FI121851B - Sieniperäinen proteaasi ja sen käyttö - Google Patents

Sieniperäinen proteaasi ja sen käyttö Download PDF

Info

Publication number
FI121851B
FI121851B FI20095779A FI20095779A FI121851B FI 121851 B FI121851 B FI 121851B FI 20095779 A FI20095779 A FI 20095779A FI 20095779 A FI20095779 A FI 20095779A FI 121851 B FI121851 B FI 121851B
Authority
FI
Finland
Prior art keywords
enzyme
serine protease
fungal
protease
host
Prior art date
Application number
FI20095779A
Other languages
English (en)
Swedish (sv)
Other versions
FI20095779A0 (fi
FI20095779A (fi
Inventor
Marja Paloheimo
Kari Juntunen
Leena Valtakari
Susanna Maekinen
Pentti Ojapalo
Original Assignee
Ab Enzymes Oy
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Ab Enzymes Oy filed Critical Ab Enzymes Oy
Priority to FI20095779A priority Critical patent/FI121851B/fi
Publication of FI20095779A0 publication Critical patent/FI20095779A0/fi
Priority to US12/803,456 priority patent/US8362222B2/en
Priority to CN201080039991.4A priority patent/CN102625810B/zh
Priority to EP10729893.7A priority patent/EP2451829B1/en
Priority to JP2012518989A priority patent/JP6054741B2/ja
Priority to DK10729893.7T priority patent/DK2451829T3/en
Priority to PCT/EP2010/059787 priority patent/WO2011003968A1/en
Publication of FI20095779A publication Critical patent/FI20095779A/fi
Application granted granted Critical
Publication of FI121851B publication Critical patent/FI121851B/fi

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
    • C12N9/14—Hydrolases (3)
    • C12N9/48—Hydrolases (3) acting on peptide bonds (3.4)
    • C12N9/50—Proteinases, e.g. Endopeptidases (3.4.21-3.4.25)
    • C12N9/58—Proteinases, e.g. Endopeptidases (3.4.21-3.4.25) derived from fungi
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A23—FOODS OR FOODSTUFFS; TREATMENT THEREOF, NOT COVERED BY OTHER CLASSES
    • A23L—FOODS, FOODSTUFFS, OR NON-ALCOHOLIC BEVERAGES, NOT COVERED BY SUBCLASSES A21D OR A23B-A23J; THEIR PREPARATION OR TREATMENT, e.g. COOKING, MODIFICATION OF NUTRITIVE QUALITIES, PHYSICAL TREATMENT; PRESERVATION OF FOODS OR FOODSTUFFS, IN GENERAL
    • A23L29/00—Foods or foodstuffs containing additives; Preparation or treatment thereof
    • A23L29/06—Enzymes
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C11—ANIMAL OR VEGETABLE OILS, FATS, FATTY SUBSTANCES OR WAXES; FATTY ACIDS THEREFROM; DETERGENTS; CANDLES
    • C11D—DETERGENT COMPOSITIONS; USE OF SINGLE SUBSTANCES AS DETERGENTS; SOAP OR SOAP-MAKING; RESIN SOAPS; RECOVERY OF GLYCEROL
    • C11D3/00—Other compounding ingredients of detergent compositions covered in group C11D1/00
    • C11D3/16—Organic compounds
    • C11D3/38—Products with no well-defined composition, e.g. natural products
    • C11D3/386—Preparations containing enzymes, e.g. protease or amylase
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C11—ANIMAL OR VEGETABLE OILS, FATS, FATTY SUBSTANCES OR WAXES; FATTY ACIDS THEREFROM; DETERGENTS; CANDLES
    • C11D—DETERGENT COMPOSITIONS; USE OF SINGLE SUBSTANCES AS DETERGENTS; SOAP OR SOAP-MAKING; RESIN SOAPS; RECOVERY OF GLYCEROL
    • C11D3/00—Other compounding ingredients of detergent compositions covered in group C11D1/00
    • C11D3/16—Organic compounds
    • C11D3/38—Products with no well-defined composition, e.g. natural products
    • C11D3/386—Preparations containing enzymes, e.g. protease or amylase
    • C11D3/38681—Chemically modified or immobilised enzymes
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/11—DNA or RNA fragments; Modified forms thereof; Non-coding nucleic acids having a biological activity
    • C12N15/52—Genes encoding for enzymes or proenzymes
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
    • C12N15/80—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for fungi
    • D—TEXTILES; PAPER
    • D06—TREATMENT OF TEXTILES OR THE LIKE; LAUNDERING; FLEXIBLE MATERIALS NOT OTHERWISE PROVIDED FOR
    • D06M—TREATMENT, NOT PROVIDED FOR ELSEWHERE IN CLASS D06, OF FIBRES, THREADS, YARNS, FABRICS, FEATHERS OR FIBROUS GOODS MADE FROM SUCH MATERIALS
    • D06M16/00—Biochemical treatment of fibres, threads, yarns, fabrics, or fibrous goods made from such materials, e.g. enzymatic
    • D06M16/003—Biochemical treatment of fibres, threads, yarns, fabrics, or fibrous goods made from such materials, e.g. enzymatic with enzymes or microorganisms

