BR112021006739A2 - processo para hidrólise enzimática de material de carboidrato e fermentação de açúcares - Google Patents

Abstract

PROCESSO PARA HIDRÓLISE ENZIMÁTICA DE MATERIAL DE CARBOIDRATO E FERMENTAÇÃO DE AÇÚCARES. A presente invenção refere-se a um processo para preparação de uma composição enzimática a partir de material celulósico.

Description

Relatório Descritivo da Patente de Invenção para "PRO- CESSO PARA HIDRÓLISE ENZIMÁTICA DE MATERIAL DE CAR- BOIDRATO E FERMENTAÇÃO DE AÇÚCARES". Campo

[001] A presente invenção refere-se a um processo para prepa- ração de uma composição enzimática. Antecedentes

[002] Material lignocelulósico é composto principalmente de celu- lose, hemicelulose e lignina e fornece uma plataforma atraente para geração de fontes de energia alternativas aos combustíveis fósseis. O material está disponível em grandes quantidades e pode ser converti- do em produtos valiosos, por exemplo, açúcares ou biocombustíveis, como bioetanol.

[003] A produção de produtos de fermentação a partir de material lignocelulósico é conhecida na técnica e geralmente inclui as etapas de pré-tratamento, hidrólise, fermentação e, opcionalmente, recupera- ção dos produtos de fermentação.

[004] Normalmente, os açúcares produzidos são convertidos em produtos de fermentação valiosos, como etanol, por micro-organismos como levedura. A fermentação ocorre em uma etapa de processo se- parada, de preferência anaeróbica, no mesmo tanque ou em um tan- que diferente.

[005] Em geral, o custo de produção da enzima é o principal fator de custo no processo geral de produção de produtos de fermentação a partir de material lignocelulósico. Até agora, redução dos custos de produção de enzima é alcançada pela aplicação de produtos enzimáti- cos de uma única fonte ou de múltiplas fontes microbianas (ver WO 2008/008793) com atividade hidrolítica(específica) mais ampla e/ou superior. Isso leva a uma menor necessidade de enzima, taxas de conversão mais rápidas e/ou maiores rendimentos de conversão e,

portanto, a menores custos gerais de produção.

[006] Além da otimização de enzimas, a otimização do projeto do processo é uma ferramenta crucial para reduzir os custos gerais da produção de produtos de açúcar e produtos de fermentação. Por exemplo, perda de açúcar por meio de produtos de degradação do açúcar aumenta com a diminuição do rendimento. Como os produtos da degradação do açúcar podem inibir a fermentação, o projeto do processo deve ser otimizado para diminuir a quantidade desses produ- tos de degradação do açúcar.

[007] Por razões econômicas, é, portanto, desejável, incluir confi- gurações de processo novas e inovadoras destinadas a reduzir os cus- tos globais de produção no processo envolvendo pré-tratamento, hi- drólise e fermentação de material de carboidrato. Sumário

[008] Um objetivo do pedido é fornecer um processo melhorado para preparação de uma composição enzimática. O processo é melho- rado usando condições específicas de hidrólise. Descrição detalhada

[009] Ao longo do presente pedido e das reivindicações anexas, as palavras "compreendem" e "incluem" e variações como "compreende", "compreendendo", "inclui" e "incluindo" devem ser interpretadas inclusiva- mente. Ou seja, essas palavras se destinam a transmitir a possível inclusão de outros elementos ou inteiros não especificamente citados, onde o contex- to permitir. Os artigos "um" e "uma" são usados neste documento para se referir a um ou mais de um (ou seja, a um ou pelo menos um) do objeto gramatical do artigo. A título de exemplo, "um elemento" pode significar um elemento ou mais de um elemento.

[0010] É aqui descrito um processo para preparação de uma com- posição enzimática, compreendendo as etapas de (a) pré-tratamento do material celulósico, (b) hidrólise enzimática do material celulósico pré-tratado para obter um hidrolisado, (c) fermentação do hidrolisado para produzir a composição enzimática, e (d) opcionalmente, recupe- ração da composição enzimática, em que o pH do material celulósico pré-tratado é controlado antes e/ou durante a etapa (b) pela adição de um hidróxido de metal alcalino e/ou um hidróxido de metal alcalino- terroso ao material celulósico pré-tratado.

[0011] É aqui descrito um processo para preparação de uma com- posição enzimática a partir de material celulósico, compreendendo as etapas de (a) pré-tratamento do material celulósico, (b) hidrólise enzi- mática do material celulósico pré-tratado para obter um hidrolisado, (c) fermentação do hidrolisado para produzir a composição enzimática, e (d) opcionalmente, recuperação da composição enzimática, em que o pH do material celulósico pré-tratado é controlado antes e/ou durante a etapa (b) pela adição de um hidróxido de um metal alcalino e/ou um hidróxido de um metal alcalino-terroso ao material celulósico pré- tratado.

[0012] Em uma modalidade preferida, o pH do material celulósico pré-tratado é controlado durante a etapa (b) adicionando um hidróxido de um metal alcalino e/ou um hidróxido de um metal alcalino-terroso ao material celulósico pré-tratado. Em vez do termo "hidrolisado", o termo "produto de açúcar", "um ou mais açúcares" ou "açúcar" pode ser usado.

[0013] É aqui descrito também um processo para a preparação de uma composição enzimática, compreendendo as etapas de (a) pré- tratamento do material celulósico, (b) hidrólise enzimática do material celulósico pré-tratado para obter um hidrolisado, (c) fermentação do hidrolisado para produzir a composição enzimática e (d) opcionalmen- te, [ ] a composição enzimática [sic], em que o pH do material celuló- sico pré-tratado é controlado antes e/ou durante a etapa (b) pela adi- ção de uma base forte ao material celulósico pré-tratado. Em uma mo- dalidade preferida, o pH do material celulósico pré-tratado é controlado durante a etapa (b) adicionando uma base forte ao material celulósico pré-tratado. A etapa de hidrólise enzimática (b) pode ser feita com qualquer uma das composições enzimáticas, conforme descrito neste documento

[0014] Conforme usado neste documento, "o pH do material celu- lósico pré-tratado é controlado antes da etapa (b)" significa que o pH é controlado após a etapa de pré-tratamento ter terminado e antes que a etapa de hidrólise tenha começado. Em outras palavras, o hidróxido de um metal alcalino e/ou um hidróxido de um metal alcalino-terroso ou a base forte é (são) adicionado(s) após a etapa de pré-tratamento ter terminado e antes da etapa de hidrólise ter começado.

[0015] Em uma modalidade preferida, o hidrolisado obtido é con- centrado antes da fermentação. A concentração pode ser feita por mé- todos padrão, como evaporação, centrifugação, filtração, sedimenta- ção ou qualquer combinação dos mesmos.

[0016] Em uma modalidade preferida, o hidrolisado obtido é esteri- lizado antes da fermentação. A esterilização pode ser feita por méto- dos padrão, como tratamento térmico, filtração estéril ou qualquer combinação dos mesmos.

[0017] O hidrolisado obtido pode ser primeiro esterilizado e depois concentrado, mas, de preferência, o hidrolisado obtido é concentrado e, em seguida, o hidrolisado concentrado é esterilizado.

[0018] Em uma modalidade, o hidrolisado obtido pode ser subme- tido a uma etapa de preservação. Esta etapa pode ser realizada antes, durante ou após a etapa de concentração e/ou antes, durante ou após a etapa de esterilização.

[0019] Em uma modalidade, a etapa de pré-tratamento e/ou a eta- pa de hidrólise são realizadas em um reator. Em uma modalidade, a etapa de pré-tratamento e/ou a etapa de hidrólise também pode(m) ser realizada(s) em dois, três, quatro, cinco, seis, sete, oito, nove, dez ou até mais reatores. Portanto, o termo "reator" não se limita a um único reator, mas pode significar vários reatores. Em uma modalidade, a etapa de pré-tratamento e a etapa de hidrólise são realizadas em rea- tores diferentes.

[0020] Nos processos aqui descritos, o material celulósico pré- tratado pode ser adicionado ao reator no qual a etapa de hidrólise ocorre. Isso pode ser feito em batelada, batelada alimentada ou conti- nuamente. Em uma modalidade, uma composição enzimática é adici- onada ao reator no qual a etapa de hidrólise ocorre. Isso pode ser feito em batelada, batelada alimentada ou continuamente. A composição enzimática pode ser uma composição aquosa.

[0021] Em uma modalidade, a etapa de hidrólise compreende uma etapa de liquefação e uma etapa de sacarificação. Em uma modalida- de, a etapa de liquefação e a etapa de sacarificação podem ser reali- zadas em um único reator, mas cada uma também pode ser realizada em vários reatores. Em uma modalidade, a etapa de liquefação e a etapa de sacarificação são feitas em reatores diferentes.

[0022] Em uma modalidade, o pré-tratamento é feito em um reator com um volume de 10 - 500 m3, de preferência 30 - 200 m3, mais pre- ferivelmente de 100 - 150 m3. No caso de múltiplos reatores serem usados no pré-tratamento dos processos aqui descritos, eles podem ter o mesmo volume, mas também podem ter volumes diferentes.

[0023] Em uma modalidade, o reator de pré-tratamento usado nos processos descritos neste documento tem uma proporção de altura para diâmetro de 3:1 a 12:1.

[0024] Em uma modalidade, a etapa de hidrólise é realizada em um reator com um volume de pelo menos 10 m3. Em uma modalidade, a etapa de hidrólise é realizada em um reator com um volume de 10- 5000 m3, de preferência de 50-5000 m3. No caso de serem utilizados vários reatores na etapa de hidrólise, eles podem ter o mesmo volume,

mas também podem ter um volume diferente.

[0025] Em uma modalidade, o reator no qual a etapa de hidrólise é realizada tem uma razão de altura para diâmetro de 0,1:1 a 10:1.

[0026] Em uma modalidade, oxigênio é adicionado ao material ce- lulósico pré-tratado durante a etapa de hidrólise. Em uma modalidade, oxigênio é adicionado durante pelo menos uma parte da etapa de hi- drólise. Oxigênio pode ser adicionado de forma contínua ou descontí- nua durante a etapa de hidrólise. Em uma modalidade, oxigênio é adi- cionado uma ou mais vezes durante os processos descritos neste do- cumento. Em uma modalidade, oxigênio é adicionado aos reatores usados na etapa de hidrólise.

[0027] Oxigênio pode ser adicionado de várias formas. Por exem- plo, oxigênio pode ser adicionado como gás oxigênio, gás enriquecido com oxigênio, como ar enriquecido com oxigênio, ou ar. Oxigênio tam- bém pode ser adicionado por meio da geração de oxigênio in situ

[0028] Exemplos de como adicionar oxigênio incluem, mas não estão limitados a adição de oxigênio por meio de borbulhamento, so- pro, eletrólise, adição química de oxigênio, enchimento de um reator usado na etapa de hidrólise a partir do topo (mergulhando o hidrolisa- do liquefeito no reator e consequentemente, introduzindo oxigênio no hidrolisado) e adição de oxigênio ao espaço superior de um reator. Quando oxigênio é adicionado ao espaço superior do reator, oxigênio suficiente necessário para a reação de hidrólise pode ser fornecido. Em geral, a quantidade de oxigênio adicionada ao reator pode ser con- trolada e/ou variada.

[0029] Restrição do oxigênio fornecido é possível adicionando oxi- gênio apenas durante parte do tempo de hidrólise no reator. Outra op- ção é adicionar oxigênio em baixa concentração, por exemplo, usando uma mistura de ar e ar reciclado (ar que sai do reator) ou "diluindo" o ar com um gás inerte. Aumento da quantidade de oxigênio adicionada pode ser obtido pela adição de oxigênio durante períodos mais longos do tempo de hidrólise, adicionando o oxigênio em uma concentração mais alta ou adicionando mais ar. Outra forma de controlar a concen- tração de oxigênio é adicionar um consumidor de oxigênio e/ou um gerador de oxigênio. Oxigênio pode ser introduzido no material de car- boidrato pré-tratado presente no reator. Ele também pode ser introdu- zido no espaço superior do reator. Oxigênio pode ser injetado no mate- rial celulósico pré-tratado presente no reator. Ele também pode ser so- prado no espaço superior do reator.

[0030] Em uma modalidade, oxigênio é adicionado ao reator usado na etapa de hidrólise antes e/ou durante e/ou após a adição do mate- rial celulósico pré-tratado ao reator. O oxigênio pode ser introduzido junto com o material celulósico pré-tratado que entra no reator. O oxi- gênio pode ser introduzido na corrente de material que entrará no rea- tor ou com parte do conteúdo do reator que passa por um circuito ex- terno do reator. De preferência, oxigênio é adicionado quando o mate- rial celulósico pré-tratado está presente no reator.

[0031] Em uma modalidade, oxigênio é adicionado durante a etapa de hidrólise para manter o oxigênio dissolvido em 11% a 80% do nível de saturação. Em uma modalidade, oxigênio é adicionado durante a etapa de hidrólise para manter o oxigênio dissolvido em 20% a 60% do nível de saturação.

