BR112017007640B1 - Processo para a preparação de um produto de açúcar e fermentação a partir de material lignocelulósico - Google Patents

Abstract

PROCESSO PARA HIDRÓLISE ENZIMÁTICA DE MATERIAL LIGNOCELULOSICO E FERMENTAÇÃO DE AÇÚCARES. A invenção se refere a um processo para a preparação de um açúcar e/ou produto de fermentação a partir de material lignocelulósico.

Description

Campo da invenção

A invenção se refere a um processo para a hidrólise enzimática de material lignocelulósico e fermentação de açúcares.

Antecedentes da invenção

O material lignocelulósico é principalmente composto por celulose, hemicelulose e lignina e fornece uma plataforma atraente para gerar fontes de energia alternativa a combustíveis fósseis. O material está disponível em grandes quantidades e pode ser convertido em produtos valiosos, por exemplo, açúcares ou biocombustível, como bioetanol.

A produção de produtos de fermentação a partir de material lignocelulósico é conhecida na técnica e, em geral, inclui as etapas de pré-tratamento, hidrólise, fermentação e, opcionalmente, recuperação dos produtos de fermentação.

Durante a hidrólise, a qual pode compreender as etapas de liquefação, pré-sacarificação e/ou sacarificação, a celulose presente no material lignocelulósico é parcialmente (tipicamente 30 a 95 %, dependendo da atividade enzimática e das condições de hidrólise) convertida em açúcares redutores por enzimas celulóticas. A hidrólise ocorre tipicamente durante um processo que dura de 6 a 168 horas (consultar Kumar, S., Chem. Eng. Technol. 32 (2009), 517 a 526) sob temperaturas elevadas de 45 a 50 °C e condições não estéreis.

Usualmente, os açúcares são, então, convertidos em produtos de fermentação valiosos, como etanol, por micro-organismos como levedura. A fermentação ocorre em uma etapa de processo separada, de preferência anaeróbica, no mesmo vaso ou em um vaso diferente. A temperatura durante a fermentação é ajustada a 30 a 33 °C para acomodar o crescimento e a produção de etanol por micro-organismos, usualmente, leveduras. Durante o processo de fermentação, o material celulósico restante é convertido em açúcares redutores pelas enzimas já presentes a partir da etapa de hidrólise, enquanto a biomassa microbiana e o etanol são produzidos. A fermentação é finalizada após o material celulósico ser convertido em açúcares fermentáveis e todos os açúcares fermentáveis são convertidos em etanol, dióxido de carbono e biomassa microbiana. Isso pode levar até 6 dias. Em geral, o tempo total de processo de hidrólise e fermentação pode somar até 13 dias.

Em geral, o custo de produção de enzima é um grande fator de custo no processo geral de produção de produtos de fermentação a partir de material lignocelulósico (consultar Kumar, S., Chem. Eng. Technol. 32 (2009), 517 a 526). Até o momento, a redução de custos de produção de enzima é alcançada aplicando-se produtos de enzima a partir de uma única fonte microbiana ou de múltiplas fontes microbianas (consultar documento WO 2008/008793) com atividade hidrolitica mais ampla e/ou maior (especifica). Isso leva a uma menor necessidade de enzimas, taxas de conversão mais rápidas e/ou maiores rendimentos de conversão e, desse modo, custos gerais de produção mais baixos.

Após a otimização de enzimas, a otimização do projeto de processo é uma ferramenta crucial para reduzir os custos gerais da produção de produtos de fermentação.

Por motivos econômicos, é, portanto, desejável incluir novas e inovadoras configurações de processo que tenham como objetivo reduzir os custos gerais de produção no processo que envolvem hidrólise e fermentação de material lignocelulósico.

Sumário da invenção

Um objetivo da invenção consiste em fornecer um processo melhorado para a preparação de um produto de açúcar e/ou um produto de fermentação a partir de material lignocelulósico. Outro objetivo consiste em fornecer um processo que envolve hidrólise, sendo que as condições de processo da hidrólise são otimizadas. A otimização se refere a qualquer um dos seguintes recursos. compreende pelo menos duas etapas, uma etapa de alimentação e uma etapa de sacarificação. As ditas etapas podem ser realizadas em diferentes recipientes. A etapa de alimentação se inicia adicionando-se material lignocelulósico a um recipiente em que uma composição enzimática está presente. Então, enzimas usadas no processo de hidrólise estão presentes no inicio da etapa de alimentação. Durante a etapa de alimentação, o material lignocelulósico é liquefeito pelas enzimas, e os açúcares são liberados. A taxa de adição do material lignocelulósico ao recipiente é determinada pela viscosidade do material presente no recipiente. Então, a viscosidade do material no recipiente pode ser controlada. De preferência, o material lignocelulósico no recipiente é mantido liquido durante a etapa de alimentação e é, então, facilmente miscivel. Isso reduz custos de energia, diminui a intensidade de mistura e, portanto, resulta em um processo de produção geral mais eficiente.

Além disso, esse processo de hidrólise tem a vantagem de que o pH pode ser ajustado em linha no recipiente, em que a etapa de alimentação e/ou a etapa de sacarificação ocorrem e não há necessidade de ajustar o pH do material lignocelulósico antes da adição ao recipiente.