Description

SIENIPERÄINEN PROTEAASI JA SEN KÄYTTÖ KEKSINNÖN ALA
5 Esillä oleva keksintö koskee sieniperäistä scri i n i protcaasientsyymiä, joka on käyttökelpoinen erilaisissa teollisissa sovelluksissa, erityisesti pyykin- ja astianpesuaineissa, joissa mainitun entsyymin tehokkuus alhaisilla tai kohtalaisilla lämpötila-alueilla on edullista. Keksintö koskee mainittua entsyymiä koodaavaa eristettyä nukleiinihappomolekyyliä, rekombinanttista vektoria, isäntäsolua mainitun entsyymin 10 tuottamiseksi, mainittua entsyymiä käsittävää entsyymi koostumusta sekä menetelmää tällaisen koostumuksen valmistamiseksi. Tämä keksintö koskee myös erilaisia käyttöjä mainitulle entsyymille tai mainittua entsyymiä käsittäville koostumuksille.
TAUSTAA
15
Mikrobien ekstrasellulaariset proteaasit muodostavat merkittävän osan, yli kolmanneksen, entsyymien maailmanlaajuisesta kokonaismyynnistä (Cherry ja Fidantsef, 2003). Noin 90 % kaupallisista proteaaseista on pesuaine-entsyymejä (Gupta ym., 2002). Muihin sovelluksiin sisältyvät sellaiset kuten elintarvikkeet, rehu, nahka, lääkeaineet, 20 diagnostiikka, j ätteiden käsittely j a hopean talteenotto.
Tällä hetkellä käytössä olevat kaupalliset pesuainevalmisteet käsittävät Z?acz7/ws-lajeista peräisin olevia emäksisiä seriiniproteaaseja (Maurer, 2004). 2?acz7/ws-entsyymien muunnelmia, joilla on parantunut katalyyttinen teho ja/tai parantunut stabiilius o 25 lämpötilan, hapetusaineiden ja erilaisten pesuolosuhteiden suhteen, on kehitetty c\i g kohdennetulla ja/tai satunnaisella mutageneesillä. Esimerkkejä kaupallisista proteaaseista t- ovat mm. subtilisiini Carlsberg (Alcalase®), subtilisiini 309 (Savinase®), subtilisiini 147 x (Esperase®) ja Kannase® (Novozymes, DK), Purafect®, Purafect® Ox ja Properase® (Genencor Inc., USA) ja BLAP S- jaX-sarjat (Henkel, DE).
05 £ 30
LO
o Emäksisiä seriiniproteaasigeenejä ja -entsyymejä (EC 3.4.21) on karakterisoitu myös C\J ....
eukaryoottisista organismeista, mukaan lukien hiivat ja rihmasienet. Sieniperäisten seriiniproteaasien käyttö on tunnettua useista patenttihakemuksista. Esimerkiksi US- 2 patentissa nro 3,652,399 ja julkaisussa EP 519229 (Takeda Chemical Industries, Ltd., JP) tuodaan esiin emäksinen proteaasi suvusta Fusarium (teleomorfi) tai Gibberella (anamorfi), erityisesti lajeista Fusarium sp. S-19-5 (ATCC 20192, IFO 8884), F. oxysporum f. sp. Uni (IFO 5880) tai G. saubinetti (ATCC 20193, IFO6608), näiden 5 ollessa käyttökelpoisia pesuaineiden ja muiden puhdistusainekoostumusten formuloinnissa. Julkaisu WO 1994025583 (Novo Nordisk A/S, DK) tuo esiin aktiivisen trypsiinin kaltaisen proteaasientsyymin, joka on saatavissa Fusarium-lajista, erityisesti F. oxysporum -kannasta (DSM 2672), sekä tätä koodaavan DNA-sekvenssin. Uuden, lajista Fusarium sp. BLB (FERM BP-10493) peräisin olevan proteaasin 10 aminohapposekvenssi tuodaan esiin julkaisussa WO 2006101140 (SODX Co Ltd, Nakamura). Tällaiset pesuainekoostumukset voivat lisäksi käsittää palautuvia proteaasi-inhibiittoreita entsyymin tai entsyymien stabiloimiseksi, kuten on tuotu esiin julkaisuissa WO 1992003529 ja WO 1992005239 (NovoNordisk A/S, DK), tai proteaasin katalyyttisesti aktiivinen aminohapposekvenssi voi olla kytketty sekvenssiin, joka 15 käsittää selluloosaa sitovan domeenin, kuten on tuotu esiin julkaisussa WO 1997028243 (NovoNordisk A/S, DK).
Seriiniproteaaseja voidaan käyttää sovelluksissa yksinään tai yhdistelmänä muiden hydrolysoivien entsyymien kanssa. Esimerkiksi julkaisuissa WO 88/03946 ja 20 WO 89/04361 (Novo Industri A/S, DK) tuodaan esiin entsymaattinen pesuaineiden lisäaine ja pesuainekoostumus, joka käsittää proteaasin ja lipaasin, jolloin sieniperäinen proteaasi on peräisin suvusta Fusarium, erityisesti lajista F. oxysporum tai F. solani.
Julkaisussa WO 1997002753 (NovoNordisk A/S) tuodaan esiin menetelmä likaantuneen ^ prosessilaitteiston hellävaraista puhdistusta varten käyttäen tällaista lipaasin ja proteaasin ^ 25 yhdistelmää. Yhdistelmä, joka käsittää sellulaasin ja proteaasin, erityisesti trypsiinin co 1 kaltaisen proteaasin lajista Fusarium sp. DSM 2672, pesuaineiden lisäaineena tai ^ koostumuksena on tuotu esiin julkaisussa WO 1992018599 (NovoNordisk A/S, DK).
X
tr
CL
Trichoderma-1 aj ien on kuvattu erittävän useita erilaisia proteaaseja (katsaus artikkelissa g 30 Kredics ym., 2005). Ainoastaan muutama niistä on kuitenkin karakterisoitu. ° Seriiniproteaasia koodaavan geenin prbl eristäminen biotoijuntakannasta T. harzianum (isolaatti myöhemmin luokiteltu T. atrovirideksi) on tuotu esiin artikkelissa Geremia ym. (1993). Tätä T. atroviriden prb/-geeni sekvenssiä käytettiin kloonattaessa prbl -geeni 3 lajeista T. hamatum ja T. harzianum (Steyaert ym., 2004) sekä tvspl-geeni lajista T. virens (Pozo ym., 2004). Kypsien T. atroviride PRB1-ja T. virens TVSP1 -proteiinien pl-arvojen odotettiin olevan 8,98 ja vastaavasti 9,2, ja molekyylipainojen 29 kDa. Niissä oli havaittavissa homologisuutta useisiin subtilisiinin kaltaisiin seriiniproteaaseihin 5 nähden, ja ne sijoitettiin seriiniproteaasien perheeseen S8. TrichoEST-lähestymistapa (Suarez ym. 2007) paljasti neljä uutta seriiniproteaasia P5431 (AM294975), P7129 (AM296482), P8048 (AM294978) ja P10261 (AM294980) biotorjuntasicncstä T. harzianum CECT 2413, joka kuului proteaasien alaperheeseen S8A. T. reesein genomiprojekti osoitti useiden erilaisia proteaaseja koodaavien geenien läsnäolon 10 (Martinez ym., 2008; http://genome.igi-psf.org/Trire2/Trire2.home.htmn. Homologi prbl-geenille koodaa proteiinia, jolla on tunnus 121495.
Edellä esitettyjen Trichoderman seriiniproteaasien on esitetty viitoittavan tietä mahdollisten biotorjuntageenien tunnistamiselle sekä parannetuille kaupallisille 15 biotorjunta-aincillc. Niiden sovelluksia muihin bioteknologisiin prosesseihin ei ole tutkittu. Meidän tietämyksemme mukaan emäksisen seriiniproteaasin lajista T. koningii on esitetty olevan sovellettavissa pesuaineteollisuuteen, sillä ristisilloittuminen glutaraldehydin kanssa aikaansai entsyymivalmisteen, joka oli stabiili laajoilla lämpötila-aluilla sekä pH-resistentti pesuaineiden aiheuttamalle inhibitiolle (Manonmani ja Joseph, 20 1993). Tämä entsyymi kuitenkin eroaa Prbl-tyypin proteaaseista sen korkean molekyylipainon ansiosta, joka on 85 kDa.
Myös sellaisista sienilajeista kuten Tritirachium ja Conidiobolus peräisin olevia ^ emäksisiä proteaaseja on selostettu (niistä ovat esittäneet katsauksen Anwar ja ^ 25 Saleemuddin, 1998).
co o ^ Sosioekonomiset haasteet ja valtiolliset säädökset ovat pakottaneet pesuaineteollisuuden £ ottamaan huomioon monia ympäristönäkökohtia, mukaan lukien sekä vähemmän haitallisten kemikaalien käytön, joita voidaan käyttää pieninä määrinä ja jotka sen vuoksi S 30 saastuttavat ympäristöä vähemmän, että myös tarpeen säästää energiaa. Pesuaineen ....
cm entsyymit, erityisesti proteaasit, ovat merkittävä aineosa pesuainekoostumuksissa. Tarve säästää energiaa laskemalla pesulämpötiloja sekä korkeita lämpötiloja sietämättömien synteettisten kuitujen lisääntynyt käyttö sekä tämänhetkinen elämäntyyli ovat muuttaneet 4 kuluttajien tottumuksia ja luoneet kysynnän uusille entsyymeille, jotka ovat tehokkaita alhaisissa lämpötiloissa.
Huolimatta siitä tosiseikasta, että on julkaistu useita patenttijulkaisuja, katsauksia ja 5 artikkeleita, joissa on tuotu esiin seriiniproteaaseja eri mikro-organismeista, esimerkiksi alhaisen lämpötilan proteaaseja sädesienestä Nocardiopsis dassonvillei (EP 0290567, Novo Nordisk A/S, DK) tai sienestä Paecilomyces marquandii (EP 0290569, Novo Nordisk A/S, DK), ja myös kylmää kestävien Trichoderma-isolaattien trypsiinin ja kymotrypsiinin kaltaisia aktiivisuuksia on tuotu esiin (Antal ym., 2000), on edelleen 10 olemassa suuri tarve vaihtoehtoisille seriiniproteaaseille, jotka soveltuvat proteiinipitoisten materiaalien tehokkaaseen muokkaamiseen, hajottamiseen ja poistamiseen erityisesti alhaisilla tai kohtalaisilla lämpötila-alueilla ja jotka ovat stabiileja ominaisuuksiltaan huomattavasti vaihtelevien pesuaineiden läsnäollessa.
15 Pesuaineteollisuudessa on otettu huomattavia edistysaskeleita uusien tuotteiden mukauttamisessa kuluttajien tarpeisiin ja tottumuksiin, uusien tekstiilituotteiden ominaisuuksiin sekä uusille pesukoneille. Pesuaineteollisuuden ja valtiollisten säädösten asettamien vaihtelevien edellytysten täyttämiseksi uusien pesuainekoostumuksiin tarkoitettujen seriiniproteaasi-aineosien ei tule ainoastaan täyttää niiden tehtävää laajoilla 20 pH- ja lämpötila-alueilla sekä pysyä stabiileina vaihtelevissa olosuhteissa, mukaan lukien mekaaniset ja kemialliset toimenpiteet käyttäen useita erilaisia pesuaineita, vaan on myös toivottavaa, että seriiniproteaasia voidaan tuottaa suuria määriä, joiden jälkikäsittely on kustannustehokasta, koska ne voidaan helposti erottaa fermentointiliemestä ja ^2 sienirihmastoista.
o ™ 25 co
° KEKSINNÖN YHTEENVETO
CM
X
Esillä olevan keksinnön tavoitteena on aikaansaada sieniperäinen seriiniproteaasi, jolla on laaja substraattispesifisyys, joka on aktiivinen laajoilla pH-alueilla ja jolla on laaja g 30 lämpötilaoptimi, eli joka toimii sekä alhaisissa että kohtalaisissa lämpötiloissa. Pyykin- ja c^ astianpesuaineisiin tarkoitettujen seriiniproteaasien on oltava stabiileja myös pesuaineiden läsnäollessa tai oltava yhteensopivia pesuaineiden kanssa. Erityisesti esillä olevan keksinnön tavoitteena on aikaansaada seriiniproteaasi, joka kykenee poistamaan 5 proteiinipitoista materiaalia, mukaan lukien pestävässä pyykissä tai tiskeissä olevia tahroja, tämänhetkisiä kaupallisia entsyymi valmisteita alhaisemmissa lämpötiloissa, säästäen näin energiaa. Sieniperäistä seriiniproteaasia voidaan valmistaa runsastuottoisissa sieni-isännissä ja sen jälkikäsittely, esim. erottaminen 5 fermentaatioliemestä ja sienirihmastoista, on helppo suorittaa.
Esillä oleva keksintö koskee sieniperäistä seriiniproteaasientsyymiä, joka on sovellettavissa proteiinipitoisten materiaalien muuntelemiseen, hajottamiseen tai poistamiseen alhaisilla tai kohtalaisilla lämpötila-alueilla. Entsyymillä on 10 seriiniproteaasiaktiivisuutta ja se käsittää kypsän Tr Prbl -entsyymin aminohapposekvenssin, joka on määritelty sekvenssissä nro 10, tai jonkin sen variantin, jolla on samankaltaisia ominaisuuksia. Edullisesti entsyymiä voidaan käyttää pesuaineiden lisäaineena.
15 Keksinnön entsyymi on saatavissa rihmasienestä Trichoderma, edullisemmin lajista T.reesei, edullisimmin T. reesei QM6a-kannasta (ATCC 13631, CBS 383.78, IMI 192654, IMI 45548 ja T.V. B117). Edullisesti entsyymillä on seriiniproteaasiaktiivisuutta ja se käsittää kypsän Tr Prbl -entsyymin aminohapposekvenssin, joka on määritelty sekvenssissä nro 10.
20
Keksinnön entsyymin molckyylimassa on 25-35 kDa. Entsyymin optimaalinen lämpötila-alue on 30-70 °C pH:ssa 9. Mainitun entsyymin pH-optimi on pH-alueella, joka on vähintään pH 6-11 lämpötilassa 50 °C. Lämpötila- ja pH-optimit määritettiin ^ käyttäen 15 minuutin reaktioaikaa ja kaseiinia substraattina. Keksinnön seriiniproteaasi ^ 25 kykenee muuntelemaan, hajottamaan tai poistamaan proteiinipitoisia tahroja pesuaineen ^ läsnäollessa 10-60 °C:n lämpötilassa.
c\j
X
te “ Mainittua entsyymiä koodaa eristetty polynukleotidisekvenssi, joka koodaa polypeptidiä, O) ... .
N· joka käsittää sekvenssissä 10 määritellyn kypsän Tr Prbl -entsyymin
LO
g 30 aminohapposekvenssin. Edullisesti mainittua kypsää entsyymiä koodaa eristetty o w nukleiinihappomolekyyli, joka käsittää sekvenssissä nro 9 esitetyn nukleotidihapposekvenssin.
6
Keksinnön sieniperäistä seriiniproteaasientsyymiä koodaa eristetty polynukleotidisekvenssi, joka sisältyy plasmidiin pALK2650, joka käsittää nukleotidisekvenssin nro 5 ja joka on talletettu E. colissa RF8052 talletusnumerolla DSM 22635. Plasmidi pALK2650 käsittää täyspitkää sieniperäistä 5 seriiniproteaasientsyymiä koodaavan polynukleotidisekvenssin.
Esillä oleva keksintö koskee myös eristettyä nukleiinihappomolekyyliä, joka koodaa sieniperäistä seriiniproteaasientsyymiä, jota voidaan käyttää proteiinipitoisten materiaalien muuntelemiseen, hajottamiseen ja poistamiseen alhaisilla tai kohtalaisilla 10 lämpötila-alueilla ja joka on valittu ryhmästä, jonka muodostavat: (a) nukleiinihappomolekyyli, joka koodaa polypeptidiä, jolla on seriiniproteaasiaktiivisuutta ja joka käsittää sekvenssissä nro 10 esitetyn aminohapposekvenssin tai sen variantin, jolla on samankaltaisia ominaisuuksia; 15 (b) nukleiinihappomolekyyli, joka käsittää sekvenssissä nro 9 kuvatun polynukleotidisekvenssin; (e) nukleiinihappomolekyyli, joka käsittää sekvenssissä nro 5 kuvatun polynukleotidisekvenssin koodaavan sekvenssin, joka sisältyy DSM 22635 :een; (d) nukleiinihappomolekyyli, jonka polynukleotidisekvenssi eroaa minkä tahansa 20 kohdista (b)-(c) nukleiinihappomolekyylin polynukleotidisekvenssistä geneettisen koodin degeneraation vuoksi.
Keksintö koskee edelleen rekombinanttista ekspressiovektoria, joka käsittää keksinnön ^2 nukleotidisekvenssin, joka on toiminnallisesti liitetty säätelysekvensseihin, jotka o ^ 25 kykenevät ohjaamaan mainittua seriiniproteaasia koodaavan geenin ilmentymistä ° soveltuvassa isännässä.
c\l
X
o- Keksintö koskee myös isäntäsolua, joka käsittää edellä kuvatun kaltaisen ekspressiovektorin. Edullisesti isäntäsolu on mikrobi-isäntä, kuten rihmasieni. Edulliset g 30 isännät kuuluvat sukuihin Trichoderma, Aspergillus, Fusarium, Humicola, cn Chrysosporium, Neurospora, Rhizopus, Penicillium ja Mortiriella. Edullisemmin isäntä on Trichoderma tai Aspergillus, edullisimmin rihmasieni T. reesei. Isäntä voi olla homologinen tai heterologinen keksinnön nukleotidisekvenssiin nähden.
7
Esillä oleva keksintö koskee valmistusmenetelmää keksinnön polypeptidille, jolla on seriiniproteaasiaktiivisuutta, mainitun menetelmän käsittäessä vaiheet keksinnön isäntäsolun viljelemiseksi ja polypeptidin talteen ottamiseksi. Keksintöön sisältyy myös keksinnön nukleiinihapposekvenssin koodaama polypeptidi, jolla on 5 seriiniproteaasiaktiivisuutta j a joka on saatavissa edellä kuvatulla menetelmällä.
Keksintö koskee menetelmää entsyymivalmisteen aikaansaamiseksi, menetelmän käsittäessä vaiheet, joissa viljellään keksinnön isäntäsolua ja joko otetaan keksinnön polypeptidi talteen soluista tai erotetaan solut elatusaineesta ja kerätään supematantti. 10 Esillä olevaan keksintöön sisältyy myös entsyymivalmiste, joka on saatavissa edellä kuvatulla menetelmällä.
Keksintö koskee entsyymi valmistetta, joka käsittää keksinnön seriiniproteaasientsyymin.
15 Keksinnön entsyymivalmiste voi edelleen sisältää muita entsyymejä, jotka on valittu ryhmästä, johon sisältyvät proteaasi, amylaasi, sellulaasi, lipaasi, ksylanaasi, mannanaasi, kutinaasi, pektinaasi tai oksidaasi mediaattorin kanssa tai ilman, sekä myös soveltuvia lisäaineita, jotka on valittu ryhmästä, johon sisältyvät stabilointiaineet, puskurit, pinta-aktiiviset aineet, valkaisuaineet, mediaattorit, korroosionestoaineet, vedenpehmentäjät, 20 uudelleen tarttumista estävät aineet, optiset kirkasteet, väriaineet, pigmentit, syövyttävät aineet, hankausaineet ja säilöntäaineet, jne.
Tuottajaisännän käytetty elatusaine voidaan käyttää sellaisenaan tai isäntäsolut voidaan ^ poistaa ja/tai se voidaan konsentroida, suodattaa tai fraktioida. Se voidaan myös kuivata.
^ 25 Keksinnön entsyymivalmiste voi olla nesteen, jauheen tai rakeiden muodossa, cp 0X1 Keksintöön sisältyy myös keksinnön seriiniproteaasientsyymin tai entsyymivalmisteen
X
käyttö pesuaineissa, kuitujen käsittelyssä, villan käsittelyssä, karvojen käsittelyssä, nahan käsittelyssä, elintarvikkeiden tai rehun käsittelyssä tai missä tahansa sovelluksissa, joihin S 30 liittyy proteiinipitoisen materiaalin muuntelu, hajotus tai poistaminen. Erityisesti o cm entsyymi tai entsyymivalmiste on käyttökelpoinen pesuaineiden lisäaineena nestemäisissä ja j auhemaisissa pesuaineissa.
8
PIIRUSTUSTEN LYHYT KUVAUS
Kuvio 1 esittää Trichoderma reesei QM6a prbl {Tr prbl) -geenin nukleotidisekvenssin ja siitä johdetun aminohapposekvenssin. Oletettu signaalipeptidi on ilmoitettu pienaakkosin ja alleviivattuna. Oletettu prosekvenssi ja prosekvenssin johdetut 5 aminohapot on ilmoitettu pienaakkosin. Kypsä nukleotidisekvenssi on ilmoitettu suuraakkosin. Oletetun intronisekvenssin sijainti on ilmoitettu pienaakkosin, kursivoituna ja merkittynä nukleotidisekvenssin alla olevalla katkoviivalla. Lopetuskodoni on osoitettu asteriskilla sekvenssin alla.
Kuvio IA esittää Tr prbl -geenin nukleotidisekvenssin ATG-aloituskodonista TCC-10 kodoniin (nukleotidit 1-1 200), sekvenssialueen, joka koodaa Tr Prbl-proteiinin aminohapposekvenssiä Metl-Ser353.
Kuvio IB esittää Tr prbl -geenin nukleotidisekvenssin ATG-kodonista TAA-lopetuskodoniin (nukleotidit 1 201-1 371), sekvenssialueen, joka koodaa Tr Prbl-proteiinin aminohapposekvenssiä Met354-Ala409.
15 Kuvio 2 esittää Fusarium graminearum ALKO1726 Fg prtS8A -geenin nukleotidisekvenssin ja siitä johdetun aminohapposekvenssin. Oletettu signaalipeptidi, joka analysoitiin käyttäen ohjelmaa SignalP V3.0, on ilmoitettu pienaakkosin ja alleviivattuna. Oletettu prosekvenssi ja prosekvenssin johdetut aminohapot on ilmoitettu pienaakkosin. Kypsä nukleotidisekvenssi on ilmoitettu suuraakkosin. Oletetun 20 intronisekvenssin sijainti on ilmoitettu pienaakkosin, kursivoituna ja merkittynä t—— nukleotidisekvenssin alla olevalla katkoviivalla. Lopetuskodoni on osoitettu asteriskilla cm sekvenssin alla.
i co o
Kuvio 2A esittää Fg prt8A -geenin nukleotidisekvenssin nukleotideille 1-1 140, x sekvenssialueen, joka koodaa Fg_ALK01726 proteiinin aminohapposekvenssiä Metl- 25 Val361.
σ> h-· h-· LT) . .
g Kuvio 2B esittää Fg prt8A -geenin nukleotidisekvenssin nukleotideille 1 141-1 140, o ^ sekvenssialueen, joka koodaa Fg_ALK01726 proteiinin aminohapposekvenssiä Ala362-
Thr411.
9
Kuvio 3 esittää kaavamaisesti kasetin (8 762 bp:n TVotl-fragmentti plasmidista pALK2701), jota käytetään Tr prbl -geenin ilmentämiseksi Trichoderma reeseissä. Esitettynä ovat sijainnit linkkerille, jota käytettiin prbl -geenin 3 '-pään liittämiseksi cAA/-tcrminaattoriin sekä joukko restriktiokohtia kasetissa.
5 Kuvio 4 esittää kaavamaisesti kasetin (8 683 bp:n Aotl-fragmentti plasmidista pALK2708), jota käytetään Fg prtS8A -geenin ilmentämiseksi Trichoderma reeseissä. Esitettynä ovat sijainnit linkkerille, jota käytettiin prbl-geenin 3-pään liittämiseksi cbh 1 -termi naattori in sekä joukko restriktiokohtia kasetissa.
Kuvio 5 kuvaa rekombinanttisten proteiinien T reesei Prbl (Tr Prbl) ja F. graminearum 10 Fg_ALK01726 lämpötilaprofulit määritettyinä pH-arvossa 9 käyttäen 15 min reaktioaikaa ja kaseiinia substraattina. Datapisteet ovat keskiarvoja kolmesta erillisestä mittauksesta.
Kuvio 5A esittää Tr Prbl -määritysten tulokset.
Kuvio 5B esittää Fg_ALK01726-määrityksen tulokset.
15 Kuvio 6 kuvaa pH:n vaikutusta rekombinanttisten Tr Prbl- ja Fg_ALK01726- proteiinien aktiivisuuteen. Käytetty puskuri oli 40 mM Britton-Robinson-puskuri, kaseiinia käytettiin substraattina, reaktioaika oli 15 min ja reaktiolämpötila 50 °C. Datapisteet ovat keskiarvoja kolmesta erillisestä mittauksesta.
Kuvio 6A esittää Tr Prbl -määritysten tulokset.
cm 20 Kuvio 6B esittää Fg_ALK01726-määrityksen tulokset.
cb o
Kuvio 7 kuvaa rekombinanttisten proteiinien Tr Prbl ja Fg_ALK01729 tehokkuutta x veri/maito/mustetahroihin (Ari. 117, EMPA) eri lämpötiloissa (pH 9, 60 min).
Kaupallisia valmisteita Savinase Ultra® 16L (Novozymes A/S, DK), Purafect® 4000L
(Genencor Inc., USA) ja Properase® 4000E (Genencor Inc., USA) käytettiin vertailua g 25 varten. AL* (deltaL*) = entsyymikäsitellyn kankaan vaaleusarvo L* - pelkällä puskurilla cm käsitellyn kankaan (entsyymin nollanäyte) vaaleusarvo L* .
10
Kuvio 7 A esittää rekombinanttisen proteiinin Tr Prbl ja kaupallisten proteaasivalmisteiden tehokkuutta 10 °C:ssa.
Kuvio 7B esittää rekombinanttisten proteiinien Tr Prbl ja Fg_ALK01729 sekä kaupallisten proteaasivalmisteiden tehokkuutta 20 °C:ssa.
5 Kuvio 7C esittää rekombinanttisten proteiinien Tr Prbl ja Fg_ALK01729 sekä kaupallisten proteaasivalmisteiden tehokkuutta 30 °C:ssa.
Kuvio 7D esittää rekombinanttisten proteiinien Tr Prbl ja Fg_ALK01729 sekä kaupallisten proteaasivalmisteiden tehokkuutta 40 °C:ssa.
Kuvio 7E esittää rekombinanttisen proteiinin Tr Prbl ja kaupallisten 10 proteaasivalmisteiden tehokkuutta 5 0 °C: ssa.
Kuvio 7F esittää rekombinanttisen proteiinin Tr Prbl ja kaupallisten proteaasivalmisteiden tehokkuutta 60 °C:ssa.
Kuvio 8 esittää rekombinanttisten proteiinien Tr Prbl ja Fg_ALK01729 tehokkuutta veri/maito/mustetahroihin (Art. 117, EMPA) erilaisten nestemäisten pesuaineiden kanssa 15 30 °C:ssa. Kaupallisia valmisteita Properase® 4000E (Genencor Inc., USA), Purafect® 4000L ja Savinase® Ultra 16L käytettiin vertailua varten. ÄL* (deltaL*) = cntsyymikäsitellyn kankaan vaaleusarvo L* - ilman entsyymiä käsitellyn kankaan vaaleusarvo L* .
i- Kuvio 8A esittää tehokkuuden Ariel Sensitiven (Procter & Gamble, UK) kanssa 20 pesuainepitoisuudella 3,3 g/1 ja noin pH:ssa 7,9.
cb o ^ Kuvio 8B esittää tehokkuuden Erisanin (Farmos, Suomi) kanssa pesuainepitoisuudella x 3,3 g/ljanoinpH:ssa 8,2.
CL
O)
Kuvio 9 esittää rekombinanttisten proteiinien Tr Prbl ja Fg_ALK01729 tehokkuutta
LO
g veri/maito/mustetahroihin (Art. 117, EMPA) värillisille kankaille tarkoitetun nestemäisen o ^ 25 pesuainepohjan (taulukko 2) kanssa erilaisilla pesuainepitoisuuksilla 30 °C:ssa sekä pesuainepitoisuudella 3,3 g/1 lämpötiloissa 10 °C ja 20 °C. Kaupallisia valmisteita Properase® 4000E, Purafect® 4000E ja Savinase® Ultra 16L käytettiin vertailua varten.
11 AL* (deltaL*) = entsyymi käsitellyn kankaan vaaleusarvo L* - ilman entsyymiä käsitellyn kankaan vaaleusarvo L* .
Kuvio 9A esittää tehokkuutta 30 °C:ssa nestemäisen pesuainepohjan kanssa pitoisuudella 5 g/1 ja noin pH:ssa 7,5.
5 Kuvio 9B esittää tehokkuutta 30 °C:ssa nestemäisen pesuainepohjan kanssa pitoisuudella 3.3 g/1 ja noin pH:ssa 7,4.
Kuvio 9C esittää tehokkuutta 30 °C:ssa nestemäisen pesuainepohjan kanssa pitoisuudella 1 g/1 ja noin pH:ssa 7,3.
Kuvio 9D esittää tehokkuutta 20 °C:ssa nestemäisen pesuainepohjan kanssa pitoisuudella 10 3,3 g/1.
Kuvio 9E esittää tehokkuutta 10 °C:ssa nestemäisen pesuainepohjan kanssa pitoisuudella 3.3 g/1.
Kuvio 10 esittää rekombinanttisten proteiinien Tr Prbl ja Fg_ALK01729 tehokkuutta veri/maito/mustetahralle (Art. 117, EMPA) jauhemaisen pesuaineen läsnä ollessa (Art. 15 601, EMPA) lämpötilassa 40-50 °C ja pH:ssa, joka oli noin 10. Kaupallisia valmisteita
Purafect® 4000E ja Properase® 4000E käytettiin vertailua varten. AL* (deltaL*) = entsyymikäsitellyn kankaan vaaleusarvo L* - ilman entsyymiä käsitellyn kankaan vaaleusarvo L* .
i- Kuvio 10A esittää tehokkuutta 40 °C:ssa.
δ
CM
oo 20 Kuvio 10B esittää tehokkuutta 50 °C:ssa. o i
C\J
Kuvio 11 kuvaa rekombinanttisen proteiinin Tr Prbl tehokkuutta erilaisiin tahroihin
CC
(valmistajilta EMPA ja CFT) nestemäisen, värillisille kankaille tarkoitetun ^ pesuainepohjan kanssa täyden mittakaavan kokeissa 30 °C:ssa käytettäessä 15 min m g pesuaikaa. Kaupallista valmistetta Purafect® 4000L käytettiin vertailua varten. AL* o ^ 25 (deltaL*) = entsyymikäsitellyn kankaan vaaleusarvo L* - ilman entsyymiä käsitellyn kankaan vaaleusarvo L* .
12
Kuvio 11A esittää tehokkuutta, kun kyseessä on veri/maito/muste/PE+CO (Art. 117, EMPA).
Kuvio 11B esittää tehokkuutta, kun kyseessä on veri/maito/muste/PE+CO (Art. 116, EMPA).
5 Kuvio 11C esittää tehokkuutta, kun kyseessä on veri/maito/muste/PE+CO (CFT7 PC-05-014).
Kuvio 11D esittää tehokkuutta, kun kyseessä on veri/maito/muste/CO (CFT/C-05-059b).
Kuvio 11E esittää tehokkuutta, kun kyseessä on kaakao (Art. 112, EMPA).
Kuvio 11F esittää tehokkuutta, kun kyseessä on suklaa/maito/pigmentti (CFT/C-03-030).
10 Kuvio 11G esittää tehokkuutta, kun kyseessä on maapähkinäöljy/maito (CFT/C-ΙΟΙ 86b).
Kuvio 11H esittää tehokkuutta, kun kyseessä on ruoho (CFT/CS-08-069).
Kuvio lii esittää tehokkuutta, kun kyseessä on munankeltuainen/pigmentti (CFT/CS-38- 010).
15 Kuvio 12 kuvaa rekombinanttisen proteiinin Tr Prbl tehokkuutta erilaisiin tahroihin nestemäisen, värillisille kankaille tarkoitetun pesuainepohjan kanssa täyden mittakaavan kokeissa 30 °C:ssa käytettäessä 15 min pesuaikaa, kun entsyymin annostus laskettiin proteiinin määränä. Kaupallista valmistetta Purafect® 4000L käytettiin vertailua varten. c\i ^ AL* (deltaL*) = entsyymi käsitellyn kankaan vaaleusarvo L* - ilman entsyymiä ° 20 käsitellyn kankaan vaaleusarvo L* .
cu g Kuvio 12A esittää tehokkuutta, kun kyseessä on veri/maito/muste/PE+CO (Art. 117, ot EMPA).
r^.
LT) g Kuvio 12B esittää tehokkuutta, kun kyseessä on ruoho (CFT/CS-08-069).
CM
13
SEKVENSSILISTA
Sekvenssi nro 1 Sekvenssi 5 '-PCR-alukkeelle PR0213, jota käytettiin kloonattaessa Trichoderma reesei QM6a prbl -geeni, joka koodaa Prbl-proteaasia (proteiinin tunnus 121495 Joint Genome Instituten T reesein genomin mukaan, v. 2.0) sekä sen 5 liittämiseksi cbhl-promoottoriin (tarkka fuusio).