[0032] Em uma modalidade, o hidróxido de um metal alcalino e/ou o hidróxido de um metal alcalino-terroso são selecionados no grupo que consiste em hidróxido de alumínio, hidróxido de bário, hidróxido de cálcio, hidróxido de césio, hidróxido de potássio, hidróxido de lítio, hi- dróxido de magnésio, hidróxido de sódio, hidróxido de rubídio, hidróxi- do de estrôncio e qualquer combinação dos mesmos. Em uma modali- dade preferida, o hidróxido de um metal alcalino e/ou o hidróxido de um metal alcalino-terroso são selecionados no grupo que consiste em hidróxido de cálcio, hidróxido de sódio e hidróxido de potássio.

[0033] Em uma modalidade, a base forte é selecionada no grupo que consiste em hidróxido de bário, hidróxido de cálcio, hidróxido de césio, hidróxido de potássio, hidróxido de lítio, hidróxido de magnésio, hidróxido de sódio, hidróxido de rubídio, hidróxido de estrôncio e qual- quer combinação dos mesmos. Em uma modalidade preferida, a base forte é selecionada no grupo que consiste em hidróxido de cálcio, hi- dróxido de sódio e hidróxido de potássio.

[0034] Em uma modalidade, o pH do material celulósico pré- tratado é controlado antes e/ou durante a etapa (b) (isto é, a etapa de hidrólise) de modo a ficar entre 3,0 e 6,5. De preferência, o pH é de 3,5 a 5,5, mais preferivelmente é de 4,0 a 5,0. De preferência, o pH é controlado durante a etapa (b).

[0035] Em uma modalidade, o pH é medido antes e/ou durante a etapa (b). De preferência, o pH é controlado durante a etapa (b) e quando o pH está fora da faixa preferida, o hidróxido de um metal alca- lino e/ou o hidróxido de um metal alcalino-terroso ou base forte é (são) adicionado(s) ao material celulósico pré-tratado.

[0036] Em uma modalidade, a composição de enzima é de um fungo, de preferência um fungo filamentoso. Em uma modalidade, a composição enzimática é produzida por um fungo, de preferência um fungo filamentoso. Em uma modalidade, as enzimas na composição enzimática são derivadas de um fungo, de preferência um fungo fila- mentoso. Em uma modalidade, a composição enzimática compreende uma enzima fúngica, de preferência uma enzima fúngica filamentosa. Em uma modalidade, a etapa (c) dos processos aqui descritos com- preende fermentação do hidrolisado por um fungo para produzir a composição enzimática.

[0037] "Fungos filamentosos" incluem todas as formas filamento- sas da subdivisão Eumycota e Oomycota (conforme definido por Haw-

ksworth et al., In, Ainsworth and Bisby's Dictionary of The Fungi (Dicio- nário dos Fungos de Ainsworth e Bisby), 8ª edição, 1995, CAB Interna- tional, University Press, Cambridge, UK). Fungos filamentosos inclu- em, mas não estão limitados a Acremonium, Agaricus, Aspergillus, Au- reobasidium, Beauvaria, Cephalosporium, Ceriporiopsis, Chaetomium paecilomyces, Chrysosporium, Claviceps, Cochiobolus, Coprinus, Cryptococcus, Cyathus, Emericella, Endothia, Endothia mucor, Filiba- sidium, Fusarium, Geosmithia, Gilocladium, Humicola, Magnaporthe, Mucor, Myceliophthora, Myrothecium, Neocallimastix, Neurospora, Pa- ecilomyces, Penicillium, Piromyces, Panerochaete, Pleurotus, Podos- pora, Pyricularia, Rasamsonia, Rhizomucor, Rhizopus, Scylatidium, Schizophyllum, Stagonospora, Talaromyces, Thermoascus, Ther- momyces, Thielavia, Tolypocladium, Trametes pleurotus, Trichoderma e Trichophyton. Em uma modalidade preferida, o fungo é Rasamsonia, sendo Rasamsonia emersonii o mais preferido. Portanto, os processos aqui descritos são vantajosamente aplicados em combinação com en- zimas derivadas de um microrganismo do gênero Rasamsonia ou as enzimas usadas nos processos aqui descritos incluem uma enzima de Rasamsonia.

[0038] Várias cepas de fungos filamentosos são facilmente aces- síveis ao público em uma série de coleções de cultura, como a Ameri- can Type Culture Collection (ATCC), Deutsche Sammlung von Mikro- organismen und Zellkulturen (Coleção alemã de microrganismos e cul- turas celulares) GmbH (DSM), Centraalbureau Voor Schimmelcultures (Escritório Central para cultura de fungos) (CBS), e Agricultural Rese- arch Service Patent Culture Collection, Northern Regional Research Center (NRRL).

[0039] De preferência, os processos aqui descritos são realizados com enzimas termoestáveis. Enzima "termoestável", conforme usado neste documento, significa que a enzima tem uma temperatura ótima de 50ºC ou superior, 60ºC ou superior, 70ºC ou superior, 75ºC ou su- perior, 80ºC ou superior, ou mesmo 85ºC ou superior. Podem, por exemplo, ser isoladas de microrganismos termofílicos ou podem ser concebidas por um especialista e sintetizadas artificialmente. Em uma modalidade, os polinucleotídeos que codificam as enzimas termoestá- veis podem ser isolados ou obtidos de fungos filamentosos termofílicos ou termotolerantes ou isolados de fungos não termofílicos ou não ter- motolerantes, mas são considerados termoestáveis. Por "fungo termo- fílico" entende-se um fungo que cresce a uma temperatura de 50 ° C ou superior. Por fungo "termotolerante" entende-se um fungo que cresce a uma temperatura de 45°C ou superior, tendo um máximo pró- ximo de 50°C.

[0040] Células fúngicas termofílicas ou termotolerantes adequadas podem ser células Humicola, Rhizomucor, Myceliophthora, Rasamso- nia, Talaromyces, Thermomyces, Thermoascus ou Thielavia, de prefe- rência células Rasamsonia. Fungos termofílicos ou termotolerantes preferidos são Humicola grisea var. thermoidea, Humicola lanuginosa, Myceliophthora thermophila, Papulaspora thermophilia, Rasamsonia byssochlamydoides, Rasamsonia emersonii, Rasamsonia argillacea, Rasamsonia eburnean, Rasamsonia brevistipitata, Rasamsonia cylin- drospora, Rhizomucor pusillus, Rhizomucor miehei, Talaromyces bacil- lisporus, Talaromyces leycettanus, Talaromyces thermophilus, Ther- momyces lenuginosus, Thermoascus crustaceus, Thermoascus ther- mophilus Thermoascus aurantiacus e Thielavia terrestris.

[0041] Rasamsonia é um novo gênero que compreende espécies termotolerantes e termofílicas de Talaromyces e Geosmithia. Com ba- se em dados fenotípicos, fisiológicos e moleculares, as espécies Tala- romyces emersonii, Talaromyces byssochlamydoides, Talaromyces eburneus, Geosmithia argillacea e Geosmithia cylindrospora foram transferidas para o gênero Rasamsonia. nov. Talaromyces emersonii,

Penicillium geosmithia emersonii e Rasamsonia emersonii são usados aqui indistintamente.

[0042] Nos processos aqui descritos, são utilizadas composições enzimáticas. Em uma modalidade, as composições são estáveis. "Composições enzimáticas estáveis", tal como aqui utilizadas, significa que as composições de enzimas retêm a atividade após 30 horas de tempo de reação de hidrólise, de preferência pelo menos 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80% 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ou 100% de sua atividade inicial após 30 horas de tempo de reação de hidrólise. Em uma modalidade, a composição en- zimática retém a atividade após 40, 50, 60, 70, 80, 90 100, 150, 200, 250, 300, 350, 400, 450, 500 horas de tempo de reação de hidrólise.

[0043] As enzimas podem ser preparadas por fermentação de um substrato adequado com um microrganismo adequado, por exemplo, Rasamsonia emersonii ou Aspergillus niger, em que as enzimas são produzidas pelo microrganismo. O microrganismo pode ser alterado para melhorar ou produzir as enzimas. Por exemplo, o microrganismo pode ser mutado por procedimentos clássicos de melhoria de cepas ou por técnicas de DNA recombinante. Assim, os microrganismos aqui mencionados podem ser usados como tal para produzir as enzimas ou podem ser alterados para aumentar a produção ou para produzir en- zimas alteradas que podem incluir enzimas heterólogas, por exemplo, celulases, ou seja, enzimas que não são produzidas originalmente por esse microrganismo. De preferência, um fungo, mais preferivelmente um fungo filamentoso é usado para produzir as enzimas. Vantajosa- mente, é usado um microrganismo termofílico ou termotolerante. Opci- onalmente, é usado um substrato que induz a expressão das enzimas pelo microrganismo produtor de enzimas.

[0044] As enzimas são usadas para hidrolisar o material celulósico pré-tratado (liberar açúcares do material celulósico que contém polis-

sacarídeos). Materiais celulósicos, conforme aqui utilizados, compre- endem polissacarídeos. Os polissacarídeos podem ser celuloses (glu- canos) e hemiceluloses (xilanos, heteroxilanos e xiloglucanos). Além disso, alguma hemicelulose pode estar presente como glucomananas, por exemplo, em material de carboidrato derivado de madeira. A hidró- lise enzimática desses polissacarídeos em açúcares solúveis, incluin- do monômeros e multímeros, por exemplo, glicose, celobiose, xilose, arabinose, galactose, frutose, manose, ramnose, ribose, ácido galactu- rônico, ácido glucurônico e outras hexoses e pentoses ocorre sob a ação de diferentes enzimas agindo em conjunto. Um produto de açú- car compreende açúcares solúveis, incluindo monômeros e multíme- ros. Em uma modalidade, o produto de açúcar compreende glicose, galactose e arabinose. Exemplos de outros açúcares são celobiose, xilose, arabinose, galactose, frutose, manose, ramnose, ribose, ácido galacturônico, ácido glicurônico e outras hexoses e pentoses. O produ- to de açúcar pode ser usado como tal ou pode ser posteriormente pro- cessado, por exemplo, recuperado e/ou purificado.

[0045] Além disso, materiais celulósicos podem compreender pec- tinas e outras substâncias pécticas, como arabinanos, que podem constituir uma proporção considerável da massa seca de paredes ce- lulares tipicamente de tecidos vegetais não lenhosos (cerca de um quarto a metade da massa seca pode ser pectinas). Além disso, o ma- terial celulósico pode compreender lignina.

[0046] Enzimas que podem ser utilizadas nos processos aqui des- critos são descritas em maiores detalhes abaixo.

[0047] Monoxigenases de polissacarídeos líticos, endoglucanases (EG) e exo-celobio-hidrolases (CBH) catalisam a hidrólise de celulose insolúvel em produtos como celoligossacarídeos (celobiose como pro- duto principal), enquanto β-glucosidases (BG) convertem os oligossa- carídeos, principalmente celobiose em glicose.

[0048] Xilanases juntamente com outras enzimas acessórias, por exemplo α-L-arabinofuranosidases, feruloíla e acetilxilano esterases, glucuronidases e β-xilosidases catalisam a hidrólise de hemicelulose.

[0049] Uma composição de enzima para uso nos processos des- critos neste documento pode compreender pelo menos duas ativida- des, embora tipicamente uma composição compreenda mais de duas atividades, por exemplo, três, quatro, cinco, seis, sete, oito, nove ou até mais atividades. Normalmente, uma composição de enzima para uso nos processos como aqui descritos compreende pelo menos duas celulases. As pelo menos duas celulases podem conter as mesmas atividades ou atividades diferentes. A composição enzimática para uso nos processos descritos neste documento também pode compreender pelo menos uma enzima diferente de uma celulase. De preferência, a pelo menos uma outra enzima tem uma atividade enzimática auxiliar, isto é, uma atividade adicional que, direta ou indiretamente, leva à de- gradação da lignocelulose. Exemplos dessas atividades auxiliares são mencionados aqui e incluem, mas não estão limitados a hemicelula- ses.

[0050] Uma composição de enzima para uso nos processos aqui descritos compreende pelo menos uma monoxigenase lítica de polis- sacarídeo (lytic polysaccharide monooxygenase - LPMO), uma endo- glucanase (EG), uma celobio-hidrolase (CBH), uma endoxilanase (EX), uma beta-xilosidase (BX) e uma beta-glucosidase (BG). Uma compo- sição enzimática pode compreender mais de uma atividade enzimática por classe de atividade. Por exemplo, uma composição pode compre- ender duas endoglucanases, por exemplo, uma endoglucanase com atividade de endo-1,3 (1,4) -β glucanase e uma endoglucanase com atividade de endo-β-1,4-glucanase.

[0051] Uma composição para uso nos processos descritos neste documento pode ser derivada de um fungo, como um fungo filamento-

so, como Rasamsonia, como Rasamsonia emersonii. Em uma modali- dade, pelo menos uma das enzimas pode ser derivada de Rasamsonia emersonii. Se necessário, a enzima pode ser suplementada com en- zimas adicionais de outras fontes. Essas enzimas adicionais podem ser derivadas de fontes clássicas e/ou produzidas por organismos ge- neticamente modificados.

