fluss. Obst 57(2): 67-73,1990. 17

As lacases como a lacase de Scytalidium também são úteis para a desinfecção do solo (Nannipieri et al., J. Environ. Qual. 20: 510-517,1991; Decegas e Bollag, Arco. Environ. Contam. Toxicol. 19: 543-550,1990. A invenção é ilustrada com maior detalhe através dos seguintes exemplos que não são limitativos.

EXEMPLOS

I. ISOLAMENTO DO GENE DE LACASE DE SCYTALIDIUM

THERMOPHILUM

A. MATERIAIS E MÉTODOS 1. Extração de ADN e análise de hibridação

Extrai-se o ADN celular total das células fúngicas da cepa E421 de Scytalidium thermophila cultivadas durante 24 horas em 25 ml de meio YEG (0,5% de extrato de levedura, 2% de glicose) utilizando o seguinte protocolo: recolhem-se os micélios mediante filtração com Miracloth (Calbiochem) e lavam-se uma vez com 25 ml de tampão TE. Extrai-se o excesso de tampão dos micélios que se congelam a continuação em nitrogénio líquido. Moem-se os micélios congelados em um moinho eléctrico de café até conseguir um pó fino e agrega-se este pó a 20 ml de tampão TE e 5 ml de 20% de SDS (p/v) num tubo de centrifugado de plástico descartável. Agita-se a mistura com cuidado várias vezes para assegurar que se dilui e se extrai duas vezes com o mesmo volume de álcool de fenol:clorofórmio: isoamil (25:24:1). Agrega-se acetato de sódio (solução 3M) para obter uma concentração final de 0,3M e precipitam-se os ácidos nucléicos com 2,5 volumes de etano gelado. Centrifugam-se os tubos a 15.000 x g durante 30 minutos e deixa- 18 se secar o granulado ao ar durante 30 minutos antes de voltar a suspender num tampão de TE de 0,5 ml. Agrega-se ribonuclease A livre de desoxirribonuclease a uma concentração de 100pg/ml e incuba-se a mistura a 37°C durante 30 minutos. Agrega-se proteinase K (200pg/ml) e incuba-se cada tubo durante outra hora a 37°C. Finalmente extrai-se duas vezes cada mostra com álcool de fenol: clorofórmio: isoamil antes de precipitar o ADN com acetato de sódio e etano. Secam-se os granulados de ADN ao vazio, retomam-se a suspender em um tampão TE e armazenam-se a 4°C.

Analisa-se às mostras de ADN celular total mediante hibridação de Southern. Digerem-se aproximadamente 5pg de ADN com EcoRI e fracciona-se por tamanho sobre um 1% de gel de agarosa. Fotografa-se o gel sob efeito do UV de curta longitude de onda e deixam-se de remolho durante 15 minutos em 0,5 M de NaOH, 1,5 M de NaCl contínuo de 15 minutos em 1 M de Tris-Cl, pH 8, 1,5 M de NaCl. Traslada-se o ADN do gel a uma membrana de hibridação Zeta- Probe™ (BioRad Laboratories) por transferência capilar em 20 X SSPE (R. W. Davis et al., Advanced Bacterial Genetics, A Manual for Genetic Engineering. Cold Spring Harbor Pre. 1980). Cozem-se as membranas durante 2 horas a 80°C ao vazio e deixam-se de remolho durante 2 horas no seguinte tampão de hibridação a 45° C com agitação suave: 5X SSPE, 35% de formamida (v/v), 0,3% de SCS, 200pg/ml de ADN desnaturalizado e cortado de testículos de salmão. O fragmento sonda específico de lacase (aprox. 1,5 kb) que codifica a porção 5 do gen lccl de N. crassa é amplificado a partir de ADN genómico de N. crassa utilizando às condições PCR Standard (Perkin-Elmer Cetus, Emeryville, CA) com o seguinte par de cebadores: cebador directo, 5' CGAGACTGATAACTGGCTTGG 3'; cebador invertido, 5' ACGGCGCATTGTCAGGGAAGT 3'. O segmento de ADN ampliado 19 é clonado em primeiro lugar num vector TA de clonação (Invitrogen, Inc., San Diego, CA), a continuação purificada através de electroforese em gel de agarosa contínuo da digestão com EcoRI. O fragmento sonda purificado é radiomarcado por translação de flexão com α [32p]dCTP(Amersham) e agrega-se ao tampão de hibridação com uma actividade de aproximadamente 1 X 106 cpm por ml de tampão. A mistura é incubada durante a noite a 45° C num banho de água agitado. Depois da incubação, lavam-se as membranas uma vez em 0,2 X SSPE com 0,1% de SDS a 45° C contínuo de dois lavados em 0,2 X SSPE (não SDS) a mesma temperatura. Deixam-se secar as membranas sobre toalhas de papel durante 15 minutos, depois envolvem-se em Saran Wrap™ e expõem-se a um filme de raio X durante a noite a -70° C com écran de intensificação (Kodak). 2. Bibliotecas de ADN e identificação de clones de lacase As bibliotecas genómicas de ADN constroem-se no vector de clonação bacteriófago λ (J.A.Sorga, em Vectors, A Survey of Molecular Cloning Vectors and Their Uses, Rodriguez et al., eds, págs.43-60, Butterworths, Boston, 1988). Em pouco tempo, o ADN celular total é digerido parcialmente com Sau3A e fragmentado por tamanho sobre geis de agarosa com um baixo ponto de fusão. Os fragmentos de ADN que migram entre 9kb e 23 kb são cortados, e eluídos do gel utilizando β-agarasa (New England Bio, Beverly MA). Os fragmentos de ADN eluídos são ligados com braços do vector λ-ΕΜΒΕ4 defosforilado e divido por BamI e as misturas de ligação são cheias utilizando extratos de recheio comerciais (Stratagene, LaJolla, CA). As bibliotecas de ADN enchidas são depositadas em placas e amplificadas sobre células K802 de Escherichia coli. Aproximadamente 10.000-20.000 placas de cada biblioteca são filtradas por hibridização de placa 20

com o fragmento de ADN lccl radio marcado utilizando às condições descritas anteriormente. As placas que dão sinais de hibridação com a sonda são purificadas duas vezes sobre células K802 de E. coli e o ADN do correspondente fago são purificados de lisatos de elevada graduação utilizando um Qiagen Lambda kit (Qiagen, Inc., Chatsworth, CA). 3. Análise dos genes de lacase O mapeio de restrição dos clones de lacase leva-se a cabo utilizando métodos Standard (Lewin, Gens. 2d ed., Wiley & Sons, 1985, New York). A sequênciação de ADN realiza-se com um sequênciador automático de ADN de Applied Biosystems modelo 373A (Applied Biosystems, Inc., Foster City, CA) usando a técnica do primer walking (síntese dos cebadores de sequências e acoplamento de dita sequência) com química de terminador de cor (H. Giesecke et al., J. Virol. Methods 38: 47-60, 1992). Sintetizam-se os cebadores de sequenciação de oligonucleótidos sobre um sintetizador de ADN/ARN de Applied Biosystems modelo 394. B. RESULTADOS E DISCUSSÃO 1. Identificação da sequência de gene de lacase Às mostras de ADN celular total obtêm-se a partir das espécies Neurospora crassa, Boíritis cinerea e Scytalidium. Digerem-se mostras destas preparações de ADN com BamHI e se fraccionam por eletroforese em gel de agarosa. Transfere-se o ADN do gel a um filtro de membrana Zeta-Probe™ (BioRad Laboratories, Hercules,CA) e avalia-se sob condições de rigor moderado com um fragmento radio marcado que codifica uma porção do gene lccl de N. crassa, como se 21