Durante a etapa de sacarificação, a viscosidade do material lignocelulósico não é alterada substancialmente em comparação à viscosidade do material presente no recipiente durante a etapa de alimentação.

Durante a etapa de alimentação e/ou a etapa de sacarificação, oxigênio pode ser fornecido aos recipientes, por exemplo, ao espaço livre dos recipientes. Através da adição de oxigênio, é possivel obter muitas vantagens de processo, incluindo condições ideais de temperatura, tempo reduzido de processo, dosagem reduzida de enzima, reutilização de enzimas, maiores rendimentos e outras otimizações de processo, resultando em custos reduzidos. Já que a taxa de adição do material lignocelulósico pode ser controlada, o fornecimento de material lignocelulósico pode ser equilibrado com a necessidade de oxigênio por tipo de material lignocelulósico.

Ademais, permitindo-se que o material lignocelulósico passe pelo espaço livre rico em oxigênio de um recipiente, o oxigênio pode ser diretamente fornecido ao material lignocelulósico. Então, pode não haver necessidade de aeração adicional por meio de, por exemplo, bolhas ou através de agitação vigorosa. Isso evita formação de espuma e reduz o consumo de energia exigido para agitar e/ou criar um fluxo de gás através do material no recipiente.

Além disso, com o uso de diferentes enzimas durante a etapa de alimentação e a etapa de sacarificação, o processo de hidrólise pode ser adicionalmente otimizado. Por exemplo, uma composição enzimática que compreende pelo menos duas celulases como endoglucanases e/ou mono-oxigenases liticas de polissacarideo pode ser usada durante a etapa de alimentação, enquanto uma composição enzimática que compreende pelo menos duas celulases como celobiohidrolases e beta-glucosidases pode ser usada durante a fase de sacarificação.

Durante a etapa de alimentação, calor é facilmente transferido para o material presente no recipiente, já que a baixa viscosidade permite uma mistura homogênea e, então, uma divisão igual de calor e temperatura. Isso torna possivel otimizar e minimizar a entrada de energia para aquecimento e evita um aumento local de temperatura que pode inativar a atividade enzimática.

Devido ao baixo nivel de viscosidade controlado durante a etapa de alimentação e a etapa de sacarificação, o nivel de oxigênio dissolvido pode ser controlado sem agitação ou mistura extensiva. Isso torna possivel otimizar e minimizar a entrada de energia para fornecimento de oxigênio e evita diferenças locais de concentração de oxigênio dissolvido que podem resultar em variação local de atividade enzimática. Devido ao controle de oxigênio dissolvido, a inativação de enzima devido à oxidação pode ser limitada.

Com o uso dos processos da presente invenção, é possível obter muitas vantagens de processo, incluindo condições ideais de temperatura, tempo reduzido de processo, dosagem reduzida de enzima, reutilização de enzimas e outras otimizações de processo, resultando em custos reduzidos. De modo vantajoso, a invenção fornece processos em que a etapa de hidrólise é conduzida em condições melhoradas. A invenção também fornece um processo que envolve hidrólise que tem um tempo reduzido de processo. A invenção fornece, ainda, um processo que é simples e robusto.

Descrição detalhada da invenção

Ao longo do presente relatório descritivo e das reivindicações anexas, as palavras "compreender" e "incluir" e variações como "compreende", "que compreende", "inclui" e "que inclui" devem ser interpretadas de modo inclusivo. Ou seja, essas palavras são destinadas a expressar a possível inclusão de outros elementos ou números inteiros não especificamente citados, quando o contexto permite. Os artigos "um" e "uma" são usados no presente documento para se referir a um ou a mais de um (isto é, a um ou pelo menos um) do objeto gramatical do artigo. Com fins exemplificativos, "um elemento" pode significar um elemento ou mais de um elemento.

A presente invenção se refere a um processo para a preparação de um produto de açúcar a partir de material lignocelulósico, o qual compreende as seguintes etapas: (a) opcionalmente, pré-tratamento do material lignocelulósico; (b) opcionalmente, lavagem do material lignocelulósico opcionalmente pré-tratado; (c) adição por batelada alimentada do material lignocelulósico opcionalmente lavado e/ou opcionalmente pré-tratado a um primeiro recipiente que compreende uma composição enzimática que compreende pelo menos duas celulases; (d) hidrólise enzimática do material lignocelulósico opcionalmente lavado e/ou opcionalmente pré- tratado no primeiro recipiente com o uso da composição enzimática que compreende pelo menos duas celulases para liquefazer o material lignocelulósico; (e) adição do material liquefeito a um segundo hidrólise enzimática do material lignocelulósico liquefeito no segundo recipiente com o uso de uma composição enzimática que compreende pelo menos duas celulases para obter um produto de açúcar; e (g) opcionalmente, recuperação do produto de açúcar.