[0052] Além disso, as enzimas nas composições de enzimas para uso nos processos descritos neste documento podem ser capazes de funcionar em pH baixo. Para os fins desta invenção, baixo pH indica um pH de 5,5 ou inferior, 5 ou inferior, 4,9 ou inferior, 4,8 ou inferior, 4,7 ou inferior, 4,6 ou inferior, 4,5 ou inferior, 4,4 ou inferior, 4,3 ou in- ferior, 4,2 ou inferior, 4,1 ou inferior, 4,0 ou inferior 3,9 ou inferior, 3,8 ou inferior, 3,7 ou inferior, 3,6 ou inferior, 3,5 ou inferior.

[0053] As composições enzimáticas para uso nos processos aqui descritos podem compreender uma celulase e/ou uma hemicelulase e/ou uma pectinase de Rasamsonia. Podem incluir também uma celu- lase e/ou uma hemicelulase e/ou uma pectinase de uma fonte diferen- te de Rasamsonia. Podem ser usadas em conjunto com uma ou mais enzimas de Rasamsonia ou podem ser usadas sem a presença de en- zimas de Rasamsonia adicionais.

[0054] Uma composição de enzima para uso nos processos aqui descritos pode compreender uma monoxigenase lítica de polissacarí- deo (lytic polysaccharide monooxygenase - LPMO), uma endogluca- nase (EG), uma celobio-hidrolase I (CBHI), uma celobio-hidrolase II (CBHII), uma beta-glucosidase (BG), e endoxilanase (EX) e uma beta- xilosidase (BX).

[0055] Uma composição de enzima para uso nos processos aqui descritos pode compreender um tipo de atividade de celulase e/ou ati- vidade de hemicelulase e/ou atividade de pectinase fornecida por uma composição como aqui descrita e um segundo tipo de atividade de ce-

lulase e/ou atividade de hemicelulase e/ou atividade de pectinase for- necida por uma celulase/hemicelulase/pectinase adicional.

[0056] Em uma modalidade, a composição enzimática compreen- de um caldo de fermentação integral de um fungo. Em uma modalida- de, o referido caldo compreende uma endoglucanase, uma celobio- hidrolase, uma beta-glucosidase, uma endoxilanase, uma beta- xilosidase e uma oxigenase lítica de monossacarídeo. Estas enzimas foram descritas em maiores detalhes aqui.

[0057] Neste contexto, uma celulase é qualquer polipeptídeo que é capaz de degradar ou modificar celulose. Um polipeptídeo que é capaz de degradar a celulose é aquele que é capaz de catalisar o processo de quebrar a celulose em unidades menores, seja parcialmente, por exemplo em celodextrinas, ou completamente em monômeros de gli- cose. Uma celulase como aqui descrita pode dar origem a uma popu- lação mista de celodextrinas e monômeros de glicose. Essa degrada- ção ocorrerá tipicamente por meio de uma reação de hidrólise.

[0058] Neste contexto, uma hemicelulase é qualquer polipeptídeo que é capaz de degradar ou modificar hemicelulose. Ou seja, uma hemicelulase pode ser capaz de degradar ou modificar um ou mais de xilano, glucuronoxilano, arabinoxilano, glucomanano e xiloglucano. Um polipeptídeo que é capaz de degradar uma hemicelulose é aquele que é capaz de catalisar o processo de quebrar a hemicelulose em polis- sacarídeos menores, seja parcialmente, por exemplo em oligossacarí- deos, ou completamente em monômeros de açúcar, por exemplo em monômeros de açúcar hexose ou pentose. Uma hemicelulase, con- forme descrito neste documento, pode dar origem a uma população mista de oligossacarídeos e monômeros de açúcar. Essa degradação ocorrerá tipicamente por meio de uma reação de hidrólise.

[0059] Neste contexto, uma pectinase é qualquer polipeptídeo que é capaz de degradar ou modificar pectina. Um polipeptídeo que é ca-

paz de degradar pectina é aquele que é capaz de catalisar o processo de quebrar a pectina em unidades menores, seja parcialmente, por exemplo em oligossacarídeos, ou completamente em monômeros de açúcar. Uma pectinase como aqui descrita pode dar origem a uma po- pulação mista de oligossacarídeos e monômeros de açúcar. Essa de- gradação ocorrerá tipicamente por meio de uma reação de hidrólise.

[0060] Assim, uma composição de enzima para uso nos processos descritos neste documento pode compreender uma ou mais das se- guintes enzimas, uma monoxigenase lítica de polissacarídeo (por exemplo, GH61), uma celobio-hidrolase, uma endo-β-1,4-glucanase, uma beta-glucosidase e uma β-(1,3)(1,4) -glucanase. Uma composição para uso nos processos descritos neste documento também pode compreender uma ou mais hemicelulases, por exemplo, uma endoxi- lanase, uma β-xilosidase, uma α-L-arabinofuranosidase, uma α-D- glucuronidase, uma acetil xilano esterase, uma feruloil esterase, uma coumaroil esterase, uma α-galactosidase, uma β-galactosidase, uma β-mananase e/ou uma β-manosidase. Uma composição para uso nos processos descritos neste documento também pode compreender uma ou mais pectinases, por exemplo, uma endo-poligalacturonase, uma pectina-metil esterase, uma endo-galactanase, uma beta- galactosidase, uma pectina-acetil esterase, uma endo-pectina-liase, pectato-liase, alfa-ramnosidase, uma exo-galacturonase, uma expoli- galacturonato-liase, uma ramnogalacturonan hidrolase, uma ramnoga- lacturonan liase, uma ramnogalacturonan acetil esterase, uma ramno- galacturonan galacturono hidrolase, e/ou uma xilogalacturonase. Além disso, uma ou mais das seguintes enzimas, uma amilase, uma pro- tease, uma lipase, uma ligninase, uma hexosiltransferase, uma glucu- ronidase, uma expansina, uma proteína induzida por celulose ou uma proteína integradora de celulose ou proteína semelhante podem estar presentes em uma composição para uso nos processos descritos nes-

te documento (referidos como atividades auxiliares acima).

[0061] Conforme usado aqui, monoxigenases líticas de polissaca- rídeos são enzimas que foram recentemente classificadas por CAZy na família AA9 (Auxiliary Activity Family 9 -Família de Atividade Auxili- ar 9) ou família AA10 (Família de Atividade Auxiliar 10). Portanto, exis- tem monoxigenases líticas de polissacarídeos AA9 e monoxigenases líticas de polissacarídeos AA10. As monoxigenases líticas de polissa- carídeos são capazes de abrir uma estrutura cristalina de glucano e aumentar a ação das celulases sobre substratos de lignocelulose. São enzimas que aumentam a atividade celulolítica. Monoxigenases líticas de polissacarídeos também podem afetar os celo-oligossacarídeos. De acordo com a literatura mais recente, (ver Isaksen et al., Journal of Biological Chemistry, vol. 289, no. 5, p. 2632-2642), proteínas denomi- nadas GH61 (família glicosídeo hidrolase 61 ou às vezes referidas como EGIV) são monoxigenases líticas de polissacarídeos. GH61 foi originalmente classificada como endoglucanase com base na medição da atividade de endo-1,4-β-d-glucanase muito fraca em um membro da família, mas foi recentemente reclassificada por CAZy na família AA9. CBM33 (módulo de ligação a carboidratos da família 33) também é uma monoxigenase lítica de polissacarídeo (ver Isaksen et al, Journal of Biological Chemistry, vol. 289, no. 5, pp. 2632-2642). CAZy reclassi- ficou recentemente CBM33 na família AA10.

[0062] Em uma modalidade, a monoxigenase lítica de polissacarí- deo compreende uma monoxigenase lítica de polissacarídeo AA9. Isso significa que pelo menos uma das monoxigenases líticas de polissaca- rídeo na composição enzimática é uma monoxigenase lítica de polis- sacarídeo AA9. Em uma modalidade, todas as monoxigenases líticas de polissacarídeo na composição enzimática são monoxigenases líti- cas de polissacarídeo AA9.

[0063] Em uma modalidade, a composição de enzima compreende uma monoxigenase lítica de polissacarídeo de Thermoascus, como Thermoascus aurantiacus, como descrito em WO 2005/074656 como SEQ ID NO: 2 e SEQ ID NO: 1 em WO2014/130812 e em WO 2010/065830; ou de Thielavia, como Thielavia terrestris, como descrito em WO 2005/074647 como SEQ ID NO: 8 ou SEQ ID NO: 4 em WO2014/130812 e em WO 2008/148131 e WO 2011/035027; ou de Aspergillus, como Aspergillus fumigatus, tal como descrito em WO 2010/138754 como SEQ ID NO: 2 ou SEQ ID NO: 3 em WO2014/130812; ou de Penicillium, como Penicillium emersonii, como o divulgado como SEQ ID NO: 2 em WO 2011/041397 ou SEQ ID NO: 2 em WO2014/130812. Outras monoxigenases líticas de polissacarí- deos adequadas incluem, mas não estão limitadas a Trichoderma ree- sei (ver WO 2007/089290), Myceliophthora thermophila (ver WO 2009/085935, WO 2009/085859, WO 2009/085864, WO 2009/085868), Penicillium pinophilum (ver WO 2011/005867), Ther- moascus sp. (ver WO 2011/039319) e Thermoascus crustaceous (ver WO 2011/041504). Outras enzimas celulolíticas que podem estar compreendidas na composição enzimática são descritas em WO 98/13465, WO 98/015619, WO 98/015633, WO 99/06574, WO 99/10481, WO 99/025847, WO 99/031255, WO 2002/101078, WO 2003/027306, WO 2003/052054, WO 2003/052055, WO 2003/052056, WO 2003/052057, WO 2003/052118, WO 2004/016760, WO 2004/043980, WO 2004/048592, WO 2005/001065, WO 2005/028636, WO 2005/093050, WO 2005/093073, WO 2006/074005, WO 2006/117432, WO 2007/071818, WO 2007/071820, WO 2008/008070, WO 2008/008793, US 5,457,046, US 5,648,263, e US 5 686 593, para citar apenas algumas. Em uma modalidade preferida, a monoxigenase lítica de polissacarídeo é de Rasamsonia, por exemplo, de Rasamso- nia emersonii (ver WO 2012/000892).

[0064] Conforme usado aqui, endoglucanases são enzimas que são capazes de catalisar a endo-hidrólise de ligações 1,4-β-D- glicosídicas em celulose, liquenina ou β-D-glucanos de cereais. Elas pertencem a EC 3.2.1.4 e podem ser capazes de hidrolisar ligações 1,4 em β-D-glucanos também contendo ligações 1,3. Endoglucanases também podem ser referidas como celulases, avicelases, β-1,4- endoglucano hidrolases, β-1,4-glucanases, carboximetilcelulases, ce- ludextrinases, endo-1,4-β-D-glucanases, endo-1,4 -β-D-glucano- hidrolases ou endo-1,4-β-glucanases.

[0065] Em uma modalidade, a endoglucanase compreende uma endoglucanase GH5 e/ou uma endoglucanase GH7. Isso significa que pelo menos uma das endoglucanases na composição enzimática é uma endoglucanase GH5 ou uma endoglucanase GH7. No caso de haver mais endoglucanases na composição enzimática, essas endo- glucanases podem ser endoglucanases GH5, endoglucanases GH7 ou uma combinação de endoglucanases GH5 e endoglucanases GH7. Em uma modalidade preferida, a endoglucanase compreende uma en- doglucanase GH5.

[0066] Em uma modalidade, a composição enzimática compreen- de uma endoglucanase de Trichoderma, como Trichoderma reesei; de Humicola, como uma cepa de Humicola insolens; de Aspergillus, como Aspergillus aculeatus ou Aspergillus kawachii; de Erwinia, como Erwi- nia carotovara; de Fusarium, como Fusarium oxysporum; de Thielavia, como Thielavia terrestris; de Humicola, como Humicola grisea var. thermoidea ou Humicola insolens; de Melanocarpus, como Melano- carpus albomyces; de Neurospora, como Neurospora crassa; de Myceliophthora, como Myceliophthora thermophila; de Cladorrhinum, como Cladorrhinum foecundissimum; e/ou de Chrysosporium, como uma cepa de Chrysosporium lucknowense. Em uma modalidade prefe- rida a endoglucanase é de Rasamsonia, como uma cepa de Rasam- sonia emersonii (ver WO 01/70998). Em uma modalidade, até uma endoglucanase bacteriana pode ser usada incluindo, não se limitando a endoglucanase de Acidothermus cellulolyticus (ver WO 91/05039; WO 93/15186; US 5,275,944; WO 96/02551; US 5,536,655, WO 00/70031, WO 05/093050); endoglucanase III deThermobifida fusca (ver WO 05/093050); e endoglucanase V de Thermobifida fusca (ver WO 05/093050).

[0067] Como usado aqui, beta-xilosidases (EC 3.2.1.37) são poli- peptídeos que são capazes de catalisar a hidrólise de 1,4-β-D-xilanos, para remover resíduos de D-xilose sucessivos dos terminais não redu- tores. As beta-xilosidases também podem hidrolisar a xilobiose. Beta- xilosidase também pode ser referida como xilano 1,4-β-xilosidase, 1,4- β-D-xilano xilo-hidrolase, exo-1,4-β-xilosidase ou xilobiase.