descreve acima. Revelam-se sequências específicas de lacases nos genomas de S. thermophilum e o controle de N. crassa, porém não no ADN genómico de B. cinerea com esta sonda. 2. Clonação e caracterização de gene de lacase de Scytalidium thermophila (StL) Isola-se o gene de lacase de S. thermophilum usando hibridação de placa para filtrar a biblioteca genómica do ADN realizada em λ-ΕΜΒΙΑ A biblioteca contém aproximadamente 250.000 clones independentes antes da amplificação e filtram-se 12.000 placas através de hibridação com um fragmento de gene de lacase radio marcada de N. crassa como se descreve acima. Identificam-se nove placas que hibridam fortemente a sonda. Isola-se o ADN de quatro destes clones e analisa-se por mapeio de restrição. Os quatro clones contêm um fragmento de BamHI de 3kb que se identifica originariamente pela técnica de hibridação de Southern com ADN genómico como acima se descreve. Isola-se este fragmento de um clone e inserta-se num vector pBluescript (Stratagene Cloning Systems, La Jolla, CA). Mas, a análise da sequência de ADN indica que só uma porção do gene se localiza sobre este segmento. Por tanto, sub-clona-se um fragmento de 6 kb de Xhol que contém todo o gene lccS em pBluescript para derivar o plásmido pShThó.

Na figura 3 mostra -seum mapa de restrição do inserto de 6 kb neste plásmido. A sequência de ácido nucléico mostra-se na figura 1 e na sequência ID N°: 1. A sequência de aminoácidos de StL obtém-se em base a homologia da sequência de aminoácidos com lacase de N. crassa. StL comparte aproximadamente o 58% de identidade da sequência de aminoácidos com NcL e esta semelhança de sequência é máxima entre aqueles resíduos aminos que participam na formação do lugar activo do centro de cobre. StL, ao igual que NcL parecem sintetizar-se como uma 22 preproenzima (616 aminoácidos com um péptido com um sinal de 21 aminoácidos e um propéptido de 24 aminoácidos). Mas, posto que a sequência de amino terminal da proteína amadurece StL não se determinou ainda, a longitude exata do propéptido não é segura. Dão-se cinco lugares potenciais para a glicosilación unida a N em StL. Também existe um sinal de processamento potencial C-terminal com homologia a lacase de N. crassa em StL (Asp-Ser-Gli-Leu*Lys564) que pode dar como resultado a extração proteolítica dos últimos sete aminoácidos do produto de translação primário. A presença de quatro pequenos intrones (nucleotídeos 63, 58, 55 e 65) determina-se comparando os marcos de leitura aberta dentro da zona de codificação de lccS com a estrutura primária de NcL. Se se excluírem as sequências que intervém, a região de codificação contém 60,8% G+C. A composição base de lccS reflete um sesgo para codones que finaliza em G ou C.

II. EXPRESSÃO DE LACASE SCYTALIDIUM EM ASPERGILLUS A. MATERIAIS E MÉTODOS 1. Cepas hóspedes bacterianas e fúngicas A Escherichia coli JM101 (Messing et al., Nucl. Acids Res. 9:309-321, 1981) emprega-se neste estudo como um hóspede para a construção e a propagação habitual de vectores de expressão de lacase. Entre os hóspedes fúngicos para a expressão de lacase encontram-se a cepa Bo-1 de Aspergillus niger, assim como um mutante que requer uridina (pyrG) da cepa HowB104 de Aspergillus oryzae a-amilasa-deficiente. 23

2. Plásmidos O plásmido pSHTh5 é um derivado do pBluescript (Stratagene Cloning Systems, LaJolla, CA) que contém um fragmento de 6kb de Xhol de ADN de S. thermophilum que codifica StL. O plásmido pToC68(WO 91/17243) contém o promotor de TAKA-amilasa de A. oryzae e o terminador glaA de A. niger, e o pToC90 (WO 91/17243) leva o gene amdS de A. nidulans. 3. Construção de vectores de expressão de lacase A estratégia de construção para o vector de expressão de lacase pShThl5 mostra-se de forma esquemática na figura 2. O promotor que dirige a transcrição do gene de lacase obtém-se a partir do gene de a -amilasa (TAKA-amilasa) de A. oryzae (Christensen et al., supra) e o terminador obtêm-se a partir da região do terminador glaA (glucoamilasa) de A. niger. O vector de expressão constrói-se como segue. Um enlace de 60 pares base de ADN sintético, 5’ TCGAGATGAAGCGCTTCTTCATTAATAGCCTTCTGCTTCTCGCAGGGCTCC TCAACTCAGGGGCC 3’ 3’ CTACTTCGCGAAGAAGTAATTATCGGAAGACGAAGAGCGTCCCGAGGA GTTGAGTCC 5’ que inclui a região desde o codon inicial até um lugar Apal, é agregado em pBluescriptSK-(Stratagena, LaJolla, CA) digerido com Xhol e Apal para produzir um intermediário denominado pShThll.5. Este vector é digerido com Apal e Asp718 e unido com um fragmento Apal-Asp718 de 662 pares de base que codifica uma porção de StL a partir de pShTh5, que gera um segundo intermediário chamado pShThl3.1. Um lugar Xbal é introduzido imediatamente corrente abaixo do codon final utilizando pShTh5 como um molde para uma 24

reacção PCR com os seguintes cebadores; direto: 5'GTCATGAACAATGACCT 3; invertido: 5 'AGAG AGTCTAG ATT AAAC AATCCGCCC AACT AC3'. O fragmento amplificado é digerido com Nsil e Xbal e subclonado em pUC518 para criar o chamado intermediário pShThl2.8. O vector pShThl2.8 é digerido com EcoRI e Asp718 e unido com um fragmento de EcoRI-Asp718 de 700 pares de base de pShThl3.1 para gerar pShThl3.1 para gerar pShThl3.2. Um fragmento de Nsil-Asp718 de 800 pares de base que contém a porção final da zona de codificação da lacase obtém-se a partir de pShTh5 e inserta-se em pShThl3.2 divido com Nsil e Asp718 para obter pShThl4. Por último, a zona de codificação da lacase de 2.2 kb que se encontra em pShThl4 extrai-se por dissociação com Xhol e Xbal e se inserta entre o Xhol e os lugares de Xbal de pToC68 para gerar o vector de expressão pShThl5. 4. Transformação de células hóspede de Aspergillus