A presente invenção também abrange um processo em que a etapa (e) é opcional, isto é, um processo para a preparação de um produto de açúcar a partir de material lignocelulósico, o qual compreende as seguintes etapas: (a) opcionalmente, pré-tratamento do material lignocelulósico; (b) opcionalmente, lavagem do material lignocelulósico opcionalmente pré-tratado; (c) adição por batelada alimentada do material lignocelulósico opcionalmente lavado e/ou opcionalmente pré-tratado a um primeiro recipiente que compreende uma composição enzimática que compreende pelo menos duas celulases; (d) hidrólise enzimática do material lignocelulósico opcionalmente lavado e/ou opcionalmente pré- tratado no primeiro recipiente com o uso da composição enzimática que compreende pelo menos duas celulases para liquefazer o material lignocelulósico; (e) opcionalmente, adição do material lignocelulósico liquefeito a um segundo recipiente; (f) hidrólise enzimática do material lignocelulósico liquefeito no primeiro e/ou no segundo recipiente com o uso de uma composição enzimática que compreende pelo menos duas celulases para obter um produto de açúcar; e (g) opcionalmente, recuperação do produto de açúcar.

A presente invenção também se refere a um processo para a preparação de um produto de fermentação a partir de material lignocelulósico, o qual compreende as seguintes etapas: (a) opcionalmente, pré-tratamento do material lignocelulósico; (b) opcionalmente, lavagem do material lignocelulósico opcionalmente pré-tratado; (c) adição por batelada alimentada do material lignocelulósico opcionalmente lavado e/ou opcionalmente pré-tratado a um primeiro recipiente que compreende uma composição enzimática que compreende pelo menos duas celulases; (d) hidrólise enzimática do material lignocelulósico opcionalmente lavado e/ou opcionalmente pré-tratado no primeiro recipiente com o uso da composição enzimática que compreende pelo menos duas celulases para liquefazer o material lignocelulósico; (e) adição do material lignocelulósico liquefeito a um segundo recipiente; (f) hidrólise enzimática do material lignocelulósico liquefeito no segundo recipiente com o uso de uma composição enzimática que compreende pelo menos duas celulases para obter um material lignocelulósico hidrolisado; (g) opcionalmente, recuperação do material lignocelulósico hidrolisado; (h) fermentação do material lignocelulósico hidrolisado para produzir um produto de fermentação; e (i) opcionalmente, recuperação do produto de fermentação.

A presente invenção também abrange um processo em que a etapa (e) é opcional, isto é, um processo para a preparação de um produto de fermentação a partir de material lignocelulósico, o qual compreende as seguintes etapas: (a) opcionalmente, pré-tratamento do material lignocelulósico; (b) opcionalmente, lavagem do material lignocelulósico opcionalmente pré-tratado; (c) adição por batelada alimentada do material lignocelulósico opcionalmente lavado e/ou opcionalmente pré-tratado a um primeiro recipiente que compreende uma composição enzimática que compreende pelo menos duas celulases; (d) hidrólise enzimática do material lignocelulósico opcionalmente lavado e/ou opcionalmente pré- tratado no primeiro recipiente com o uso da composição enzimática que compreende pelo menos duas celulases para liquefazer o material lignocelulósico; (e) opcionalmente, adição do material lignocelulósico liquefeito a um segundo recipiente; (f) hidrólise enzimática do material lignocelulósico liquefeito no primeiro e/ou no segundo recipiente com o uso de uma composição enzimática que compreende pelo menos duas celulases para obter um material lignocelulósico hidrolisado; (g) opcionalmente, recuperação do material lignocelulósico hidrolisado; (h) fermentação do material lignocelulósico hidrolisado para produzir um produto de fermentação; e (i) opcionalmente, recuperação do produto de fermentação. A etapa (d) dos processos de acordo com a presente invenção também pode ser denominada etapa de alimentação, enquanto a etapa (f) dos processos de acordo com a presente invenção também pode ser denominada etapa de sacarificação. Na etapa de alimentação, o material lignocelulósico opcionalmente lavado e/ou opcionalmente pré-tratado é adicionado em um modo de batelada alimentada ao recipiente que compreende a composição enzimática. 0 termo "primeiro recipiente", como usado no presente documento, pode se referir a um único recipiente, porém, também pode se referir a um grupo de recipientes. 0 termo "segundo recipiente", como usado no presente documento, pode se referir a um único recipiente, porém, também pode se referir a um grupo de recipientes. Na etapa (c) dos processos de acordo com a presente invenção, o material lignocelulósico que é opcionalmente lavado e/ou opcionalmente pré-tratado é adicionado a um primeiro recipiente em que uma composição enzimática que compreende pelo menos duas celulases já está presente. A composição enzimática presente no primeiro recipiente pode ser uma composição aquosa. Em uma modalidade, a composição enzimática presente no primeiro recipiente compreende uma quantidade de material lignocelulósico antes de o material lignocelulósico que é opcionalmente lavado e/ou opcionalmente pré-tratado ser adicionado a um primeiro recipiente. Em uma modalidade, o teor de matéria seca da composição enzimática que já compreende algum material lignocelulósico é de 0,01 a 5 % em peso. O material lignocelulósico que pode já estar presente na composição enzimática pode ser opcionalmente lavado e/ou opcionalmente pré-tratado. O material lignocelulósico que pode já estar presente na composição enzimática pode ser opcionalmente liquefeito. A presença de %. um pouco de material lignocelulósico na composição enzimática antes de o material lignocelulósico ser adicionado ao primeiro recipiente pode resultar em uma estabilidade aumentada das enzimas presentes no primeiro recipiente. Em uma modalidade preferencial na etapa (c) dos processos de acordo com a presente invenção, o material lignocelulósico que é opcionalmente lavado e/ou opcionalmente pré-tratado é adicionado em um modo de batelada alimentada a um primeiro recipiente em que uma composição enzimática que compreende pelo menos duas celulases já está presente. Em uma modalidade, o material lignocelulósico opcionalmente lavado e/ou opcionalmente pré-tratado é adicionado durante a etapa (d) dos processos de acordo com a presente invenção. Isso significa que o material lignocelulósico opcionalmente lavado e/ou opcionalmente pré-tratado é adicionado em porções ao recipiente em que uma composição enzimática que compreende pelo menos duas celulases já está presente. Portanto, na etapa (c) dos processos de acordo com a presente invenção, o material lignocelulósico que é opcionalmente lavado e/ou opcionalmente pré-tratado é adicionado em um modo de batelada alimentada a um primeiro recipiente em que uma composição enzimática que compreende pelo menos duas celulases já está presente.