[0068] Em uma modalidade, a beta-xilosidase compreende uma beta-xilosidase GH3. Isso significa que pelo menos uma das beta- xilosidases na composição enzimática é uma beta-xilosidase GH3. Em uma modalidade, todas as beta-xilosidases na composição enzimática são beta-xilosidases GH3.

[0069] Em uma modalidade, a composição enzimática compreen- de uma beta-xilosidase de Neurospora crassa, Aspergillus fumigatus ou Trichoderma reesei. Em uma modalidade preferida, a composição enzimática compreende uma beta-xilosidase de Rasamsonia, tal como Rasamsonia emersonii (ver WO 2014/118360).

[0070] Como usado aqui, uma endoxilanase (EC 3.2.1.8) é qual- quer polipeptídeo que é capaz de catalisar a endo-hidrólise de ligações 1,4-β-D-xilosídicas em xilanos. Esta enzima também pode ser referida como endo-1,4-β-xilanase ou 1,4-β-D-xilano xilano-hidrolase. Uma al- ternativa é EC 3.2.1.136, uma glucuronoarabinoxilano endoxilanase, uma enzima que é capaz de hidrolisar ligações 1,4 xilosídicas em glu- curonoarabinoxilanos.

[0071] Em uma modalidade, a endoxilanase compreende uma xi-

lanase GH10. Isso significa que pelo menos uma das endoxilanases na composição enzimática é uma xilanase GH10. Em uma modalida- de, todas as endoxilanases na composição enzimática são xilanases GH10.

[0072] Em uma modalidade, a composição enzimática compreen- de uma endoxilanase de Aspergillus aculeatus (ver WO 94/21785), Aspergillus fumigatus (ver WO 2006/078256), Penicillium pinophilum (ver WO 2011/041405), Penicillium sp (ver WO 2010/126772), Thiela- via terrestris NRRL 8126 (ver WO 2009/079210), Talaromyces leycet- tanus, Thermobifida fusca ou Trichophaea saccata GH10 (ver WO 2011/057083). Em uma modalidade preferida, a composição enzimáti- ca compreende uma endoxilanase de Rasamsonia, como Rasamsonia emersonii (ver WO 02/24926)

[0073] Tal como aqui utilizado, uma beta-glucosidase (EC

3.2.1.21) é qualquer polipeptídeo que é capaz de catalisar a hidrólise de resíduos β-D-glicose terminais não redutores com liberação de β-D- glicose. Esse polipeptídeo pode ter uma ampla especificidade para β- D-glucosídeos e pode hidrolisar um ou mais dos seguintes: um β-D- galactosídeo, um α-L-arabinosídeo, um β-D-xilosídeo ou um β-D - fucosídeo. Esta enzima também pode ser referida como amigdalase, β-D-glucosídeo gluco-hidrolase, celobiase ou gentobiase.

[0074] Em uma modalidade, a composição enzimática compreen- de uma beta-glucosidase de Aspergillus, como Aspergillus oryzae, como a divulgada em WO 02/095014 ou a proteína de fusão com ativi- dade de beta-glucosidase divulgada em WO 2008/057637, ou de As- pergillus fumigatus, como a divulgada como SEQ ID NO: 2 em WO 2005/047499 ou SEQ ID NO: 5 em WO 2014/130812 ou uma variante de beta-glucosidase de Aspergillus fumigatus, como uma divulgada em WO 2012/044915, como uma com as seguintes substituições: F100D, S283G, N456E, F512Y (usando SEQ ID NO: 5 em WO 2014/130812 para numeração), ou de Aspergillus aculeatus, Aspergillus niger ou Aspergillus kawachi. Em outra modalidade, a beta-glucosidase é deri- vada de Penicillium, como de Penicillium brasilianum divulgada como SEQ ID NO: 2 em WO 2007/019442, ou de Trichoderma, tal como de Trichoderma reesei, como as descritas em US 6.022.725, US

6.982.159, US 7.045.332, US 7.005.289, US 2006/0258554, US 2004/0102619.

[0075] Em uma modalidade, até uma beta-glucosidase bacteriana pode ser usada. Em outra modalidade, a beta-glucosidase é derivada de Thielavia terrestris (WO 2011/035029) ou de Trichophaea saccata (WO 2007/019442). Em uma modalidade preferida, a composição de enzima compreende uma beta-glucosidase de Rasamsonia, tal como Rasamsonia emersonii (ver WO 2012/000886).

[0076] Conforme usado aqui, uma celobio-hidrolase (EC 3.2.1.91) é qualquer polipeptídeo que é capaz de catalisar a hidrólise de liga- ções 1,4-β-D-glicosídicas em celulose ou celotetraose, liberando celo- biose das extremidades das cadeias. Esta enzima também pode ser referida como celulase 1,4-β-celobiosidase, 1,4-β-celobio-hidrolase, 1,4-β-D-glucano celobio-hidrolase, avicelase, exo-1,4-β-D-glucanase, exocelobio-hidrolase ou exoglucanase.

[0077] Em uma modalidade, a composição enzimática compreen- de uma celobio-hidrolase I de Aspergillus, como Aspergillus fumigatus, como Cel7A CBH I divulgada em SEQ ID NO: 6 em WO 2011/057140 ou SEQ ID NO: 6 em WO 2014/130812 ; de Trichoderma, como Tri- choderma reesei; de Chaetomium, como Chaetomium thermophilum; de Talaromyces, como Talaromyces leycettanus ou de Penicillium, como Penicillium emersonii. Em uma modalidade preferida, a compo- sição enzimática compreende uma celobio-hidrolase I de Rasamsonia, tal como Rasamsonia emersonii (ver WO 2010/122141)

[0078] Em uma modalidade, a composição enzimática compreen-

de uma celobio-hidrolase II de Aspergillus, como Aspergillus fumi- gatus, como aquela em SEQ ID NO: 7 em WO 2014/130812 ou de Tri- choderma, como Trichoderma reesei, ou de Talaromyces, como Tala- romyces leycettanus, ou de Thielavia, como Thielavia terrestris, como celobio-hidrolase II CEL6A de Thielavia terrestris. Em uma modalidade preferida, a composição enzimática compreende uma celobio- hidrolase II de Rasamsonia, tal como Rasamsonia emersonii (ver WO 2011/098580).

[0079] Em uma modalidade, a composição de enzima também compreende uma ou mais das enzimas mencionadas abaixo.

[0080] Tal como aqui utilizado, uma β- (1,3)(1,4) -glucanase (EC

3.2.1.73) é qualquer polipeptídeo que é capaz de catalisar a hidrólise de ligações 1,4-β-D-glicosídicas em β-D -glucanos contendo ligações 1,3 e 1,4. Esse polipeptídeo pode atuar sobre liquenina e β-D-glucanos de cereais, mas não sobre β-D-glucanos contendo apenas ligações 1,3 ou 1,4. Esta enzima também pode ser referida como liqueninase, 1,3- 1,4-β-D-glucano 4-glucano-hidrolase, β-glucanase, endo-β-1,3-1,4 glu- canase, liquenase ou ligação mista β- glucanase. Uma alternativa a este tipo de enzima é EC 3.2.1.6, que é descrita como endo-1,3(4)- beta-glucanase. Este tipo de enzima hidrolisa ligações 1,3 ou 1,4 em beta-D-glucanase quando o resíduo de glicose cujo grupo redutor está envolvido na ligação a ser hidrolisada é ele próprio substituído em C-3. Nomes alternativos incluem endo-1,3-beta-glucanase, laminarinase, 1,3-(1,3;1,4)-beta-D-glucano 3(4) glucano-hidrolase. Substratos inclu- em laminarina, liquenina e beta-D-glucanos de cereais.

[0081] Tal como aqui utilizado, uma α-L-arabinofuranosidase (EC

3.2.1.55) é qualquer polipeptídeo que é capaz de atuar sobre α-L- arabinofuranosídeos, α-L-arabinanos contendo ligações (1,2) e/ou (1,3) - e/ou (1,5), arabinoxilanos e arabinogalactanos. Esta enzima também pode ser referida como α-N-arabinofuranosidase, arabinofu-

ranosidase ou arabinosidase. Exemplos de arabinofuranosidases que podem estar presentes na composição enzimática incluem, mas não estão limitadas a arabinofuranosidases de Aspergillus niger, Humicola insolens DSM 1800 (ver WO 2006/114094 e WO 2009/073383) e M. giganteus (ver WO 2006/114094 ).

[0082] Tal como aqui utilizado, uma α-D-glucuronidase (EC

3.2.1.139) é qualquer polipeptídeo que é capaz de catalisar uma rea- ção da seguinte forma: alfa-D-glucuronosídeo + H(2)O = um álcool + D-glucuronato. Esta enzima também pode ser referida como alfa- glucuronidase ou alfa-glucosiduronase. Estas enzimas podem também hidrolisar o ácido glucurônico 4-O-metilado, que também pode estar presente como um substituinte em xilanos. Uma alternativa é EC

3.2.1.131: xilano alfa-1,2-glucuronosidase, que catalisa a hidrólise de ligações alfa-1,2-(4-O-metil)glucuronosila. Exemplos de alfa- glucuronidases que podem estar contidas na composição enzimática incluem, mas não estão limitadas a alfa-glucuronidases de Aspergillus clavatus, Aspergillus fumigatus, Aspergillus niger, Aspergillus terreus, Humicola insolens (ver WO 2010/014706), Penicillium aurantiogriseum (ver WO 2009/068565) e Trichoderma reesei.

[0083] Tal como aqui utilizado, uma acetil-xilano esterase (EC

3.1.1.72) é qualquer polipeptídeo que é capaz de catalisar a desaceti- lação de xilanos e xilo-oligossacarídeos. Tal polipeptídeo pode catali- sar a hidrólise de grupos acetila de xilano polimérico, xilose acetilada, glicose acetilada, acetato de alfa-naftila ou acetato de p-nitrofenila, mas, tipicamente, não de triacetilglicerol. Esse polipeptídeo normal- mente não atua sobre manana ou pectina acetiladas.

[0084] Exemplos de acetilxilano esterases que podem estar conti- das na composição de enzima incluem, mas não estão limitadas a acetilxilano esterases de Aspergillus aculeatus (ver WO 2010/108918), Chaetomium globosum, Chaetomium gracile, Humicola insolens DSM

1800 (ver WO 2009/073709), Hypocrea jecorina (ver WO 2005/001036), Myceliophtera thermophila (ver WO 2010/014880), Neurospora crassa, Phaeosphaeria nodorum e Thielavia terrestris NRRL 8126 (ver WO 2009/042846). Em uma modalidade preferida, a composição de enzima compreende uma acetil xilano esterase de Ra- samsonia, como Rasamsonia emersonii (ver WO 2010/000888).

[0085] Conforme usado aqui, uma feruloil esterase (EC 3.1.1.73) é qualquer polipeptídeo que é capaz de catalisar uma reação da forma: feruloil-sacarídeo + H2O = ferulado + sacarídeo. O sacarídeo pode ser, por exemplo, um oligossacarídeo ou um polissacarídeo. Pode tipica- mente catalisar a hidrólise do grupo 4-hidróxi-3-metoxicinamoíla (feru- loíla) de um açúcar esterificado, que geralmente é arabinose em subs- tratos "naturais". Acetato de p-nitrofenol e ferulato de metila são, tipi- camente, substratos mais pobres. Esta enzima também pode ser refe- rida como cinamoil éster hidrolase, ácido ferúlico esterase ou hidroxi- cinamoil esterase. Também pode ser referida como uma enzima aces- sória hemicelulase, uma vez que pode ajudar xilanases e pectinases a quebrar hemicelulose e pectina da parede celular vegetal. Exemplos de feruloil esterases (esterases de ácido ferúlico) que podem estar contidas na composição de enzima incluem, mas não estão limitadas a feruloil esterases de Humicola insolens DSM 1800 (ver WO 2009/076122), Neosartorya fischeri, Neurospora crassa, Penicillium aurantiogriseum (WO 2009/127729) e Thielavia terrestris (ver WO 2010/053838 e WO 2010/065448).

[0086] Tal como aqui utilizado, uma cumaroil esterase (EC

3.1.1.73) é qualquer polipeptídeo que é capaz de catalisar uma reação da forma: cumaroil-sacarídeo + H(2)O = cumarato + sacarídeo. O sa- carídeo pode ser, por exemplo, um oligossacarídeo ou um polissacarí- deo. Esta enzima também pode ser referida como trans-4-cumaroil es- terase, trans-p-cumaroil esterase, p-cumaroil esterase ou ácido p-

cumárico esterase. Esta enzima também se enquadra na EC 3.1.1.73, então também pode ser referida como feruloil esterase.

[0087] Tal como aqui utilizado, uma α-galactosidase (EC 3.2.1.22) é qualquer polipeptídeo que é capaz de catalisar a hidrólise de resí- duos de α-D-galactose terminais não redutores em α-D-galactosídeos, incluindo oligossacarídeos de galactose, galactomananos, galactanos e arabinogalactanos. Esse polipeptídeo também pode ser capaz de hidrolisar α-D-fucosídeos. Esta enzima também pode ser referida co- mo melibiase.