Os métodos para a co-transformação de cepas de Aspergillus são como os de em Christensen et al., supra. Para a introdução dos vectores de expressão de lacase em pyrG HowB 104 de A. oryzae, empregam-se quantidades iguais (aproximadamente de 5 pg cada uma) de vector de expressão de lacase e de pPyrG, que alberga o gene pyrG clonado de A. nidulans. Selecionam-se os transformantes de Protrophic (Pyr+) em um meio mínimo de Aspergillus (Rowlands e Tumer, Mol. Gen. Genet. 126: 201-216, 1973) e filtram-se os transformantes para observar a capacidade para produzir lacase em um meio mínimo que contém 1 mM de ácido 2,2'-azinobis(3-etilbenztiazolinosulfónico) [ABTS]. As células que segregam lacase activa oxidam o ABTS produzindo um halo verde que rodeia a colónia. Os protoplastos Bo-1 de A. niger se co-transformam utilizando as mesmas quantidades (aproximadamente de 5pg cada uma) de vector de expressão de lacase 25

e de pToC90 que contém o gene amdS (acetamidasa) de A. nidulans (Hynes et al., Mol. Cell Biol. 3: 1430-1439, 1983). Selecionam-se os transformantes AmdS+ sobre um meio mínimo de Cove (Cove, Biochim. Biophys. Acta Π3: 51-56, 1966) com um 1% de glicose como fonte de carbono e acetamida como a única fonte de nitrogénio e filtram-se para obter a expressão de lacase sobre o meio Cove com 1 mM deABTS. 5. Análise dos transformantes que produzem lacase

Purificam-se duas vezes os transformantes que produzem a actividade de lacase sobre placas de Agar através de conidiosporas e a partir de cada um destes realizam-se suspensão de esporas em 0,01% de Tween-80 estéril. A densidade de esporas em cada suspensão calculou-se espectrofotométricamente (A595 nm). Aproximadamente empregam-se 0,5 unidades de absorbância de esporas para inocular 25 ml de meio ASP04 ou MY50 em frascos de plástico de 125 ml. Incubam-se os cultivos a 37°C com ventilação enérgica (aproximadamente 200 rpm) durante quatro a cinco dias. Recolhem-se os caldos de cultivo por centrifugado e a quantidade de actividade de lacase no sobrenadante determina-se utilizando siringaldacina como substrato. Seguidamente mistura-se 800 μΐ de tampão de ensaio (25 mM de acetato de sódio, pH 5.5, 40 μΜ de CUS04) com 20 μΐ de sobrenadante do cultivo e 60 μΐ de solução controlada de siringaldacina de 0,28 mM (Sigma Chemical Co., St. Louis, MO) em 50% de etano. Mede-se a absorbância a 530 nm ao comprido do tempo em um espectrofotómetro Genesys 5 UV-vis (Milton-Roy). Uma unidade de lacase (LACU) define-se como a quantidade de enzima que oxida um pmol de substrato por minuto a temperatura ambiente. A SDS-PAGE (eletroforese sobre gel de poliacrilamida-sódio 26 dodecilsulfato) realiza-se utilizando um 10-27% de geles de gradiente pré-fundidos de Novex (San Diego, CA). As bandas de proteína desenvolvem-se utilizando Coomassie Brillant Blue (Sigma).

B. RESULTADOS E DISCUSSÃO 1. Expressão de lacase de Scytalidium O vector de expressão pShThl5 emprega-se conjuntamente com plásmidos pPyrG (pyrG de A. nidulans) ou pToC90(amdS de A. nidulans) para gerar cotransformantes de A. oryzae e A. niger que expressam StL. Como se mostra na tábua 1, o número de cotransformantes que produzem lacase obtidos em HowB104pyrG de A. oryzae é reduzido (3,7% de transformantes Pyr+-) comparado com o número obtido em Bo-1 de A. niger utilizando selecção amdS (71,5% de transformantes AmdS+). Desconhece-se se isto se deve a uma frequência de co-transformação (isto é, integração) anormalmente baixa, a uma expressão extremamente baixa ou a uma degradação da lacase em muitos transformantes de A. oryzae. Os níveis de expressão de StL oscilam entre um 50 mg/1 em frascos de agitação e l-2g/l em um fermento.

III. PURIFICAÇÃO E CARACTERIZAÇÃO DE LACASE RECOMBINANTE

SCYTALIDIUM

A. MATERIAIS E MÉTODOS 1. Materiais

Os produtos químicos empregados como tampões e substratos são produtos comerciais pelo menos de qualidade de reativo. A cromatografia leva-se a cabo 27

sobre um cromotógrafo FPLC Pharmacia. Às provas espectroscópicas levam-se a cabo ou sobre um espectrofotômetro (Shimadzu PC 160) ou sobre um leitor de microplacas (Molecular De). Os tampões Britton & Robinson (B&R) preparam-se segundo o protocolo descrito em Quelle, Bio Taschenbuch, H.M. Raven, II. Teil, S.93 o. 102,1964. 2. Fermentação

Agrega-se uma parte alíquota de 1 ml de uma suspensão de espora de transformante de Aspergillus oryzae HowB104-pST15-2 (aprox. 109 esporas/ml) assepticamente a um frasco de agitação de 500 ml contendo 100 ml de meio do frasco de agitação estéril (maltose, 50g/l; MgSC>4*7H20, 2g/l; KH2PO4, 10g/l; K2SO4, 2g/l; CaCl2*2H20, 0,5 g/1; ácido cítrico, 2g/l; extrato de levedura, 10g/l; metais traças [ZnS04*7H20, 14,3 g/1; CuS04*5H20, 2,5 g/1; NiCl2e6H20, 0,5 g/1; FeSC>4»7H20, 13,8 g/1, MnS04«H20, 8,5 g/1; ácido cítrico, 3,0 g/1], 0,5 ml/L; uréia, 2g/l, elaborado com água corrente e ajustado o pH 6.0 antes de ser submetido ao auto-chave) e incuba-se a 37° C num agitador giratório a 200 rpm durante 18 horas. Transferem-se 50 ml deste cultivo assepticamente a um fermento de 3 litros contendo 1,8 litros dos meios de fermento (MgSC>4*7H20, 2g/l; KH2PO4, 2g/l; ácido cítrico 4g/l; K2SO4, 3g/l;CaCl2*2H20, 2g/l; metais traças, 0,5 ml/L; antiespuma plurónico, lml/1). A temperatura do fermento mantém-se a 34° C graças a circulação de água frite através da coberta do fermento. Distribui-se ar estéril através do fermento a um nível de 1,8 litros/min (lv/v/m). O nível de agitação mantém-se entre 600 e 1300 rpm a aproximadamente o nível mínimo requerido para manter o nível de oxigénio dissolvido no cultivo acima do 20%. Agrega-se ao fermento alimento estéril (Nutriuse 725 [suco de maltose], 225 g/1; uréia, 30 g/1; extrato de levedura, 15 g/1; antiespuma plurónico, 1,5 ml/L, 28

I elaborado com água destilada e submetido ao auto-chave) utilizando uma bomba peristáltica. O perfil do nível de alimento durante a fermentação é o seguinte: agrega-se 30 g de alimento inicialmente antes inoculação; 0-24 h, 2 g/1 h; 24-48 h, 4 g/1 h; 48h final, 6 g/1. O cobre (em forma de CuCl2, CUSO4 ou outro sal solúvel) realiza-se como uma pasta 400X em água ou em um tampão adequado, esteriliza-se mediante filtração e agrega-se assepticamente ao tanque até um nível definitivo de 0,5 mM.