Sekvenssi nro 2 Sekvenssi 3'-PCR-alukkeelle PR0214, jota käytettiin kloonattaessa Trichoderma reesei QM6a prbl -geeni, joka koodaa Prbl-proteaasia (proteiinin tunnus 121495 Joint Genome Instituten T. reesein genomin mukaan, v. 2.0) sekä sen liittämiseksi cbhl-terminaattoriin (linkkerin välityksellä).
10 Sekvenssi nro 3 Sekvenssi 5'-PCR-alukkeelle PR0245, jota käytettiin Fusarium graminearum ALKO 1726 -proteaasin kloonaamiseksi sekä sen liittämiseksi cbhl-promoottoriin (tarkka fuusio).
Sekvenssi nro 4 Sekvenssi 3'-PCR-alukkeelle PR0246, jota käytettiin Fusarium graminearum ALKO 1726 -proteaasin kloonaamiseksi sekä sen liittämiseksi cbhl-15 terminaattoriin (linkkerin välityksellä).
Sekvenssi nro 5 Nukleotidisekvenssi täyspitkälle Trichoderma reesei QM6a -proteaasigeenilleprbl (Trprbl), joka koodaa Prbl-proteaasia (tunnus 121495).
Sekvenssi nro 6 Täyspitkän Trichoderma reesei QM6a -proteaasin Prbl (Tr Prbl) johdettu aminohapposekvenssi, mukaan lukien aminohapot Metl-Ala409.
cm 20 Sekvenssi nro 7 Nukleotidisekvenssi, joka koodaa Trichoderma reesei Prbl -proteaasin o procntsyymi muodon aminohapposekvenssiä.
CM
x Sekvenssi nro 8 Trichoderma reesei Prbl -proteaasin proentsyymimuodon
CL
aminohapposekvenssi, mukaan lukien täyspitkän proteaasin aminohapot Ala21-Ala 409.
h-· h-· m g Sekvenssi nro 9 Nukleotidisekvenssi, joka koodaa Trichoderma reesei Prbl -proteaasin o ^ 25 kypsän muodon aminohapposekvenssiä.
14
Sekvenssi nro 10 Trichoderma reesei Prbl -proteaasin kypsän muodon aminohapposekvenssi, mukaan lukien täyspitkän entsyymin aminohapot Alal21-Ala409.
Sekvenssi nro 11 Täyspitkän Fusarium graminearum ALKO 1726 -proteaasigeenin FgprtS8 nukleotidisekvenssi.
5 Sekvenssi nro 12 Täyspitkän Fusarium graminearum ALKO 1726 -proteaasin (Fg_ALK01726) johdettu aminohapposekvenssi, mukaan lukien aminohapot Metl-Thr411.
Sekvenssi nro 13 Nukleotidisekvenssi, joka koodaa Fusarium graminearum ALKO 1726 -proteaasin proentsyymimuodon aminohapposekvenssiä.
10
Sekvenssi nro 14 Fusarium graminearum ALKO 1726 -proteaasin proentsyymimuodon aminohapposekvenssi, mukaan lukien täyspitkän proteaasin aminohapot Ala21-Thr411.
Sekvenssi nro 15 Nukleotidisekvenssi, joka koodaa Fusarium graminearum ALK01726 15 -proteaasin kypsän muodon aminohapposekvenssiä.
Sekvenssi nro 16 Fusarium graminearum ALKO 1726 -proteaasin kypsän muodon aminohapposekvenssi, mukaan lukien täyspitkän entsyymin aminohapot Alal23-Thr411.
20 TALLETUKSET
i- Fusarium graminearum ALKO 1726 talletettiin 3.6.2009 Centraalbureau Voor cm Schimmelcultures -kokoelmaan, Uppsalalaan 8, 3508 AD, Utrecht, Alankomaat, ja sille i 00 o annettiin talletusnumero CBS 124697.
i
CM
x E. coli -kanta RF8052, sisältäen plasmidin pALK2650, talletettiin 3.6.2009 kokoelmaan
CL
25 Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH (DSMZ),
Inhoffenstrasse 7 b, D-38124 Braunschweig, Saksa, ja sille annettiin talletusnumero o DSM 22635.
o
CM
E. coli -kanta RF8098, sisältäen plasmidin pALK2707, talletettiin 3.6.2009 kokoelmaan Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH (DSMZ), 15
Inhoffenstrasse 7 b, D-38124 Braunschweig, Saksa, ja sille annettiin talletusnumero DSM 22636.
YKSITYISKOHTAINEN KUVAUS
5 Esillä oleva keksintö aikaansaa sieniperäisen seriiniproteaasin, jolla on laaja substraattispesifisyys, joka on aktiivinen korkeilla pH-alueilla ja jolla on laaja lämpötilaoptimi, eli jolla on hyvä suorituskyky sekä alhaisissa että kohtalaisissa lämpötiloissa. Entsyymi on ihanteellinen pesuainesovelluksiin, se kestää tyypillisiä pesuainekoostumuksia ja on tehokas alhaisilla entsyymitasoilla pesuaineliuoksissa. 10 Erityisesti seriiniproteaasi on aktiivinen alhaisissa lämpötiloissa, jopa 10 °C:ssa tai alle, edullisen alueen ollessa 10-60 °C. Näin ollen esillä oleva keksintö aikaansaa vaihtoehtoisen seriiniproteaasin käytettäväksi pesuainesovelluksissa sekä muissa teollisissa sovelluksissa, joissa tehokkuus alhaisilla tai kohtalaisilla lämpötila-alueilla on toivottavaa. Sieniperäistä seriiniproteaasia voidaan valmistaa runsastuottoisissa sieni-15 isännissä ja sen jälkikäsittely, esim. erottaminen fermentaatioliemestä ja sienirihmastoista, on helppo suorittaa.
Termeillä “seriiniproteaasi” tai “seriiniendopeptidaasi” tai “seriiniendoproteinaasi” tarkoitetaan tämän keksinnön yhteydessä entsyymiä, joka saa luokituksen EC 3.4.21 20 kansainvälisen biokemian ja molekyylibiologian liiton IUBMB:n (International Union of Biochemistry and Molecular Biology) nimistön mukaan. Seriiniproteaaseja esiintyy sekä yksisoluisissa että monisoluisissa organismeissa. Niiden rakenteellisten T- samankaltaisuuksien perusteella seriiniproteaasit on ryhmitelty ainakin kuuteen klaaniin c3 (SA, SB, SC, SE, SF ja SG; S merkitsee seriiniproteaasia), jotka on edelleen jaetaan i o 25 perheisiin ja alaperheisiin, joilla on samankaltaisia aminohapposekvenssejä sekä c\j kolmiulotteinen rakenne (ks. esimerkiksi seriiniproteaasikotisivu osoitteessa £ http://www.biochem.wustl.edu/~protease/. Biokemian ja molekyylibiofysiikan laitos, o) Washingtonin lääketieteellinen yliopisto, St. Louis, MO, USA). Näille proteiineja
En hydrolysoiville tai hajottaville entsyymeille on tunnusomaista nukleofiilisen
o 30 seriiniryhmän läsnäolo niiden aktiivisessa kohdassa, ja pääasiallisten klaanien SA ja SB
proteaaseille on myös tunnusomaista se, että niissä on välttämättömiä aspartaatti- ja histidiinijäännöksiä, jotka seriinin kanssa muodostavat katalyyttisen triadin. Entsyymien 16 vaikutus kohdistuu eri alueille polypeptidiketjua katkaisukohtaa ympäröivien aminohappoj äännösten perusteella.
Esillä olevan keksinnön seriiniproteaasi kuuluu klaaniin SB, perheeseen 8, jonka 5 muodostavat ’’subtilisiinin kaltaiset seriiniproteaasit” tai ’’subtilaasit”. Tälle seriiniproteaasien luokalle, jota edustavat eri Bacillus-lajii, kuten B. amyloliquifaciens, B. licheniformis ja B. subtilis (Rao ym., 1998), ovat tunnusomaisia aromaattiset tai hydrofobiset jäännökset kuten tyrosiini, fenyylialaniini ja leusiini.
10 Keksinnön yhteydessä käytettynä termillä ’’seriiniproteaasiaktiivisuus” tarkoitetaan hydrolyyttista aktiivisuutta proteiinia sisältävillä substraateilla kuten esim. kaseiini, hemoglobiini, keratiini ja naudan seerumin albumiini (BSA). Menetelmät proteolyyttisen aktiivisuuden analysoimiseksi ovat kirjallisuudessa hyvin tunnettuja, ja niihin on viitattu esim. julkaisussa Gupta ym. (2002).
15
Proteaasit voidaan luokitella käyttäen ryhmäspesifisiä inhibiittoreita. “Seriiniproteaasi-inhibiittorien” moninaiseen ryhmään sisältyy synteettisiä kemiallisia inhibiittoreita ja luonnollisia proteiini-inhibiittoreita. Eräs luonnollisten inhibiittorien ryhmä on serpiinit (lyhennetty seriiniproteaasi-inhibiittoreista), kuten antitrombiini ja alfa-l-antitrypsiini. 20 Keinotekoisiin synteettisiin inhibiittoreihin sisältyvät 3,4-dikloori-isokumariini (3,4-DCI), di-isopropyylifluorifosfaatti (DFP), fenyylimetyylisulfonyylifluoridi (PMSF) ja tosyyli-L-lysiinikloorimetyyliketoni (TLCK). Joitain seriiniproteaaseja inhiboivat tiolireagenssit kuten p-kloorielohopeabentsoaatti (PCMB) johtuen kysteiinijäännöksen ^ läsnäolosta aktiivisen kohdan lähellä. Näin ollen seriiniproteaasiaktiivisuus voidaan
O
, 25 määrittää testillä, joka perustuu spesifisen substraatin pilkkomiseen, tai testillä, jossa co ° käytetään mitä tahansa proteiinipitoista substraattia seriiniproteaasien spesifisen ^ inhibiittorin kanssa tai ilman sitä soveltuvissa olosuhteissa.
x tr
CL
Seriiniproteaasit syntetisoidaan epäaktiivisina “zymogeenisina esiasteina” tai g 30 ’’zymogeeneina” preproentsyymin muodossa, ja ne aktivoidaan poistamalla oj signaalisekvenssi (erityksen signaalipeptidi tai prepeptidi) ja prosekvenssi (propeptidi), niin että aikaansaadaan entsyymin aktiivinen, kypsä muoto (Chen ja Inouye, 2008). Tähän aktivointiprosessiin liittyy proteaasien toiminta, ja se voi olla seurausta 17 seriiniproteaasin rajoitetusta itsehajottavasta tai autokatalyyttiscstä prosessoinnista. Prosekvenssi voidaan lohkaista esimerkiksi tuotannon translaation jälkeisillä vaiheilla tai käytetyssä elatusaineessa tai elatusaineen tai entsyymival m i stccn varastoinnin aikana. Proentsyymin aktivointi voidaan myös aikaansaada lisäämällä proteolyyttistä entsyymiä, 5 joka kykenee muuntamaan epäaktiivisen proentsyymin aktiiviseksi, kypsäksi entsyymiksi elatusaineessa, jossa isäntäorganismia viljellään, tai lisäämällä proteolyyttistä entsyymiä viljelyn supematanttiin viljelyprosessin jälkeen. Entsyymin lyheneminen voidaan myös aikaansaada esimerkiksi typistämällä polypeptidiä koodaava geeni ennen kuin tuotantoisäntä transformoidaan sillä.
10
Termi “kypsä” tarkoittaa sellaista entsyymin muotoa, joka signaalisekvenssin ja propeptidin poistamisen jälkeen käsittää entsymaattisen tai katalyyttisen aktiivisuuden kannalta välttämättömät aminohapot. Rihmasienissä se on elatusaineeseen eritettävä muoto.
15
Proteaasiaktiivisuutta tuottamaan kykeneviä mikro-organismikantoja voidaan seuloa erilaisilla substraateilla. Valittuja kantoja voidaan viljellä sopivassa elatusaineessa, jotta saadaan riittävä määrä kiinnostavaa seriiniproteaasia eristystä tai puhdistusta sekä ominaisuuksien lisäkarakterisointia varten. Vaihtoehtoisesti eri organismeissa olevia 20 seriiniproteaaseja koodaavia geenejä voidaan eristää ja geenien koodaamaa aminohapposekvenssiä voidaan verrata tässä esimerkeissä eristetyn ja karakterisoidun seriiniproteaasin aminohapposekvensseihin.
^ Keksinnön seriiniproteaasientsyymi voi olla peräisin sienestä, mukaan lukien rihmasienet o ^ 25 ja hiivat, esimerkiksi suvusta Trichoderma. Sieniperäiset emäksiset proteaasit ovat ^ edullisia bakteeriproteaaseihin nähden johtuen niiden jatkokäsittelyn helppoudesta ^ mikrobittoman entsyymin tai entsyymivalmisteen aikaansaamiseksi. Sienirihmasto x voidaan poistaa helposti suodatusmenetelmillä ennen entsyymin puhdistusta.
CD
g 30 Luonnollinen tai rekombinanttinen seriiniproteaasi voidaan puhdistaa käyttämällä cm tavanomaisia entsyymikemiallisia menetelmiä, kuten suolan valmistus, ultrasuodatus, ioninvaihtokromatografia, affiniteettikromatografia, geelisuodatus ja hydrofobinen vuorovaikutus -kromatogafia. Puhdistusta voidaan seurata proteiinien määrityksellä, 18 entsyymiaktiivisuusmäärityksillä j a SDS-polyakryyliamidigeelielektroforeesilla. Puhdistetun entsyymin entsyymiaktiivisuus eri lämpötiloissa ja pH-arvoissa sekä sen moolekyylimassa ja isoelektrinen piste voidaan määrittää.
5 Kahden rekombinanttisen seriiniproteaasin puhdistus on esitetty esimerkissä 3. T. reesei QM6a:n ja F. graminearum ALK01726:n viljelmien suodatetut supematantit, joille oli suoritettu suolanpoisto, lisättiin Q Sepharose FF -kolonniin. Läpivirtausfraktiot lisättiin Superdex 75 10/300 GL -kolonniin. Puhdistusta seurasivat aktiivisuusmääritykset kaseiinilla esimerkissä 2c kuvatulla tavalla. Luonnollisesti on mahdollista erottaa esillä 10 olevan keksinnön entsyymi käyttäen muita tunnettuja puhdistusmenetelmiä tässä esitettyjen menetelmien sijaan tai lisäksi. Rekombinanttisia seriiniproteaaseja käytettiin pH-ja lämpötilaprofiilien selvittämiseksi esimerkissä 3 kuvatulla tavalla.
Optimaalisen pH-arvon määritys voidaan suorittaa soveltuvassa puskurissa eri pH-15 arvoissa seuraamalla proteiinin aktiivisuutta substraatilla. Seriiniproteaasit ovat yleensä aktiivisia neutraalissa tai emäksisessä pH:ssa, niin että niiden pH-optimi on välillä 7-11, ja niillä on laaja substraatti spesifi syys. “Emäksisillä seriiniproteaaseilla” tarkoitetaan entsyymejä, jotka ovat aktiivisia ja stabiileja pH:ssa 9-11 tai jopa pH:ssa 10-12,5 (Shimogaki ym., 1991) ja joiden isoelektrinen piste on noin kohdassa pH 9.
20
Seriiniproteaasin lämpötilaoptimi voidaan määrittää soveltuvassa puskurissa eri lämpötiloissa käyttäen kaseiinia substraattina, kuten esimerkissä 3 on kuvattu, tai käyttämällä muita substraatteja ja puskurijärjestelmiä, joita on kuvattu alan ^ kirjallisuudessa (Gupta ym., 2002). Luonnollisten seriiniproteaasien lämpötilaoptimit ^ 25 ovat noin 60 °C (Rao ym., 1998).
o i ^ pl voidaan määrittää isoelektrisellä fokusoinnilla immobilisoidulla pH-gradienttigeelillä, ir joka koostuu polyakryyliamidistä, tärkkelyksestä tai agaroosista, tai arvioimalla pl aminohapposekvenssistä, esimerkiksi käyttämällä pLMW-työkalua ExPASy-palvelimella
LO
g 30 (http://expasv.ors/tools/pi tool.html; Gasteiger ym.. 2003).
o
CM
Puhdistetun seriiniproteaasin moolekyylimassa voidaan määrittää massaspektrometrisesti tai SDS-PAGE:lla tavalla, jonka on esittänyt Laemmli (1970). Moolekyylimassa voidaan 19 myös ennustaa entsyymin aminohapposekvenssistä. Kypsän seriiniproteaasin tai kypsän seriiniproteaasientsyymin molekyylimassa on tyypillisesti 20-35 kDa, tyypillisesti noin 25-30 kDa (Rao ym., 1998). Puhdistetun proteaasin N-pää sekä sisäiset peptidit voidaan sekvensoida Edmanin hajotuskemian mukaan (Edman ja Begg, 20) tai muilla alan 5 kirjallisuudessa kuvatuilla menetelmillä.
Proteaasiaktiivisuus perustuu yleensä liukoisten substraattien hajoamiselle. Pesuainesovelluksissa proteaasien on toimittava aineille, jotka ovat ainakin osittain liukenemattomia. Näin ollen merkittävä parametri pesuaineproteaasille on sen kyky 10 absorboida ja hydrolysoida näitä liukenemattomia fragmentteja.
Toinen merkittävä parametri pesuaineproteaasin valinnalle on sen isoelektrinen piste tai pl-arvo. Pesuaineproteaasin tehokkuus on paras, kun sen kanssa käytetyn pesuaineliuoksen pH on suurin piirtein sama kuin entsyymin pl-arvo.
15
Esillä olevassa keksinnössä ’’hyvä tehokkuus pesuaineen läsnä ollessa” tarkoittaa sitä, että entsyymi, tässä tapauksessa keksinnön sieniperäinen seriiniproteaasi, tai entsyymiä käsittävä valmiste toimii alhaisemmilla lämpötila-alueilla kuin useat tällä hetkellä kaupan olevat subtilisiinit. Toisin sanoen ’’hyvä tehokkuus” tarkoittaa sitä, että entsyymi kykenee 20 muuntelemaan, hajottamaan tai poistamaan proteiinipitoisia tahroja tai proteiinipitoista materiaalia alhaisesta kohtalaiseen olevilla lämpötila-alueilla, mutta jolla on erityisen hyvä tehokkuus alhaisemmilla lämpötila-alueilla (10-30 °C) kuin nykyisillä kaupallisilla valmisteilla, esimerkiksi kaupallisilla entsyymivalmisteilla Purafect® (Genencor inc., ^2 USA) tai Savinase® (Novozymes A/S, DK). Esimerkiksi pH-arvoa muuntelemalla, 0 , 25 valitsemalla ominaisuuksiltaan soveltuvia pesuaineita, sisällyttämällä valmisteeseen ° entsyymejä suojaavia aineita ja säätelemällä pesuolosuhteita keksinnön seriiniproteaasin ^ aktiivisuus voidaan säilyttää lämpötiloissa, jotka ovat niinkin alhaisia kuin 10 °C.
CC
CL
Ilmausta "pesuaine" käytetään viittaamaan sellaiseen aineeseen tai materiaaliin, joka on g 30 avuksi puhdistuksessa tai jolla on puhdistavia ominaisuuksia. Termi “puhdistuskyky” cm viittaa puhdistavan ominaisuuden läsnäoloon tai asteeseen. Puhdistuskyvyn astetta voidaan testata erilaisilla proteiinista koostuvilla tai sitä sisältävillä substraattimateriaaleilla tai tahroilla tai tahraseoksilla, jotka ovat kiinnittyneinä kiinteään, 20 veteen liukenemattomaan kantajaan, kuten tekstiilikuituihin tai lasiin. Tyypillisiin ’’proteiinipitoisiin materiaaleihin” sisältyvät veri, maito, muste, kananmuna, ruoho ja kastikkeet. Koetarkoituksia varten proteiinipitoisten tahrojen seoksia on kaupallisesti saatavilla. Pesuaine-entsyymin tehtävänä on hajottaa ja poistaa proteiinipitoisia tahroja.
5 Testitulokset riippuvat tahran tyypistä, pesuaineen koostumuksesta ja pesukokeessa käytettävien tekstiilien ominaisuuksista ja tilasta (Maurer 2004).
Esillä olevan sovelluksen yhteydessä termillä “alhainen lämpötila” tarkoitetaan 10-30 °C olevia lämpötila-alueita, jotka kokeiden mukaan eivät ole optimaalisia monien 10 tällä hetkellä saatavilla olevien entsyymivalmisteiden ja erityisesti pesuaine-entsyymivalmisteiden tehokkuuden kannalta. Termillä “kohtalainen lämpötila” tarkoitetaan 30-60 °C olevaa lämpötila-aluetta.
Termi ’’sovellettavissa alhaisille tai kohtalaisille lämpötila-alueille” sisältää teolliset 15 sovellukset, joissa on toivottavaa, että entsyymivalmiste toimii tehokkaasti alhaisilla tai kohtalaisilla lämpötila-alueilla (10-60 °C). Tällaiset sovellukset sisältävät niiden käytön elintarvike-, rehu- ja nahkateollisuudessa, lääkeaineissa, diagnostiikassa, jätteiden käsittelyssä ja hopean talteenotossa. Tässä tarkoitetulla tavalla näihin sovelluksiin ei sisälly keksinnön seriiniproteaasi en tsyym i n käyttö biotorjunta-aineena kasvien 20 patogeenisten sienten ja nematodien biologisessa torjunnassa.
Erään edullisen suoritusmuodon mukaan keksintö koskee sieniperäistä scriiniproteaasicntsyymiä, joka on polypeptidi, joka on sovellettavissa tai ^ käyttökelpoinen proteiinipitoisten materiaalien muuntelemiseen, hajottamiseen tai ^ 25 poistamiseen sovelluksissa, joissa entsyymin tehokkuus alhaisilla tai kohtalaisilla ° lämpötila-alueilla on toivottavaa. Mainitulla sieniperäisellä seriiniproteaasilla on ^ seriiniproteaasiaktiivisuutta ja se käsittää Tr Prbl:n kypsän entsyymin, jolla on ^ sekvenssin nro 10 aminohapposekvenssi ja joka kykenee muuntelemaan, hajottamaan tai poistamaan proteiinipitoisia materiaalia alhaisissa tai kohtalaisissa lämpötiloissa, g 30 Kypsältä entsyymiltä puuttuu signaalisekvenssi tai prepeptidi ja prosekvenssi tai S propeptidi. Keksinnön kypsä seriiniproteaasi sisältää sekvenssissä nro 6 esitetyn täyspitkän proteaasin aminohapot Alal21-Ala409. Näin ollen keksintö kattaa myös täyspitkän Tr Prbl -entsyymin, jolla on sekvenssi nro 6, sisältäen signaalisekvenssin 21 (prepeptidi) ja propeptidin, ja kypsän entsyymin sekä proentsyymimuodon, josta puuttuu signaalisekvenssi (prepeptidi), mutta joka sisältää propeptidin ja kypsän entsyymin ja jolla on näin ollen sekvenssi nro 8.
5 Keksinnön kontekstiin sisältyvät myös sekvenssin nro 10 aminohapposekvenssin luonnolliset variantit. Näihin variantteihin sisältyvät vähäiset muutokset aminohapposekvenssissä, esimerkiksi seurauksena proteiinin tuotannosta heterologisessa isäntäorganismissa, mikä saattaa aiheuttaa muutoksia yhdessä tai useammassa aminohapposekvenssin asemassa deleetion, substituution, insertion, addition tai näiden 10 yhdistelmän ansiosta. Nämä variaatiot eivät kuitenkaan muuta molekyylien biologista toimintaa. Näin ollen variantit ovat samanlaisia ominaisuuksiltaan, toisin sanoen ominaispiirteiden ja aktiivisuuden suhteen, kuin seriiniproteaasi, jolla on sekvenssin nro 10 aminohapposekvenssi. Identtisyyttä kahden aminohapposekvenssin välillä voidaan verrata vastaavalla sekvenssialueella, jossa on suurin piirtein sama määrä aminohappoja. 15 Voidaan esimerkiksi verrata kahden aminohapposekvenssin täyspitkän tai kypsän sekvenssin identtisyyttä. Sekvenssien identtisyys voidaan määrittää käyttäen ClustalW-rinnastusta (esim. osoitteessa ww w. ebi. ac. uk/T ools/Clustahv) käyttäen matriisia: BLOSUM, aukon muodostus: 10, aukon laajennus: 0,5. Näiden kahden sekvenssin identtisyys on korkea, edullisesti vähintään 94 %, edullisesti vähintään 95 %, 20 edullisemmin 96 %, edullisemmin 97 %, vieläkin edullisemmin 98 % ja edullisimmin 99 %.
Edullisesti keksinnön sieniperäistä seriiniproteaasia voidaan käyttää pesuaineiden ^ lisäaineena, o " 25 co o 1 Keksinnön seriiniproteaasille on annettu nimi Tr Prbl, ja se on eristetty seriiniproteaasi,
C\J
joka on peräisin suvusta Trichoderma, edullisemmin lajista T. reesei, edullisimmin * T. reesei QM6a -kannasta (ATCC 13631, CBS 383.78, IMI 192654, IMI 45548 ja
CD
T.V. B117) ja se kuuluu seriiniendoproteaasien klaaniin SB, perheeseen 8.
8 30 o ^ Keksinnön edullinen suoritusmuoto on sieniperäinen seriiniproteaasi, jolla on seriiniproteaasiaktiivisuutta ja joka käsittää kypsän entsyymin Tr Prbl, jolla on aminohapposekvenssi nro 10.
22
Esillä oleva keksintö koskee sieniperäistä seriiniproteaasientsyymiä, jonka kypsän muodon molekyylimassa tai molekyylipaino (MW) on 20-35 kDa, edullisesti 25-33 kDa, edullisemmin 28-30 kDa. Edullisin MW on Tr Prbl:n ennustettu molekyylimassa, joka on 29 kDa kypsälle polypeptidille ja joka on saatu käyttämällä 5 Compute pI/MW -työkalua ExPASy-palvelimella (Gasteiger ym., 2003).
Keksinnön entsyymi on tehokas proteiinipitoisen materiaalin hajottamisessa laajalla lämpötila-alueella. Entsyymin optimaalinen lämpötila on 30-70 °C (noin 20 % maksimiaktiivisuudesta), edullisesti 40-60 °C (vähintään noin 40 % 10 maksimiaktiivisuudesta) ja edullisemmin 50-60 °C (vähintään 70 % maksimiaktiivisuudesta), edullisimmin 50 °C (Tr Prbl:n maksimiaktiivisuus) määritettynä pH-arvossa 9 käyttäen 15 min reaktioaikaa ja kaseiinia substraattina esimerkissä 3 kuvatulla tavalla.
15 Keksinnön erään edullisen suoritusmuodon mukaisesti sieniperäisen seriiniproteaasientsyymin pH-optimi on alueella, joka on vähintään pH 6-11, jolloin yli 20 % maksimiaktiivisuudesta esiintyy pH-arvossa pH 6-10, lämpötilan ollessa 50 °C ja käyttäen 15 min reaktioaikaa ja kaseiinia substraattina esimerkeissä 2c ja 3 kuvatulla tavalla. Erityisesti pH-optimi on välillä pH 6-10 (vähintään noin 90 % 20 maksimiaktiivisuudesta).
Keksinnön sieniperäisellä seriiniproteaasilla on hyvä tehokkuus pesuaineen läsnä ollessa, toisin sanoen se kykenee muuntelemaan, hajottamaan tai poistamaan proteiinipitoisia tahroja tai proteiinipitoisia materiaalia pesuaineen läsnä ollessa alhaisesta (10-30 °C) o , 25 kohtalaiseen (30-60 °C) olevilla lämpötila-alueilla, erityisesti alhaisemmilla lämpötila- oo ° alueilla kuin nykyiset kaupalliset valmisteet, esimerkiksi kaupalliset entsyymivalmisteet 0X1 Purafect® 4000L ja Properase® 4000E (Genencor Inc., USA) sekä Savinase®
X
Q- (Novozyme A/S, DK). Pesuolosuhteista sekä pesuaineissa olevista avustavista valmistusta ja lisäaineista riippuen keksinnön entsyymi toimii lämpötilassa 10-60 °C, edullisesti
g 30 lämpötilassa 50 °C tai alle. Tr Prbl-entsyymi toimii myös lämpötiloissa, jotka ovat 45 °C
S tai alle, 40 °C tai alle, 35 °C tai alle, 30 °C tai alle, 25 °C tai alle, 20 °C tai alle, 15 °C tai alle tai 10 °C tai alle.
23
Pesuaineen läsnä ollessa keksinnön sieniperäinen seriiniproteaasi toimii edellä määritellyllä tavalla välillä 10-60 °C olevassa lämpötilassa, ja erityisesti mainitulla sieniperäisellä seriiniproteaasilla Tr Prbl on hyvä tehokkuus pesuaineessa lämpötilan ollessa 30 °C. Esimerkeissä 5-7 on kuvattu vertailuesimerkkejä, ja kuvioista 7-12 5 voidaan havaita, että sieniperäisen seriiniproteaasin Tr Prbl tehokkuus vaihtelevissa olosuhteissa ja erilaisille käsittelyille altistettuna, kohdistettuna useille erilaisille tahroille erilaisilla kangasmateriaaleilla ja määritettynä arvona deltaL*, on huomattavasti parempi kuin kaupallisten tuotteiden Savinase® Ultra 16L (Novozymes A/S, DK), Properase® 4000E ja Purafect® 4000E (Genencor Inc, USA). Valmistajan mukaan Properase® on 10 emäksinen proteaasi, joka soveltuu alhaisen lämpötilan pesuolosuhteisiin.
Mainituista koetuloksista voidaan päätellä, että keksinnön sieniperäinen seriiniproteaasi kykenee täyttämään pesuaineita ostavien asiakkaiden, pesuaineteollisuuden ja pesukoneiden valmistajien suuresti vaihtelevat vaatimukset sekä on myös hyvin 15 yhteensopiva tulevaisuuden säädösten ja kuluttajatottumusten asettamien edellytysten kanssa.
Keksinnön seriiniproteaasientsyymillä on pl, joka johdetun aminohapposekvenssin perusteella ennustetulla tavalla on välillä pi 8,7-9,4, edullisesti pi 8,8-9,3. Keksinnön 20 Tr Prbl -entsyymin ennustettu pl on 8,9.
Erään edullisen suoritusmuodon mukaisesti keksinnön sieniperäistä seriiniproteaasientsyymiä koodaa eristetty nukleiinihappomolekyyli, joka koodaa ^2 polypeptidiä, joka käsittää sekvenssissä nro 10 esitetyn aminohapposekvenssin tai sen ^ 25 variantin, jolla on samankaltaisia ominaisuuksia.
co cp 0X1 Keksinnön seriiniproteaasia koodaavan cDNA:n tai genomin geenin eristäminen voidaan
X
myös suorittaa käyttäen PCR-menetelmää ja alukkeita, jotka on suunniteltu perustuen homologisten seriiniproteaasien tunnettuihin nukleotidi- tai aminohapposekvensseihin. g 30 Myös puhdistetun entsyymin N-terminaalisten tai tryptisten peptidien cm aminohapposekvenssiin syntetisoituja oligonukleotideja tai edellä mainittuja oligonukleotideja käyttämällä aikaansaatua PCR-tuotetta voidaan käyttää koettimina eristettäessä cDNA:ta tai genomin geeniä, joka koodaa keksinnön seriiniproteaasia.
24
Seriiniproteaasiklooneja voidaan myös seuloa perustuen niiden aktiivisuuteen maljoilla, jotka sisältävät entsyymin spesifistä substraattia, tai käyttämällä seriiniproteaasille spesifisiä vasta-aineita.
5 Esillä olevassa keksinnössä Tr prbl -geeni eristettiin käyttäen PCR-menetelmää ja alukkeita, jotka oli suunniteltu perustuen prbl-geenin sekvenssiin (geenin tunnus 121495), jonka julkaisi DOE Joint Genome Institute (T. r ees ei QM6a -kannan genomin sekvenssi v2.0, http://genome.id-ps£org/cd-biii/dispGeneModel?db=Trire2&idl21495). kuten on kuvattu esimerkissä Ib. Tavanomaisia molekyylibiologian menetelmiä, 10 esimerkiksi menetelmiä, jotka on kuvattu sellaisissa molekyylibiologian käsikirjoissa kuten Sambrook ja Russell, 2001, voidaan käyttää cDNA:n tai genomisen DNA:n eristämisessä isäntäorganismista.