[0088] Tal como aqui utilizado, uma β-galactosidase (EC 3.2.1.23) é qualquer polipeptídeo que é capaz de catalisar a hidrólise de resí- duos β-D-galactose não redutores terminais em β-D-galactosídeos. Esse polipeptídeo também pode ser capaz de hidrolisar α-L- arabinosídeos. Esta enzima também pode ser referida como exo- (1-> 4) -β-D-galactanase ou lactase.

[0089] Tal como aqui utilizado, uma β-mananase (EC 3.2.1.78) é qualquer polipeptídeo que é capaz de catalisar a hidrólise aleatória de ligações 1,4-β-D-manosídicas em mananas, galactomananas e gluco- mananas. Esta enzima também pode ser referida como manan endo- 1,4-β-manosidase ou endo-1,4-mananase.

[0090] Tal como aqui utilizado, uma β-manosidase (EC 3.2.1.25) é qualquer polipeptídeo que é capaz de catalisar a hidrólise de resíduos β-D-manose terminais não redutores em β-D-manosídeos. Esta enzi- ma também pode ser referida como mananase ou manase.

[0091] Conforme usado aqui, uma endo-poligalacturonase (EC

3.2.1.15) é qualquer polipeptídeo que é capaz de catalisar a hidrólise aleatória de ligações 1,4-α-D-galactosidurônicas em pectato e outros galacturonanos. Esta enzima também pode ser referida como poliga- lacturonase pectina despolimerase, pectinase, endopoligalacturonase, pectolase, pectina hidrolase, pectina poligalacturonase, poli-α-1,4-

galacturonídeo glicano-hidrolase, endogalacturonase; endo-D- galacturonase ou poli(1,4-α-D-galacturonida) glicano-hidrolase.

[0092] Como usado aqui, uma pectina metil esterase (EC 3.1.1.11) é qualquer enzima que é capaz de catalisar a reação: pectina + n H2O = n metanol + pectato. A enzima também pode ser conhecida como pectinesterase, pectina desmetoxilase, pectina metoxilase, pectina me- tilesterase, pectase, pectinoesterase ou pectina pectil-hidrolase.

[0093] Tal como aqui utilizado, uma endo-galactanase (EC

3.2.1.89) é qualquer enzima capaz de catalisar a endo-hidrólise de li- gações 1,4-β-D-galactosídicas em arabinogalactanos. A enzima tam- bém pode ser conhecida como arabinogalactan endo-1,4-β- galactosidase, endo-1,4-β-galactanase, galactanase, arabinogalacta- nase ou arabinogalactan 4-β-D-galactano-hidrolase.

[0094] Tal como aqui utilizado, uma pectina acetil esterase é defi- nida aqui como qualquer enzima que tem uma atividade de acetil este- rase que catalisa a desacetilação dos grupos acetila nos grupos hidro- xila de resíduos GalUA de pectina.

[0095] Tal como aqui utilizado, uma endo-pectina liase (EC

4.2.2.10) é qualquer enzima capaz de catalisar a clivagem eliminativa do éster metílico de (1 4) -α-D-galacturonano para dar oligossacarí- deos com grupos 4-desóxi-6-O-metil -α-D-galact-4-enuronosila em su- as extremidades não redutoras. A enzima também pode ser conhecida como pectina liase, pectina transeliminase; endopectina liase, transe- liminase polimetilgalacturônica, pectina metiltranseliminase, pectoliase, PL, PNL ou PMGL ou (1 4) -6-O-metil-α-D-galacturonano liase.

[0096] Tal como aqui utilizado, uma pectato liase (EC 4.2.2.2) é qualquer enzima capaz de catalisar a clivagem eliminativa de (1 4) - α-D-galacturonano para dar oligossacarídeos com grupos 4-desóxi-α- D-galact-4-enuronosila em suas extremidades não redutoras. A enzi- ma também pode ser conhecida por transeliminase poligalacturônica,

ácido péctico transeliminase, poligalacturonato liase, endopectina me- tiltranseliminase, pectato transeliminase, endogalacturonato transeli- minase, ácido péctico liase, liase péctica, ácido α-1,4-D- endopoligalacturônico liase, ácido poligalacturônico liase (PGA liase), PPase-N, ácido endo-α-1,4-poligalacturônico liase, ácido poligalactu- rônico liase, pectina transeliminase, ácido poligalacturônico transelimi- nase ou (1 4)-α-D-galacturonano liase.

[0097] Tal como aqui utilizado, uma alfa ramnosidase (EC

3.2.1.40) é qualquer polipeptídeo que é capaz de catalisar a hidrólise de resíduos terminais não redutores de α-L-ramnose em α-L- ramnosídeos ou alternativamente em ramnogalacturonano. Esta enzi- ma também pode ser conhecida como α-L-ramnosidase T, α-L- ramnosidase N ou α-L-ramnosídeo ramno-hidrolase.

[0098] Tal como aqui utilizado, exo-galacturonase (EC 3.2.1.82) é qualquer polipeptídeo capaz de hidrólise de ácido péctico a partir da extremidade não redutora, liberando digalacturonato. A enzima tam- bém pode ser conhecida como exo-poli-α-galacturonosidase, exopoli- galacturonosidase ou exopoligalacturanosidase.

[0099] Tal como aqui utilizado, exo-galacturonase (EC 3.2.1.67) é qualquer polipeptídeo capaz de catalisar: (1,4-α-D-galacturonídeo)n + H2O = (1,4-α-D-galacturonídeo)n-1 + D-galacturonato. A enzima tam- bém pode ser conhecida como galacturano 1,4-α-galacturonidase, exopoligalacturonase, poli(galacturonato) hidrolase, exo-D- galacturonase, exo-D-galacturonanase, exopoli-D-galacturonase ou poli (1,4-α- D-galacturonídeo) galacturono-hidrolase.

[00100] Tal como aqui utilizado, exopoligalacturonato liase (EC

4.2.2.9) é qualquer polipeptídeo capaz de catalisar a clivagem elimina- tiva de 4-(4-desóxi-α-D-galact-4-enuronosil)-D-galacturonato a partir da extremidade redutora de pectato, isto é pectina desesterificada. Esta enzima pode ser conhecida como pectato dissacarídeo-liase, pectato exo-liase, ácido exopéctico transeliminase, exopectato liase, ácido exopoligalacturônico-transeliminase, PATE, exo-PATE, exo-PGL ou (14)-α-D-galacturonano- dissacarídeo com extremidade redutora- liase.

[00101] Tal como aqui utilizado, ramnogalacturonano hidrolase é qualquer polipeptídeo que é capaz de hidrolisar a ligação entre ácido galactosilurônico e ramnopiranosila de uma forma endo em estruturas estritamente alternadas de ramnogalacturonano, consistindo no dissa- carídeo [(1,2-alfa-L-ramnoil-ácido (1,4)-alfa-galactosilurônico].

[00102] Tal como aqui utilizado, ramnogalacturonano liase é qual- quer polipeptídeo que é capaz de clivar ligações α-L-Rhap-(14)-α-D- GalpA de modo endo em ramnogalacturonano por eliminação beta.

[00103] Tal como aqui utilizado, ramnogalacturonano acetil esterase é qualquer polipeptídeo que catalisa a desacetilação da espinha dorsal de resíduos alternados de ramnose e ácido galacturônico em ramno- galacturonano.

[00104] Tal como aqui utilizado, ramnogalacturonano galacturono- hidrolase é qualquer polipeptídeo que é capaz de hidrolisar ácido ga- lacturônico a partir da extremidade não redutora de estruturas ramno- galacturonano estritamente alternadas de modo exo.

[00105] Tal como aqui utilizado, xilogalacturonase é qualquer poli- peptídeo que atua no xilogalacturonano por clivagem da espinha dor- sal do ácido galacturônico substituído com β-xilose de modo endo. Es- ta enzima também pode ser conhecida como xilogalacturonano hidro- lase.

[00106] Tal como aqui utilizado, uma α-L-arabinofuranosidase (EC

3.2.1.55) é qualquer polipeptídeo que seja capaz de atuar sobre α-L- arabinofuranosídeos, α-L-arabinanos contendo ligações (1,2) e/ou (1,3) e/ou (1,5), arabinoxilanos e arabinogalactanos. Esta enzima tam- bém pode ser referida como α-N-arabinofuranosidase, arabinofurano-

sidase ou arabinosidase.

[00107] Como usado aqui, endo-arabinanase (EC 3.2.1.99) é qual- quer polipeptídeo que é capaz de catalisar endo-hidrólise de ligações 1,5-α-arabinofuranosídicas em 1,5-arabinanos. A enzima também po- de ser conhecida como endo-arabinase, arabinano endo-1,5-α-L- arabinosidase, endo-1,5-α-L-arabinanase, endo-α-1,5-arabanase; en- do-arabanase ou 1,5-α-L-arabinan 1,5-α-L-arabinano-hidrolase.

[00108] "Protease" inclui enzimas que hidrolisam ligações peptídi- cas (peptidases), bem como enzimas que hidrolisam ligações entre peptídeos e outras porções, como açúcares (glicopeptidases). Muitas proteases são caracterizadas sob EC 3.4 e são adequadas para uso nos processos descritos neste documento. Alguns tipos específicos de proteases incluem cisteína proteases, incluindo pepsina, papaína e serina proteases, incluindo quimotripsinas, carboxipeptidases e meta- loendopeptidases.

[00109] "Lipase" inclui enzimas que hidrolisam lipídios, ácidos gra- xos e acilglicerídeos, incluindo fosfoglicerídeos, lipoproteínas, diacilgli- ceróis e semelhantes. Em plantas, lipídios são usados como compo- nentes estruturais para limitar a perda de água e infecção por patóge- nos. Esses lipídios incluem ceras derivadas de ácidos graxos, bem como cutina e suberina.

[00110] "Ligninase" inclui enzimas que podem hidrolisar ou quebrar a estrutura de polímeros de lignina. Enzimas que podem quebrar ligni- na incluem lignina peroxidases, manganês peroxidases, lacases e fe- ruloil esterases, e outras enzimas descritas na técnica conhecidas por despolimerizar ou de outra forma quebrar polímeros de lignina. Tam- bém estão incluídas enzimas capazes de hidrolisar ligações formadas entre açúcares hemicelulósicos (principalmente arabinose) e lignina. Ligninases incluem, mas não estão limitadas ao seguinte grupo de en- zimas: lignina peroxidases (EC 1.11.1.14), manganês peroxidases (EC

1.11.1.13), lacases (EC 1.10.3.2) e feruloil esterases (EC 3.1.1.73).

[00111] "Hexosiltransferase" (2.4.1-) inclui enzimas que são capa- zes de catalisar uma reação de transferase, mas que também podem catalisar uma reação de hidrólise, por exemplo, de celulose e/ou pro- dutos de degradação da celulose. Um exemplo de hexosiltransferase que pode ser usado é uma ß-glucanosiltransferase. Tal enzima pode ser capaz de catalisar a degradação de (1,3) (1,4)glucano e/ou celulo- se e/ou um produto de degradação de celulose.

[00112] "Glucuronidase" inclui enzimas que catalisam a hidrólise de um glucuronosídeo, por exemplo, β-glucuronosídeo para produzir um álcool. Muitas glucuronidases foram caracterizadas e podem ser ade- quadas para uso, por exemplo, β-glucuronidase (EC 3.2.1.31), hialuro- no-glucuronidase (EC 3.2.1.36), glucuronosil-dissulfoglucosamina glu- curonidase (3.2.1.56), glicirrizinato β-glucuronidase (3.2 .1.128) ou α- D-glucuronidase (EC 3.2.1.139).

[00113] Expansinas estão implicadas no afrouxamento da estrutura da parede celular durante o crescimento das células vegetais. As ex- pansinas têm sido propostas para romper as ligações de hidrogênio entre a celulose e outros polissacarídeos da parede celular sem ter atividade hidrolítica. Dessa forma, acredita-se que elas permitam o deslizamento das fibras de celulose e o alargamento da parede celu- lar. A swollenina, uma proteína semelhante à expansina, contém um domínio da família 1 de módulo de ligação a carboidratos N-terminal (CBD) e um domínio semelhante à expansina C-terminal. Conforme descrito neste documento, uma proteína semelhante à expansina ou proteína semelhante à swollenina pode compreender um ou ambos desses domínios e/ou pode romper a estrutura das paredes celulares (como romper a estrutura de celulose), opcionalmente sem produzir quantidades detectáveis de açúcares redutores.