Retira-se às mostras para determinar a actividade enzimática e filtram-se através de Miracloth para eliminar os micélios. Ensaia-se a actividade de lacase destas mostras mediante a prova LACU de anteriormente. Descobre-se que a actividade de lacase aumenta de forma contínua durante 0 curso da fermentação, com um valor de aproximadamente 3,6 LACU/ml alcançado depois de 115 horas na fermentação contendo do excesso de cobre. Com uma actividade específica de 1,9 LACU/mg, isto corresponde a mais de 1,8 g/1 de lacase recombinante expressada pelo transformante. 3. Ensaio enzimático A actividade de lacase determina-se por oxidação de siringaldacina a 30° C numa cuba de quartzo de 1 cm. Mistura-se 60μ1 de solução de caldo de siringaldacina (0,28 mM em 50% de etano) e 20 μΐ de mostra com 0,8 ml de solução de tampão pré-esquentada. Controla-se a oxidação a 530nm durante 5 minutos. Expressa-se a actividade como substrato pmol oxidado por minuto. Empregam-se tampões B&R com vários pHs. Na presente invenção a unidade de actividade denomina-se "SOU". Um tampão de 25 mM de acetato de sódio, 40 μΜ de CUSO4, pH 5.5, 29 também é empregado para determinar a actividade a que se denomina LACU, tal e como se definiu anteriormente. As provas de oxidação do ácido 2,2'-azinobis(3-etilbenzotiazolina-6-sulfónico) (ABTS) realizam-se utilizando 0,4 mM de ABTS, um tampão B&R, pH 4.1, a temperatura ambiente mediante o controle de ΔΑ405.

Um ensaio da actividade de oxidase ABTS do véu de superfície leva-se a cabo vertendo agarosa ABTS(0,05 g de ABTS, 1 g de agarosa, 50 ml de H2O, aquecido para dissolver a agarosa) sobre um gel IEF natural e o continuação incuba-se a temperatura ambiente. A análise de termo-estabilidade realiza-se utilizando mostras que têm 3 μΜ de enzima pré-incubada durante uma ora em um tampão B&R, 0 pH 2.7, 6.1, e 9.0 e diversas temperaturas. Analisam-se as mostras depois de diluir 44 vezes em tampão B & R, pH 4.1, a temperatura ambiente. 3. Purificação de um caldo de fermento

Filtram-se 1,2 litros de caldo filtrado por estopilha (pH 7.9, 13 mS) através de papel filtrante Whatman #2 e concentra-se sobre um concentrador espiral (Amicon) com uma membrana S1Y100 (MWCO:100) a 200 ml. Ajusta-se o concentrado a 0,86 mS diluindo-lo em água e voltando a concentrar sobre S1Y100 até 324 ml. O caldo lavado e concentrado tem uma cor esverdeada densa.

Congela-se 0 caldo durante a noite a -20° C, descongela-se no dia seguinte (sem nenhuma perda de atividade) e carrega-se sobre uma coluna de Q-Sefarosa XK26 (120 ml), pré-equilibra-se com 10 mM de Tris, pH 7.7, 0,9 mS. A banda de lacase azul eluíe-se durante um gradiente lineal com 2 M de NaCl. 30 Às fracções de lacase agrupadas (44 ml), dialisam em 3,5 litros de 10 mM de NaAc, pH 5.5,0,8 mS a 4o C durante a noite, carregam-se sobre um mono-Q 16/10 (40 ml), pré-equilibram-se com 10 mM de mês, pH 5.3, 0,8 mS. A lacase eluida durante um gradiente lineal com 1 M de NaCl mostra uma clara homogenedade em SDS-PAGE (eletroforese sobre gel de poliacrilamida-sódio dodecilsulfato). 4. Análise do contido de aminoácidos e N-terminus A sequenciação N-terminal leva-se a cabo sobre um sequênciador ABI 476A; e a análise de aminoácido total, a partir do qual se determina o coeficiente de extinção de lacase, realiza-se sobre um instrumento HP AminoQuant.

B. RESULTADOS E DISCUSSÃO 1. Purificação

Isolam-se um 0,6g de lacase de 1200 ml de caldo de fermento. A concentração inicial na que se emprega uma membrana com MWCO de 100 kDa elimina as quantidades significativas de matéria marrom e as pequenas proteínas contaminantes. A baixa afinidade da lacase com respeito à matriz Q-Sefarosa equilibrada com 10 mM de Tris, pH 7.7, facilita a sua separação de outras impurezas. As fracções enriquecidas purificam-se ulteriormente mediante mono-Q o pH 5.3. Ainda que apresenta um pi de 5.1, a lacase migra lentamente sobre mono-Q e separa-se das impurezas durante o lavado com 10 mM de MES, pH 5.3. Obtém-se uma purificação total de 15 vezes e uma recuperação do 60%. 31 2. Caracterização A lacase purificada mostra uma massa molecular de 75-80 kDa em SDS-PAGE (eletroforese sobre gel de poliacrilamida-sódio dodecilsulfato). A diferença entre a massa molecular derivada da sequência de ADN (63 kDa) e a massa molecular observada atribui-se a glicosilação. O IEF natural mostra 3 bandas perto do extremo do tubo de pi de aprox. 5,1, que se encontram activa no ensaio do véu de superfície do ABTS. 3. Sequenciação N-terminal Não resultado possível a sequênciação directa do N-terminal da lacase purificada a partir das mostras já seja numa solução dessalada ou numa membrana PVDF. Este resultado sugere um N-terminal bloqueado, mais provavelmente um lugar de piroglutamato baseado na sequência do gene. O espetro da lacase azul tem uma absorção máxima de 276 e 602 nm; com Abs280/Abs600=23 e Abs33o/Abs589=2,l. O coeficiente de extinção determinado mediante análise de aminoácidos é de 1,9 l/(g*cm). A actividade avalia-se utilizando siringaldacina ou ABTS como substratos. Tanto expressando-se segundo Abs280 ou em mg> a lacase tem um valor de 2,2 ou 4,2 unidades para SOU o pH 7, respectivamente.

Os perfis de pH da actividade da lacase apresentam um pH óptimo de 7 e 4, para siringaldacina e oxidação de ABTS, respectivamente (figura 4). Na figura 5 mostra-se a análise de termo com três pHs. A lacase é mais estável com pH neutro 32 a alcalino que com pH ácido. Também se observa termo-activação numa margem de pH neutro -alcalino.

Depósito de materiais biológicos O seguinte material biológico foi depositado sob os términos do Tratado de Budapeste em colaboração com The Agricultural Research Service Patent Culture Colection, Northern Regional Research Center, 1815 University Street, Peoria, Illinois, 61604 e foi-lhe dado o seguinte número de adesão.