Mikäli polynukleotidisekvenssi eristetään käyttäen PCR-menetelmällä valmistettua 15 DNA-koetinta, hybridisointi DNA-koettimella, joka käsittää yli 100-200 nukleotidia, suoritetaan yleensä “erittäin ankarissa” olosuhteissa eli hybridisoimalla lämpötilassa, joka on 20-25 °C täydellisen hybridin lasketun sulamislämpötilan (Tm) alapuolella, niin että Tm on laskettu Boltonin ja McCarthyn (1962) mukaan. Yleensä esihybridisaatio ja hybridisaatio suoritetaan vähintään 65 °C:ssa seuraavissa olosuhteissa: 6xSSC (tai 20 6xSSPE), 5xDenhardtin reagenssi, 0,5 % (w/v) SDS, 100 pg/ml denaturoitu, ffagmentoitu lohen maidin DNA. Esihybridisaatio- ja hybridisaatiolämpötila laskee 42 °C:seen, kun lisätään formamidia kunnes 50 %. Pesut suoritetaan alhaisessa suolapitoisuudessa, esim. 2xSSC - 0,5% SDS (w/v), 15 minuutin ajan ^ huoneenlämpötilassa, mitä seuraa 2xSSC - 0,1% SDS (w/v) huoneenlämpötilassa ja 25 lopuksi 0,lxSSC - 0,1% SDS (w/v) vähintään 65 °C:ssa. o i ^ Näin ollen keksinnön suojapiiriin sisältyy polypeptidisekvenssi, jota koodaa nukleiinihappomolekyyli, joka koodaa keksinnön täyspitkän seriiniproteaasin aminohapposekvenssiä, mukaan lukien prepeptidin (signaalisekvenssi) ja propeptidin
LO
g 30 entsyymin kypsän muodon lisäksi, ja joka aminohapposekvenssi on esitetty sekvenssissä o cm nro 6.
25
Keksinnön suojapiiriin sisältyy myös polypeptidisekvenssi, jota koodaa nukleiinihappomolekyyli, joka koodaa keksinnön seriiniproteaasientsyymin propeptidiä, sisältäen propeptidin entsyymin kypsän muodon lisäksi, ja joka aminohapposekvenssi on esitetty sekvenssissä nro 8.
5
Keksinnön eräs edullinen suoritusmuoto on sieniperäinen seriiniproteaasientsyymi, jota koodaa eristetty nukleiinihappomolekyyli, joka käsittää nukleotidisekvenssin, joka koodaa Tr Prbl -seriiniproteaasin kypsää muotoa, jolla on sekvenssi nro 9.
10 Näin ollen keksinnön Tr Prbl -polypeptidiä koodaa nukleiinihappomolekyyli, jolla on sekvenssin nro 5 nukleotidisekvenssi, joka käsittää entsyymin "koodaavan sekvenssin". Ilmaus “koodaava sekvenssi” tarkoittaa sitä nukleotidisekvenssiä, joka alkaa translaation aloituskodonista (ATG) ja päättyy translaation lopetuskodoniin (TAA, TAG tai TGA) ja joka voi käsittää intronisekvenssejä. Polypeptidi, jolle translaatio on suoritettu, alkaa 15 yleensä metioniinista. Keksinnön sieniperäistä seriiniproteaasientsyymiä voi myös koodata nukleiinihappomolekyyli, joka käsittää sekvenssin nro 7 nukleotidisekvenssin, joka koodaa Tr Prb 1 -procntsyymimuotoa.
Keksinnön edullisen suoritusmuodon mukaisesti sieniperäistä seriiniproteaasientsyymiä 20 koodaa eristetty polynukleotidisekvenssi, joka sisältyy plasmidiin pALK2650, käsittäen sekvenssin nro 5 nukleotidisekvenssin E. co/zssa RF8052, joka on talletettu kokoelmaan Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen (DSMZ) talletusnumerolla DSM 22635.
δ ^ 25 Eräs keksinnön suoritusmuoto on seriiniproteaasientsyymi, joka valmistetaan ° rekombinanttisesta ekspressiovektorista, joka käsittää nukleiinihappomolekyylin, joka ^ koodaa edellä määriteltyä sieniperäistä seriiniproteaasia, toiminnallisesti liitettynä ^ säätelysekvensseihin, jotka kykenevät ohjaamaan seriiniproteaasia koodaavan geenin il- ^ mentymistä soveltuvassa isännässä. Mainitun rekombinanttisen ekspressiovektorin ra- S 30 kentamista ja mainitun vektorin käyttöä on kuvattu yksityiskohtaisemmin esimerkissä 2.
o
(M
Soveltuvia isäntiä sieniperäisen seriiniproteaasientsyymin tuottamista varten ovat homologiset tai heterologiset isännät kuten mikrobi-isännät, mukaan lukien bakteerit, 26 hiivat ja sienet. Rihmasienet kuten Trichoderma, Aspergillus, Fusarium, Humicola, Chrysosporium, Neurospora, Rhizopus, Penicillium ja Mortiriella, ovat edullisia tuotantoisäntiä johtuen jatkokäsittelyn ja entsyymi tuotteen talteen ottamisen helppoudesta. Soveltuviin isäntälajeihin sisältyvät sellaiset kuten T. reesei, A. niger, 5 A. oryzae, A. sojae, A. awamori tai A. japonicus -tyyppiset kannat, F. venenatum tai F. oxysporum, H. insolens tai H. lanuginosa, N. orassa ja C. lucknowense, joista osa on lueteltu entsyymien tuotannossa käytettävinä isäntäorganismeina esim. kaupallisten entsyymien luettelossa AMFEP 2007 (http J!www.amfep.org/list.html). Edullisemmin entsyymi valmistetaan suvun Trichoderma tai Aspergillus rihmasieni-isännässä, kuten 10 T. reesei tai A. niger, A. oryzae tai A. awamori. Keksinnön edullisimman suoritusmuodon mukaan sieniperäinen proteaasientsyymi valmistetaan T. reeseiss'i.
Esillä oleva keksintö koskee myös eristettyä nukleiinihappomolekyyliä, joka koodaa sieniperäistä seriiniproteaasientsyymiä, jota voidaan käyttää proteiinipitoisten 15 materiaalien muuntelemiseen, hajottamiseen ja poistamiseen alhaisilla tai kohtalaisilla lämpötila-alueilla ja joka on valittu ryhmästä, jonka muodostavat: (a) nukleiinihappomolekyyli, joka koodaa polypeptidiä, jolla on seriiniproteaasiaktiivisuutta ja joka käsittää sekvenssissä nro 10 esitetyn 20 aminohapposekvenssin tai sen variantin, jolla on samankaltaisia ominaisuuksia; (b) nukleiinihappomolekyyli, joka käsittää sekvenssissä nro 9 kuvatun polynukleotidisekvenssin; (e) nukleiinihappomolekyyli, joka käsittää sekvenssissä nro 5 esitetyn r polynukleotidisekvenssin koodaavan sekvenssin, joka sisältyy DSM 2263 5: een; ^ 25 (d) nukleiinihappomolekyyli, jonka polynukleotidisekvenssi eroaa minkä tahansa co ° kohdista (b)-(c) nukleiinihappomolekyylin polynukleotidisekvenssistä 0X1 geneettisen koodin degeneraation vuoksi.
X
tr
CL
^ Keksinnön nukleiinihappomolekyyli voi olla RNA tai DNA, jolloin DNA voi koostua S 30 genomisesta DNA:sta tai cDNA:sta.
o cv
Tavanomaisia molekyylibiologian menetelmiä voidaan käyttää eristettäessä ja entsyymikäsiteltäessä polynukleotidisekvenssiä, joka koodaa keksinnön sieniperäistä 27 seriiniproteaasia, mukaan lukien genomisen ja plasmidi-DNA:n eristyksessä, DNA:n pilkkomisessa DNA-fragmenttien aikaansaamiseksi, sekvensoinnissa, E. coli - transformaatioissa jne. Perusmenetelmiä on kuvattu tavanomaisissa molekyylibiologian käsikirjoissa, esim. teoksessa Sambrook ja Russell, 2001.
5
Tr Prbl -polypeptidiä koodaavan Tr prbl -geenin eristäminen on kuvattu esimerkissä 1. Lyhyesti esitettynä, geeni eristettiin käyttäen PCR-menetelmää ja alukkeita, jotka oli suunniteltu perustuen prbl-geenin sekvenssiin (geenin tunnus 121495), jonka julkaisi DOE Joint Genome Institute (T. reesei QM6a -kannan genomin sekvenssi v2.0, 10 http://genome.igi-psf.org/cd-bin/dispGeneModel?db=Trii,e2&idl21495). Täyspitkä Tr prbl -geeni sisällytettiin plasmidiin pALK2650, joka on talletettu E. co/zssa DSMZ-kantakokoelmaan talletusnumerolla DSM 22635. Seriiniproteaasin johdettu aminohapposekvenssi analysoitiin DNA-sekvenssistä.
15 Täyspitkän T. reesein seriiniproteaasin Tr prbl (sekvenssi nro 5) nukleotidisekvenssi ja siitä johdettu sekvenssi (sekvenssi nro 6) on esitetty kuvioissa 1A-B. Geenin pituus on 1 371 bp (mukaan lukien lopetuskodoni). Löydettiin kaksi oletettua intronia, joiden pituudet olivat 68 bp ja 73 bp. Johdettu proteiinisekvenssi koostuu 409 aminohaposta, mukaan lukien ennustettu 20 aminohapon signaalisekvenssi (SignalP V3.0; Nielsen ym., 20 1997, sekä Nielsen ja Krogh, 1998) ja propeptidi Ala21-Alal21. Kypsän peptidin ennustettu molekyylimassa oli 29 kDa ja ennustettu pl 8,94. Nämä ennustukset suoritettiin käyttäen Compute pI/MW -työkalua ExPASy-palvelimella (Gasteiger ym., 2003). Johdettu aminohapposekvenssi sisälsi kaksi mahdollista N-glykosylaatiokohtaa ^ (Asn252 ja Asn396), mutta CBS-palvelimen NetNGlyc V1.0:n mukaan ainoastaan yksi ^ 25 kohta, Asn252, on todennäköinen. Homologioita julkaistuihin proteaasisekvensseihin ° nähden etsittiin käyttäen BLASTP-ohjelmaa, versio 2.2.21, NCBLssa (National Center ^ for Biotechnology Information) (Altschul ym., 1990). Identtisyysarvot kypsälle Tr Prbl - ^ sekvenssille verrattuna homologisten sekvenssien vastaaviin alueisiin saatiin käyttäen
ClustalW-rinnastusta (matriisi: BLOSUM, aukon muodostus: 10, aukon laajennus: 0,5 S 30 (esim. osoitteessa www.cbi.ac.uk/Toois/Clustalw). o C\l
Esillä olevan keksinnön seriiniproteaasilla Tr Prbl oli eniten homologisuutta (92-93-prosenttinen identtisyys) verrattuna emäksiseen proteaasin lajista T. hamatum 28 (AAP15044; Steyaert ym., 2004), seriiniendopeptidaasiin lajista Hypocrea lixii (teleomorfi T. harzianum; CAL25580; Suarez ym. 2007), emäksiseen proteinaasiin lajista T. atroviride (ALPTRLAT; Geremia ym., 1993) sekä ekstrasellulaariseen seriiniproteaasiin Tvspl lajista Hypocrea virens (AA063588; Pozo ym., 2004). Kypsän 5 Tr Prbl -aminohapposekvenssin identtisyys verrattuna vastaavaan alueeseen ALP-proteaasissa (EMBL-talletusnumero M87516; Geremia ym. 1993; esitetty sekvenssinä nro 313 julkaisussa US 60/818,910 (Catalyst Bioscience Inc.) oli 92 %.
Näin ollen keksinnön suojapiiriin sisältyy eristetty polynukleotidisekvenssi tai eristetty 10 nukleiinihappomolekyyli, joka koodaa sieniperäistä seriiniproteaasientsyymiä tai polypeptidiä, joka käsittää Tr Prbl-entsyymin kypsän muodon aminohapposekvenssin, joka on esitetty sekvenssissä nro 10, eli sekvenssin nro 6 täyspitkän seriiniproteaasin aminohapot Alal21-Ala409.
15 Keksinnön suojapiiriin sisältyvät myös aminohapposekvenssin nro 10 luonnollisia variantteja koodaavat polynukleotidisekvenssit. Nämä variantit sisältävät pieniä muutoksia aminohapposekvenssissä, esim. aminohapposekvenssin yhdessä tai useammassa asemassa olevia muutoksia, jotka ovat seurausta niiden deleetiosta, substituutiosta, insertiosta, additiosta tai kombinaatiosta. Nämä variaatiot eivät 20 kuitenkaan muuta molekyylien biologista toimintaa. Näin ollen varianteilla on aminohapposekvenssin nro 10 ominaisuudet, toisin sanoen ominaispiirteet ja aktiivisuus.
Identtisyyttä kahden aminohapposekvenssin välillä voidaan verrata vastaavalla sekvenssialueella, jossa on suurin piirtein sama määrä aminohappoja. Voidaan ^ esimerkiksi verrata kahden aminohapposekvenssin täyspitkän tai kypsän sekvenssin ^ 25 identtisyyttä. Sekvenssien identtisyys voidaan määrittää käyttäen ClustalW-rinnastusta o 1 (esim. osoitteessa www.ebi.ac.uk/Tools/Clustalw) käyttäen matriisia: BLOSUM, aukon
CM
muodostus: 10, aukon laajennus: 0,5. Näiden kahden sekvenssin identtisyys on korkea, cc “ edullisesti vähintään 94 %, edullisesti vähintään 95 %, edullisemmin 96 %, edullisemmin O) 97 %, vieläkin edullisemmin 98 % ja edullisimmin 99 %.
§ 30
O
00 Eristetty polynukleotidisekvenssi tai eristetty nukleiinihapposekvenssi käsittää edullisesti sekvenssissä 9 määritellyn polynukleotidisekvenssin, toisin sanoen 29 polynukleotidisekvenssin, joka koodaa sekvenssin nro 10 kypsän Tr Prbl:n aminohapposekvenssiä.
Keksinnön eristetty nukleiinihappomolekyyli voi olla molekyyli, joka käsittää sekvenssin 5 nro 5 polynukleotidisekvenssin koodaavan sekvenssin, joka sisältyy DSM 22635 :een, joka kantaa täyspitkän Tr prbl -geenin nukleotidisekvenssiä.
Keksinnön nukleiinihappomolekyyli voi myös olla edellä määritellyn nukleotidisekvenssin analogi. Termi “degeneraatio” viittaa sellaisiin nukleotidisekvenssin analogeihin, jotka eroavat 10 yhden tai useamman nukleotidin tai kodonin suhteen, mutta jotka koodaavaat keksinnön rekombinanttista proteaasia.
Näin ollen keksinnön suojapiiriin sisältyvät eristetty nukleiinihappomolekyyli, joka käsittää sekvenssissä nro 5, sekvenssissä nro 7 tai sekvenssissä nro 9 esitetyn nukleotidisekvenssin, sekä 15 sen analogit.
Keksinnön erään edullisen suoritusmuodon mukaisesti eristetty nukleiinihappomolekyyli koodaa sieniperäistä seriiniproteaasia käytettäväksi pesuaineiden lisäaineena.
20 Esillä oleva keksintö koskee myös rekombinanttista ekspressiovektoria tai rekombinanttista ekpressiokonstruktia, jota voidaan käyttää valittua seriiniproteaasia koodaavan nukleiinihapposekvenssin lisäämiseksi tai ilmentämiseksi soveltuvassa prokaryoottisessa tai eukaryoottisessa isännässä. Rekombinanttinen ekspressiovektori käsittää DNA:ta tai nukleiinihapposekvenssejä, jotka helpottavat tai ohjaavat ^ 25 seriiniproteaasia koodaavan sekvenssin ilmentymistä ja erittymistä soveltuvassa ^ isännässä, kuten promoottoreita, tehostajia, terminaattoreita (mukaan lukien transkription ° ja translaation päättämissignaalit) sekä signaalisekvenssejä, jotka ovat toiminnallisesti ^ kytkeytyneitä mainittua seriiniproteaasia koodaavaan polynukleotidisekvenssiin.
S
Ekspressiovektori voi edelleen käsittää markkerigeenejä transformattikantojen valintaa 30 varten, tai selektiomarkkeri voidaan viedä isäntään toisessa vektorikonstruktissa
LO
g kotransformoinnin avulla. Mainitut säätelysekvenssit voivat olla homologisia tai o cm heterologisia tuotanto-organismiin kanssa, tai ne voivat olla peräisin siitä organismista, josta seriiniproteaasia koodaava geeni eristettiin.
30
Esimerkkeihin promoottoreista keksinnön seriiniproteaasin ilmentämiseksi rihmasieni-isännissä sisältyvät promoottorit seuraavista: A. oryzaen TAKA-amylaasi, emäksinen proteaasi ALP ja trioosifosfaatti-isomeraasi, Rhizopus miehein lipaasi, Aspergillus nig elin tai A. awamorin glukoamylaasi (glaA), Fusarium oxysporumin trypsiinin 5 kaltainen proteaasi, Chrysosporium lucknowensen sellobiohydrolaasi 1 -promoottori, Trichoderma reesein sellobiohydrolaasi I (Cel7A) jne.
Hiivoissa ilmentymisen aikaansaamiseksi voidaan käyttää esimerkiksi promoottoreita seuraavista: S. cerevisiaen enolaasi (ENO-1), galaktokinaasi (GAL1), 10 alkoholidehydrogenaasi (ADH2) j a 3 -fosfoglyseraattikinaasi.
Esimerkkejä promoottorisekvensseistä keksinnön seriiniproteaasin transkription ohjaamiseksi bakteeri-isännässä ovat seuraavat: Escherichia colin /aooperonin promoottori, Streptomyces coelicolorm agaraasigeenin dagA promoottori, 15 B. licheniformisin alfa-amylaasigeenin (amyL) promoottori, B. stearothermophilusin maltogeenisen amylaasigeenin (amyM) promoottori, B. sublitis xylA ja xylB -geenien promoottorit, jne.
Soveltuviin terminaattoreihin sisältyvät edellä mainittujen geenien terminaattorit tai 20 mitkä tahansa muut terminaattorisekvenssit, jotka toimivat isäntäkannassa.
Soveltuviin transformaatio- tai selektiomarkkereihin sisältyvät ne, jotka täydentävät puutetta isännässä, esim. dal-geenit lajeista B. subtilis tai B. licheniformis, tai Aspergillus ^ amdS ja niaD. Selektio voi myös pohjautua markkerille, joka antaa antibioottista ^ 25 resistenssiä, kuten ampisilliini-, kanamysiini-, kloramfenikoli-, tetrasykliini-, ° pleomysiini- tai hygromysiiniresistenssiä.
ou
X
Keksinnön seriiniproteaasin solun ulkoinen erittäminen on edullista. Näin ollen ^ rekombinanttinen vektori käsittää sekvenssejä, jotka helpottavat erittämistä valitussa g 30 isännässä. Keksinnön seriiniproteaasin signaalisekvenssi tai presekvenssi tai prepeptidi cm voidaan sisällyttää rekombinanttiseen ekspressiovektoriin, tai luonnollinen signaalisekvenssi voidaan korvata toisella signaalisekvenssillä, joka kykenee 31 helpottamaan erittämistä valitussa isännässä. Näin ollen valittu signaalisekvenssi voi olla homologinen tai heterologinen valitun ilmentämisessä käytetyn isännän kanssa.
Esimerkkeihin soveltuvista signaalisekvensseistä sisältyvät sieni- tai hiivaorganismien 5 signaalisekvenssit, esimerkiksi signaalisekvenssit hyvin ilmennetyistä geeneistä. Tällaiset signaalisekvenssit ovat kiqallisuudesta hyvin tunnettuja.
Rekombinanttinen vektori voi edelleen käsittää sekvenssejä, jotka helpottavat vektorin sisällyttämistä isännän kromosomaaliseen DNA:han stabiilin ilmentämisen 10 aikaansaamiseksi.
Keksinnön Tr Prbl -proteaasi ilmennettiin T. reesein cbhl (cel7A) -promoottorin signaalisekvenssin kanssa, kuten on kuvattu esimerkissä 1. Ilmentämiskonstrukti, jota käytettiin T. reesei -isännän transformoimiseksi, sisälsi myös cbhl-terminaattorin ja 15 am^S-markkerin transformanttien valitsemiseksi transformoimattomista soluista.
Esillä oleva keksintö koskee myös isäntäsoluja, jotka käsittävät edellä kuvatun kaltaisen rekombinanttisen ekspressiovektorin. Soveltuvia isäntiä sieniperäisen seriiniproteaasientsyymin tuottamista varten ovat homologiset tai heterologiset isännät 20 kuten mikrobi-isännät, mukaan lukien bakteerit, hiivat ja sienet. Mahdollisia ovat myös tuotantojäqestelmät kasvi- tai nisäkässoluissa.
Rihmasienet kuten Trichoderma, Aspergillus, Fusarium, Humicola, Chrysosporium ^ Neurospora, Rhizopus, Penicillium ja Mortiriella ovat edullisia valmistusisäntiä johtuen ^ 25 jatkokäsittelyn ja entsyymituotteen talteen ottamisen helppoudesta. Soveltuviin ^ ilmentämis- ja tuotantoisäntäjäqestelmiin sisältyvät esimerkiksi tuotantojäqestelmä, joka ^ on kehitetty rihmasieni-isännälle Trichoderma reesei (EP 244234), tai Aspergillus- ^ tuotantojäqestelmät, kuten A. oryzae tai A. niger (WO 9708325, US 5,843,745, ^ US 5,770,418), A. awamori, A. sojae ja A. japonicus -tyyppiset kannat, tai g 30 tuotantojäqestelmä, jotka on kehitetty Fusam//»-lajeille kuten F. oxysporum (Malardier ym., 1989) tai F. venenatum, sekä lajeille Neurospora erässä, Rhizopus miehei, Mortiriella alpinis, H. lanuginosa tai H. insolens tai lajille Chrysosporium lucknowense (US 6,573,086). Soveltuviin hiivoille kehitettyihin tuotanto) äqestelmiin sisältyvät 32 järjestelmät, jotka on kehitetty seuraaville: Saccharomyces, Schizosaccharomyces tai Pichia pastoris. Soveltuviin bakteereille kehitettyihin tuotantojärjestelmiin sisältyvät tuotantojärjestelmät, jotka on kehitetty suvulle Bacillus, esimerkiksi lajeille B. subtilis, B. licheniformis, B. amyloliquefaciens, tai E. co//lle tai sädesienille Streptomyces.
5 Edullisesti keksinnön seriiniproteaasi valmistetaan suvun Trichoderma tai Aspergillus rihmasieni-isännässä, kuten T. reeseissä tai A. niger, A oryzae, A. sojae, A. awamori tai A. japonicus -tyyppisissä kannoissa. Keksinnön edullisimman suoritusmuodon mukaan sieniperäinen proteaasientsyymi valmistetaan T. reeseissä,.
10 Isännältä voivat puuttua homogeeniset proteaasit johtuen proteaasien poistamisesta joko inaktivoimalla tai poistamalla yksi tai useampi isännän proteaaseista, esim. tällaisia homogeenisiä tai homologisia proteaaseja koodaavan yhden tai useamman geenin deleetion vuoksi.
15 Esillä oleva keksintö koskee myös valmistusmenetelmää polypeptidille, jota voidaan käyttää proteiinipitoisen materiaalin muuntelemisessa, hajottamisessa ja poistamisessa teollisissa sovelluksissa, joissa entsyymin tehokkuus alhaisissa tai kohtalaisissa lämpötiloissa on toivottavaa, edullisesti käytettäväksi pesuaineiden lisäaineena, jolloin mainitulla polypeptidillä on seriiniproteaasiaktiivisuutta ja mainittu menetelmä käsittää 20 vaiheet, joissa keksinnön luonnollista tai rekombinanttista, keksinnön seriiniproteaasin rekombinanttista ekspressiovektoria kantavaa isäntäsolua viljellään soveltuvissa olosuhteissa ja valinnaisesti mainittu entsyymi eristetään. Tuotantoelatusaine voi olla elatusaine, joka soveltuu isäntäorganismin kasvattamiseen sekä sisältää tehokkaan ^ ilmentämisen vaatimat indusorit. Tällaiset elatusaineet ovat kirjallisuudesta hyvin ^ 25 tunnettuja, o i ^ Keksintö koskee Tr Prbl -polypeptidiä käytettäväksi proteiinipitoisen materiaalin
X
muuntelemisessa, hajottamisessa ja poistamisessa sovelluksissa, joissa käytetään alhaisia tai kohtalaisia lämpötiloja, edullisesti käytettäväksi pesuaineiden lisäaineena, jolla g 30 polypeptidillä on seriiniproteaasiaktiivisuutta ja jota koodaa keksinnön cm nukleiinihappomolekyyli ja joka on saatavissa edellä kuvatun menetelmän avulla.
33
Keksinnön rekombinanttisen entsyymin molekyyli massa on 25-35 kDa. Entsyymin optimaalinen lämpötila-alue on 30-70 °C pH:ssa 9. Mainitun entsyymin pH-optimi on pH-alueella, joka on vähintään pH 6-11 lämpötilassa 50 °C. Lämpötila- ja pH-optimit määritettiin käyttäen 15 minuutin reaktioaikaa ja kaseiinia substraattina. Keksinnön 5 seriiniproteaasi kykenee muuntelemaan, hajottamaan tai poistamaan proteiinipitoisia tahroja pesuaineen läsnäollessa 10-60 °C:n lämpötilassa.
Esillä oleva keksintö koskee myös menetelmää entsyymi valmisteen aikaansaamiseksi, joka käsittää polypeptidin, jota voidaan käyttää proteiinipitoisen materiaalin 10 muuntelemisessa, hajottamisessa ja poistamisessa sovelluksissa, joissa käytetään alhaisia tai kohtalaisia lämpötiloja, edullisesti käytettäväksi pesuaineiden lisäaineena, jolla polypeptidillä on seriiniproteaasiaktiivisuutta ja mainittu menetelmä käsittää vaiheet, joissa keksinnön ekspressiovektoria kantavaa isäntäsolua viljellään ja polypeptidi otetaan joko talteen soluista tai solut erotetaan elatusaineesta ja otetaan talteen supematantti, jolla 15 on seriiniproteaasiaktiivisuutta.
Esillä oleva keksintö koskee myös entsyymivalmistetta käytettäväksi proteiinipitoisen materiaalin muuntelemisessa, hajottamisessa tai poistamisessa alhaisissa tai kohtalaisissa lämpötiloissa, edullisesti käytettäväksi pesuaineiden lisäaineena, joka entsyymivalmiste 20 käsittää edellä esitetyn seriiniproteaasientsyymin. Entsyymivalmisteella tai koostumuksella on seriiniproteaasiaktiivisuutta ja se on saatavissa keksinnön mukaisella menetelmällä.
^2 Mainittu entsyymivalmiste voi lisäksi käsittää erityyppisiä entsyymejä tämän keksinnön ^ 25 seriiniproteaasin lisäksi, esimerkiksi toisen proteaasin, amylaasin, lipaasin, sellulaasin, co kutinaasiin, pektinaasin, mannaasin, ksylanaasin ja/tai oksidaasin kuten lakkaasin tai 0X1 peroksidaasin mediaattorin kanssa tai ilman sitä. Näiden entsyymien odotetaan
X
tehostavan keksinnön seriiniproteaasien vaikutusta poistamalla käsiteltävässä materiaalissa olevia hiilihydraatteja ja öljyjä tai rasvoja. Mainitut entsyymit voivat olla g 30 luonnollisia tai rekombinanttisia entsyymejä, jotka isäntäkanta on tuottanut, tai ne cn voidaan lisätä vilj elmän supematanttiin valmistusprosessin j älkeen.
34
Mainittu entsyymivalmiste voi lisäksi käsittää soveltuvan lisäaineen, joka on valittu ryhmästä, johon sisältyvät pinta-aktiiviset aineet, puskurit, korroosionestoaineet, stabilointiaineet, valkaisuaineet, mediaattorit, vedenpehmentäjät, syövyttävät aineet, hankausaineet ja säilöntäaineet, optiset kirkasteet, uudelleen tarttumista estävät aineet, 5 väriaineet, pigmentit jne.
Pinta-aktiiviset aineet ovat käyttökelpoisia rasvan emulgoinnissa ja pintojen kostuttamisessa. Pinta-aktiivinen aine voi olla ioniton, mukaan lukien semipolaarinen, ja/tai anioninen ja/tai kationinen ja/tai kahtaisioninen.
10
Entsyymivalmisteeseen voidaan lisätä puskureita pH:n säätämiseksi tai muiden aineiden tehokkuuteen tai stabiiliuteen vaikuttamiseksi.
Soveltuviin stabilointiaineisiin sisältyvät polyolit kuten propyleeniglykoli tai glyseroli, 15 sokeri tai sokerialkoholi, maitohappo, boorihappo tai boorihappojohdannaiset, peptidit jne.
Valkaisuainetta käytetään orgaanisten yhdisteiden hapettamiseksi ja hajottamiseksi.
Esimerkkejä soveltuvista kemiallisista valkaisujärjestelmistä ovat H202:n lähteet, kuten 20 perboraatti tai perkarbonaatti perhappoa muodostavien valkaisuaktivaattorien kuten tetra- asctyyl ictylceni di amiinin kanssa tai ilman, tai vaihtoehtoisesti peroksihapot kuten amidi-, imidi- tai sulfonityyppiset. Kemiallisia hapettimia voidaan korvata osittain tai kokonaan käyttämällä hapettavia entsyymejä, kuten lakkaaseja tai peroksidaaseja. Monet lakkaasit ^2 eivät toimi tehokkaasti mediaattorien puuttuessa, o ™ 25 co 1 Vedenpehmentäjiin tai kompleksointiaineisiin sisältyvät sellaiset aineet kuten zeoliitti, ^ difosfaatti, trifosfaatti, karbonaatti, sitaatti jne. Entsyymivalmiste voi lisäksi käsittää x yhtä tai useampaa polymeeriä, kuten karboksimetyyliselluloosaa, poly(etyleeniglykolia), poly(vinyylialkoholia), poly(vinyylipyrrolidonia), jne. Voidaan lisätä myös pehmentimiä, g 30 syövyttäviä aineita ja säilöntäaineita muiden aineosien pilaantumisen estämiseksi, cm hankausaineita j a vaahtoamis- j a viskositeettiominaisuuksia muuttavia aineita.
35
Keksinnön erään edullisen suoritusmuodon mukaisesti mainittu cntsyymivalmistc on nesteen, jauheen tai rakeiden muodossa.
Esillä olevan keksinnön sieniperäistä seriiniproteaasia voidaan muiden proteaasien, 5 erityisesti emäksisten proteaasien tapaan, käyttää pesuaine-, proteiini-, panimo-, liha-, valokuvaus-, nahka-, meijeri-ja lääkeaineteollisuudessa (Kalisz, 1988; Rao ym., 1998). Sitä voidaan esimerkiksi käyttää vaihtoehtona kemikaaleille, joita käytetään kuituisen proteiinijätteen (esim. sarvi, höyhenet, kynnet, karvat) muuntamisessa käyttökelpoiseksi biomassaksi, proteiinikonsentraatiksi tai aminohapoiksi (Anwar ja Saleemuddin, 1998). 10 Esillä olevan keksinnön sieniperäisen seriiniproteaasin käyttö voi muiden entsyymien tapaan osoittautua hyväksi nahan laadun parantamisessa sekä ympäristön saastumisen vähentämisessä ja energian säästämisessä, ja se voi olla käyttökelpoinen peptidien synteesissä ja D,L-aminohappojen seoksen erottamisessa. Subtilisiini käytettynä yhdessä laaja-alaisten antibioottien kanssa palovammojen ja haavojen hoidossa on esimerkki 15 seriiniproteaasien käytöstä lääketeollisuudessa, ja näin ollen esillä olevan keksinnön sieniperäisellä seriiniproteaasilla voi myös olla tällaista käyttöä, ja sitä voidaan emäksisten proteaasien tapaan käyttää myös veren poistamisessa kirurgisista laitteista sekä piilolinssien tai tekohampaiden puhdistuksessa. Kuten lajista Conidiobolus coronatus saatavaa emäksistä proteaasia, esillä olevan keksinnön sieniperäistä 20 seriiniproteaasia voidaan käyttää korvaaman trypsiini eläinsoluviljelmissä. Keksinnön proteaaseja voidaan myös käyttää kalvojen puhdistuksessa sekä biofilmien tuhoamisessa. Leivonnassa proteaaseja voidaan käyttää gluteeni verkon hajottamisessa ja muissa elintarvikesovelluksissa ruoan proteiinien, esim. maidon proteiinien, hydrolyysissa. Niitä ^ voidaan käyttää myös esimerkiksi hiivan käsittelyssä, renderoinnissa (suuremman 0 , 25 proteiinimäärän erottamisessa eläinten luista), uusien makujen tuottamisessa, kitkeryyden co vähentämisessä, emulgointiominaisuuksien muuttamisessa, bioaktiivisten peptidien 0X1 tuottamisessa sekä proteiinien allergiaa aiheuttavien ominaisuuksien vähentämisessä.