[00114] Uma proteína induzida por celulose, por exemplo, o produto polipeptídico do gene cip1 ou cip2 ou genes semelhantes (ver Fore- man et al., J. Biol. Chem. 278 (34), 31988-31997, 2003), uma proteína de integração de celulose/celulossoma, por exemplo, o produto poli- peptídico do gene cipA ou cipC, ou uma proteína estrutural ou proteína semelhante à estrutural. Proteínas estruturais e proteínas de integra- ção à celulose são subunidades de integração multifuncionais que po- dem organizar subunidades celulolíticas em um complexo multienzi- mático. Isso é conseguido pela interação de duas classes complemen- tares de domínio, ou seja, um domínio de coesão na proteína estrutu- ral e um domínio de ancoragem em cada unidade enzimática. A subu- nidade estrutural também carrega um módulo de ligação à celulose (CBM) que medeia a ligação do celulossoma ao seu substrato. Uma proteína estrutural ou proteína de integração à celulose pode compre- ender um ou ambos os domínios.

[00115] Uma catalase; o termo "catalase" significa um peróxido de hidrogênio: peróxido de hidrogênio oxidoredutase (EC 1.11.1.6 ou EC

1.11.1.21) que catalisa a conversão de dois peróxidos de hidrogênio em oxigênio e duas moléculas de água. A atividade da catalase pode ser determinada monitorando a degradação do peróxido de hidrogênio a 240 nm com base na seguinte reação: 2H2O2 → 2H2O + O2. A rea- ção é realizada em fosfato 50 mM pH 7,0 a 25°C com 10,3 mM de substrato (H2O2) e aproximadamente 100 unidades de enzima por ml. A absorbância é monitorada espectrofotometricamente em 16-24 se- gundos, o que deve corresponder a uma redução da absorbância de 0,45 para 0,4. Uma unidade de atividade de catalase pode ser expres- sa como um micromol de H2O2 degradado por minuto a pH 7,0 e 25°C.

[00116] O termo "amilase", tal como aqui utilizado, significa enzimas que hidrolisam ligações alfa-1,4-glicosídicas em amido, tanto em ami- lose quanto em amilopectina, como alfa-amilase (EC 3.2.1.1), beta- amilase (EC 3.2.1.2) , glucano 1,4-alfa-glucosidase (EC 3.2.1.3), glu-

cano 1,4-alfa-maltotetrao-hidrolase (EC 3.2.1.60), glucano 1,4-alfa- malto-hexaosidase (EC 3.2.1.98), glucano 1,4 -alfa-maltotrio-hidrolase (EC 3.2.1.116) e glucano 1,4-alfa-malto-hidrolase (EC 3.2.1.133), e enzimas que hidrolisam ligações alfa-1,6-glicosídicas, sendo os pontos de ramificação na amilopectina, como pululanase (EC 3.2.1.41) e dex- trinase-limite (EC 3.2.1.142).

[00117] Uma composição para uso nos processos descritos neste documento pode ser composta de enzimas de (1) fornecedores co- merciais; (2) genes clonados que expressam enzimas; (3) caldo (tal como aquele resultante do crescimento de uma cepa microbiana no meio, em que as cepas secretam proteínas e enzimas para o meio; (4) lisados de células de cepas cultivadas como em (3); e/ou (5) material de planta que expressa enzimas. Diferentes enzimas em uma compo- sição da invenção podem ser obtidas de diferentes fontes.

[00118] As enzimas podem ser produzidas exogenamente em mi- crorganismos, leveduras, fungos, bactérias ou plantas, depois isoladas e adicionadas, por exemplo, a material lignocelulósico. Alternativamen- te, a enzima pode ser produzida em uma fermentação que usa materi- al lignocelulósico (pré-tratado) (como palha de milho ou palha de trigo) para fornecer nutrição a um organismo que produz enzima(s). Desta forma, plantas que produzem as enzimas podem, elas mesmas, servir como um material lignocelulósico e ser adicionadas ao material ligno- celulósico.

[00119] Nos usos e processos descritos neste documento, os com- ponentes das composições descritas acima podem ser fornecidos concomitantemente (isto é, como uma única composição per se) ou separadamente ou sequencialmente.

[00120] Em uma modalidade, a composição enzimática compreen- de um caldo de fermentação integral de um fungo, de preferência um caldo de fermentação integral de um fungo filamentoso, mais preferi-

velmente um caldo de fermentação integral de Rasamsonia. O caldo de fermentação integral pode ser preparado a partir da fermentação de fungos filamentosos não recombinantes e/ou recombinantes. Em uma modalidade, o fungo filamentoso é um fungo filamentoso recombinante que compreende um ou mais genes que podem ser homólogos ou he- terólogos ao fungo filamentoso. Em uma modalidade, o fungo filamen- toso é um fungo filamentoso recombinante que compreende um ou mais genes que podem ser homólogos ou heterólogos ao fungo fila- mentoso, em que o um ou mais genes codificam enzimas que podem degradar um substrato celulósico. O caldo de fermentação integral po- de compreender qualquer um dos polipeptídeos descritos acima ou qualquer combinação dos mesmos.

[00121] De preferência, a composição enzimática é um caldo de fermentação integral em que as células são mortas. O caldo de fer- mentação integral pode conter ácido(s) orgânico(s) (usado(s) para ma- tar as células), células mortas e/ou restos de células e meio de cultura.

[00122] Geralmente, fungos filamentosos são cultivados em um meio de cultura de células adequado para produção de enzimas capa- zes de hidrolisar um substrato celulósico. O cultivo ocorre em um meio nutriente adequado compreendendo fontes de carbono e nitrogênio e sais inorgânicos, usando procedimentos conhecidos na técnica. Meios de cultura adequados, faixas de temperatura e outras condições ade- quadas para o crescimento e produção de celulase e/ou hemicelulase e/ou pectinase são conhecidos na técnica. O caldo de fermentação integral pode ser preparado cultivando os fungos filamentosos até a fase estacionária e mantendo os fungos filamentosos sob condições de carbono limitantes por um período suficiente para expressar a(s) uma ou mais celulases e/ou hemicelulases e/ou pectinases. Uma vez que enzimas, como celulases e/ou hemicelulases e/ou pectinases, são secretadas pelos fungos filamentosos para o meio de fermentação, o caldo de fermentação integral pode ser usado.

O caldo de fermentação integral da presente invenção pode compreender fungos filamentosos.

Em algumas modalidades, o caldo de fermentação integral compreen- de o conteúdo não fracionado dos materiais de fermentação derivados no final da fermentação.

Tipicamente o caldo de fermentação integral compreende o meio de cultura gasto e detritos celulares presentes após o fungo filamentoso crescer até a saturação, incubado sob condi- ções limitantes de carbono para permitir a síntese de proteínas (parti- cularmente, expressão de celulases e/ou hemicelulases e/ou pectina- ses). Em algumas modalidades, o caldo de fermentação integral com- preende o meio de cultura de células gasto, enzimas extracelulares e fungos filamentosos.

Em algumas modalidades, os fungos filamento- sos presentes no caldo de fermentação integral podem ser lisados, permeabilizados ou mortos usando métodos conhecidos na técnica para produzir um caldo de fermentação integral com células mortas.

Em uma modalidade, o caldo de fermentação integral é um caldo de fermentação integral com células mortas, em que o caldo de fermenta- ção integral contendo as células de fungos filamentosos têm as células lisadas ou mortas.

Em algumas modalidades, as células são mortas por lise dos fungos filamentosos por tratamento químico e/ou de pH para gerar o caldo integral com células mortas de uma fermentação dos fungos filamentosos.

Em algumas modalidades, as células são mortas por lise dos fungos filamentosos por tratamento químico e / ou de pH e ajustando o pH da mistura de fermentação com células mortas a um pH adequado.

Em uma modalidade, o caldo de fermentação in- tegral compreende um primeiro componente de ácido orgânico con- tendo pelo menos um ácido orgânico de 1-5 carbonos e / ou um sal do mesmo e um segundo componente de ácido orgânico contendo um ácido orgânico com pelo menos 6 ou mais carbonos e / ou um sal do mesmo.

[00123] Em uma modalidade, o primeiro componente de ácido or- gânico é ácido acético, ácido fórmico, ácido propiônico, um sal do mesmo ou qualquer combinação dos mesmos e o segundo componen- te de ácido orgânico é ácido benzoico, ácido ciclo-hexanocarboxílico, ácido 4-metilvalérico, ácido fenilacético, um sal dos mesmos, ou qual- quer combinação dos mesmos.

[00124] O termo "caldo de fermentação integral", conforme aqui uti- lizado, refere-se a uma preparação produzida por fermentação celular que sofre nenhuma ou mínima recuperação e/ou purificação. Por exemplo, caldos de fermentação integrais são produzidos quando cul- turas microbianas são cultivadas até a saturação, incubadas sob con- dições limitantes de carbono para permitir a síntese de proteínas (por exemplo, expressão de enzimas por células hospedeiras) e secreção no meio de cultura de células. Tipicamente, o caldo de fermentação integral não é fracionado e compreende meio de cultura de células gasto, enzimas extracelulares e células microbianas, de preferência não viáveis.

[00125] Se necessário, o caldo de fermentação integral pode ser fracionado e um ou mais dos conteúdos fracionados podem ser usa- dos. Por exemplo, as células mortas e/ou detritos celulares podem ser removidos de um caldo de fermentação integral para fornecer uma composição que esteja livre desses componentes.

[00126] O caldo de fermentação integral pode compreender ainda um conservante e/ou agente antimicrobiano. Esses conservantes e/ou agentes são conhecidos na técnica.

[00127] O caldo de fermentação integral, conforme descrito neste documento, é tipicamente um líquido, mas pode conter componentes insolúveis, tais como células mortas, restos celulares, componentes do meio de cultura e/ou enzima(s) insolúve(l)(is). Em algumas modalida- des, componentes insolúveis podem ser removidos para fornecer um caldo de fermentação integral clarificado

[00128] Em uma modalidade, o caldo de fermentação integral pode ser suplementado com uma ou mais atividades enzimáticas que não são expressas endogenamente ou são expressas em um nível relati- vamente baixo pelos fungos filamentosos, para melhorar a degradação do substrato celulósico, por exemplo, em açúcares fermentáveis, tais como glicose ou xilose. A(s) enzima(s) suplementar(es) podem ser adicionadas como um suplemento ao caldo de fermentação integral e as enzimas podem ser um componente de um caldo de fermentação integral separado, ou podem ser purificadas ou minimamente recupe- radas e/ou purificadas.

[00129] Em uma modalidade, o caldo de fermentação integral com- preende um caldo de fermentação integral de uma fermentação de um fungo filamentoso recombinante superexpressando uma ou mais en- zimas para melhorar a degradação do substrato celulósico. Alternati- vamente, o caldo de fermentação integral pode compreender uma mis- tura de um caldo de fermentação integral de uma fermentação de um fungo filamentoso não recombinante com o de um fungo filamentoso recombinante superexpressando uma ou mais enzimas para melhorar a degradação do substrato celulósico. Em uma modalidade, o caldo de fermentação integral compreende um caldo de fermentação integral de uma fermentação de um fungo filamentoso superexpressando beta- glucosidase ou endoglucanase. Alternativamente, o caldo de fermen- tação integral para uso nos presentes métodos e composições reativas pode compreender uma mistura de um caldo de fermentação integral de uma fermentação de um fungo filamentoso não recombinante com um caldo de fermentação integral de uma fermentação de um fungo filamentoso recombinante superexpressando uma beta -glucosidase ou endoglucanase.

[00130] Material celulósico, conforme usado neste documento, in-

clui qualquer material contendo celulose.

De preferência, o material celulósico aqui utilizado inclui material lignocelulósico e/ou hemiceluló- sico.

No máximo da preferência, o material celulósico conforme aqui usado é material lignocelulósico.

O material celulósico adequado para uso nos processos conforme descrito neste documento inclui biomas- sa, por exemplo, biomassa virgem e/ou biomassa não virgem, como biomassa agrícola, produtos orgânicos comerciais, entulhos de cons- trução e demolição, resíduos sólidos urbanos, resíduos de papel e re- síduos de quintal.

Formas comuns de biomassa incluem árvores, ar- bustos e gramíneas, trigo, centeio, aveia, palha de trigo, cana-de- açúcar, palha de cana-de-açúcar, bagaço de cana-de-açúcar, gramí- nea "switchgrass"(Panicum virgatum), Miscanthus, cana de energia, mandioca, melaço, cevada, milho, resíduos de espigas de milho (resto- lho de milho - corn stover), fibra de milho, palha de milho, espigas de milho, caules de canola, caules de soja, sorgo doce, grãos de milho incluindo fibras de grãos, grãos secos de destilaria (distillers dried gra- ins DDGS), produtos e subprodutos da moagem de grãos como milho, trigo e cevada (incluindo moagem úmida e moagem a seco), muitas vezes chamados de "farelo ou fibra", bem como resíduos sólidos urba- nos, resíduos de papel e resíduos de quintal.