Em uma modalidade, enzimas adicionais são adicionadas durante a etapa (d) e/ou a etapa (f) dos processos de acordo com a presente invenção.

Em uma modalidade, a viscosidade do material lignocelulósico no primeiro recipiente durante a etapa (d) dos processos de acordo com a presente invenção é controlada ajustando-se a taxa de adição do material lignocelulósico opcionalmente lavado e/ou opcionalmente pré-tratado. A viscosidade do material lignocelulósico no primeiro recipiente durante a etapa (d) dos processos de acordo com a presente invenção é mantida abaixo de 1000 cP. Em uma modalidade, a viscosidade do material lignocelulósico no primeiro recipiente durante a etapa (d) dos processos de acordo com a presente invenção é mantida entre 10 e 1000 cP, entre 10 e 900 cP, entre 10 e 800 cP, entre 10 e 700 cP, entre 10 e 600 cP, entre 10 e 500 cP, entre 10 e 400 cP, entre 10 e 300 cP, entre 10 e 200 cP e, de preferência, entre 10 e 100 cP. A viscosidade pode ser determinada com um Reômetro Brookfield DV III na temperatura usada para a hidrólise.

Em uma modalidade, uma composição aquosa, opcionalmente, uma composição enzimática aquosa que compreende pelo menos duas celulases, é adicionada ao primeiro recipiente.

Em uma modalidade, o oxigênio é adicionado ao primeiro recipiente e/ou ao segundo recipiente. Em uma modalidade, o oxigênio é adicionado ao primeiro recipiente e/ou ao segundo recipiente durante uma única parte ou múltiplas partes do tempo de processo.

O oxigênio pode ser adicionado de diversos modos. Por exemplo, o oxigênio pode ser adicionado como gás oxigênio, gás enriquecido com oxigênio, como ar enriquecido com oxigênio, ou ar. O oxigênio também pode ser adicionado por meio de geração de oxigênio in situ. Por exemplo, o oxigênio pode ser gerado por eletrólise, o oxigênio pode ser produzido enzimaticamente, por exemplo, pela adição de peróxido, ou o oxigênio pode ser produzido quimicamente, por exemplo, por um sistema de geração de oxigênio, como KHSO5. Por exemplo, o oxigênio é produzido a partir de peróxido por catalase. O peróxido pode ser adicionado na forma de peróxido dissolvido ou gerado por uma reação enzimática ou quimica. Caso a catalase seja usada como enzima para produzir oxigênio, a catalase presente na composição enzimática para a hidrólise pode ser usada ou a catalase pode ser adicionada para esse propósito. 0 oxigênio pode ser adicionado continua ou descontinuamente. Exemplos de como adicionar o oxigênio incluem, porém sem limitação, adição de oxigênio à fase liquida que compreende o material lignocelulósico no recipiente (por exemplo, como bolhas) e adição de oxigênio ao espaço livre do recipiente. Quando o oxigênio é adicionado ao espaço livre do recipiente e o material lignocelulósico é passado através do espaço livre rico em oxigênio, o oxigênio suficiente necessário para a reação de hidrólise pode ser fornecido. Em geral, a quantidade de oxigênio adicionado ao primeiro e/ou ao segundo recipiente pode ser controlada e/ou variada. A restrição do oxigênio fornecido é possivel adicionando-se apenas oxigênio durante parte do tempo de hidrólise no dito recipiente. Outra opção é adicionar o oxigênio a uma baixa concentração, por exemplo, com o uso de uma mistura de ar e ar reciclado (o ar que sai do recipiente) ou "diluindo-se" o ar com um gás inerte. O aumento da quantidade de oxigênio adicionado pode ser alcançado pela adição de oxigênio durante periodos mais longos do tempo de hidrólise, adicionando-se o oxigênio a uma maior concentração ou adicionando-se mais ar. Outra opção para alterar a absorção de oxigênio é variar a temperatura de hidrólise. Uma temperatura de hidrólise mais alta pode causar uma concentração de saturação máxima mais baixa do oxigênio no conteúdo do recipiente. Outra maneira de controlar a concentração de oxigênio é adicionar um consumidor de oxigênio e/ou um gerador de oxigênio. A adição do oxigênio ao material celulolitico pode ser feito antes e/ou durante a hidrólise enzimática. 0 oxigênio pode ser introduzido, por exemplo, por sopro, no conteúdo do recipiente de hidrólise de liquido de material lignocelulósico. Também pode ser soprado no espaço livre do recipiente.