X
Substraatteihin sisältyvät eläin-, kasvi- ja mikrobiperäiset proteiinit.
01 I'-I'- g 30 Pesuaineteollisuus, erityisesti pyykinpesuaineteollisuus, on osoittautunut suurimmaksi cv yksittäiseksi kuluttajaksi proteaaseille, jotka ovat aktiivisia korkealla pH-alueella (Anwar ja Saleemuddin, 1998). Ihanteellisella seriiniproteaasilla tulisi olla laaja substraattispesifisyys edesauttamaan sitä, että voidaan poistaa suuri joukko erilaisia 36 tahroja, joiden aiheuttajia ovat elintarvikkeet, ruoho, veri ja muut ruumiin eritteet. Sen täytyy olla aktiivinen pesuaineliuoksen pH:ssa ja ionivahvuudessa, pesussa käytetyissä lämpötilassa ja pH:ssa ja sen on kestettävä mekaanista käsittelyä samoin kuin pesuaineisiin lisättäviä kelaatinmuodostajia ja hapetusaineita. Proteaasin pl:n on oltava 5 lähellä pesuaineliuoksen pl:tä. Tämänhetkisestä energiakriisistä ja energian säästämiseen kohdistuvista pyrkimyksistä johtuen nykyisin on toivottavaa käyttää proteaasia alhaisemmissa lämpötiloissa.
Esillä oleva keksintö koskee myös seriiniproteaasientsyymin tai entsyymivalmisteen 10 käyttöä pesuaineissa, tekstiilikuitujen käsittelyssä, villan käsittelyssä, karvojen käsittelyssä, nahan käsittelyssä, elintarvikkeiden tai rehun käsittelyssä tai missä tahansa sovelluksissa, joihin sisältyy proteiinipitoisen materiaalin muuntelu, hajotus tai poistaminen.
15 Keksinnön eräs edullinen suoritusmuoto on näin ollen edellä määritellyn seriiniproteaasientsyymin käyttö pesuaineiden lisäaineena, joka on käyttökelpoinen pyykinpesu- ja astianpesuainekoostumuksissa, mukaan lukien pesukoneiden astianpesuainekoostumukset.
20 Pesuaine on aine tai materiaali, jonka on tarkoitus olla avuksi puhdistuksessa tai jolla on puhdistavia ominaisuuksia. Termi “puhdistuskyky” viittaa puhdistavan ominaisuuden läsnäoloon tai asteeseen. Puhdistuskyvyn astetta voidaan testata erilaisilla proteiinista koostuvilla tai sitä sisältävillä substraattimateriaaleilla tai tahroilla tai tahraseoksilla, 12 jotka ovat kiinnittyneinä kiinteään, veteen liukenemattomaan kantajaan, kuten ^ 25 tekstiilikuituihin tai lasiin. Tyypillisiin proteiinipitoisiin materiaaleihin sisältyvät veri, ° maito, muste, kananmuna, ruoho ja kastikkeet. Koetarkoituksia varten proteiinipitoisten ^ tahrojen seoksia on kaupallisesti saatavilla. Pesuaine-entsyymin tehtävänä on hajottaa ja ^ poistaa proteiinipitoisia tahroja. Testitulokset riippuvat tahran tyypistä, pesuaineen koostumuksesta ja pesukokeessa käytettävien tekstiilien ominaisuuksista ja tilasta S 30 (Maurer 2004).
o
CM
Tyypillisesti proteaasi tai pesutehokkuus määritetään “tahranpoistotehokkuutena” tai “tahranpoistovaikutuksena” tai ’’puhdistusominaisuuden asteena”, mikä tarkoittaa 37 näkyvää ja mitattavissa olevaa vaaleuden lisääntymistä tai värin muutosta tahrautuneessa materiaalissa, esim. keinotekoisesti liatuissa kangasnäytteissä (’’swatch”) tai koekankaissa. Vaaleus tai muutokset väriarvoissa voidaan määrittää esimerkiksi mittaamalla väri heijastusarvoina spektro fotometrillä käyttäen L*a*b*- 5 väriavaruuskoordinaatteja, kuten esimerkeissä 4-7 on kuvattu. Proteaasin tehokkuuden (tahranpoistotehokkuuden) osoittava proteiinipitoisen tahran haalistuminen tai häviäminen lasketaan esimerkiksi arvona AL*, joka tarkoittaa entsyymikäsitellyn kankaan vaaleusarvoa L*, josta on vähennetty pelkällä pesunesteellä (puskuri tai pesuaineliuos) käsitellyn kankaan vaaleusarvo L*. Pesuaineen läsnäolo voi parantaa 10 entsyymin tehokkuutta tahrojen poistamisessa.
Esillä olevan keksinnön seriiniproteaasi hajottaa erityyppisiä proteiinipitoisia tahroja neutraalin tai emäksisen pH:n olosuhteissa ja koostumukseltaan erilaisten pesuaineiden läsnä ollessa tai ilman niitä (kuten on osoitettu esimerkeissä 4-7). Proteaasi kykenee 15 myös hajottamaan proteiinipitoista materiaalia laajalla lämpötila-alueella, erityisesti alhaisilla lämpötila-alueilla, kuten 10-30 °C:ssa (esimerkki 4, kuvio 7).
Kuten on esitetty esimerkissä 5, keksinnön Tr Prbl -seriiniproteaasi poisti veri/maito/muste-tahran alhaisissa pesulämpötiloissa huomattavasti paremmin kuin 20 kaupalliset proteaasivalmisteet Savinase® Ultra 16L, Purafect® 4000L ja Properase®
4000E. Kuvio 8 esittää tulokset pesuaineilla Ariel Sensitive ja Erisan. Kuviot 9A-C
esittävät tuloksia erilaisilla pesuainepohjan annostuksilla 30 °C:ssa ja kuviot 9D-E
esittävät tuloksia pesuainepitoisuudella 3,3 g/1 lämpötilassa 10-20 °C.
U Entsyymi valmisteet annosteltiin aktiivisuusyksikköinä.
^ 25 co 1 Tr Prbl -proteaasin tehokkuutta testattiin myös jauhemaisessa pesuaineessa 40 °C:n ^ ja50°C:n lämpötiloissa ja pH-arvossa noin 10 esimerkissä 6 kuvatulla tavalla.
^ Määritettiin entsyymin kyky poistaa veri/maito/muste-standarditahroja polyesterini puuvillamateriaalista. Kutakin entsyymivalmistetta annosteltiin aktiivisuusyksikköinä g 30 (iimol tyrosiinia/minuutti/tilavuus). Kuten kuviossa 10 on esitetty, keksinnön Tr Prbl -o cvj proteaasi on soveltuva myös jauhemaisiin pesuaineisiin hyvin emäksisissä olosuhteissa.
38 T. reeseissä valmistetun rekombinanttisen Tr Prbl -entsyymivalmisteen tehokkuutta testattiin nestemäisen pesuainepohjan läsnä ollessa täydessä mittakaavassa pesukoneessa 30 °C:ssa (esimerkki 7). Yhdeksän erilaista proteaasille herkkää seurantakangasta (’’tracer”) haittavaikutusten testaamiseksi on esitetty taulukossa 5 ja prosessiolosuhteet 5 taulukossa 6. Kokeissa käytetyt entsyymin annostukset on laskettu sekä entsyymiaktiivisuuksien että entsyymin proteiinimäärän perusteella. Kuvioissa 11A-I esitetyt tulokset osoittavat, että Tr Prbl:n tehokkuus alhaisessa lämpötilassa ja lyhyen ohjelman pesulla (15 min) oli huomattavasti korkeampi kaikilla testatuilla tahroilla verrattuna kaupalliseen proteaasivalmisteeseen Purafect® 4000L, kun entsyymiä 10 annosteltiin perustuen aktiivisuuden määrään. Myös silloin, kun annostus laskettiin lisätyn proteiinin määränä (kuvio 12), tahranpoistotehokkuus oli vastaava tai hieman parempi kuin valmisteella Purafect® 4000L.
Keksinnön edullisen suoritusmuodon mukaisesti keksinnön sieniperäinen seriiniproteaasi 15 on käyttökelpoinen nestemäisissä tai jauhemaisissa pesuaineissa, kuten on osoitettu esimerkeissä 5-7. Keksinnön entsyymivalmisteen entsyymi voidaan formuloida käytettäväksi käsinpesussa tai konepesussa, tai se voidaan formuloida käytettäväksi kotitalouksien kovien pintojen puhdistuksessa tai edullisesti astioiden pesussa käsin tai astianpesukoneella.
20
Sovellus tuo esiin myös sieniperäisen seriiniproteaasin Fusarium graminearum ALK01726:sta, joka on saatavissa kannasta, joka on talletettu Centraalbureau voor Schimmelcultures -kokoelmaan talletusnumerolla CBS 124697.
δ ^ 25 Fg_ALK01726-entsyymin optimaalinen lämpötila oli 30-60 °C (vähintään 30 % co ° maksimiaktiivisuudesta 50 °C:ssa), 40-60 °C (vähintään noin 40 % ^ maksimiaktiivisuudesta), tai 50 °C (Fg_ALK01726:n maksimiaktiivisuus) määritettynä £ pFl-arvossa 9 käytettäessä 15 min reaktioaikaa ja kaseiinia substraattina esimerkeissä 2c h? ia 3 kuvatulla tavalla.
S 30 o cm Fg_ALK01726-seriiniproteaasientsyymin pH-optimi on alueella, joka on vähintään pH 6-11, jolloin vähintään 50 % maksimiaktiivisuudesta esiintyy pH:ssa 9 lämpötilan ollessa 50 °C käytettäessä 15 min reaktioaikaa ja kaseiinia substraattina esimerkeissä 2c 39 ja 3 kuvatulla tavalla. Vähintään noin 60 % maksimiaktiivisuudesta esiintyy välillä pH 7-10. Fg_ALK01726-cntsyymin ennustettu pl oli 9,3.
Pesuaineen läsnä ollessa Fg_ALK01726-entsyymi toimi lämpötilassa 10-60 °C, 5 edullisesti lämpötilassa 50 °C tai alle. Entsyymi toimi myös lämpötiloissa, jotka olivat 45 °C tai alle, 40 °C tai alle, 35 °C tai alle, tai 30 °C tai alle.
F. graminearum -seriiniproteaasi käsittää kypsän Fg_ALK01726-entsyymin aminohapposekvenssin, joka on esitetty sekvenssissä nro 16. Kypsä seriiniproteaasi 10 sisältää sekvenssissä nro 12 esitetyn täyspitkän proteaasin aminohapot Alal23-Ala411. Fg_ALK01726-proteaasin proentsyymimuoto on esitetty sekvenssissä nro 14.
Fg_ALK01726-seriiniproteaasientsyymiä koodaa nukleiinihappomolekyyli, joka käsittää sekvenssin nro 11 nukleotidisekvenssin, joka koodaa täyspitkää Fg_ALK01726-15 entsyymiä (sekvenssi nro 12), tai sekvenssin nro 13 nukleotidisekvenssin, joka koodaa Fg_ALK01726:n protentsyymimuotoa (sekvenssi nro 14), tai sitä voi koodata nukleiinihappomolekyyli, joka käsittää sekvenssin nro 15 nukleotidisekvenssin, joka koodaa kypsää Fg_ALK01726- polypeptidiä (sekvenssi nro 16).
20 Fg_ALK01726-seriiniproteaasia koodaava Fg prtS8A -geeni eristettiin PCR- menetelmällä esimerkissä 1 kuvatulla tavalla käyttäen alukkeita, jotka olivat spesifisiä sekvenssille XM_383491. Täyspitkä Fg prtS8A -geeni sisällytettiin plasmidiin pALK2707, joka oli talletettu E. co/zssa RF9098 DSMZ-kantakokoelmaan ^ talletusnumerolla DSM 22636. Seriiniproteaasin johdettu aminohapposekvenssi ^ 25 analysoitiin DNA-sekvenssistä.
co 0 i ^ Täyspitkän Fg prtS8A:n nukleotidisekvenssi (sekvenssi nro 11) ja johdettu sekvenssi (sekvenssi nro 12) on esitetty kuvioissa 2A-B. Geenin pituus on 1 292 bp (mukaan lukien lopetuskodoni). Löydettiin yksi oletettu introni, jonka pituus oli 56 bp. Johdettu S 30 proteiinisekvenssi koostuu 411 aminohaposta, mukaan lukien ennustettu 20 aminohapon o cm signaalisekvenssi (SignalP V3.0; Nielsen ym., 1997, sekä Nielsen ja Krogh, 1998) ja propeptidi Ala21-Argl23. Kypsän peptidin ennustettu molekyylimassa oli 29 kDa ja ennustettu pl 9,30. Nämä ennustukset tehtiin käyttäen Compute pI/MW -työkalua 40
ExPASy-palvelimella (Gasteiger ym., 2003). Johdettu aminohapposekvenssi sisälsi kolme mahdollista N-glykosylaatiokohtaa (Asn77, Asn254 ja Asn 398), mutta CBS-palvelimen NetNGlyc V1.0:n mukaan ainoastaan yksi kohta, Asn77 (sijaitsee prosekvenssissä) on todennäköinen. Homologioita julkaistuihin proteaasisekvensseihin 5 nähden etsittiin käyttäen BLASTP-ohjelmaa, versio 2.2.21, NCBLssa (National Center for Biotechnology Information) (Altschul ym., 1990). ClustalW-rinnastusta (matriisi: BLOSUM, aukon muodostus: 10, aukon laajennus 0,5, esim. osoitteessa www.ebi.ac.uk/Tools/Clu stalwl käyttäen saatiin kypsän Fg_ALK01726-sekvenssin identtisyysarvot vastaaviin homologisten sekvenssien alueisiin nähden 10
Fg_ALK01726-sekvenssin identtisyys verrattuna Gibberella zeaen hypoteettiseen proteiiniin XP_383491 oli 99 %. Kypsien polypeptidien aminohapposekvensseistä löydettiin kaksi eroavaisuutta: aminohappo 188 oli Ser Fg_AFK01726:ssa ja Ala XP_383491:ssä, ja aminohappo 289 oli Phe Fg_AFK01726:ssa ja Feu XP_383491:ssä.
15 Fg_AFK01726:n kypsä sekvenssi oli 72-78-prosenttisesti identtinen verrattuna emäksiseen proteaasin lajista T. hamatum (AAP15044; Steyaert ym., 2004), seriiniendopeptidaasiin lajista Hypocrea lixii (teleomorfi T. harzianum; CAF25580;
Suarez ym. 2007), emäksiseen proteinaasiin lajista T. atroviride (ALP_TRIAT; Geremia ym., 1993) sekä ekstrasellulaariseen seriiniproteaasiin Tvspl lajista Hypocrea virens 20 (AA063588; Pozo ym., 2004). Kypsän Fg_AEK01726-aminohapposekvenssin identtisyys verrattuna vastaavaan alueeseen AFP-proteaasissa (EMBF-talletusnumero.
M87516; Geremia ym. 1993; esitetty sekvenssinä 313 julkaisussa US 60/818,910 (Catalyst Bioscience Inc.)) oli 76 %. Identtisyys Tr Prbl:n ja Fg_ALK01726:n kypsien ^ sekvenssien välillä oli 76 %.
o ™ 25 co ° Fg_AEK01726-proteaasin sisältävä entsyymivalmiste valmistettiin T. reeseissä 00 T. reesei cbhl (cel7A) -promoottorin säätelyn alaisena esimerkissä 2 kuvatulla tavalla.
Käpertyä elatusainetta laboratoriomittakaavassa suoritetuista bioreaktoriviljelyistä ^ käytettiin testattaessa Fg_AFK01726:n tehokkuutta pyykin pesussa pesuaineen kanssa g 30 tai ilman. Kuten on esitetty esimerkissä 4-6, Fg_AEK01726-seriiniproteaasivalmisteen oj tehokkuus oli erilaissa koeolosuhteissa vähintään yhtä hyvä tai hieman parempi kuin kaupallisten proteaasivalmisteiden Savinase® Ultra 16E, Purafect® 4000F ja Properase® 41 4000E. Tahranpoistovaikutus oli kuitenkin alhaisempi kuin aikaansaatiin keksinnön Tr Prbl-seriiniproteaasia sisältävällä entsyymivalmisteella.
ESIMERKKI 1. Proteaasigeenien Ttrichoderma reesei QM6a prbl (Tr prbl) ja 5 Fusarium graminearum ALKO 1726 FgprtS8A kloonaus (a) DNA:n eristäminen ja käytetyt molekyylibiologian menetelmät
Tavanomaisia molekyylibiologian menetelmiä käytettiin DNA:n eristämisessä ja entsyymikäsittelyissä (esim. plasmidi-DNA:n eristäminen, DNA:n digestio DNA-10 fragmenttien aikaansaamiseksi), E. coli -transformaatioissa, sekvensoinnissa jne. Näitä perusmenetelmiä käytettiin joko entsyymin, reagenssin tai pakkauksen valmistajan ohjeiden mukaan tai tavalla, joka on kuvattu tavanomaisissa molekyylibiologian oppikirjoissa, esim. Sambrook ja Russell (2001). Genomisen DNA:n eristäminen T. reesei QM6a:sta ja F. graminearum ALK01726:sta suoritettiin tavalla, jonka ovat 15 kuvanneet Raeder ja Broda (1985). Fenoliuuttovaihe suoritettiin käyttäen Phase Lock -putkia (Eppendorf, Saksa).
(b) Oligonukleotidialukkeet geenien kloonausta varten
Geenit Tr prbl ja FgprtS8A kloonattiin PCR-menetelmällä käyttäen T. reesei QM6a:n ja 20 F. graminearum ALKOI726:n genomisia DNA-valmisteita templaatteina. PCR-alukkeet
Tr prbl -geenin koodausta varten suunniteltiin perustuen sekvenssiin prbl (tunnus 121495), julkaisija DOE Joint Genome Institute (T. reesei QM6a-kannan genomin sekvenssi v2.0, http:/7genome.igi-psf.oro/Trire2,/Trire2.home.htmll. PCR-alukkeet Fg ^ prtS8A -geenin kloonausta varten suunnisteltiin perustuen sekvenssiin XM 383491, joka o ^ 25 oli aiemmin julkaistu EMBL-tietokannassa ja saatiin Gibberella zeae PH-l:sta ^ (anamorfi: Fusarium graminearum). XM_383491 on kuvattu tietokannassa osittaisena 0X1 mRNA:na, joka koodaa hypoteettista proteiinia EAA71059. Taulukossa 1 on esitetty cc sekvenssit alukkeille, joita käytettiin geenien Tr prbl ja Fg prtS8A kloonauksessa. 5'-PCR-alukkeet PR0213 ja PR0245 sisälsivät (5-3-suunnassa), vastaavasti, cbhl-
LO
g 30 promoottorisekvenssin lopun (SacII-kohdasta) fuusioituna Tr prbl- ja Fg prtS8A-o ^ geenisekvensseihin (26 ja vastaavasti 27 nukleotidia mukaan lukien ATG). Lisäksi alukkeet sisälsivät kolme (PR0213) tai kaksi (PR0245) lisänukleotidia niiden 5'-päissä, jotta voitiin varmistaa katkaisu PCR-tuotteista SacII-kohdasta sekä geenien tarkka fuusio 42 täyspitkän cbhl-promoottorin &cII-kohtaan. 3-PCR-alukkeet PR0214 ja PR0246 sisälsivät (5'-3'-suunnassa), vastaavasti, Z?amHI-kohdan sekä geenien Tr prbl ja FgprtS8A lopun (26 tai vastaavasti 25 nukleotidia mukaan lukien lopetuskodoni). Lisäksi PR0214 sisälsi kolme ja PR0246 kaksi lisänukleotidia 5'-päissä, jotta voitiin 5 taata katkaisu itamHI-kohdasta, jota käytettiin geenien fuusioimiseksi cbhl-terminaattoriin linkkerin välityksellä.
Taulukko 1. PCR-alukkeina geenien Tr prbl ja Fg prtS8A kloonauksessa käytetyt oligonukleotidit (sekvenssit nro 1-4) Taulukossa on esitetty alukkeet, niitä vastaavat 10 sekvenssinumerot sekä sekvenssit (5'—► 3'). Geeneistä Tr prbl ja Fg prtS8A peräisin olevat sekvenssit on esitetty lihavoituina.
Oligo- Sekvenssi Sekvenssi nuklotidi__nro;__
PR0213 1 TCCCCGCGGACTGCGCATCATGGCCAGCCTTCGTC
___GCCTTGCCCT_
PRQ214__2__CGCGGATCCTTAAGCACTGTTCCCGTTGAAGATGA
PR0245 3 ACCCGCGGACTGCGCATCATGACCAGCTTCCGCCG
___TCTTGCTCTC_
PR0246 4 CGGGATCCTTAAGTAGAGGCACCGTTGAAGGCG
15 (c) PCR-reaktiot T. reesei QM6a:n ja F. graminearum ALK01726:n (CBS 124697) genomisia DNA:ita käytettiin templaatteina PCR-reaktioissa. PCR-reaktioseokset sisälsivät lXPhusion HF -puskuria (Finnzymes, Suomi), 0,2 mM dNTPs:a, 0,5 μΜ kutakin aluketta ja 0,5 yksikköä Phusion DNA -polymeraasia (Finnzymes, Suomi) sekä noin 0,5-1 pg genomista DNA:ta i o 20 per 50 μΐ reaktiotilavuutta. Olosuhteet PCR-reaktioille olivat seuraavat: 30 min i c\i alkudenaturaatio 98 °C:ssa, minkä jälkeen 25 sykliä seuraavaa: 10 min 98 °C:ssa, 30 s g liittäminen 49,4 °C:ssa, 54,7 °C:ssa ja 60,2 °C:ssa (Tr prbl) tai 54,4 °C:ssa, 59,5 °C:ssa 05 ja 64,8 °C:ssa (Fg prtSSÄ), 1 min pidentäminen 72 °C:ssa sekä loppupidentäminen i^· ^ 72 °C:ssa 7 min ajan. DNA-tuotteet, joiden koot olivat sellaiset, joita oli odotettu o oj 25 (julkaistuihin sekvensseihin perustuvien laskelmien perusteella), ~1,4 kb ja vastaavasti ~1,3 kb, saatiin kaikista reaktioista käyttämällä alukeyhdistelmiä PR0213 (sekvenssi nro 1) ja PR0214 (sekvenssi nro 2) sekä PR0245 (sekvenssi nro 3) ja PR0246 (sekvenssi 43 nro 4). DNA-tuotteet eristettiin ja puhdistettiin PCR-reaktioseoksista. Ne katkaistiin käyttäen SacW.d ja BamHV.d ja ligatoitiin pALK1910-vektoriin, joka oli katkaistu iSacIklla ja BainHY.Wa. Vektori pALK1910 sisältää ~2,2 kb:n cbh 1-promoottorin (St/cIlkoiltaan) sekä linkkerin (mukaan lukien esim. RamHI-kohta), tämän mahdollistaessa 5 geenin ligatoimisen cbhl-promoottoriin ja -terminaattoriin (~0,6 kb, lopetuskodonista ^4vaII-kohtaan). Tuotteet kahdesta erillisestä T. reesei PCR-reaktiosta sekvensoitiin, ja niiden havaittiin olevan identtisiä keskenään sekä verrattuina DOE Joint Genome Instituten julkaisemaan sekvenssiin. Myös tuotteet kahdesta erillisestä F. graminearum PCR-reaktiosta sekvensoitiin ja niiden havaittiin olevan identtisiä keskenään. 10 Plasmideille, jotka sisälsivät geenit Tr prbl ja FgprtS8A fuusioituina cbhI-promoottoriin ja -terminaattoriin, annettiin nimet pALK2650 ja vastaavasti pALK2707. E. coli -kannat RF8052 ja RF8098, jotka sisälsivät plasmidit pALK2650 ja pALK2707, talletettiin DSM-kokoelmaan talletusnumeroilla DSM 22635 ja vastaavasti DSM 22636. Ekspressiokasetit pALK2701 (Tr prbl) ja pALK2708 (FgprtS8A) konstruoitiin edelleen 15 näistä plasmideista esimerkissä 2 kuvatulla tavalla.
(e) Proteaaseja Tr Prbl- ja Fg_ALK01726 koodaavien geenien karakterisointi ja johdetut aminohapposekvenssit
Tr prbl -sekvenssi (sekvenssi nro 5) ja johdettu aminohapposekvenssi (sekvenssi nro 6) 20 on esitetty kuvioissa 1A-B. Geenin pituus on 1 371 bp (mukaan lukien lopetuskodoni). Geeni sisältää kaksi intronia, joiden koot ovat 68 kb ja 73 kb. Johdettu aminohapposekvenssi koostuu 409 aminohaposta, mukaan lukien ennustettu 20 aminohapon signaalisekvenssi (http://genome.igi-psf.org/Trire2/Trire2.home.html ja ^ SignalP V3.0; Nielsen ym., 1997, ja Nielsen ja Krogh, 1998). Kypsän peptidin ennustettu ^ 25 molekyylimassa oli 29 062,21 kDa ja ennustettu pl 8,94. Nämä ennustukset suoritettiin ° käyttäen Compute pEMW -työkalua ExPASy-palvelimella (Gasteiger ym., 2003).
^ Johdettu aminohapposekvenssi sisälsi kaksi mahdollista .V-glykosylaatiokohtaa, Asn252 ^ ja Asn396 (kuvio 1), mutta CBS-palvelimenNetNGlyc VI.0 ennustaa ainoastaan aseman
Asn252 kohdan olevan mahdollinen V-glykosylaatiokohta.
LO
05 30 o
O
cm FgprtS8A -sekvenssi (sekvenssi nro 11) ja johdettu aminohapposekvenssi (sekvenssi nro 12) on esitetty kuvioissa 2A-B. Geenin pituus on 1 292 bp (mukaan lukien lopetuskodoni). Geeni sisältää yhden oletetun intronin, joka pituus on 56 bp (5'- ja 3'- 44 rajasekvenssit sieniperäisten intronien vastaavien mukaan, kuten ovat esittäneet Gurr ym., 1987). Johdettu proteiinisekvenssi koostuu 411 aminohaposta, mukaan lukien ennustettu 20 aminohapon signaalisekvenssi (SignalP V3.0; Nielsen ym., 1997 sekä Nielsen ja Krogh, 1998). Ennustettu molekyylimassa oli 28 935,98 Da kypsälle 5 polypeptidille ja ennustettu pl 9,30. Nämä ennusteet tehtiin käyttäen Compute pI/MW -työkalua ExPASy-palvelimella (Gasteiger ym., 2003). Johdettu aminohapposekvenssi sisälsi kolme mahdollista iV-glykosylaatiokohtaa aminohappoasemissa Asn77, Asn254 ja Asn398 (kuvio 2), mutta CBS-palvelimen NetNGlyc V1.0:n mukaan ainoastaan kohta asemassa Asn77 (sijaitsee prosekvenssissä) on mahdollinen .V-glykosylaatiokohta.
10 (f) Homologia-, identtisyys- ja rinnastustutkimukset
Kypsiä Tr Prbl- ja Fg_ALK01726-proteiineja koodaavien sekvenssien homologioita julkaistuihin proteaasisekvensseihin nähden (ei-redundantit GenBank CDS -translaatiot + PDB + SwissProt + PIR + PRF poislukien ympäristönäytteet WGS-projekteista) tutkittiin 15 käyttäen proteiinien BLASTP-ohjelmaa, versio 2.2.21, NCBEssa (National Center for
Biotechnology Information) oletusasetuksilla (Altschul ym., Fg_ALK01726).
Suurimmat identtisyydet (92-93 %) Tr Prbl:lle olivat seuraavat: emäksinen proteaasi lajista Trichoderma hamatum (AAP15044; Steyaert ym., 2004), seriiniendopeptidaasi lajista Hypocrea lixii (Trichoderma harzianum; CAL25580; Suarez ym., 2007), 20 emäksinen proteaasi lajista Trichoderma atroviride (ALP TRIAT; Geremia ym., 1993) ja ekstrasellulaarinen seriiniproteaasi Tvspl lajista Hypocrea virens (AA063588; Pozo ym., 2004). Fg ALKO 1726:n identtisyys verrattuna hypoteettiseen proteiiniin Gibberella zeaesta (Fusarium graminearum), sekvenssi XP 383491, oli 99 %. Edellä mainittujen ^ kahden kypsän aminohapposekvenssin sekvensseissä havaittiin ainoastaan kaksi eroa o ^ 25 (aminohappo 188 on Ser Fg_ALK01726:ssa ja Ala XP_383491:ssä, ja aminohappo 289
CO
? on Phe Fg_ALK01726:ssa ja Leu XP_383491:ssä). Seuraavaksi lähimpien homologien ^ Fg_ALK01726:een nähden havaittiin olevan Tr Prbl -homologit (ks. yllä). Kypsän
X
o- Fg_ALK01726-sekvenssin identtisyydet näihin sekvensseihin nähden olivat 74-78 %.
Homologiaa havaittiin myös verrattuna sekvenssiin, joka sisältyi patenttihakemukseen N- g 30 US 60/818,910 (Catalyst Bioscience Inc.) sekvenssinä nro 313. Tämän sekvenssin cm identtisyysarvot, jotka saatiin käyttäen kypsiä sekvenssialueita ja ClustalW-rinnastusta twww.ebi.ac.uk/Tools/clustalw; matriisi: BLOSUM, Aukon muodostus: 10, aukon laajennus: 0,5) verrattuna Tr Prb:een ja Fg_ALK01726:een olivat 92 % (Tr Prbl) ja 45 76% (Fg_ALK01726). Identtisyys Tr Prbl:n ja Fg_ALK01726:n välillä oli 76 % käyttäen edellä mainittua ClustalW-rinnastusta.
ESIMERKKI 2. Rekombinanttisten Tr Prbl- ja Fg_ALK01726-proteaasien 5 valmistus Trichoderma reeseissä.
(a) Ekspressiokasettien valmistus ja niiden transformointi T. reeseihm
Ekspressioplasmidit pALK2701 (Tr prbl) ja pALK2708 (Fg prtS8Ä) rekombinanttisten
Tr Prbl- ja Fg_ALK01726-proteiinien tuotantoa vasten Trichoderma reeseissä 10 konstruoitiin ligatoimalla amdS- (asetamidaasi-) markkerigeeni plasmideihin pALK2650 ja pALK2707 (esimerkki le), vastaavasti. Markkeri amdS ligatoitiin ekspressiokonstrukteihin cbh I-terminaatttorin jälkeen. Analogisia konstrukteja ovat kuvanneet esim. Paloheimo ym. (2003). Ekspressiokaseteissa pALK2701 ja pALK2708 (kuviot. 3 ja 4) geenit Tr prbl ja Fg prtS8A omien signaalisekvenssiensä kanssa ovat 15 tarkasti fuusioituina T. reesein cbhl (cel7A) -promoottoriin PCR-menetelmällä. Geenien 3'-päät fuusioidaan cbh I-terminaattoriin käyttäen i?amHI-kohtaa, joka luotiin lopetuskodonin jälkeen PCR:ssä. Näin konstruktiin ei jää alkuperäisiä terminaattorisekvenssej ä ennen cbh /-term inaattorisekvenssiä. Kooltaan ~8,7 kb olevat lineaariset ekspressiokasetit (esitetty kuvioissa 3 ja 4) eristettiin vektorirungoista käyttäen 20 Notl-digestiota, ja niitä käytettiin T. reesein protoplastien transformoinnissa. Käytetty isäntäkanta ei tuota mitään pääasiallisista T. reesein sellulaaseista (CBHI, CBHII, EGI, EGII). Transformaatiot suoritettiin kuten ovat esittäneet Penttilä ym. (1987) niillä muutoksilla, jotka ovat kuvanneet Karhunen ym. (1993). Transformantit puhdistettiin ^ selektiivisillä maljoilla yksittäisinä kuroumaitiöinä ennen niiden itiöittämistä PD:llä.
^ 25 co 1 (b) Proteaasin valmistus ravistuspulloissa ja laboratoriomittakaavan bioreaktorissa ^ Valikoima transformantteja siirrostettiin PD-vinopinnoilta ravistuspulloihin, jotka
X
sisälsivät 50 ml kompleksista laktoosipohjaista sellulaasia indusoivaa elatusainetta (Joutsjoki ym., 1993), joka oli puskuroitu 5 % KH2Po4:lla, pH:ssa 6,0. Transformanttien g 30 proteaasin tuotanto analysoitiin viljelmien supematantaista sen jälkeen, kun niitä oli ° kasvatettu 7 päivää 30 °C:ssa, 250 rpm. SDS-PAGE-geeleissä viljelmien käytetyistä supematanteista havaittiin pääasiallinen noin 29 kDa:n proteiinikaista, joka vastasi Tr Prbl- ja rekombinanttisten Fg_ALK01726-proteaasien odotettua molekyylimassaa.
46
Proteaasien aktiivisuudet määritettiin viljelmien supematanteista käyttäen kaseiinia substraattina esimerkissä 2c kuvatulla tavalla. Havaittiin isäntään verrattuna selvästi kohonneita proteaasiaktiivisuuksia. Ekspressiokasetin (-kasettien) sisällyttäminen sienigenomeihin vahvistettiin valituista transformanteista käyttämällä Southern blot -5 analyysia, johon sisällytettiin useita digestoituja genomisia fragmentteja ja ilmentämiskasettia käytettiin koettimena.