Depósito Número de adesão E. coli JM101 contendo NRRL B-2126 pShThl5 2

Lista de sequências (1) Informação geral (i) Solicitante: (A) NOME: Novo Nordisk Bio, Inc. (B) RUA: 1445 Drew Avenue (C) CIDADE: Davis, Califórnia (D) PAÍS: Estados (E) CÓDIGO postal: 95616-4880 (F) TELEFONE: (916) 757-8100 (G) FAX: (916) 758-0317

(ii) Título da invenção: LACASAS PURIFICADAS DE SCYTALIDIUM E ÁCIDOS NUCLEICOS QUE AS CODIFICAM (iii) Número de sequências: 2 (iv) Endereço postal:

(A) DESTINATÁRIO: Novo Nordisk of North America, Inc. (B) RUA: 405 Lexington Avenue, Suíte 6400 (C) CIDADE: Nova York (D) ESTADO: Nova York (E) PAÍS: U.S.A. (F) CÓDIGO postal: 10174-6401 (v) Formato legível do computador (A) Tipo de meio: disquete

(B) Computador: IBM compatível com PC

(C) Sistema operativo: PC-DOS/MS-DOS (D) Software: Patentln Release #1.0, Versão #1.25 (EPO) (vi) Data de solicitude atual:

(A) Número de solicitude: US (B) Data de solicitude: 31 de maio de 1995 (C) Classificação: (vii) Data de solicitude anterior: (A) Número de solicitude: US 08/253,784 (B) Data de solicitude: 03 de junho de 1994 (viii) Informação sobre o agente/advogado (A) Nome: Lowney, Karen a. (B) Número de registro: 31,274

(C) Referencia/ número de certificado:4186.204-WO (ix) Informação sobre telecomunicações: (A) Telefone: 212 867 0123 (B) Fax: 212 867 0298 (2) Informação sobre a Sequência ID N°: 1: (i) Características da sequência: (A) LONGITUDE: 2476 pares base (B) TIPO: ácido nucléico (C) ENCADEAMENTO: duplo (D) TOPOLOGIA: lineal (ii) Tipo de molécula: ADN (genómico) (vi) Fonte original: 34 (A) ORGANISMO: Scytalidium thermophilum (ix) Característica: (A) NOMBRE/ CLAVE: intrón (B) UBIQUAÇÃO: 349. .411 (ix) Característica: (A) NOME/CHAVE: intrón (B) UBIQUAÇÃO: 502.. 559 (ix) Característica: (A) NOME/ CLAVE: intrón (B) UBIQUAÇÃO: 632. .686 (ix) Característica: (A) NOMBRE/CLAVE: intrón (B) UBIQUAÇÃO: 1739. .1804 (ix) Característica:

(A) NOME/CHAVE: CDS (B) UBIQUAÇÃO: união (106. .348, 412. .501, 560. .631, 687. .1738, 1805. .2194). (xi) Descrição de sequência: Sequência ID N0:.: 1 35 CTGAATTTAA ATACAGGAAG ATCGCATTCA ATCCAGCCTA GACTGCACAA TGGTTCTGCA 60 CGACCGTCGC ACACCTGCCA ATAGTGTTAA TAACGGNCTA ATACC ATGAAGCGCTTC 117

Met Lys Arg Phe 1 TTC ATT AAT AGC CTT CTG CTT CTC GCA GGG CTC CTC AAC TCA GGGGCC 165

Phe Ile Asn Ser Leu Leu Leu Leu Ala Gly Leu Leu Asn Ser Gly Ala 5 10 15 20 CTC GCG GCT CCG TCT ACA CAT CCC AGA TCA AAC CCC GAC ATA CTG CTT 213

Leu Ala Ala Pro Ser Thr His Pro Arg Ser Asn Pro Asp Ile Leu Leu 25 30 35 GAA AGA GAT GAC CAC TCC CTT ACG TCT CGG CAA GGT AGC TGT CAT TCT 261

Glu Arg Asp Asp His Ser Leu Thr Ser Arg Gin Gly Ser Cys His Ser 40 45 50 CCA AGC AAC CGC GCC TGT TGG TGC TCT GGC TTC GAT ATC AAC ACG GAT 309

Pro Ser Asn Arg Ala Cys Trp Cys Ser Gly Phe Asp Ile Asn Thr Asp 55 60 65 TAT GAG ACC AAG ACT CCA AAC ACC GGA GTG GTG CGG CGG GTTAGTATCC 358

Tyr Glu Thr Lys Thr Pro Asn Thr Gly Vai Vai Arg Arg 70 75 80 CAAGTTACGT TTGACCAAGA AATGGACGTG AAGTGTGCTG ACTCTCCCGC TAG 411 36

TAC ACC TTT GAT ATC ACC GAA GTC GAC AAC CGC CCC GGT CCC GAT GGG 459

Tyr Thr Phe Asp Ile Thr Glu Vai Asp Asn Arg Pro Gly Pro Asp Gly 85 90 95 GTC ATC AAG GAG AAG CTC ATG CTT ATC AAC GAC AAA CTC CTG GTAGG 506

Vai Ile Lys Glu Lys Leu Met Leu Ile Asn Asp Lys Leu Leu 100 105 110 GTCCTCTCGA ACGCCTGCGT CTGCCACACA GCGTAAAACT AACGAACCGC TAG 559 GGC CCG ACA GTC TTC GCA AAC TGG GGC GAC ACC ATC GAG GTG ACC GTC 607

Gly Pro Thr Vai Phe Ala Asn Trp Gly Asp Thr Ile Glu Vai Thr Vai 115 120 125 AAC AAC CAC CTG AGA ACC AAC GGA GTAAGCGTTC GGACACAAAG CCCAGCAACC 661 Asn Asn His Leu Arg Thr Asn Gly 130 135 TAGACACACT CAACTGACCA AGTAG ACC TCC ATC CAC TGG CAC GGCTTGCACCAA 716

Thr Ser Ile His Trp His Gly Leu His Gin 140 145 AAA GGA ACC AAC TAC CAC GAC GGC GCC AAC GGC GTG ACC GAG TGT CCC 764

Lys Gly Thr Asn Tyr His Asp Gly Ala Asn Gly Vai Thr Glu Cys Pro 150 155 160 ATC CCG CCC GGT GGC TCC CGA GTC TAC AGC TTC CGA GCG CGC CAATAT 812

Ile Pro Pro Gly Gly Ser Arg Vai Tyr Ser Phe Arg Ala Arg Gin Tyr 165 170 175 37 GGA ACG TCA TGG TAC CAC TCC CAC TTC TCC GCC CAG TAT GGC AAC GGC 860

Gly Thr Ser Trp Tyr His Ser His Phe Ser Ala Gin Tyr Gly Asn Gly 180 185 190 GTG AGC GGC GCC ATC CAG ATC AAC GGA CCC GCC TCC CTG CCC TAC GAC 908

Vai Ser Gly Ala Ile Gin Ile Asn Gly Pro Ala Ser Leu Pro Tyr Asp 195 200 205 ATC GAC CTC GGC GTC CTC CCG CTG CAG GAC TGG TAC TAC AAG TCC GCC 956