A biomassa também po- de ser, mas não está limitada a, material herbáceo, resíduos agrícolas, resíduos florestais, resíduos sólidos urbanos, resíduos de madeira (ti- po A, B e/ou C) resíduos de papel e resíduos de polpa de celulose e papel. "Biomassa agrícola" inclui ramos, arbustos, canas, milho e cas- cas de milho, culturas energéticas, florestas, frutas, flores, grãos, gra- míneas, culturas herbáceas, folhas, cascas, agulhas, troncos, raízes, mudas, culturas lenhosas de rotação curta, arbustos , gramíneas "switchgrass"(Panicum virgatum), árvores, vegetais, cascas de frutas, vinhas, beterraba, polpa de beterraba sacarina, sêmeas de trigo, cas- cas de aveia e madeiras duras e macias (não incluindo madeiras com materiais nocivos). Além disso, a biomassa agrícola inclui resíduos or- gânicos gerados a partir de processos agrícolas, incluindo atividades agrícolas e florestais, especificamente incluindo resíduos de madeira florestal. Biomassa agrícola pode ser qualquer uma das acima menci- onadas individualmente ou em qualquer combinação ou mistura das mesmas.

[00131] O material celulósico é pré-tratado antes da etapa de hidró- lise. Métodos de pré-tratamento são conhecidos na técnica e incluem, mas não estão limitados a calor, modificação mecânica, química, mo- dificação biológica e qualquer combinação dos mesmos. O pré- tratamento é tipicamente realizado para aumentar a acessibilidade do material celulósico à hidrólise enzimática e/ou hidrolisar a hemicelulo- se e/ou solubilizar a hemicelulose e/ou celulose e/ou lignina, no mate- rial celulósico. Em uma modalidade, o pré-tratamento compreende tra- tar o material celulósico com explosão de vapor, tratamento de água quente ou tratamento com ácido ou base diluída.

[00132] Exemplos de métodos de pré-tratamento incluem, mas não se limitam a, tratamento com vapor (por exemplo, tratamento a 100- 260ºC, a uma pressão de 7-45 bar, em pH neutro, por 1-10 minutos), tratamento com ácido diluído (por exemplo, tratamento com 0,1 a 5 % H2SO4 e/ou SO2 e/ou HNO3 e/ou HCl, na presença ou na ausência de vapor, a 120-200ºC, a uma pressão de 2-15 bar, em pH ácido, por 2- 30 minutos), tratamento com organosolv (por exemplo, tratamento com H2SO4 1 - 1,5% na presença de solvente orgânico e vapor, a 160- 200ºC, a uma pressão de 7 a 30 bar, em pH ácido, por 30 a 60 minu- tos), tratamento com cal (por exemplo, tratamento com 0,1 - 2% Na- OH/Ca(OH)2 na presença de água/vapor a 60-160ºC, a uma pressão de 1-10 bar, em pH alcalino, por 60-4800 minutos), tratamento ARP (por exemplo, tratamento com 5 -15 % NH3, a 150-180ºC, a uma pres- são de 9 a 17 bar, em pH alcalino, por 10-90 minutos), tratamento

AFEX (por exemplo, tratamento com > 15% de NH3, a 60-140ºC, a uma pressão de 8 -20 bar, em pH alcalino, por 5-30 minutos).

[00133] Em uma modalidade, o pré-tratamento é feito na ausência de oxigênio.

[00134] O material celulósico pode ser lavado. Em uma modalidade, o material celulósico pode ser lavado após o pré-tratamento. A etapa de lavagem pode ser usada para remover compostos solúveis em água que podem atuar como inibidores para a etapa de fermentação e/ou hidrólise. A etapa de lavagem pode ser conduzida de maneira co- nhecida pelo especialista. Além da lavagem, existem outros métodos de destoxificação. O material celulósico pré-tratado também pode ser destoxificado por qualquer (ou qualquer combinação) destes métodos que incluem, mas não estão limitados a separação sólido/líquido, eva- poração a vácuo, extração, adsorção, neutralização, overliming, adição de agentes redutores, adição de enzimas destoxificantes como laca- ses ou peroxidases, adição de microrganismos capazes de destoxificar hidrolisados.

[00135] A composição de enzima como aqui descrita pode hidrolisar de forma extremamente eficaz o material celulósico, por exemplo res- tolho de milho (corn stover), palha de trigo, palha de cana e/ou bagaço de cana de açúcar, que pode então ser posteriormente convertido em um produto, como uma composição de enzima.

[00136] Em uma modalidade, a composição enzimática é usada na hidrólise enzimática em uma quantidade de 4,5 mg a 15 mg de proteí- na/grama de peso de matéria seca de glucanos no material celulósico. Em uma modalidade, a composição enzimática é usada na hidrólise enzimática em uma quantidade de 5 mg a 14 mg de proteína/grama de peso de matéria seca de glucanos no material celulósico. Em uma modalidade, a composição enzimática é usada na hidrólise enzimática em uma quantidade de 6 mg a 12 mg de proteína/grama de peso de matéria seca de glucanos no material celulósico.

[00137] Proteína é medida de acordo com a análise de TCA (ácido tricloroacético) -Biureto como aqui descrito.

[00138] Em uma modalidade, o teor de matéria seca na hidrólise é de 10% a 40% (p/p). Em uma modalidade, o material celulósico pré- tratado que é hidrolisado tem um teor de matéria seca de 10 a 40% (p/p). Em uma modalidade, o teor de matéria seca do material celuló- sico na hidrólise enzimática é de 10% a 40% (p/p), de 11% a 35% (p/p), de 12% a 30% (p/p), de 13% a 29% (p/p), de 14% a 28% (p/p) e, de preferência, de 15% a 25% (p/p).

[00139] Em uma modalidade, a etapa de hidrólise é conduzida a uma temperatura de 40-90ºC, preferivelmente de 45-70ºC, mais prefe- rivelmente de 55-65ºC.

[00140] Em uma modalidade, a fermentação é feita em um reator. Em uma modalidade, a fermentação também pode ser feita em dois, três, quatro, cinco, seis, sete, oito, nove, dez ou até mais reatores. Portanto, o termo "reator" não se limita a um único reator, mas pode significar vários reatores.

[00141] Em uma modalidade, a fermentação é feita em um reator com um volume de 1-5000 m3. No caso de múltiplos reatores serem usados na fermentação dos processos descritos neste documento, eles podem ter o mesmo volume, mas também podem ter um volume diferente.

[00142] Em uma modalidade, o reator no qual a fermentação é feita tem uma proporção de altura para diâmetro de 2:1 a 8:1.

[00143] Em uma modalidade, a fermentação é realizada por um fungo como já descrito acima. O fungo fermenta o hidrolisado para produzir a composição enzimática.

[00144] A invenção também se refere a um hidrolisado compreen- dendo 500 - 900 g de açúcares/kg de hidrolisado em matéria seca e

0,5 - 3,5% (p/p) de um hidróxido de um metal alcalino e/ou um hidróxi- do de um metal alcalino-terroso. Em uma modalidade, o hidrolisado compreende 500 - 900 g de açúcares/kg de hidrolisado em matéria seca e 1,0 - 3,0% (p/p) de hidróxido de metal alcalino e/ou hidróxido de metal alcalino-terroso. Em uma modalidade preferida, o hidrolisado compreende 500 - 900 g de açúcares/kg de hidrolisado em matéria seca e 1,5 - 2,5% (p/p) de hidróxido de metal alcalino e/ou hidróxido de metal alcalino-terroso. Hidróxidos de metal alcalino e/ou hidróxidos de metal alcalino-terroso adequados foram aqui descritos.

[00145] A invenção também se refere a um hidrolisado compreen- dendo 500 - 900 g de açúcares/kg de hidrolisado em matéria seca e 0,5 - 3,5% (p/p) de uma base forte. Bases fortes adequadas foram aqui descritas. Em uma modalidade, o hidrolisado compreende 500 - 900 g de açúcares/kg de hidrolisado em matéria seca e 1,0 - 3,0% (p/p) de uma base forte. Em uma modalidade preferida, o hidrolisado compre- ende 500 - 900 g de açúcares/kg de hidrolisado em matéria seca e 1,5 - 2,5% (p/p) de uma base forte.

[00146] Em uma modalidade preferida, o hidrolisado é preparado como aqui descrito. Em uma modalidade preferida, o hidrolisado é preparado por pré-tratamento do material celulósico e hidrólise enzi- mática do material celulósico pré-tratado para obter o hidrolisado. O hidrolisado pode ser preparado realizando as etapas (a) e (b) dos pro- cessos descritos neste documento.

[00147] A invenção também se refere a uma mistura de fermenta- ção compreendendo um hidrolisado, um fungo e 0,02 - 20 g de um hi- dróxido de metal alcalino e/ou um hidróxido de metal alcalino-terroso por kg de mistura de fermentação. Em uma modalidade, a mistura de fermentação compreende um hidrolisado, um fungo e 0,03 - 18 g de um hidróxido de metal alcalino e/ou um hidróxido de metal alcalino- terroso por kg de mistura de fermentação. Em uma modalidade, a mis-

tura de fermentação compreende um hidrolisado, um fungo e 0,04 - 16 g de um hidróxido de metal alcalino e/ou um hidróxido de metal alcali- no-terroso por kg de mistura de fermentação. Em uma modalidade pre- ferida, a mistura de fermentação compreende um hidrolisado, um fun- go e 0,05-15 g de um hidróxido de metal alcalino e/ou um hidróxido de metal alcalino-terroso por kg de mistura de fermentação. O hidrolisado pode ser o hidrolisado conforme descrito acima.

[00148] O hidrolisado pode ser preparado conforme descrito neste documento. O hidrolisado pode ser preparado por pré-tratamento do material celulósico e hidrólise enzimática do material celulósico pré- tratado. O hidrolisado pode ser preparado realizando as etapas (a) e (b) dos processos descritos neste documento. O fungo pode ser um fungo conforme descrito neste documento. A mistura de fermentação pode ainda compreender uma celulase, uma hemicelulase e / ou uma pectinase. Celulases, hemicelulases e/ou pectinases adequadas foram aqui descritas. A mistura de fermentação pode ser preparada confor- me descrito neste documento. Em uma modalidade, a mistura de fer- mentação é preparada por pré-tratamento do material celulósico, hi- drólise enzimática do material celulósico pré-tratado para obter um hi- drolisado e fermentação do hidrolisado

EXEMPLOS Exemplo 1 Controle de pH na hidrólise enzimática de restolho de milho (corn stover)

[00149] O efeito do uso de diferentes titulantes para ajustar e man- ter o pH em um valor constante durante a hidrólise enzimática do ma- terial de carboidrato pré-tratado é mostrado neste exemplo.

[00150] O coquetel de celulase de Rasamsonia emersonii (ou seja, um caldo de fermentação integral) foi produzido de acordo com os mé- todos descritos em WO 2011/000949. Além disso, Rasamsonia emer-

sonii beta-glucosidase conforme descrito em WO2012 / 000890 foi usado nos experimentos.

[00151] A concentração de proteína do coquetel de celulase foi de- terminada usando um método de biureto. Amostras de coquetéis foram diluídas com base em peso com água e centrifugadas por 5 minutos a> 14000xg. Diluições de albumina de soro bovino (Bovine serum al- bumin BSA) (0,5, 1, 2, 5, 10 e 15 mg/ml) foram feitas para gerar uma curva de calibração. De cada amostra de proteína diluída (do BSA e do coquetel), 200 µl do sobrenadante foram transferidos para um tubo de reação de 1,5 ml. Foram adicionados 800 µl de reagente BioQuant Biuret e misturados completamente. Da mesma amostra de proteína diluída, 500 µl foram adicionados ao tubo de reação contendo um filtro de 10KD. 200 µl do efluente foram transferidos para um tubo de rea- ção de 1,5 ml, 800 µl de reagente BioQuant Biuret foram adicionados e bem misturados. Em seguida, todas as misturas (amostra de proteína diluída antes e após a filtração de 10KD misturada com BioQuant) fo- ram incubadas em temperatura ambiente por pelo menos 30 minutos. A absorção das misturas foi medida a 546 nm com uma amostra de água usada como uma medição em branco. Diluições do coquetel que deram um valor de absorção a 546 nm dentro da faixa da linha de cali- bração foram utilizadas para calcular a concentração de proteína total das amostras do coquetel de celulase por meio da linha de calibração com BSA.

[00152] A atividade enzimática da beta-glucosidase (WBDG) foi de- terminada a 37°C e pH 4,4 usando para-nitrofenil-ß-D- glucopiranosídeo como substrato. A hidrólise enzimática de pNP-beta- D-glucopiranosídeo resultou na liberação de para-nitrofenol (pNP) e D- glicose. O para-nitrofenol liberado quantitativamente, determinado em condições alcalinas, foi uma medida para a atividade enzimática. Após 10 minutos de incubação, a reação foi interrompida pela adição de carbonato de sódio 1 M e a absorbância foi determinada a um com- primento de onda de 405 nm. A atividade da beta-glicosidase foi calcu- lada usando o coeficiente de extinção molar do para-nitrofenol. Uma linha de calibração de para-nitro-fenol foi preparada diluindo uma solu- ção de estoque de pNP 10 mM em tampão acetato 100 mM pH 4,40 0,1% BSA para concentrações de pNP de 0,25, 0,40, 0,67 e 1,25 mM. O substrato era uma solução de pNP-BDG 5,0 mM em um tampão acetato (100 mM, pH 4,4). A 3 ml de substrato, 200 µl de solução de calibração e 3 ml de carbonato de sódio 1M foram adicionados. A ab- sorção da mistura foi medida a 405 nm com um tampão de acetato (100 mM) usado como uma medição em branco. O teor de pNP foi calculado usando protocolos de cálculo padrão conhecidos na técnica, plotando OD405 versus a concentração de amostras com concentração conhecida, seguido pelo cálculo da concentração das amostras des- conhecidas usando a equação gerada a partir da linha de calibração. Amostras foram diluídas em peso correspondendo a uma atividade entre 1,7 e 3,3 unidades. A 3 ml de substrato, pré-aquecido a 37°C, foram adicionados 200 µl de solução de amostra diluída. Isso foi regis- trado como t = 0. Após 10,0 minutos, a reação foi interrompida pela adição de 3 ml de carbonato de sódio 1M. A atividade da beta- glucosidase é expressa em unidades WBDG por grama de caldo de enzima. Uma unidade WBDG é definida como a quantidade de enzima que libera um nanomol de para-nitrofenol por segundo a partir de para- nitrofenil-beta-D-glucopiranosídeo sob as condições de ensaio defini- das (4,7 mM pNPBDG, pH = 4,4 e T = 37°C).