Ne T. reesein transformantit, jotka tuottivat parhaat proteaasiaktii visuudet ravistuspulloviljelmissä, valittiin viljeltäviksi laboratoriomittakaavan bioreaktoreissa. 10 Sellulaasia indusoivaa kompleksista elatusainetta käytettiin viljelyissä. Viljelyistä saatua käytettyä elatusainetta käytettiin lähtöaineena sovelluskokeissa (esimerkit 4-7) ja lähtöaineena Tr Prbl- sekä rekombinanttisten Fg_ALK01726-proteaasien puhdistusta ja tarkempaa karakterisointia varten.
15 (c) Proteaasiaktiivisuuden määritys
Proteaasiaktiivisuus määritettiin kaseiini-Folin-Ciocalteau-menetelmällä. Määrityksessä käytetty kaseiinisubstraatti valmistettiin seuraavalla tavalla: 6 g kaseiinia, Hammerstein
Grade, MP Biomedicals, LLC (101289), liuotettiin 500 mkaan seuraavia: 100 mM Tris, 20 20 μΜ CaCE, 7 μΜ MgCl2, 25 μΜ NaHCCN. Substraattiliuoksen pH säädettiin arvoon 9,0 käyttäen HCl:a. Entsyymireaktiot pysäytettiin käyttäen TCA-liuosta, joka sisälsi 0,11 M TCA:a, 0,22 M natriumasetaattia 0,33 M etikkahappoa, 0,5 M Na2C03:a 1 000 ml:ssa tislattua vettä. Määrityksessä käytetty Folin-reagenssi valmistettiin ^ laimentamalla 25 ml 2 N Folin-Ciocalteun fenolireagenssia (SIGMA, F 9252) o , 25 100 millilitraksi käyttäen tislattua vettä. Reaktio käynnistettiin inkuboimalla ensin 2,5 ml co substraattiliuosta 5 min ajan annetussa lämpötilassa, minkä jälkeen lisättiin 0,5 ml 0X1 entsyymiliuosta ja reaktiota jatkettiin 15 min tai 30 min. Kun reaktio oli jatkunut 15 min
X
tai 30 min, lisättiin 2,5 ml reaktion pysäytysliuosta, sisällöt sekoitettiin ja niiden annettiin seistä 30 minuuttia huoneenlämpötilassa. Putkia sentrifugoitiin nopeudella 4 000 rpm
Is" g 30 10 minuutin ajan (Hettich Rotanta 460). Yksi ml kirkasta supematanttia pipetoitiin ja cm sekoitettiin 2,5 mkaan 0,5 M Na2C03:a ja 0,5 mkaan laimennettua Folin-reagenssia. Kun oli odotettu 5 min (värin kehittyminen), seoksen absorbanssi (väri) määritettiin aallonpituudella 660 nm entsyymin nollanäytteeseen verrattuna. Entsyymin nollanäyte 47 valmistettiin seuraavalla tavalla: 0,5 ml entsyymi liuosta sekoitettiin 2,5 ml: aan pysäytysliuosta ja 2,5 ml:aan substraattia ja seosta inkuboitiin 15 min tai 30 min annetussa lämpötilassa. Yksi yksikkö entsyymiaktiivisuutta määritettiin siksi entsyymin määräksi, joka vapauttaa happoliukoisen proteiinin hydrolyysituotteen, niin että se vastaa 5 1 μ g tyrosiinia kohti yhtä ml reaktioseosta minuutissa.
ESIMERKKI 3. Rekombinanttisten Tr Prbl- ja Fg_ALK01726-proteaasien puhdistus ja karakterisointi
Solut ja kiinteät aineet poistettiin käytetystä elatusaineesta, joka oli saatu fermentaatiosta 10 (esimerkki 4), sentrifugoimalla 30 min ajan 50 000 g:ssa lämpötilassa +4 °C (Sorvali RC6 plus). Supematantista 15 ml käytettiin proteaasin puhdistamiseen. Kaikki puhdistusvaiheet suoritettiin kylmähuoneessa. Sentrifugoinnin jälkeen näyte suodatettiin 0,44 pm:n suodattimen (MILLEX HV Millipore) läpi ennen kuin se lisättiin HiPrep 26/10 -suolanpoistokolonniin (valmistajalta GE Healthcare), joka oli tasapainotettu 15 20 mM Tris-HCl:ssa, pH 8,8. Geelisuodatettu näyte lisättiin 20 ml:n Q Sepharose FF - kolonniin (valmistajalta GE Healthcare), joka oli tasapainotettu 20 mM Tris-HCl:ssa, pH 8,8. Läpivirtausfraktio, jolla oli proteolyyttistä aktiivisuutta, konsentroitiin käyttäen suodattavaa sentrifugilaitetta Amicon Ultra, 10000 MWCO (Millipore). Konsentroitu näyte lisättiin Superdex 75 10/300 GL -kolonniin (GE Healthcare) ja eluoitiin käyttäen 20 20 mM Hepes:a, 150 mM NaCka, pH 6,8. Proteaasia sisältävät fraktiot yhdistettiin ja niitä käytettiin pH- ja lämpötilaprofiilien karakterisoinnissa.
0 Lämpötilaprofiilit oö Lämpötilaprofiilit Tr Prbl- ja Fg_ALK01726-proteaaseille analysoitiin pH:ssa 9 T- 25 käyttämällä esimerkissä 2c kuvattua määritystä ja käyttäen 15 min reaktioaikaa. Tulokset 1 on esitetty kuvioissa 5A (Tr Prbl) ja 5B (Fg ALK01726). Molempien proteaasien
CL
optimilämpötila on noin 50 °C.
CD
I'-- t'--
LO
o pH-proflilit c\j 30 Proteaasien pH-proflilit määritettiin 50 °C:ssa käyttäen kaseiinia substraattina ja 15 min reaktioaikaa esimerkissä 2c kuvatulla tavalla. Reaktion pH säädettiin arvoon pH 6-12 48 käyttämällä 40 mM Britton-Robinson-puskuria. Tulokset on esitetty kuvioissa 6A (TrPrbl) ja 6B (Fg_ALK01726). Molemmat proteaasit olivat aktiivisia laajalla pH-alueella. Tr Prb 1:11a on havaittavissa suhteellinen aktiivisuus, joka on yli 85 % pH:ssa 6- 10. Tr Prbl:n pH-optimi on laaja, ja vähintään 95 % maksimiaktiivisuudesta ilmenee 5 pH:ssa 6-9 mittauksissa käytetyissä olosuhteissa.
ESIMERKKI 4. Rekombinanttisten proteiinien Tr Prbl ja Fg_ALK01726 tehokkuus pH 9 -puskurissa erilaisissa lämpötiloissa 10 Testattiin rekombinanttisten proteiinien Tr Prbl ja Fg_ALK01726, jotka oli valmistettu Trichodermassa (kuten esimerkissä 2 on kuvattu), kyky poistaa standardeja veri/maito/muste-tahroja (Art. 117, polyesteri + puuvilla, EMPA Testmaterialen AG, Sveitsi) lämpötiloissa 10-60 °C tai vastaavasti 20—40 °C. Kaupallisia proteaasivalmisteita Savinase® Ultra 16 L (Novozymes), Purafect® 4000L (Genencor International) ja 15 Properase® 4000E (Genencor International) sekä käsittelyä ilman entsyymiä (verrokki) käytettiin vertailua varten. Tahrakangas leikattiin ensin 1,5 cm x 1,5 cm kangasnäytteiksi ja paloja pyöristettiin leikkaamalla kulmat. Palat sijoitettiin mikrotiitterilevyjen (Nunc 150200) kuoppiin. Jokaiseen kuoppaan, jonka halkaisija oli 2 cm, lisättiin kankaan päälle 1,5 ml entsyymin laimennosta glysiini-NaOH-puskurissa, pH 9. Kutakin 20 entsyymiä annosteltiin 0, 0,2, 0,4, 0,8, 1,6, 4 ja 8 aktiivisuusyksikköä (pmol tyrosiinia/min) kohti 1,5 ml puskuria. Aktiivisuus määritettiin käyttäen 30 min reaktioaikaa esimerkissä 2(c) kuvatulla tavalla, paitsi että mittaukset suoritettiin pH:ssa 8,5 ja pysäytysliuos sisälsi ainoastaan 0,11 M TCA:a. Mikrotiitterilevyjä näytteiden U kanssa inkuboitiin vaakaravistimessa 10-60 °C:ssa / 20-40 °C:ssa 60 min nopeudella 0 , 25 125 rpm. Tämän jälkeen kangasnäytteet huuhdeltiin huolellisesti juoksevan veden alla ° (noin pesulämpötilassa) ja niitä kuivattiin yön yli sisäilmassa säleikössä päivänvalolta ^ suojattuina
CC
CL
Tahranpoistovaikutus arvioitiin mittamaalla väri reflektanssiarvoina Minolta CM 2500 -g 30 spektrofotometrillä käyttäen L* a*b * -väriavaruuskoordinaatteja (valonlähde D65/2°). oj Väri molemmilta kangasnäytteen puolilta määritettiin käsittelyn jälkeen. Kukin arvo oli keskiarvo ainakin kahdesta rinnakkaisesta kangasnäytteestä mitattuna kankaan molemmilta puolilta. Veri/maito/muste-tahran haalistuminen, joka osoitti proteaasin 49 tehokkuuden (tahranpoistotehon), laskettiin arvona AL*, joka tarkoittaa entsyymikäsitellyn kankaan vaaleusarvoa L*, josta on vähennetty pesunesteellä (puskuri) ilman entsyymiä (entsyymin nollanäyte, verrokki) käsitellyn kankaan vaaleusarvo L*.
5 Tulokset on esitetty kuvioissa 7A-F. Prbl-proteaasivalmiste osoitti huomattavasti korkeampaa tahranpoistokykyä 10-60 °C olevalla lämpötila-alueella pH 9 -puskurissa, erityisesti alhaisimmissa pesulämpötiloissa, kuten 10-30 °C:ssa, verrattuna kaupallisiin proteaasivalmisteisiin Savinase® Ultra 16L, Purafect® 4000L ja Properase® 4000E. Fg_ALK01726-proteaasivalmiste oli hieman parempi kuin proteaasivalmisteet 10 Savinase® Ultra 16L ja Purafect® 4000L lämpötilassa 20^40 °C.
ESIMERKKI 5. Rekombinanttisten proteiinien Tr Prbl ja Fg_ALK01726 tehokkuus erilaisten nestemäisten pesuaineiden kanssa alhaisissa lämpötiloissa 15 Testattiin rekombinanttisten proteiinien Tr Prbl ja Fg_ALK01726, jotka oli valmistettu
Trichodermassa (kuten esimerkissä 2 on kuvattu), kyky poistaa standardeja veri/maito/muste-tahroja (Art. 117, puuvilla + polyesteri, EMPA) erilaisten nestemäisten pesuaineiden kanssa 30 °C:ssa. Käytettiin nestemäistä, värillisille kankaille tarkoitettua pesuainepohjaa (pH > 8,0), joka sisälsi 25 % pesuaktiivisia aineita, polyolia ja 20 polymeerejä (taulukko 2), pitoisuuksina 1-5 g/1 sekä kaupallisia pesuaineita Ariel
Sensitive (pH > 8,0, Procter & Gamble, Yhdistynyt kuningaskunta) ja Erisan (pH > 9,0,
Farmos, Suomi, taulukko 4), jotka eivät sisältäneet entsyymejä ja joita käytettiin pitoisuuksina 3,3 g/1. Kaupallisia proteaasivalmisteita Savinase® Ultra 16L, Purafect® ^ 4000L, Properase® 4000E ja käsittelyä ilman entsyymiä (verrokki) käytettiin vertailua ^ 25 varten. Tr Prbl :a testattiin myös 10 °C:ssa ja 20 °C:ssa käyttäen pesuainepohjaa (3,3 g/1).
° Kutakin entsyymiä annosteltiin 0, 0,2, 0,4, 0,8, 1,6, 4 ja 8 aktiivisuusyksikköä (pmol ^ tyrosiinia/min) kohti ml pesunestettä. Aktiivisuus määritettiin esimerkissä 4 esitetyllä ^ tavalla. Kussakin kokeessa annostus, joka oli vähintään kaksi yksikköä kaupallisia entsyymejä per ml pesunestettä, vastasi annostusta, joka olin noin 0,2-0,5 % S 30 entsyymivalmistetta pesuaineen painoa kohden, mikä on tyypillinen käyttömäärä o cm pesuaine-entsyymeille.
50
Taulukko 2. Värilliselle kankaalle tarkoitetun nestemäisen pesuainepohjan koostumus
Valmistusaineet__%_
NaLES (natriumlauryylieetterisulfaatti)__4^9_
Ioniton Cl2-15 7EO (etyleenioksidi)__15_
Na-saippua (palmunydin-FA)__4^4_
Kookosglukosidi__1_ <Pinta-aktiiviset aineet yhteensä>__<25,30>
Polyoli (glyseriini)__5_
Fosfonaatti (32 %) (ThermPhos)__2_ PVP-Sokalan HP 53 (BASF)__1_
Sokalan PA 15 (BASF)__1,56
Sorez-100 (ISP)__0,4
Vettä kunnes 100 %__ 5 Taulukko 3. Arien Sensitiven koostumus
Valmistusaineet__%_
Saippua__<5_
Optiset kirkasteet__<5_
Fosfaatti__<5_
Hajuste__<5_
Anioniset tensidit__< 5-15 %
Ionittomat tensidit__< 5-15 %
Taulukko 4. Hienoille ja värillisille kankaille tarkoitetun Erisan-pesuaineen koostumus 10
Valmistusaineet__%_
Saippua__<5_
Sitraatti__<5_
Fosfaatti__<5_ ^ Polykarboksylaatti__<5_ ^ Anioniset tensidit__< 5-15 % pr) Ionittomat tensidit <5-15% o ^ Määrät, jotka käsittivät 1, 3,3 ja 5 g nestemäistä pesuainetta, liuotettiin 1 litraan x £ vesijohtovettä (dH < 4), sekoitettiin hyvin magneettisekoittimella ja temperoitiin ^ 30 °C:seen. Pesunesteiden pH oli noin 7,3-7,5 pesuainepohjan kanssa riippuen o? 15 pesuainepitoisuudesta, tai noin 7,9 Anelin ja noin 8,2 Erisanin kanssa. Tahrakangas o leikattiin paloiksi esimerkissä 4 kuvatulla tavalla. Kangasnäytteet sijoitettiin mikrotiitterilevyjen (Nunc 150200) kuoppiin ja 1,5 ml pesunestettä, joka sisälsi pesuainetta ja entsyymin laimennosta vedessä (alle 60 μΐ) lisättiin kankaan päälle. Levyjä 51 näytteiden kanssa inkuboitiin vaakaravistimessa 30 °C:ssa 60 min nopeudella 125 rpm. Tämän jälkeen kangasnäytteet huuhdeltiin huolellisesti juoksevan veden alla (noin pesulämpötilassa) ja niitä kuivattiin yön yli sisäilmassa säleikössä päivänvalolta suojattuina. Kokeet pesuainepohjan kanssa suoritettiin samaan tapaan myös 10 °C:ssa ja 5 20 °C:ssa käyttäen pesuainepitoisuutta 3,3 g/1
Kangasnäytteiden väri käsittelyn jälkeen määritettiin Minolta CM 2500 - spektrofotometrillä käyttäen L*a*b*-väriavaruuskoordinaatteja ja tahranpoistovaikutusta, joka laskettiin arvona AL* esimerkissä 4 kuvatulla tavalla. Ilman entsyymiä tapahtunutta 10 käsittelyä varten (entsyymin nollanäyte) vastaavaa pesuaineliuosta käytettiin pesunesteenä.
Kuviot 8A ja B esittävät pesuaineiden Ariel Sensitive ja Erisan kanssa 30 °C:ssa saadut tulokset. Tulokset, jotka saatiin värillisille kankaille tarkoitetulla pesuainepohjalla 15 käyttäen erilaisia pesuainepitoisuuksia 30 °C:ssa on esitetty kuvioissa 9A-C, ja pesuainepitoisuudella 3,3 g/1 lämpötiloissa 10 °C ja 20 °C saadut tulokset on esitetty kuvioissa 9D-E. Tr Prbl:n tehokkuus veri/maito/muste-tahroille oli huomattavasti
korkeampi verrattuna kaupallisiin valmisteisiin Savinase® Ultra 16L, Purafect® 4000L
ja Properase® 4000E kaikilla pesuaineilla ja kaikilla pesuainepitoisuuksilla, kun 20 annosteltiin sama aktiivisuusmäärä. Tr Prbl:n tehokkuus verrattuna valmisteisiin
Purafect® 4000L ja Properase® 4000E oli huomattavasti suurempi erityisesti alhaisimmissa lämpötiloissa (10 °C ja 20 °C). Näiden kokeiden tulokset osoittavat, että
Tr Prbl -proteaasilla on erinomainen tehokkuus nestemäisten pesuaineiden kanssa ^ alhaisissa pesulämpötiloissa. Myös Fg_ALK01726-valmiste oli vähintään yhtä hyvä o , 25 kuin edellä mainitut kaupalliset proteaasivalmisteet 30 °C:ssa.
o ^ ESIMERKKI 6. Rekombinanttisten proteiinien Tr Prbl ja Fg_ALK01726 ^ tehokkuus jauhemaisen pesuaineen kanssa lämpötilassa 40-50 °C ja pH:ssa 10 co
Is-
Is- g 30 Testattiin rekombinanttisten Tr Prbl- ja Fg_ALK01726-proteiinivalmisteiden, joka oli cu valmistettu Trichodermassa (kuten esimerkissä 2 on kuvattu), kyky poistaa standardeja veri/maito/muste-tahroja fosfaattipitoisen vertailupesuaineen kanssa ilman valkaisuainetta 40 °C:ssa ja 50 °C:ssa (pH noin 10). Standarditahraa, Art. 117 52 (veri/maito/muste, polyesteri + puuvilla, EMPA) käytettiin koemateriaalina. Kaupallisia proteaaseja Purafect® 4000L ja Properase® 4000E sekä käsittelyä ilman entsyymiä (verrokki) käytettiin vertailua varten. Kutakin entsyymiä annosteltiin 0, 0,2, 0,4, 0,8, 1,6, 4 ja 8 aktiivisuusyksikköä (pmol tyrosiinia/min) kohti ml pesunestettä. Aktiivisuus 5 määritettiin esimerkissä 4 esitetyllä tavalla.
Määrä, joka käsitti 3,3 g fosfaattipitoista ECE-vertailupesuainetta 77 ilman optista kirkastetta (Art. 601, EMPA), liuotettiin 1 litraan vesijohtovettä (vesi, dH < 4), sekoitettiin hyvin magneettisekoittimella ja temperoitiin lämpötilaan 40 °C / 50 °C. 10 Tahrakangas leikattiin paloiksi esimerkissä 4 kuvatulla tavalla. Kangasnäytteet sijoitettiin mikrotiitterilevyjen (Nunc 150200) kuoppiin ja 1,5 ml pesunestettä, joka sisälsi pesuainetta ja entsyymin laimennosta vedessä (alle 60 μΐ) lisättiin kankaan päälle. Levyjä näytteiden kanssa inkuboitiin vaakaravistimessa lämpötilassa 40 °C / 50 °C nopeudella 125 rpm 60 min ajan. Tämän jälkeen kangasnäytteet huuhdeltiin huolellisesti juoksevan 15 veden alla (noin 45 °C) ja niitä kuivattiin yön yli sisäilmassa säleikössä suojattuina päivänvalolta.
Kangasnäytteiden väri käsittelyn jälkeen määritettiin Minolta CM 2500 - spektrofotometrillä käyttäen L*a*b*-väriavaruuskoordinaatteja, niin että 20 tahranpoistovaikutus laskettiin arvona AL* esimerkissä 4 kuvatulla tavalla. Ilman entsyymiä tapahtunutta käsittelyä varten (entsyymin nollanäyte) pesuaineliuosta käytettiin pesunesteenä.
^2 Tulokset (kuviot 10 A-B) osoittivat, että proteaasit Tr Prbl ja Fg_ALK01726 soveltuvat ^ 25 myös jauhemaisille pesuaineille hyvin emäksisissä olosuhteissa, cp w ESIMERKKI 7. Rekombinanttisen proteiinin Tr Prbl tehokkuuden arviointi
X
nestemäisessä pyykinpesuaineessa 30 °C:ssa täyden mittakaavan kokeissa
Oi I'-- I'-- g 30 Testattiin rekombinanttisen Tr Prbl -proteiinivalmisteen, joka oli valmistettu cv Trichodermassa (kuten on kuvattu esimerkissä 2), tehokkuutta nestemäisessä pesuaineessa pyykinpesukoneessa täyden mittakaavan kokeessa pesukoneessa 30 °C:ssa käyttäen lyhyttä pesuaikaa (15 min), ja sitä verrattiin kaupalliseen proteaasivalmisteeseen 53
Purafect® 4000L sekä käsittelyyn pesuaineella ilman entsyymiä. Käytettiin nestemäistä värillisille kankaille tarkoitettua pesuainepohjaa, kuten esimerkissä 8 on kuvattu, sekä yhdeksää erilaista proteaasille herkkää seurantakangasta (taulukko 5). Seurantakankaat olivat valmistajilta EMPA Testmaterialen AG, Sveitsi, sekä CFT (Center For 5 Testmaterials BV, Alankomaat). Kooltaan noin 10 cm x 10 cm olevat tahrakangasnäytteet ommeltiin tyynyliinoihin. Prosessiparametrit ja olosuhteet on kuvattu taulukossa 6. Entsyymin annostukset kokeissa laskettiin sekä entsyymiaktiivisuuksina (noin 0-14 aktiivisuusyksikköä per ml pesunestettä) että proteiinin määränä (noin Q-A mg per litra pesunestettä). Valmistetta Purafect® 4000E
10 annosteltiin 0,5 %, 0,75 % ja 1 % pesuaineen painosta. Proteaasiaktiivisuus määritettiin esimerkissä 4 esitetyllä tavalla. Proteiinin määrä määritettiin entsyymivalmisteista Bio-Rad-proteiinimäärityksellä (Bio-Rad Laboratories, Hercules, CA) käyttäen naudan gammaglobuliinia (Bio-Rad) standardina.
15 Käytettiin samanlaista pesumenettelyä kuin on kuvattu eurooppalaisessa standardissa EN ISO 6330:2000, nro 5A, paitsi että käytettiin lämpötilaa, joka oli 30 °C eikä 40 °C. Proteaasille herkkiä kangasnäytteitä kuivattiin yön yli sisäilmassa säleikössä suojattuina päivänvalolta ja täytemateriaali kuivattiin kuivausrummussa.
20 Taulukko 5. Kokeessa käytetyt proteaasille herkät seurantakankaat
Kangasnäyte__Määrä/pesu Substraatti_ EMPA Ari. 117 (sarj anro 10-07) 2_Veri/maito/muste, PE + CO_ EMPA Ari. 116 (sarjanro 18-16) 2_Veri/maito/muste, CO_ EMPA Ari. 112 (sarj anro 31-06) 2_Kaakao_ CFT/C-03-030__1_Maitokaakao/pigmentti_ 0 CFT/C-05-059b__1_Veri/maito/muste/CO_ ^ CFT/PC-05-014__1_Veri/maito/muste/PE-CO_ 9 CFT/CS-08-069__1_Ruoho/Puuvilla_ CFT/C-10-186b__1_Maapähkinäölj y/maito_ x CFT/CS-38-010 1 Munankeltuainen/Pigmentti cc
CL
01 1^· h-· m
Oi o o
(M
54
Taulukko 6. Prosessiparametrit ja olosuhteet
Kone Wascator FOM71 CSL (Electrolux)
Ohjelma 30 °C, 15 min (ISO 6330:200, 5A, lämpötila muutettu)
Veden kovuus < 4 noin 20 kg:n sisäänotolla
Kuormitus 2,0 kg valkoisia lakanoita, tyynyliinoja, froteepyyhkeitä
Pesuaineen annostus 50 g / konetäyttö (noin 2,5 g/1)
Tahranpoistovaikutus arvioitiin mittamaalla väri reflektanssiarvoina Minolta CM 2500 -5 spektrofotometrillä käyttäen L*a*b*-väriavaruuskoordinaatteja (valonlähde D65/2°). Väri molemmilta kangasnäytteen puolilta määritettiin käsittelyn jälkeen. Kukin arvo oli keskiarvo vähintään 12 mittaukselle kangasnäytettä kohti (6 kummaltakin puolelta). EMPA:n tahroilla arvot olivat kahdelle kangasnäytteelle suoritettujen mittausten keskiarvoja. Tahran haalistuminen, joka osoitti proteaasin tehokkuuden 10 (tahranpoistotehon), laskettiin arvona AL*, joka tarkoittaa entsyymikäsitellyn kankaan vaaleusarvoa L*, josta on vähennetty pelkällä pesuaineella käsitellyn kankaan vaaleusarvo L*. Tahrakangasnäytteiden väri määritettiin myös ennen käsittelyä, mutta arvoja ei sisällytetty laskelmiin, sillä kangasnäytteet olivat homogeenisia (L*-arvojen keskihajonta < 0,2 yksikköä kaikille tahroille).
15
Tulokset on esitetty kuvioissa 11A-I. Tr Prbl:n tehokkuus alhaisessa lämpötilassa ja lyhyen ohjelman pesulla (15 min) oli huomattavasti korkeampi kaikilla testatuilla 0 tahroilla verrattuna kaupalliseen proteaasivalmisteeseen Purafect® 4000L, kun proteaasia oö annosteltiin perustuen aktiivisuuden määrään. Myös silloin, kun annostus laskettiin T- 20 proteiinin määränä (kuviot 12A-B), Tr Prbl:n tahranpoistotehokkuus oli vastaava tai 1 hieman parempi kuin valmisteella Purafect® 4000L, vaikka mittaus proteiinin
CL
kokonaismääränä ei ollut edullinen Tr Prbl -valmisteelle, joka oli saatu O) optimoimattomasta fermentaatiosta.
σ> o o C\] 25 Tr Prbl:11a saavutettiin vastaava tai hieman parempi tahranpoistotehokkuus verrattuna valmisteeseen Purafect® 4000L myös käytettäessä pidempää pesuaikaa (60 min), kun 55 entsyymin annostus oli 1,9 mg proteiinia per litra pesunestettä, mikä vastaa annostusta, joka on per ml noin 2 aktiivisuusyksikköä Tr Prbl:a ja noin 14 aktiivisuusyksikköä valmistetta Purafect® 4000L.
5 VIITTEET
Altschul SF, W Gish, W Miller, EW Myers ja DJ Lipman. 1990. Basic local alignment search tool. J.JMol. Biol. 215: 403M10.
AMFEP, 2007. Association of Manufacturers and Formulators of Enzyme products, kaupallisten entsyymien luettelo osoitteessa hftp://ww^¥.amfep.oradist.htnil (päivitetty 10 30.11.2007).
Antal Z, L Manczinger, G Szakacs, RP Tengerdy ja L Ferenczy. 2000. Colony growth, in vitro antagonism and secretion of extracellular enzymes in cold-tolerant strains of Trichoderma species. Mycol. Res. 104: 545-549.
15
Anwar, A ja M Saleemuddin. 1998. Alkaline proteases: A review. Bioresource Technology 64: 175-183.
Bolton, ET ja BJ McCarthy. 1962. A general method for the isolation of RNA 20 complementary to DNA. Proc. Nat. Acad. Sci. USA 48: 1390-1397.
Chen, Y-J, ja M Inouye. 2008. The intramolecular chaperone-mediated protein folding, δ Curr. Opin. Struct. Biol. 18: 765-770.
CM
CO
O
T-- 25 Cherry JR. ja AL Fidantsef. 2003. Directed evolution of industrial enzymes: an update.
x Curr. Opin. Biotechnol. 14: 438-443.
□_ σ>
Edman P ja G Begg. 1967. Aprotein sequenator. Eur. J. Biochem. 1: 80-91.
05 o cm Gasteiger, E, A Gattiker, C Hoogland, I Ivanyi, RD Appel ja A Bairoch. 2003. ExPASy: 30 the proteomics server for in-depth protein knowledge and analysis. Nucleic Acids Res. 31: 3784-3788.
56
Geremia RA, GH Goldman, W Ardiles, SB Vila, M Van Montagu ja A Herrera-Estrella. 1993. Molecular characterization of the proteinase-encoding gene, prbl, related to mycoparasitism by Trichoderma harzianum. Mol. Microbiol. 8(3): 603-613.
Gupta, R, QK Beg, S Khan ja B Chauhan. 2002. An overview on fermentation, 5 downstream processing and properties of microbial alkaline protease. Appi. Microbiol. Biotechnol. 60: 381-395.
Gurr SJ, SE Uncles ja JR Kinghom. 1987. The structure and organization of nuclear genes in filamentous fungi, s. 93-139. Teoksessa (JR Kinghom, toim.) Gene Structure in Eukaryotic Microbes. IRL Press, Oxford.
10 Joutsjoki, VV, TK Torkkeli ja KMH Nevalainen. 1993. Transformation of Trichoderma reesei with the Hormoconis resinae glucoamylase P (gamP) gene: production of a heterologous glucoamylase by Trichoderma reesei. Curr. Genet. 24: 223-228.
Kalisz, HM. 1988. Microbial proteinases. Adv. Biochem. Eng. Biotechnol. 36: 1-65.
Karhunen T, A Mäntylä, KMH Nevalainen ja PL Suominen. 1993. High frequency one-15 step gene replacement in Trichoderma reesei. I. Endoglucanase I overproduction. Mol. Gen. Genet. 241:515-522.
Kredics L, Z Antal, A Szekeres, L Hatvani, L Manczinger, CS Vagwolgyi ja E Nagy. 2005. Extracellular proteases of Trichoderma species. Acta Microbiol, et Immunol. Hungarica 52: 169-184.
° 20 Laemmli UK. 1970. Cleavage of stmctural proteins during the assembly of the head of o bacteriophage T4. Nature 227: 680-685.
c\j x Malardier L, MJ Daboussi, J Julien, F Roussel, C Scazzocchio ja Y Brygoo. 1989.
Cloning of the nitrate reductase gene (niaD) of Aspergillus nidulans and its use for £ transformation of Fusarium oxysporum. Gene 78: 147-156.
05 o o ^ 25 Manonmani HK j a R Joseph. 1993. Preparation and properties of insolubilized proteinase of Trichoderma koningii. Process Biochem. 34: 325-329.
57
Matrinez D, RM Berka, B Henrissat, M Saloheimo, M Arvas, SE Bakers, J Chapman, O Chertkov, PM Coutinho, D Cullen, EGJ Danchin, IV Grigoriev, P Harris, M Jackson, CP Kubicek, CS Han, I Ho, LF Larrondo, AL de Leon, JK Magnuson, S Merino, M Misra, B Nelson, N Putman, B Robbertse, AA Salamov, M Schmoll, A Terry, 5 N Thayer, A Westerholm-Parvinen, CL Schoch, J Yao, R Barabote, MA Nelson, C Detter, D Bruce, CR Kuske, G Xie, P Richardson, DS Rokhsar, SM Lucas, EM Rubin, N Dunn-Coleman, M Ward ja TS Brettin. 2008. Genome sequencing and analysis of the biomass-degrading fungus Trichoderma reesei (syn. Hypocrea jecorina). Nature Biotechnol. 26: 553-560.
10 Maurer K-H. 2004. Detergent proteases. Curr. Opin. Biotechnol. 15: 330-334.
Nielsen H, J Engelbrecht, S Brunak ja G von Heijne. 1997. Identification of prokaryotic and eukaryotic signal peptides and prediction of their cleavage sites. Protein Engineering 10: 1-6.
Nielsen H ja A Krogh. 1998. Prediction of signal peptides and signal anchors by a hidden 15 Markov model. Julkaisussa: Proceedings of the Sixth International Conference on Intelligent Systems for Molecular Biology (ISMB 6), AAAI Press, Menlo Park, Kalifornia, s. 122-130.
Paloheimo M, A Mäntylä, J Kallio ja P Suominen. 2003. High-yield production of a bacterial xylanase in the filamentous fungus Trichoderma reesei requires a carrier 20 polypeptide with an intact domain structure. Appi. Env. Microbiol. 69: 7073-7082.
δ Penttilä M, H Nevalainen, M Rättö, E Salminen ja J Knowles. 1987. A versatile g transformation system for the cellulolytic filamentous fungus Trichoderma reesei. Gene - 61:155-164.
CM
X
cc
Pozo MJ, J-M Baek, JM Garcia ja CM Kenerley. 2004. Functional analysis of tvspl, a 25 serine protease-encoding gene in the biocontrol agent Trichoderma virens. Fungal Genet.
§ Biol. 41:336-348.
o
CM
Raeder U ja P Broda. 1985. Rapid preparation of DNA from filamentous fungi. Lett. Appi. Microbiol. 1: 17-20.
58
Rao, MB, AM Tanksale, MS Ghatge ja W Deshpande. 1998. Molecular and biotechnological aspects of microbial proteases. Microbiol. Mol. Biol. Rev. 62: 597-635.
Sambrook J ja DW Russell. 2001. Molecular cloning, a laboratory manual. Cold Spring Harbor Laboratory, New York, US.
5 Shimogaki, H, K Takenchi, T. Nishino, M. Ohdera, T. Kudo, K. Ohba, MV Iwama ja M Irie. 1991. Purification and properties of a novel surface active agent and alkaline-resistant protease from Bacillus sp. Y. Agric. Biol. Chem. 55: 2251-2258.
Steyaert JM, A Stewart ja HJ Ridgway. 2004. Co-expression of two genes, a chitinase (chit42) and proteinase (prbl), implicated in mycoparasitism by Trichoderma hamatum. 10 Mycologia 96: 1245-1252.
Suarez MB, Vizcaino JA, Lobell Aja Monte E. 2007. Characterization of genes encoding novel peptidases in the biocontrol Trichoderma harzianum CECT 2413 using the TrichoEST functional genomics approach. Curr. Genet. 51: 331-342.
δ
CM
CO
o δ
X
cc O- σ> r·-
LO
σ> o o
CM