Ile Asp Leu Gly Vai Leu Pro Leu Xaa Asp Trp Tyr Tyr Lys Ser Ala 210 215 220 225 GAC CAG CTC GTC ATC GAG ACC CTG GCC AAG GGC AAC GCT CCG TTC AGC 1004

Asp Gin Leu Vai Ile Glu Thr Leu Xaa Lys Gly Asn Ala Pro Phe Ser 230 235 240 GAC AAC GTC CTC ATC AAC GGC ACC GCA AAG CAC CCC ACC ACT GGC GAA 1052

Asp Asn Vai Leu Ile Asn Gly Thr Ala Lys His Pro Thr Thr Gly Glu 245 250 255 GGG GAG TAC GCC ATC GTG AAG CTC ACC CCG GGC AAA CGC CAT CGCCTG 110

Gly Glu Tyr Ala Ile Vai Lys Leu Thr Pro Asp Lys Arg His Arg Leu 260 265 270 CGG CTC ATC AAC ATG TCG GTG GAG AAC CAC TTC CAG GTC TCG CTGGCG 1148

Arg Leu Ile Asn Met Ser Vai Glu Asn His Phe Gin Vai Ser Leu Ala 275 280 285 AAG CAC ACC ATG ACG GTC ATC GCG GCG GAC ATG GTC CCC GTC AAC GCC 1196

Lys His Thr Met Thr Vai Ile Ala Ala Asp Met Vai Pro Vai Asn Ala 290 295 300 305 38 ATG ACC GTC GAC AGC CTG TTT ATG GCC GNC GGG CAG CGG TAT GAT GTT 1244

Met Thr Vai Asp Ser Leu Phe Met Ala Vai Gly Gin Arg Tyr Asp Vai 310 315 320 ACC ATC GAC GCG AGC CAG GCG GTG GGG AAT TAC TGG TTC AAC ATC ACC 1292

Thr Ile Asp Ala Ser Gin Ala Vai Gly Asn Tyr Trp Phe Asn Ile Thr 325 330 335 TTT GGA GGG CAG CAG AAG TGC GGC TTC TCG CAC AAT CCG GCG CCGGCA 1340

Phe Gly Gly Gin Gin Lys Cys Gly Phe Ser His Asn Pro Ala Pro Ala 340 345 350 GCC ATC TTT CGC TAC GAG GGC GCT CCT GAC GCT CTG CCG ACG GATCCT 1388

Ala Ile Phe Arg Tyr Glu Gly Ala Pro Asp Ala Leu Pro Thr Asp Pro 355 360 365 GGC GCT GCG CCA AAG GAT CAT CAG TGC CTG GAC ACT TTG GAT CTTTCA 1436

Gly Ala Ala Pro Lys Asp His Gin Cys Leu Asp Thr Leu Asp Leu Ser 370 375 380 385 CCG GTG GTG CAA AAG AAC GTG CCG GTT GAC GGG TTC GTC AAA GAG CCT 1484

Pro Vai Vai Gin Lys Asn Vai Pro Vai Asp Gly Phe Vai Lys Glu Pro 390 395 400 GGC AAT ACG CTG CCG GTG ACG CTC CAT GTT GAC CAG GCC GCG GCT CCA 1532

Gly Asn Thr Leu Pro Vai Thr Leu His Vai Asp Gin Ala Ala Ala Pro 405 410 415 39 CAC GTG TTT ACG TGG AAG ATC AAC GGG AGC GCT GCG GAC GTG GACTGG 1580

His Vai Phe Thr Trp Lys Ile Asn Gly Ser Ala Ala Asp Vai Asp Trp 420 425 430 GAC AGG CCG GTG CTG GAG TAT GTC ATG AAC AAT GAC CTG TCT AGC ATT 1628

Asp Arg Pro Vai Leu Glu Tyr Vai Met Asn Asn Asp Leu Ser Ser Ile 435 440 445 CCG GTC AAG AAC AAC ATT GTG AGG GTG GAC GGA GTC AAC GAG TGG ACG 1676

Pro Vai Lys Asn Asn Ile Vai Arg Vai Asp Gly Vai Asn Glu Trp Thr 450 455 460 465 TAC TGG CTC GTC GAA AAC GAC CCG GAG GGC CGC CTC AGT TTG CCG C AT 1724

Tyr Trp Leu Vai Glu Asn Asp Pro Glu Gly Arg Leu Ser Leu Pro His 470 475 470 CCG ATG CAT CTA CAC GTAAGTCACA TCCCCCACTA CCATTCGGAA TGACCACCAG 1779 Pro Met His Leu His 475 GTACTGACAC CCTCCTCCTC AATAG GGA CAC GAT TTC TTT GTC CTA GGC CGC 1831

Gly His Asp Phe Phe Vai Leu Gly Arg 480 485 TCC CCC GAC GTC TCG CCC GAT TCA GAA ACC CGC TTC GTC TTT GAC CCG 187

Ser Pro Asp Vai Ser Pro Asp Ser Glu Thr Arg Phe Vai Phe Asp Pro 490 495 500 GCC GTC GAC CTC CCC CGT CTG CGC GGA CAC AAC CCC GTC CGG CGC GAC 1927

Ala Vai Asp Leu Pro Arg Leu Arg Gly His Asn Pro Vai Arg Arg Asp 505 510 515 40 GTC ACC ATG CTT CCC GCG CGC GGC TGG CTG CTG CTG GCC TTC CGCACG 1975

Vai Thr Met Leu Pro Ala Arg Glu Trp Leu Leu Leu Ala Phe Arg Thr 520 525 530 GAC AAC CCG GGC GCG TGG TTG TTC CAC TGC CAC ATC GCG TGR CAC GTG 202

Asp Asn Pro Gly Ala Trp Leu Phe His Cys His Ile Ala Trp His Vai 535 540 545 TCG GGC GGG TTA AGC GTC GAC TTT CTG GAG CGG CCG GAC GAG CTG CGC 2071

Ser Gly Gly Leu Ser Vai Asp Phe Leu Glu Arg Pro Asp Glu Leu Arg 550 555 560 565 GGG CAG CTG ACG GGA GAG AGC AAG GCG GAG TTG GAG CGT GTT TGTCGC 2119

Gly Gin Leu Thr Gly Glu Ser Lys Ala Glu Leu Glu Arg Vai Cys Arg 570 575 580 GAG TGG AAG GAT TGG GAG GCG AAG AGC CCG CAT GGG AAG ATC GAT TCG 2167

Glu Trp Lys Asp Trp Glu Ala Lys Ser Pro His Gly Lys Ile Asp Ser 585 590 595 GGG TTG AAG CAG CGG CGA TGG GAT GCG TGAGGTAGTT GGGCGGATTG 2214