Em uma modalidade, o oxigênio é adicionado ao primeiro e/ou ao segundo recipiente antes e/ou durante a adição do material lignocelulósico ao dito recipiente. O oxigênio pode ser introduzido juntamente ao material lignocelulósico que entra no recipiente de hidrólise. Em uma modalidade, o oxigênio é adicionado ao material lignocelulósico antes e/ou durante a adição do material lignocelulósico ao primeiro recipiente. 0 oxigênio pode ser introduzido na corrente de material que entrará no recipiente ou com parte do conteúdo do recipiente que passa em um circuito externo do recipiente.

O oxigênio pode ser adicionado antes da hidrólise, durante uma parte da hidrólise, durante toda a hidrólise ou qualquer combinação dos mesmos. Caso o oxigênio presente no conteúdo de recipiente de hidrólise ou o produto de açúcar ou o hidrolisado formado na etapa de hidrólise influencie ou afete a etapa de fermentação subsequente, o oxigênio pode ser adicionado, exceto para a última parte da hidrólise na etapa (f) . Desse modo, (a maior parte de) o oxigênio pode ser consumido antes de o material lignocelulósico hidrolisado ser fermentado.

Em uma modalidade, a concentração de oxigênio (DO) no material lignocelulósico presente durante a hidrólise enzimática na etapa (f) dos processos da presente invenção é de pelo menos 0,001 mol/m3, de preferência, pelo menos 0,002 mol/m3, mais preferencialmente, pelo menos 0,003 mol/m3, ainda mais preferencialmente, pelo menos 0,01 mol/m3, com máxima preferência, pelo menos 0,02 mol/m3 e, em particular, pelo menos 0,03 mol/m3. Em reatores de menos de 1 m3, uma concentração de oxigênio no material lignocelulósico de menos de 0,01 mol/m3 ou 0,02 mol/m3 será obtida por agitação vagarosa. A mistura ou agitação vigorosa em tal escala introduz parte da fase gasosa do espaço livre no liquido de reação. Por exemplo, a mistura ou a agitação pode criar um redemoinho que atrai oxigênio para o liquido. Em geral, preencher o espaço livre com ar em combinação com mistura ou agitação (vigorosa) introduzirá oxigênio suficiente no material celulósico no recipiente de hidrólise para recipientes de um tamanho de até 100 litros a 1 m3. Em uma escala maior, por exemplo, em um reator de 50 m3 ou mais, por exemplo, 100 m3, tanta energia é necessária para agitação vigorosa que, do ponto de vista econômico, isso não se aplicará a um processo em operação comercial.

Em uma modalidade, a concentração de oxigênio (DO) no material lignocelulósico presente durante a hidrólise enzimática na etapa (d) e/ou na etapa (f) dos processos presente invenção é, de preferência, de no máximo 80 % concentração de saturação de oxigênio sob as condições reação de hidrólise, mais preferencialmente, no máximo 0,12 mol/m3, ainda mais preferencialmente, no máximo 0,09 mol/m3, ainda mais preferencialmente, no máximo 0,06 mol/m3, com máxima preferência, no máximo 0,045 mol/m3 e, em particular, no máximo 0,03 mol/m3. A temperatura e a pressão influenciarão na DO.

Os valores de mol/m3 preferenciais e exemplificativos dados acima se referem à pressão atmosférica normal e a uma temperatura de cerca de 62 °C. A pessoa versada na técnica observará valores de DO favoráveis com base nos presentes ensinamentos.

Na hidrólise enzimática, polissacarideos amorfos e cristalinos ou celulose são hidrolisados em açúcares, como glicose. Os polissacarideos amorfos são, por exemplo, convertidos em oligossacarideos por endoglucanases e, então, os oligossacarideos podem ser convertidos em celobiohidrolases e beta-glucosidases em glicose. A conversão dos polissacarideos cristalinos pode ocorrer em paralelo ou seguencialmente e continuar mesmo quando a maior parte dos polissacarideos amorfos é hidrolisada. A adição de oxigênio em combinação com mono-oxigenases liticas de polissacarideo é benéfica durante a hidrólise dos polissacarideos cristalinos, por exemplo, na degradação dos polissacarideos em oligossacarideos. A estrutura cristalina de glucano pode ser aberta por mono-oxigenases liticas de polissacarideo. Esse tipo de enzima abre a estrutura oxidando-se as ligações glicosidicas e tornando-as acessiveis para as outras enzimas celulóticas para hidrólise adicional dos oligossacarideos em glicose. A adição de oxigênio é muito útil, especialmente na fase em que os polissacarideos cristalinos são convertidos em enzimas. Fora dessa fase, nenhuma adição de oxigênio ou adicionar menos oxigênio pode ser mais eficiente.