Claims (38)

59
1. Sieniperäinen seriiniproteaasientsyymi, tunnettu siitä, että mainitulla entsyymillä on seriiniproteaasiaktiivisuutta ja se käsittää kypsän Tr Prbl -entsyymin aminohapposekvenssin, joka on määritelty sekvenssissä nro 10, tai jonkin sen variantin, 5 jolla on samankaltaisia ominaisuuksia, jolloin mainittua entsyymiä voidaan käyttää proteiinipitoisten materiaalien muuntelemisessa, hajottamisessa tai poistamisessa alhaisissa tai kohtalaisissa lämpötiloissa.
2. Patenttivaatimuksen 1 mukainen sieniperäinen seriiniproteaasientsyymi, tunnettu 10 siitä, että mainittua entsyymiä voidaan käyttää pesuaineiden lisäaineena.
3. Patenttivaatimuksen 1 tai 2 mukainen sieniperäinen seriiniproteaasientsyymi, tunnettu siitä, että mainittu entsyymi on saatavissa rihmasienestä Trichoderma, edullisemmin lajista T. r ees ei, edullisimmin kannasta T. rees ei QM6a. 15
4. Minkä tahansa patenttivaatimuksista 1-3 mukainen sieniperäinen seriiniproteaasientsyymi, tunnettu siitä, että mainitulla entsyymillä on seriiniproteaasiaktiivisuutta ja se käsittää sekvenssin nro 10 aminohapposekvenssin.
5. Minkä tahansa patenttivaatimuksista 1-4 mukainen sieniperäinen seriiniproteaasientsyymi, tunnettu siitä, että mainitun entsyymin kypsän muodon molekyylimassa on 20-35 kDa, edullisesti 25-33 kDa, edullisemmin 28-30 kDa, edullisimmin 29 kDa. δ CVJ cp 25
6. Minkä tahansa patenttivaatimuksista 1-5 mukainen sieniperäinen cvi seriiniproteaasientsyymi, tunnettu siitä, että mainitun entsyymin optimilämpötila c pH:ssa 9 käytettäessä 15 min reaktioaikaa ja kaseiinia substraattina on 30-70 °C, co edullisesti 40-60 °C ja edullisemmin 50-60 °C, edullisimmin 50 °C. l'- l'-- m co o 30
7. Minkä tahansa patenttivaatimuksista 1-6 mukainen sieniperäinen seriiniproteaasi, tunnettu siitä, että mainitun entsyymin pH-optimi 50 °C:ssa käytettäessä 15 min 60 reaktioaikaa ja kaseiinia substraattina on pH-alueella, joka on vähintään pH 6-11, edullisesti pH-alueella, joka on välillä pH 6-10.
8. Minkä tahansa patenttivaatimuksista 1-7 mukainen sieniperäinen 5 seriiniproteaasientsyymi, tunnettu siitä, että mainittu entsyymi kykenee hajottamaan tai poistamaan proteiinipitoisia tahroja pesuaineen läsnäollessa lämpötilassa, joka on 10-60 °C, edullisesti 50 °C tai alle, edullisemmin 40 °C tai alle, edullisemmin 30 °C tai alle, edullisemmin 20 °C tai alle, edullisimmin 10 °C tai alle.
9. Minkä tahansa patenttivaatimuksista 1-8 mukainen sieniperäinen seriiniproteaasientsyymi, tunnettu siitä, että mainittua entsyymiä koodaa eristetty nukleiinihappomolekyyli, joka koodaa polypeptidiä, joka käsittää sekvenssissä nro 10 esitetyn aminohapposekvenssin tai sen variantin, jolla on samankaltaisia ominaisuuksia.
10. Minkä tahansa patenttivaatimuksista 1-9 mukainen sieniperäinen seriiniproteaasientsyymi, tunnettu siitä, että mainittua entsyymiä koodaa eristetty nukleiinihappomolekyyli, joka käsittää sekvenssin nro 9 nukleotidisekvenssin.
11. Minkä tahansa patenttivaatimuksista 1-10 mukainen sieniperäinen 20 seriiniproteaasientsyymi, tunnettu siitä, että mainittua entsyymiä koodaava polynukleotidisekvenssi, sekvenssi nro 5, sisältyy plasmidiin pALK2650, joka on talletettu Escherichia colissa RF8052 talletusnumerolla DSM 22635.
^ 12. Minkä tahansa patenttivaatimuksista 1-11 mukainen sieniperäinen o , 25 seriiniproteaasientsyymi, tunnettu siitä, että mainittu entsyymi valmistetaan co rekombinanttisesta ekspressiovektorista, joka käsittää nukleiinihappomolekyylin, joka ^ koodaa minkä tahansa patenttivaatimuksista 1-11 mukaista sieniperäistä X seriiniproteaasia, toiminnallisesti liitettynä säätelysekvensseihin, jotka kykenevät ohj aamaan seriiniproteaasia koodaavan geenin ilmentymistä soveltuvassa isännässä. S 30 o cm
13. Minkä tahansa patenttivaatimuksista 1-12 mukainen sieniperäinen seriiniproteaasientsyymi, tunnettu siitä, että mainittu entsyymi tuotetaan heterologisessa isännässä. 61
14. Minkä tahansa patenttivaatimuksista 1-13 mukainen sieniperäinen seriiniproteaasientsyymi, tunnettu siitä, että mainittu entsyymi tuotetaan mikrobi-isännässä.
15. Minkä tahansa patenttivaatimuksista 1-14 mukainen sieniperäinen seriiniproteaasientsyymi, tunnettu siitä, että mainittu entsyymi tuotetaan isännässä, joka kuuluu johonkin suvuista Trichoderma, Aspergillus, Fusarium, Humicola, Chrysosporium, Neurospora, Rhizopus, Penicillium ja Mortiriella
16. Patenttivaatimuksen 15 mukainen sieniperäinen seriiniproteaasientsyymi, tunnettu siitä, että mainittu entsyymi tuotetaan suvussa Trichoderma tai Aspergillus.
17. Patenttivaatimuksen 16 mukainen sieniperäinen seriiniproteaasientsyymi, tunnettu siitä, että mainittu entsyymi tuotetaan lajissa T. reesei. 15
18. Eristetty nukleiinihappomolekyyli, joka koodaa sieniperäistä seriiniproteaasientsyymiä, jota voidaan käyttää proteiinipitoisten materiaalien muuntelemisessa, hajottamisessa ja poistamisessa alhaisissa tai kohtalaisissa lämpötiloissa ja joka on valittu ryhmästä, jonka muodostavat: 20 (a) nukleiinihappomolekyyli, joka koodaa polypeptidiä, jolla on seriiniproteaasiaktiivisuutta ja joka käsittää sekvenssissä nro 10 esitetyn aminohapposekvenssin tai sen variantin, jolla on samankaltaisia ominaisuuksia; ^ (b) nukleiinihappomolekyyli, joka käsittää sekvenssissä nro 9 kuvatun o ^ 25 polynukleotidisekvenssin; ° (c) nukleiinihappomolekyyli, joka käsittää sekvenssissä nro 5 kuvatun ^ polynukleotidisekvenssin koodaavan sekvenssin, joka sisältyy DSM 22635 :een; (d) nukleiinihappomolekyyli, jonka polynukleotidisekvenssi eroaa minkä tahansa kohdista (b)-(c) nukleiinihappomolekyylin polynukleotidisekvenssistä geneettisen S 30 koodin degeneraation vuoksi, o C\l 62
19. Patenttivaatimuksen 18 mukainen nukleiinihappomolekyyli, tunnettu siitä, että mainittua sieniperäistä seriiniproteaasientsyymiä voidaan käyttää pesuaineiden lisäaineena.
20. Rekombinanttinen ekspressiovektori, joka käsittää patenttivaatimuksen 18 mukaisen nukleotidisekvenssin, joka on toiminnallisesti liitetty säätelysekvensseihin, jotka kykenevät ohjaamaan mainittua seriiniproteaasia koodaavan geenin ilmentymistä soveltuvassa isännässä.
21. Isäntäsolu, joka käsittää patenttivaatimuksen 20 mukaisen rekombinanttisen ekspressiovektorin.
22. Patenttivaatimuksen 21 mukainen isäntäsolu, tunnettu siitä, että mainittu isäntä on mikrobi-isäntä. 15
23. Patenttivaatimuksen 21 tai 22 mukainen isäntäsolu, tunnettu siitä, että mainittu isäntä on rihmasieni.
24. Minkä tahansa patenttivaatimuksista 21-23 mukainen isäntäsolu, tunnettu siitä, 20 että isäntä kuuluu johonkin suvuista Trichoderma, Aspergillus, Fusarium, Humicola, Chrysosporium, Neurospora, Rhizopus, Penicillium ja Mortiriella.
25. Patenttivaatimuksen 24 mukainen isäntäsolu, tunnettu siitä, että mainittu isäntä on ^2 Trichoderma tai Aspergillus. 0 ™ 25 CO
° 26. Patenttivaatimuksen 25 mukainen isäntäsolu, tunnettu siitä, että mainittu isäntä on CU rp T. reesei. CC CL
27. Menetelmä sellaisen polypeptidin valmistamiseksi, jolla on g 30 seriiniproteaasiaktiivisuutta, mainitun menetelmän käsittäessä vaiheet minkä tahansa oj patenttivaatimuksista 21-26 mukaisen isäntäsolun viljelemiseksi ja polypeptidin talteen ottamiseksi. 63
28. Patenttivaatimuksen 18 mukaisen nukleiinihapposekvenssin koodaama polypeptidi, jolla on seriiniproteaasiaktiivisuutta ja joka on saatavissa patenttivaatimuksen 27 mukaisella menetelmällä.
29. Menetelmä entsyymivalmisteen aikaansaamiseksi, menetelmän käsittäessä vaiheet, joissa viljellään minkä tahansa patenttivaatimuksista 21-26 mukaista isäntäsolua ja joko otetaan polypeptidi talteen soluista tai erotetaan solut elatusaineesta ja kerätään supematantti.
30. Entsyymivalmiste, joka on saatavissa patenttivaatimuksen 29 mukaisella menetelmällä.
31. Entsyymivalmiste, joka käsittää minkä tahansa patenttivaatimuksista 1-10 mukaista scri ini protcaasientsyymiä. 15
32. Patenttivaatimuksen 30 tai 31 mukainen entsyymivalmiste, tunnettu siitä, että mainittu valmiste käsittää muita entsyymejä, jotka on valittu ryhmästä, johon sisältyvät proteaasi, amylaasi, sellulaasi, lipaasi, ksylanaasi, mannanaasi, kutinaasi, pektinaasi tai oksidaasi mediaattorin kanssa tai ilman. 20
33. Minkä tahansa patenttivaatimuksista 30-32 mukainen entsyymivalmiste, tunnettu siitä, että mainittu valmiste käsittää soveltuvan lisäaineen, joka on valittu ryhmästä, johon sisältyvät stabilointiaineet, puskurit, pinta-aktiiviset aineet, vedenpehmentäjät, ^ valkaisuaineet, mediaattorit, korroosionestoaineet, uudelleen tarttumista estävät aineet, o ^ 25 syövyttävät aineet, hankausaineet, optiset kirkasteet, väriaineet, pigmentit ja ^ säilöntäaineet. CM X CC
34. Minkä tahansa patenttivaatimuksista 30-33 mukainen entsyymivalmiste, tunnettu siitä, että mainittu entsyymivalmiste on nesteen, jauheen tai rakeiden muodossa. 10 ,n cd 30 o o
^ 35. Minkä tahansa patenttivaatimuksista 1-17 mukaisen seriiniprotcaasicntsyymin tai minkä tahansa patenttivaatimuksista 30-34 mukaisen entsyymivalmisteen käyttö pesuaineissa, kuitujen käsittelyssä, villan käsittelyssä, karvojen käsittelyssä, nahan 64 käsittelyssä, elintarvikkeiden tai rehun käsittelyssä tai missä tahansa sovelluksissa, joihin liittyy proteiinipitoisen materiaalin muuntelu, hajotus tai poistaminen.
36. Minkä tahansa patenttivaatimuksista 1-17 mukaisen seriiniproteaasientsyymin tai 5 minkä tahansa patenttivaatimuksista 30-34 mukaisen entsyymivalmisteen käyttö pesuaineen lisäaineena.
37. Patenttivaatimuksen 36 mukainen käyttö nestemäisissä pesuaineissa.
38. Patenttivaatimuksen 3 6 mukainen käyttö j auhemaisissa pesuaineissa. δ (M i co 0 δ X en Q_ 01 r- r- m o> o o (M 65
FI20095779A 2009-07-08 2009-07-08 Sieniperäinen proteaasi ja sen käyttö FI121851B (fi)