[00153] Material de carboidrato pré-tratado concentrado foi feito in- cubando palha de milho por 6,7 minutos a 186°C. Antes do tratamento térmico, o restolho de milho foi impregnado com H2SO4 por 10 minutos para definir o pH em 2,3 durante o pré-tratamento.

[00154] As reações de hidrólise enzimática foram realizadas em re-

atores fechados agitados, com pH e temperatura controlados, com um volume de trabalho de 1 l. Cada hidrólise foi realizada em pH 4,5 e a 62°C. O material de carboidrato pré-tratado concentrado foi diluído com água para obter um material de carboidrato pré-tratado com uma concentração final de 17% (p/p) de matéria seca. Posteriormente, o pH foi ajustado para pH 4,5 com: Experimento 1: solução de NH3 (aq) a 10% (p/p); Experimento 2: solução de hidróxido de potássio 4 M; Experimento 3: solução de hidróxido de sódio 4 M; Experimento 4: solução de hidróxido de cálcio 5 M.

[00155] Para cada experimento as mesmas soluções foram utiliza- das para manter o pH em 4,5 durante a hidrólise enzimática.

[00156] Os reatores usados para hidrólise enzimática foram agita- dos a 150 rpm por 18 horas, enquanto o espaço superior (headspace) foi continuamente renovado por um fluxo de nitrogênio (100 ml / min) a 62°C. Posteriormente, as reações de hidrólise foram iniciadas pela adição de 2,5 mg de coquetel de celulase de Rasamsonia emersonii + 300 WBDG/g de matéria seca. Após 24 horas de hidrólise, o fluxo de nitrogênio (100 ml / min) foi trocado por um fluxo de ar (100 ml/min) e a velocidade de agitação foi aumentada para 250 rpm, resultando em um nível de oxigênio dissolvido (dissolved oxygen - DO) de ≥ 70% (ou seja, 0,111 mol / m3) na mistura de reação, conforme medido por um eletrodo DO. O tempo total de hidrólise enzimática foi de 120 horas.

[00157] No final da hidrólise, foram retiradas amostras para análise as quais foram imediatamente centrifugadas por 8 minutos a 4000xg. O sobrenadante foi filtrado em filtros de náilon de 0,2 µm (Whatman) e armazenado a 4°C até a análise do teor de açúcar como descrito abai- xo.

[00158] As concentrações de açúcar das amostras diluídas foram medidas usando um HPLC equipado com uma coluna Aminex HPX-

87H de acordo com o relatório técnico NREL / TP-510-42623, janeiro de 2008. Os resultados são apresentados na Tabela 1.

[00159] Os resultados da Tabela 1 mostram claramente uma maior concentração de glicose e xilose quando o pH do material de carboi- drato pré-tratado é controlado antes e/ou durante a hidrólise enzimáti- ca pela adição de um hidróxido de metal alcalino e/ou de um hidróxido de metal alcalino-terroso (por exemplo hidróxido de potássio, hidróxido de sódio ou hidróxido de cálcio) ao material de carboidrato pré-tratado. Exemplo 2 Controle de pH na hidrólise enzimática de madeira

[00160] O efeito do uso de diferentes titulantes para ajustar e man- ter o pH em um valor constante durante um processo de hidrólise en- zimática para fazer hidrolisados úteis para o processo de produção de enzima fermentativa é mostrado neste exemplo.

[00161] O coquetel de celulase de Rasamsonia emersonii (ou seja, um caldo de fermentação integral) foi produzido de acordo com os mé- todos descritos em WO 2011/000949. Além disso, beta-glucosidase de Rasamsonia emersonii conforme descrito em WO2012/000890 foi usada nos experimentos. A concentração de proteína do coquetel de celulase e a atividade enzimática de beta-glucosidase (WBDG) foram determinadas conforme descrito no Exemplo 1.

[00162] O material de carboidrato pré-tratado foi feito a partir de madeira de choupo por equipamento de explosão com vapor em esca- la de bancada com H2SO4 por 10 minutos a 180°C (pH 1,75).

[00163] Antes da hidrólise enzimática, o pH do material de carboi- drato pré-tratado (contendo 30% (p/p) de matéria seca) foi ajustado para pH 4,5 usando dois titulantes diferentes (Experimentos 1 e 2) co- mo descrito abaixo. O material de carboidrato pré-tratado foi diluído com água para se obter um material de carboidrato pré-tratado com uma concentração final de 10% (p/p) de matéria seca. As reações de hidrólise enzimática foram realizadas em reatores fechados agitados, com pH e temperatura controlados, com um volume de trabalho de 1 l. Cada hidrólise foi realizada em pH 4,5 e a 62°C. Experimento 1: solução de NH3 (aq) a 10% (p/p); Experimento 2: solução de hidróxido de sódio 4 M.

[00164] As reações de hidrólise foram iniciadas pela adição de 10 mg/g de matéria seca de coquetel de celulase de Rasamsonia emer- sonii + 1200 WBDG/g de matéria seca. O tempo total de hidrólise en- zimática foi de 72 horas.

[00165] No final da hidrólise, os hidrolisados obtidos foram filtrados em uma placa de filtro de profundidade HS2000 e concentrados em evaporador rotativo a 50ºC até uma concentração de cerca de 500 g de açúcares totais por kg de hidrolisado concentrado como tal. Depois disso, os hidrolisados concentrados foram esterilizados para torná-los prontos para uso em um processo de fermentação para produzir um coquetel de enzimas celulolíticas fúngicas. A esterilização foi feita au- toclavando os hidrolisados por 10 minutos a 110ºC. Os resultados são apresentados na Tabela 2.

[00166] Os resultados na Tabela 2 mostram claramente que o hi- drolisado feito pelo controle de pH do material de carboidrato pré- tratado antes e / ou durante a hidrólise enzimática por adição de amô- nia não pode ser usado em um processo de fermentação para fazer um coquetel de enzimas celulolíticas fúngicas devido a problemas de precipitação, enquanto o hidrolisado feito controlando o pH do material de carboidrato pré-tratado antes e/ou durante a hidrólise enzimática por adição de um hidróxido de metal alcalino e/ou um hidróxido um metal alcalino-terroso (por exemplo, hidróxido de sódio) é adequado para fazer um coquetel de enzima celulolítica fúngica em um processo de fermentação.

[00167] Resultados semelhantes também foram encontrados quan-

do a esterilização foi feita esterilizando os hidrolisados por 15 minutos a 120ºC.

[00168] Resultados semelhantes também foram encontrados quan- do resíduos de madeira foram usados como material de carboidrato pré-tratado concentrado. Exemplo 3 Controle de pH na hidrólise enzimática de madeira

[00169] O experimento foi feito conforme descrito no Exemplo 2 com a condição de que o pré-tratamento foi feito em escala piloto em condições de rigor semelhantes; as reações de hidrólise enzimática foram feitas em reatores fechados agitados, com pH controlado e tem- peratura controlada com um volume de trabalho de 4 m3. Os resulta- dos são mostrados na Tabela 3.

[00170] A Tabela 3 mostra que os resultados de experimentos em larga escala são semelhantes aos resultados do Exemplo 2; que ne- nhum problema de precipitação foi encontrado quando o pH do mate- rial de carboidrato pré-tratado é controlado antes e/ou durante a hidró- lise pela adição de um hidróxido de metal alcalino e/ou um hidróxido de metal alcalino-terroso ao material de carboidrato pré-tratado. Os hidrolisados obtidos quando o pH do material de carboidrato pré- tratado é controlado antes e/ou durante a hidrólise pela adição de um hidróxido de metal alcalino e/ou um hidróxido de metal alcalino-terroso ao material de carboidrato pré-tratado foram usados em um processo de fermentação para fazer um coquetel de enzimas celulolíticas fúngi- cas e foi verificado que são facilmente fermentáveis. Tabela 1: Concentrações de glicose e xilose após 120 horas de hidró- lise utilizando diferentes soluções para controle de pH. Experimento # Glicose (g/L) Xilose (g/L) Glicose + Xilose (g/L) 1 42,4 30,7 73,1 2 43,6 32,7 76,3

Experimento # Glicose (g/L) Xilose (g/L) Glicose + Xilose (g/L) 3 44,3 32,6 76,9 4 43,3 33,2 76,5 Tabela 2: Produção de um coquetel de enzimas celulolíticas fúngicas com hidrolisados.

Experimento # Precipitação do hi- Hidrolisado adequado drolisado após esteri- para produção de co- lização quetel de enzimas 1 + - 2 - + Tabela 3: Produção de um coquetel de enzimas celulolíticas fúngicas com hidrolisados em larga escala.

Experimento # Precipitação do hi- Hidrolisado adequado drolisado após esteri- para produção de co- lização quetel de enzimas 1 + - 2 - +* * O hidrolisado foi usado com sucesso na produção de coquetéis de enzimas.

Claims (13)

REIVINDICAÇÕES

1. Processo para preparação de uma composição enzimáti- ca, caracterizado pelo fato de que compreende as etapas de (a) pré-tratamento do material celulósico, (b) hidrólise enzimática do material celulósico pré-tratado para obter um hidrolisado, (c) fermentação do hidrolisado para produzir a composição enzimática, e (d) opcionalmente, recuperação da composição enzimática, em que o pH do material celulósico pré-tratado é controlado antes e/ou durante a etapa (b) pela adição de um hidróxido de metal alcalino e/ou um hidróxido de metal alcalino-terroso ao material celuló- sico pré-tratado

2. Processo de acordo com a reivindicação 1 caracterizado pelo fato que o hidrolisado obtido é concentrado antes da fermentação

3. Processo de acordo com a reivindicação 2 caracterizado pelo fato que o hidrolisado concentrado é esterilizado antes da fermen- tação

4. Processo, de acordo com qualquer uma das reivindica- ções 1 a 3, caracterizado pelo fato que o hidróxido de metal alcalino e o hidróxido de metal alcalino-terroso são selecionados no grupo que consiste em hidróxido de alumínio, hidróxido de bário, hidróxido de cálcio, hidróxido de césio, hidróxido de potássio, hidróxido de lítio, hi- dróxido de magnésio, hidróxido de sódio, hidróxido de rubídio, hidróxi- do de estrôncio e qualquer combinação dos mesmos

5. Processo, de acordo com qualquer uma das reivindica- ções 1 a 4, caracterizado pelo fato que o pH do material celulósico pré- tratado é controlado antes e/ou durante a etapa (b) de modo a ficar na faixa de 3,0 a 6,5.

6. Processo, de acordo com qualquer uma das reivindica-

ções 1 a 5, caracterizado pelo fato que oxigênio é adicionado durante a etapa (b).

7. Processo, de acordo com qualquer uma das reivindica- ções 1 a 6, caracterizado pelo fato que a composição enzimática é produzida por um fungo.

8. Processo, de acordo com qualquer uma das reivindica- ções 1 a 7, caracterizado pelo fato que a composição enzimática com- preende um caldo de fermentação integral de um fungo.

9. Processo, de acordo com qualquer uma das reivindica- ções 1 a 8, caracterizado pelo fato que a composição enzimática com- preende uma celobio-hidrolase, uma endoglucanase, uma beta- glucosidase, uma endoxilanase, uma beta-xilosidase e uma monoxi- genase de polissacarídeo líticos polissacarídeo lítico.

10. Processo, de acordo com qualquer uma das reivindica- ções 1 a 9, caracterizado pelo fato de que compreende um teor de ma- téria seca na hidrólise de 10% a 40% (p/p).

11. Processo, de acordo com qualquer uma das reivindica- ções 1 a 10, caracterizado pelo fato que o pH é medido antes e/ou du- rante a etapa (b).

12. Hidrolisado concentrado, caracterizado pelo fato de que contém 500-900 g de açúcares/kg de hidrolisado em matéria seca e 0,5 - 3,5% (p/p) de um hidróxido de metal alcalino e/ou um hidróxido de metal alcalino-terroso.

13. Mistura de fermentação caracterizado pelo fato de que compreende um hidrolisado, um fungo e 0,02 - 20 g de um hidróxido de metal alcalino e/ou um hidróxido de metal alcalino-terroso por kg de mistura de fermentação