Os processos da presente invenção mostram vantagens, especialmente em usinas piloto e em escala industrial. Em uma modalidade, o primeiro recipiente e/ou o segundo recipiente têm um volume de pelo menos 1 m3. De preferência, o primeiro recipiente e/ou o segundo recipiente tem um volume de pelo menos 1 m3, pelo menos 2 m3, pelo menos 3 m3, pelo menos 4 m3, pelo menos 5 m3, pelo menos 6 m3, pelo menos 7 m3, pelo menos 8 m3, pelo menos 9 m3, pelo menos 10 m3, pelo menos 15 m3, pelo menos 20 m3, pelo menos 25 m3, pelo menos 30 m3, pelo menos 35 m3, pelo menos 40 m3, pelo menos 45 m3, pelo menos 50 m3, pelo menos 60 m3, pelo menos 70 m3, pelo menos 75 m3, pelo menos 80 m3, pelo menos 90 m3, pelo menos 100 m3, pelo menos 200 m3, pelo menos 300 m3, pelo menos 400 m3, pelo menos 500 m3, pelo menos 600 m3, pelo menos 700 m3, pelo menos 800 m3, pelo menos 900 m3, pelo menos 1000 m3, pelo menos 1500 m3, pelo menos 2000 m3, pelo menos 2500 m3. Em geral, o recipiente será menor do que 3000 m3 ou 5000 m3. O primeiro recipiente e o segundo recipiente podem ter o mesmo volume, porém, também podem ter um volume diferente. Caso diversos primeiros recipientes e/ou segundos recipientes sejam usados, podem ter o mesmo volume, porém, também podem ter um volume diferente.

O processo da invenção é aplicado de modo vantajoso em combinação com o uso de enzimas termoestáveis. Em uma modalidade, a composição enzimática é derivada a partir de um fungo, de preferência, um micro-organismo do gênero Rasamsonia, ou a composição enzimática compreende uma enzima fúngica, de preferência, uma enzima de Rasamsonia. As enzimas celuloliticas de Rasamsonia aplicadas em matéria-prima lignocelulósica pré-tratada mostram taxas de conversão máxima a uma temperatura na faixa de 50 a 70 °C. As enzimas permanecem ativas sob essas circunstâncias por 14 dias e mais sem a interrupção completa de atividade. Com o uso de condições ideais de temperatura, uma quantidade máxima de açúcares redutores pode ser liberada a partir de material lignocelulósico (hidrólise total) dentro do tempo de hidrólise mais curto possivel. Desse modo, 100 % de conversão de celulose em glicose podem ser alcançados em menos de 5 dias. O rendimento máximo teórico (Yps máx em g de produto por grama de glicose) de um produto de fermentação pode ser derivado de livros de bioquímica. Para etanol, 1 mol de glicose (180 g) produz, de acordo com o caminho normal de glicólise-fermentação na levedura, 2 mols de etanol (= 2 x 46 = 92 g de etanol). O rendimento máximo teórico de etanol em glicose é, portanto, de 92/180 = 0,511 g de etanol/g de glicose. Para butanol (MW 74 g/mol) ou isobutanol, o rendimento máximo teórico é de 1 mol de butanol ou mol de glicose. Então, Yps máx para (iso-)butanol = 74/180 = 0,411 g (iso-)butanol/g de glicose. Para o ácido láctico, o rendimento de fermentação para fermentação homoláctica é de 2 mols de ácido láctico (MW = 90 g/mol) por mol de glicose. De acordo com essa estequiometria, o Yps máx = 1 g de ácido láctico/g de glicose. Para outros produtos de fermentação, um cálculo similar pode ser realizado. A redução de custo alcançada aplicando-se enzimas celulóticas de Rasamsonia é o resultado de uma redução de tempo total de processo.

Devido à alta estabilidade das enzimas usadas nos processos da presente invenção, é possivel diminuir a dosagem de enzima e estender o uso da enzima prolongando-se os tempos de hidrólise. Por exemplo, 0,175 ml de enzima/g de matéria seca de material lignocelulósico resulta em liberação de aproximadamente 90 % do máximo teórico de açúcares redutores de material lignocelulósico pré-tratado dentro de 72 h. Com o uso de 0,075 ml de enzima/g de matéria seca de material lignocelulósico, aproximadamente 90 % de conversão do máximo teórico são alcançados em 120 h. Os resultados mostram que, devido à estabilidade da atividade enzimática, a diminuição da dosagem de enzima pode ser compensada estendendo-se o tempo de hidrólise para obter a mesma quantidade de açúcares redutores. A redução de custo alcançada com o uso de enzimas celulóticas estáveis, como aquelas de Rasamsonia, resulta em menores dosagens de enzima que resultam, entretanto, em rendimentos de conversão de hidrólise similares.