Priority Applications (7)

Application Number Priority Date Filing Date Title
FI20095779A FI121851B (fi) 2009-07-08 2009-07-08 Sieniperäinen proteaasi ja sen käyttö
US12/803,456 US8362222B2 (en) 2009-07-08 2010-06-28 Fungal protease and use thereof
CN201080039991.4A CN102625810B (zh) 2009-07-08 2010-07-08 真菌蛋白酶及其用途
EP10729893.7A EP2451829B1 (en) 2009-07-08 2010-07-08 A fungal protease and use thereof
JP2012518989A JP6054741B2 (ja) 2009-07-08 2010-07-08 真菌プロテアーゼおよびその使用
DK10729893.7T DK2451829T3 (en) 2009-07-08 2010-07-08 Fungal protease and use thereof
PCT/EP2010/059787 WO2011003968A1 (en) 2009-07-08 2010-07-08 A fungal protease and use thereof

Applications Claiming Priority (2)

Application Number Priority Date Filing Date Title
FI20095779 2009-07-08
FI20095779A FI121851B (fi) 2009-07-08 2009-07-08 Sieniperäinen proteaasi ja sen käyttö

Publications (3)

Publication Number Publication Date
FI20095779A0 FI20095779A0 (fi) 2009-07-08
FI20095779A FI20095779A (fi) 2011-01-09
FI121851B true FI121851B (fi) 2011-05-13

Family

ID=40935860

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
FI20095779A FI121851B (fi) 2009-07-08 2009-07-08 Sieniperäinen proteaasi ja sen käyttö

Country Status (7)

Country Link
US (1) US8362222B2 (fi)
EP (1) EP2451829B1 (fi)
JP (1) JP6054741B2 (fi)
CN (1) CN102625810B (fi)
DK (1) DK2451829T3 (fi)
FI (1) FI121851B (fi)
WO (1) WO2011003968A1 (fi)

Families Citing this family (28)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
FI121712B (fi) 2009-04-30 2011-03-15 Ab Enzymes Oy Uusi sieniperäinen proteaasi ja sen käyttö
FI121711B (fi) * 2009-04-30 2011-03-15 Ab Enzymes Oy Sieniperäinen seriiniproteaasi ja sen käyttö
FI121851B (fi) 2009-07-08 2011-05-13 Ab Enzymes Oy Sieniperäinen proteaasi ja sen käyttö
FI123942B (fi) 2010-10-29 2013-12-31 Ab Enzymes Oy Sieniperäisen seriiniproteaasin variantteja
CN102181419A (zh) * 2011-01-18 2011-09-14 湖南尤特尔生化有限公司 一种里氏木霉蛋白酶及其制备方法和应用
FI123425B (fi) 2011-03-31 2013-04-30 Ab Enzymes Oy Proteaasientsyymi ja sen käytöt
CN104153200A (zh) * 2014-08-26 2014-11-19 湖州圣绒服饰有限公司 一种酶法羊绒纤维防毡缩方法
WO2017139659A1 (en) 2016-02-11 2017-08-17 Trustees Of Boston University Rothia subtilisins, s8a family proteases, as therapeutic enzymes for application in gluten-intolerance disorders
CN108588060B (zh) * 2017-03-07 2020-12-01 武汉康复得生物科技股份有限公司 一种用丝状真菌宿主细胞表达的重组草酸脱羧酶
WO2019006252A1 (en) 2017-06-30 2019-01-03 Diversey, Inc. MEMBRANE CLEANING SOLUTION AND METHOD OF CLEANING ACCELERATED MEMBRANE USING THE SAME
US20200248159A1 (en) * 2017-10-04 2020-08-06 Novozymes A/S Polypeptides having protease activity and polynucleotides encoding same
US20210363470A1 (en) 2018-06-19 2021-11-25 Danisco Us Inc Subtilisin variants
US20210214703A1 (en) 2018-06-19 2021-07-15 Danisco Us Inc Subtilisin variants
EP3636735B1 (en) * 2018-10-12 2024-03-27 AB Enzymes Oy Protease enzyme variants and uses thereof
US20220220419A1 (en) 2019-05-24 2022-07-14 Danisco Us Inc Subtilisin variants and methods of use
EP3980517A1 (en) 2019-06-06 2022-04-13 Danisco US Inc. Methods and compositions for cleaning
CN116323935A (zh) 2020-08-27 2023-06-23 丹尼斯科美国公司 用于清洁的酶和酶组合物
US20240117275A1 (en) 2021-01-29 2024-04-11 Danisco Us Inc. Compositions for cleaning and methods related thereto
CN117616120A (zh) 2021-06-30 2024-02-27 丹尼斯科美国公司 变体脂肪酶及其用途
CN115701464A (zh) * 2021-08-02 2023-02-10 江苏金太阳纺织科技股份有限公司 超疏水整理剂及其制备方法与应用
CN117916354A (zh) 2021-09-03 2024-04-19 丹尼斯科美国公司 用于清洁的衣物洗涤组合物
WO2023114939A2 (en) 2021-12-16 2023-06-22 Danisco Us Inc. Subtilisin variants and methods of use
WO2023114932A2 (en) 2021-12-16 2023-06-22 Danisco Us Inc. Subtilisin variants and methods of use
WO2023114936A2 (en) 2021-12-16 2023-06-22 Danisco Us Inc. Subtilisin variants and methods of use
WO2023168234A1 (en) 2022-03-01 2023-09-07 Danisco Us Inc. Enzymes and enzyme compositions for cleaning
WO2023250301A1 (en) 2022-06-21 2023-12-28 Danisco Us Inc. Methods and compositions for cleaning comprising a polypeptide having thermolysin activity
WO2024050346A1 (en) 2022-09-02 2024-03-07 Danisco Us Inc. Detergent compositions and methods related thereto
WO2024050343A1 (en) 2022-09-02 2024-03-07 Danisco Us Inc. Subtilisin variants and methods related thereto

Family Cites Families (43)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US3652399A (en) 1969-04-30 1972-03-28 Takeda Chemical Industries Ltd Alkali protease
GB8610600D0 (en) 1986-04-30 1986-06-04 Novo Industri As Transformation of trichoderma
DK563986A (da) 1986-11-25 1988-06-17 Novo Industri As Fremstilling af en lav-temperatur-aktiv protease
DK564086A (da) 1986-11-25 1988-06-17 Novo Industri As Enzymatisk detergent-additiv
DE3855375T2 (de) 1987-04-03 1996-11-14 Amgen Inc Proteolytische enzyme
DK571587D0 (da) 1987-11-02 1987-11-02 Novo Industri As Enzymatisk detergentsammensaetning
US5288627A (en) 1988-01-07 1994-02-22 Novo Nordisk A/S Endoprotease from Fusarium oxysporumDSM 2672 for use in detergents
EP0394352B1 (en) 1988-01-07 1992-03-11 Novo Nordisk A/S Enzymatic detergent
JPH0241398A (ja) 1988-07-20 1990-02-09 Novo Ind As 安定化酵素液体洗剤組成物
DK316989D0 (da) 1989-06-26 1989-06-26 Novo Nordisk As Enzymer
DK204290D0 (da) 1990-08-24 1990-08-24 Novo Nordisk As Enzymatisk detergentkomposition og fremgangsmaade til enzymstabilisering
DK223790D0 (da) 1990-09-18 1990-09-18 Novo Nordisk As Proteaseholdig detergentkomposition
DK73791D0 (da) 1991-04-22 1991-04-22 Novo Nordisk As Detergentadditiv
CA2069147A1 (en) 1991-05-22 1992-11-23 Kazuaki Kitano Dna and its use
US5962765A (en) 1991-08-08 1999-10-05 Boyce Thompson Institute For Plant Research, Inc. Molecular cloning of a complimentary DNA sequence encoding a cuticle degrading protease produced by entomopathogenic fungi
DK52393D0 (fi) 1993-05-05 1993-05-05 Novo Nordisk As
EP0763115B1 (en) 1994-06-03 2000-09-06 Novo Nordisk Biotech, Inc. Purified scytalidium laccases and nucleic acids encoding same
US5770418A (en) 1994-06-24 1998-06-23 Novo Nordisk A/S Purified polyporus laccases and nucleic acids encoding same
IL116275A0 (en) 1994-12-08 1996-03-31 Invest Y De Estudios Avanzados Methods for obtaining strains of trichoderma spp. and strains obtained thereby
US6682924B1 (en) 1995-05-05 2004-01-27 Novozymes A/S Protease variants and compositions
WO1997002753A1 (en) 1995-07-12 1997-01-30 Novo Nordisk A/S Cleaning-in-place with a solution containing a protease and a lipase
US6008029A (en) 1995-08-25 1999-12-28 Novo Nordisk Biotech Inc. Purified coprinus laccases and nucleic acids encoding the same
ES2230594T3 (es) 1996-01-29 2005-05-01 Novozymes A/S Proceso para eliminacion o decoloracion de la suciedad o manchas de tejido celulosico.
CN1136311C (zh) * 1996-11-04 2004-01-28 诺沃奇梅兹有限公司 枯草杆菌酶变异体和组合物
CA2301851C (en) 1997-08-29 2012-08-07 Novo Nordisk A/S Protease variants and compositions
ES2237159T3 (es) 1998-10-06 2005-07-16 Mark Aaron Emalfarb Sistema de transformacion en el campo de los hongos micoticos filamentosos en chrysosporium.
US6777218B1 (en) * 2000-03-14 2004-08-17 Novozymes A/S Subtilase enzymes having an improved wash performance on egg stains
ES2329874T3 (es) 2000-07-22 2009-12-02 Genencor International, Inc. Estabilizacion de enzimas.
ES2171136B1 (es) 2000-12-01 2003-10-16 Newbiotechnic Sa Enzima con actividad proteolitica construccion de adn que comprende una secuencia de adn que codifica dicha enzima y sus aplicaciones.
DE60330579D1 (de) * 2002-09-24 2010-01-28 Novozymes Inc Mikrobielle trypsinvarianten mit chymotrypsinaktivität und diese codierende nukleinsäuren
FR2852949B1 (fr) 2003-03-28 2008-08-29 Biovitis Procede de reduction de la matiere organique contenue dans des effluents agroalimentaires et industriels comportant une phase de biodigestion par des champignons filamenteux
EP1678296B1 (en) * 2003-10-23 2011-07-13 Novozymes A/S Protease with improved stability in detergents
EP1831362B1 (en) 2004-12-30 2011-10-26 Genencor International, Inc. Acid fungal proteases
WO2006101140A1 (ja) 2005-03-22 2006-09-28 Sodx Co., Ltd. 新規プロテアーゼ、該プロテアーゼを生産する微生物、及びこれらの利用
US20080009431A1 (en) 2006-06-05 2008-01-10 Jean-Pol Boutique Enzyme stabilization
EP2046951B1 (en) 2006-07-05 2011-10-26 Catalyst Biosciences, Inc. Protease screening methods and proteases identified thererby
WO2008116915A1 (en) 2007-03-27 2008-10-02 Novozymes A/S Stable enzyme solutions and method of manufacturing
JP2011508610A (ja) 2008-01-29 2011-03-17 ダニスコ・ユーエス・インク バチルス属とストレプトマイセス属の種におけるストレプトマイセススブチリシン阻害剤（ｓｓｉ）タンパク質の発現
EP2352831B1 (en) 2008-09-30 2015-03-25 Novozymes Inc. Methods for producing polypeptides in enzyme-deficient mutants of fusarium venenatum
FI121711B (fi) 2009-04-30 2011-03-15 Ab Enzymes Oy Sieniperäinen seriiniproteaasi ja sen käyttö
FI121712B (fi) 2009-04-30 2011-03-15 Ab Enzymes Oy Uusi sieniperäinen proteaasi ja sen käyttö
FI121851B (fi) 2009-07-08 2011-05-13 Ab Enzymes Oy Sieniperäinen proteaasi ja sen käyttö
FI123942B (fi) 2010-10-29 2013-12-31 Ab Enzymes Oy Sieniperäisen seriiniproteaasin variantteja

Also Published As

Publication number Publication date
EP2451829A1 (en) 2012-05-16
WO2011003968A1 (en) 2011-01-13
JP6054741B2 (ja) 2016-12-27
DK2451829T3 (en) 2016-02-29
CN102625810B (zh) 2015-04-01
US8362222B2 (en) 2013-01-29
US20110008870A1 (en) 2011-01-13
JP2014503171A (ja) 2014-02-13
FI20095779A0 (fi) 2009-07-08
EP2451829B1 (en) 2015-11-25
CN102625810A (zh) 2012-08-01
FI20095779A (fi) 2011-01-09

Similar Documents

Publication Publication Date Title
FI121851B (fi) Sieniperäinen proteaasi ja sen käyttö
EP2424993B1 (en) A fungal serine protease and use thereof
EP2424992B1 (en) A novel fungal protease and use thereof
US10221377B2 (en) Protease enzyme and uses thereof
EP2633041B1 (en) Variants of fungal serine protease

Legal Events

Date Code Title Description
FG Patent granted

Ref document number: 121851

Country of ref document: FI