Gly Leu Lys Gin Arg Arg Trp Asp Ala 600 605 TTTAACACGT AGTGGGTAAG GTTGGGGCGG GTTTGTTTGG CGTTTTCAGG GGTTGGGGTG 2274 CGGATGCTGG TCATCCGGGA AACGGCTCTA CAACTGGTGT CAATAGACTA ATATAGAGTG 2334 ATCAAAGAAC TGAGGTTCTG AAAGAGGCGT GGAAGTCGCG TTGTGACTCC CTTTGCCATG 2394 41 TTGGGAAGTG TGGCTCAACA TTGTGTTCAG GTTTGCTCAG GGTGATNTCG AACTGACGTN 2454 TTGATGAGGG TTATTGCNTA GA 2476 (2) Informação sobre a sequência ID N°: 2: (i) Características da sequência: (A) LONGITUDE: 616 aminoácidos (B) TIPO: aminoácido (C) ENCADEAMENTO: único (D) TOPOLOGIA: lineal (ii) Tipo de molécula: proteína (vi) Fonte original: (A) ORGANISMO: Scytalidium thermophilum (xi) Descrição da sequência: Sequência ID N°: 2

Met Lys Arg Phe Phe Ile Asn Ser Leu Leu Leu Leu Ala Gly Leu Leu 1 5 10 15

Asn Ser Gly Ala Leu Ala Ala Pro Ser Thr His Pro Arg Ser Asn Pro 20 25 30

Asp Ile Leu Leu Glu Arg Asp Asp His Ser Leu Thr Ser Arg Gin Gly 35 40 45

Ser Cys His Ser Pro Ser Asn Arg Ala Cys Trp Cys Ser Gly Phe Asp 50 55 60

Ile Asn Thr Asp Tyr Glu Thr Lys Thr Pro Asn Thr Gly Vai Vai Arg 65 70 75 80

Arg Tyr Thr Phe Asp Ile Thr Glu Vai Asp Asn Arg Pro Gly Pro Asp 85 90 95 42

Gly Vai Ile Lys Glu Lys Leu Met Leu Ile Asn Asp Lys Leu Leu Gly 100 105 110

Pro Thr Vai Phe Ala Asn Trp Gly Asp Thr Ile Glu Vai Thr Vai Asn 115 120 125

Asn His Leu Arg Thr Asn Gly Thr Ser Ile His Trp His Gly Leu His 130 135 140

Gin Lys Gly Thr Asn Tyr His Asp Gly Ala Asn Gly Vai Thr Glu Cys 145 150 155 160

Pro Ile Pro Pro Gly Gly Ser Arg Vai Tyr Ser Phe Arg Ala Arg Gin 165 170 175

Tyr Gly Thr Ser Trp Tyr His Ser His Phe Ser Ala Gin Tyr Gly Asn 180 185 190

Gly Vai Ser Gly Ala Ile Gin Ile Asn Gly Pro Ala Ser Leu Pro Tyr 195 200 205

Asp Ile Asp Leu Gly Vai Leu Pro Leu Gin Asp Trp Tyr Tyr Lys Ser 210 215 220

Ala Asp Gin Leu Vai Ile Glu Thr Leu Ala Lys Gly Asn Ala Pro Phe 225 230 235 240

Ser Asp Asn Vai Leu Ile Asn Gly Thr Ala Lys His Pro Thr Thr Gly 245 250 255

Glu Gly Glu Tyr Ala Ile Vai Lys Leu Thr Pro Asp Lys Arg His Arg 260 265 270

Leu Arg Leu Ile Asn Met Ser Vai Glu Asn His Phe Gin Vai Ser Leu 275 280 285

Ala Lys His Thr Met Thr Vai Ile Ala Ala Asp Met Vai Pro Vai Asn 290 295 300 43

Ala Met Thr Vai Asp Ser Leu Phe Met Ala Xaa Gly Gin Arg Tyr Asp 305 310 315 320

Vai Thr Ile Asp Ala Ser Gin Ala Vai Gly Asn Tyr Trp Phe Asn Ile 325 330 335

Thr Phe Gly Gly Gin Gin Lys Cys Gly Phe Ser His Asn Pro Ala Pro 340 345 350

Ala Ala Ile Phe Arg Tyr Glu Gly Ala Pro Asp Ala Leu Pro Thr Asp 355 360 365

Pro Gly Ala Ala Pro Lys Asp His Gin Cys Leu Asp Thr Leu Asp Leu 370 375 380

Ser Pro Vai Vai Gin Lys Asn Vai Pro Vai Asp Gly Phe Vai Lys Glu 385 390 395 400

Pro Gly Asn Thr Leu Pro Vai Thr Leu His Vai Asp Gin Ala Ala Ala 405 410 415

Pro His Vai Phe Thr Trp Lys Ile Asn Gly Ser Ala Ala Asp Vai Asp 420 425 430

Trp Asp Arg Pro Vai Leu Glu Tyr Vai Met Asn Asn Asp Leu Ser Ser 435 440 445

Ile Pro Vai Lys Asn Asn Ile Vai Arg Vai Asp Gly Vai Asn Glu Trp 450 455 460

Thr Tyr Trp Leu Vai Glu Asn Asp Pro Glu Gly Arg Leu Ser Leu Pro 465 470 475 480

His Pro Met His Leu His Gly His Asp Phe Phe Vai Leu Gly Arg Ser 485 490 495

Pro Asp Vai Ser Pro Asp Ser Glu Thr Arg Phe Vai Phe Asp Pro Ala 500 505 510 44

Vai Asp Leu Pro Arg Leu Arg Gly His Asn Pro Vai Arg Arg Asp Vai 515 520 525

Thr Met Leu Pro Ala Arg Gly Trp Leu Leu Leu Ala Phe Arg Thr Asp 530 535 540

Asn Pro Gly Ala Trp Leu Phe His Cys His Ile Ala Trp His Vai Ser 545 550 555 560

Gly Gly Leu Ser Vai Asp Phe Leu Glu Arg Pro Asp Glu Leu Arg Gly 565 570 575

Gin Leu Thr Gly Glu Ser Lys Ala Glu Leu Glu Arg Vai Cys Arg Glu 580 585 590

Trp Lys Asp Trp Glu Ala Lys Ser Pro His Gly Lys Ile Asp Ser Gly 595 600 605

Leu Lys Gin Arg Arg Trp Asp Ala 610 615

45

Número de referência do expediente do N° de Solicitude Internacional solicitante ou agente TBA 4186.204-WO INDICAÇÕES REFERIDAS A UM MICROORGANISMO DEPOSITADO (Regra PCT 13 bis)

A. As indicações feitas abaixo se referem ao microorganismo citado na descrição da página 29 , linha_3_. B. IDENTIFICAÇÃO DE Outros depósitos são identificados numa folha adicional §| Nome do organismo depositário Agricultural Research Service Patent Culture Collection (NRRL) Morada do organismo depositário (incluindo código postal e país) Northern Regional Research Center 1815 University Street Peoria, IL 61604, US

Data do depósito Número de admissão 25 de Maio de 1995 NRRL B-21262 C. INDICAÇÕES ADICIONAIS (deixe em branco se não há) Esta informação continua em folha adicional ss Em relação àquelas designações nas quais se busca uma patente Européia e/ou Australiana, durante a tramitação da solicitude da patente, somente se entregará uma mostra do microorganismo depositado a um experto independente nomeado pela pessoa que solicita a mostra (Regra 28(4) Regramento 3.25 da Regra Estatutaria de Austrália n° 71 de 1991).