Em um processo comum para converter material lignocelulósico em etanol, etapas de processo são, de preferência, realizadas sob condições sépticas para diminuir os custos operacionais. A contaminação e o crescimento de micro-organismos contaminantes podem, portanto, ocorrer e resultar em efeitos colaterais indesejáveis, como produção de ácido láctico, ácido fórmico e ácido acético, perdas de rendimento de etanol em substrato, produção de toxinas e polissacarideos extracelulares. Esses efeitos podem afetar custos de produção de modo significativo. Uma alta temperatura de processo e/ou um curto tempo de processo limita o risco de contaminação durante a hidrólise e a fermentação. Enzimas termoestáveis, como aguelas de Rasamsonia, são capazes de hidrolisar material lignocelulósico a temperaturas de mais que 60 °C. A essas temperaturas, o risco que um micro-organismo contaminante causará efeitos colaterais indesejados é pequeno a quase zero.

Durante a etapa de fermentação, na qual o etanol é produzido, temperaturas estão tipicamente entre 30 a 37 °C e são, de preferência, não aumentadas devido a perdas de produção. Aplicando-se curtos tempos de processo de fermentação, os riscos e os efeitos de contaminação e/ou o crescimento de contaminantes são reduzidos tanto quanto possivel. Com enzimas estáveis, como aquelas de Rasamsonia, um curto tempo de fermentação pode ser aplicado e, então, riscos de contaminação e/ou crescimento de contaminantes são reduzidos tanto quanto possivel. A redução de custo alcançada aplicando-se enzimas termoestáveis celulóticas de Rasamsonia desse modo resulta em um risco menor de falhas de processo devido à contaminação.

A primeira etapa após o pré-tratamento térmico consiste em resfriar o material pré-tratado a temperaturas em que as enzimas têm uma atividade ideal. Em ampla escala, isso é feito tipicamente adicionando-se água (resfriada), a qual, além de diminuir a temperatura, reduz o teor de matéria seca.

Rasamsonia, a redução de custo pode ser alcançada, devido ao fato de que (i) menos resfriamento do material pré-tratado é exigido já que temperaturas mais altas são permitidas durante a hidrólise, e (ii) menos água é adicionada, a qual aumenta o teor de matéria seca durante a hidrólise e a fermentação e, então, a capacidade de produção de etanol (quantidade produzida por unidade de tempo por volume) de uma usina de etanol. Com o uso de enzimas termoestáveis, como aquelas de Rasamsonia, a redução de custo também pode ser alcançada com o uso de água de resfriamento que tem uma temperatura maior do que a água que é usada em um processo com enzima não termoestável.

Ao final da hidrólise, as atividades enzimáticas parecem ser baixas, já que poucos açúcares redutores são liberados após quase toda a celulose ter sido convertida. A quantidade de atividade enzimática presente, no entanto, diminui apenas um pouco, supostamente devido principalmente à absorção das enzimas ao substrato. Aplicando-se separação sólido-liquido após a hidrólise, como centrifugação, filtração, decantação, sedimentação, 60 % ou mais (por exemplo, 70 %) da atividade enzimática em solução podem ser recuperados e reutilizados para hidrólise de um novo material lignocelulósico pré-tratado durante a próxima hidrólise.

Além disso, após a separação sólido-liquido, a enzima em solução pode ser separada da solução que contém açúcares redutores e outros produtos de hidrólise das ações enzimáticas. Essa separação pode ser realizada por técnicas incluindo, porém sem limitação, ultra- e microfiltração, centrifugação, decantação, sedimentação, com ou sem primeira adsorção da enzima a um carreador de qualquer tipo. Por exemplo, após a hidrólise de material pré-tratado com 0,175 ml/g de carga de enzima de matéria seca de material por 20 h, 50 % da quantidade máxima teórica de açúcares redutores são liberados e, após a mesma hidrólise por 72 h, 90 % da quantidade máxima teórica de açúcares redutores são liberados. Por centrifugação e ultrafiltração, 60 a 70 % da atividade enzimática foram recuperados no retentado, enquanto o filtrado continha mais que 80 % dos açúcares redutores liberados. Através da reutilização do retentado, como está ou após purificação e/ou concentração adicional, a dosagem de enzima durante a próxima etapa de hidrólise pode ser reduzida em 60 a 70 %. A redução de custo alcançada com o uso de enzimas celulóticas estáveis, como aquelas de Rasamsonia, desse modo é a consequência de uma dosagem de enzima menor.

O processo que inclui reciclagem de enzima após hidrólise, como descrito acima, pode ser combinado com reciclagem do micro-organismo produtor de etanol após a fermentação e com o uso dos açúcares redutores que contêm filtrado como um substrato (purificado e/ou concentrado ou diluido) em fermentação de produção de enzima e como substrato para o cultivo do micro-organismo produtor de etanol.

A termoestabilidade de enzimas, como aquelas de Rasamsonia, causa a atividade celulolitica remanescente após hidrólise, fermentação e destilação a vácuo na vinhaça fina. A atividade total da enzima é reduzida durante as três etapas de processo sucessivas. A vinhaça fina obtida após a destilação a vácuo pode ser, então, reutilizada como uma fonte de enzima para um ciclo de processo de hidrólise- fermentação-destilação recém-iniciado de conversão de material pré-tratado em etanol. A vinhaça fina pode ser usada em forma concentrada ou diluida (ou não diluida) e/ou purificada e com ou sem suplementação de enzima adicional.