46 D. ESTADOS DESIGNADOS PARA OS QUAIS FORAO FEITAS AS INDICAÇÕES (se as indicações não são para todos os estados designados) E. OUTRAS INFORMAÇÕES SOBRE AS INDICAÇÕES (deixe em branco se não há) A indicação relacionada abaixo será apresentada à Oficina Internacional mais tarde (especifique a natureza geral das indicações, p.ex. “Número de Admissão do Depósito)”.

Para uso exclusivo da Oficina Para uso exclusivo da Oficina receptora Internacional m Esta folha foi recebida com a !§ Esta folha foi recebida com a solicitude internacional solicitude internacional o Oficial autorizado Doris L Brook Oficial autorizado Divisão internacional PCT Formulário PCT/RO/134 (Julio 1992) Lisboa, 5 de Dezembro de 2000.

Pela Requerente

Gonçeio da Cunha Ferreiro Adjunto do Agente Oficiei de Propriedade Industriei R. D. Joêo V, 9-2° dl.°-1250 LISSOÂ 47

Claims (33)

1. REIVINDICAÇÕES 1. Lacase Scytalidium substancialmente pura tendo uma sequência de aminoácidos que apresenta ao menos um 80% de homologia a totalidade da sequência de aminoácidos indicada pela sequência identificada com o n° 2.
2. 2. Lacase Scytalidium segundo a reivindicação 1 caracterizado por ter uma sequência de aminoácidos que apresenta ao menos um 85% de homologia a sequência de aminoácidos indicada pela sequência identificada com o n° 2.
3. 3. Lacase Scytalidium segundo a reivindicação 1 caracterizado por ter uma sequência de aminoácidos que apresenta ao menos 90% de homologia a sequência de aminoácidos indicada pela sequência identificada com o n° 2. ¥
4. 4. Lacase Scytalidium segundo a reivindicação 1 caracterizado por ter uma sequência de aminoácidos que apresenta ao menos 95% de homologia a sequência de aminoácidos indicada pela sequência identificada com o n° 2.
5. 5. Lacase da reivindicação 1 caracterizado por ser uma lacase de Scytalidium thermophila.
6. 6. Lacase de Scytalidium segundo a reivindicação 1 caracterizado por ter a sequência de aminoácidos indicada pela sequência identificada com o n° 2.
7. 7. Construção de ADN caracterizado por incluir uma sequência de ácido nucléico que codifica uma lacase de Scytalidium segundo a reivindicação 1. 1
8. 8. Construção de ADN caracterizado por incluir uma sequência de ácido nucléico que codifica uma lacase de Scytalidium segundo a reivindicação 2.
9. 9. Construção de ADN caracterizado por incluir uma sequência de ácido nucléico que codifica uma lacase de Scytalidium segundo a reivindicação 3.
10. 10. Construção de ADN caracterizado por incluir uma sequência de ácido nucléico que codifica uma lacase de Scytalidium segundo a reivindicação 4.
11. 11. Construção de ADN caracterizado por incluir uma sequência de ácido nucléico que codifica uma lacase de Scytalidium segundo a reivindicação 5.
12. 12. Construção de ADN caracterizado por incluir uma sequência de ácido nucléico que codifica uma lacase de Scytalidium segundo a reivindicação 6. *
13. 13. Vector recombinante caracterizado por compreender a construção de ADN da reivindicação 7.
14. 14. Vector segundo a reivindicação 13 caracterizado por a construção ser ligada de maneira funcional a uma sequência de promotor.
15. 15. Vector segundo a reivindicação 14 caracterizado por o promotor ser um promotor fúngico ou de levedura.
16. 16. Vector segundo a reivindicação 15 caracterizado por o promotor ser o promotor de TAKA amilase de Aspergillus oryzae. 2 /1 / /
17. 17. Vector segundo a reivindicação 16 caracterizado por o promotor ser o promotor de glucoamilase (glAu) de Aspergillus niger ou de Aspergillus awamori.
18. 18. Vector segundo a reivindicação 14 caracterizado por compreender também um marcador seleccionável.
19. 19. Vector segundo a reivindicação 18 caracterizado por o marcador seleccionável ser seleccionado do grupo que consiste em amdS, pyrG, argB, niaD, sC, ehygB.
20. 20. Vector segundo a reivindicação 19 caracterizado por o marcador seleccionável ser o marcador amdS de Aspergillus nidulans ou Aspergillus oryzae, ou o marcador pyrG de Aspergillus nidulans, Aspergillus niger, Aspergillus awamori, ou Aspergillus oryzae. *
21. 21. Vector segundo a reivindicação 18 caracterizado por compreender tanto o promotor de TAKA amilasa de Aspergillus oryzae como o marcador amdS ou pyrG de Aspergillus nidulans ou Aspergillus oryzae.
22. 22. Célula hóspede recombinante caracterizada por incluir uma construção de ADN heterologa segundo a reivindicação 7.
23. 23. Célula segundo a reivindicação 22 caracterizada por ser uma célula fúngica.
24. 24. Célula segundo a reivindicação 22 caracterizada por ser uma célula de Aspergillus. 3
25. 25. Célula segundo a reivindicação 22 caracterizada por a construção se integrar no genoma da célula hóspede.
26. 26. Célula segundo a reivindicação 22 caracterizada por a construção se encontrar contida em um vector.
27. 27. Célula segundo a reivindicação 22 caracterizada por a sequência de ácido nucléico codificar uma lacase que tem a sequência de aminoácido indicada na sequência identificada com o n° 2.
28. 28. Método para obter uma lacase segundo a reivindicação 1, caracterizado por compreender o cultivo de uma célula hóspede recombinante segundo qualquer das reivindicações 22-27 incluindo uma construção de ADN contendo uma sequência de ácido nucléico que codifica a lacase sob condições propicias para a expressão da é lacase e a recuperação da enzima do cultivo.
29. 29. Método de intensificação da rendimento da lacase recombinante activa segundo a reivindicação 1, caracterizado por compreender o cultivo de uma célula hóspede recombinante segundo qualquer das reivindicações 22-27 incluindo uma construção de ADN contendo uma sequência que codifica um enzima que contém cobre, baixo condições propicias para o expressão do enzima, em presença de pelo menos aprox. 0,02 mM de cobre.
30. 30. Método para polimerizar um substrato de lignina ou de lignosulfato numa solução, caracterizado por compreender o pôr em contacto o substrato com uma lacase segundo a reivindicação 1. 4
31. 31. Método para uma despolimerização in situ em pasta de papel Kraft, caracterizado por compreender pôr em contacto a pasta de papel com uma lacase segundo a reivindicação 1.
32. 32. Método para oxidar corantes ou precursores da cor, caracterizado por compreender pôr em contacto a cor com uma lacase segundo a reivindicação 1.
33. 33. Método de polimerização ou de oxidação de um composto fenólico ou composto de anilina, caracterizado por compreender pôr em contacto o composto fenólico ou composto de anilina com uma lacase de Scytalidium segundo a reivindicação 1. Lisboa, 5 de Dezembro de 2000. Pela Requerente O Agente Oficial

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