Em um processo ideal, uma quantidade de enzima é suplementada na vinhaça fina, antes de sua reutilização em um novo ciclo de processo, igual à quantidade de atividade perdida durante as três etapas de processo sucessivas do ciclo de processo anterior. Desse modo, a superdosagem de enzima é impedida e, então, um uso mais eficiente de enzima é obtido. Além disso, fornecendo-se uma alta dosagem de enzima no primeiro ciclo de processo e suplementando-se a enzima igual à quantidade de atividade perdida durante etapas de processo sucessivas nos ciclos de seguintes, as taxas de hidrólise mais altas possiveis podem ser obtidas em cada ciclo de processo, resultando em curtos tempos de hidrólise de menos que 48 h em combinação com o uso mais eficiente de enzimas.

Aplicando-se a mistura durante a hidrólise, as enzimas entram em contato mais frequentemente com substratos, o que resulta no uso mais eficiente da atividade catalítica. Isso resultará em menores dosagens de enzima e, desse modo, em custos menores, a menos que a mistura tenha um efeito negativo nas enzimas. As enzimas estáveis, como as enzimas termoestáveis de Rasamsonia, são robustas e podem resistir a circunstâncias de alto cisalhamento (localmente) e temperaturas, que é o caso durante a mistura intensa de pastas fluidas. 0 uso das mesmas em sistemas mistos é, portanto, benéfico e resultará na redução de dosagem e, desse modo, custos.

Uma enzima "termoestável", como usado no presente documento, significa que a enzima tem uma temperatura ideal de 60 °C ou maior, 70 °C ou maior, 75 °C ou maior, 80 °C ou maior, 85 °C ou maior. As mesmas podem ser, por exemplo, isoladas de micro-organismos termofilicos ou podem ser projetadas pela pessoa versada e artificialmente sintetizadas. Em uma modalidade, os polinucleotideos podem ser isolados ou obtidos a partir de fungos filamentosos termofilicos ou termotolerantes ou isolados dos fungos não termofilicos ou não termotolerantes, porém, constatou-se que são termoestáveis.

"Fungo termofilico" se refere a um fungo que cresce a uma temperatura de 50 °C ou maior. Fungo "termotolerante" se refere a um fungo que cresce a uma temperatura de 45 °C ou maior, tendo um máximo de quase 50 °C.

Exemplos de cepas fúngicas termofilicas são Rasamsonia emersonii (anteriormente conhecida como Talaromyces emersoni). Talaromyces emersonii, Penicillium geosmithia emersonii e Rasamsonia emersonii são usadas de modo alternado no presente documento.

As células fúngicas termofilicas ou termotolerantes adequadas podem ser uma célula de Humicola, Rhizomucor, Myceliophthora, Rasamsonia, Talaromyces, Thermomyces, Thermoascus ou Thielavia, de preferência, uma célula de Rasamsonia. Os fungos termofilicos ou termotolerantes preferenciais são Humicola grisea var. thermoidea, Humicola lanuginosa, Myceliophthora thermophila, Papulaspora thermophilia, Rasamsonia byssochlamydoides, Rasamsonia emersonii, Rasamsonia argillacea, Rasamsonia eburnean, Rasamsonia brevistipitata, Rasamsonia cylindrospora, Rhizomucor pusillus, Rhizomucor miehei, Talaromyces bacillisporus, Talaromyces leycettanus, Talaromyces thermophilus, Thermomyces lenuginosus, Thermoascus crustaceus, Thermoascus thermophilus Thermoascus aurantiacus e Thielavia terrestris.

Os fungos termofilicos não são restritos a uma ordem taxonômica especifica e ocorre ao longo de toda a árvore da vida fúngica. Exemplos são Rhizomucor nos Mucorales, Myceliophthora nos Sordariales e Talaromyces, Thermomyces e Thermoascus nos Eurotiales (consultar Mouchacca, 1997) . A maior parte das espécies de Talaromyces é mesófila, porém, exceções são espécies nas seções de Emersonii e Thermophila. A seção Emersonii inclui Talaromyces emersonii, Talaromyces byssochlamydoides, Talaromyces bacillisporus e Talaromyces leycettanus, sendo que todos crescem bem a 40 °C. Talaromyces bacillisporus é termotolerante, Talaromyces leycettanus é termotolerante a termofilico, e Talaromyces emersonii e Talaromyces byssochlamydoides são verdadeiramente termofilicos (consultar Stolk e Samson, 1972). O único membro de Talaromyces seção Thermophila, Talaromyces thermophilus, cresce rapidamente a 50 °C (consultar Stolk e Samson, 1972). A classificação atual dessas espécies termofilicas de Talaromyces é principalmente baseada em características fenotipicas e fisiológicas, como sua habilidade de crescer acima de 40 °C, cor de ascósporo, a estrutura de cobertura ascornatal e a formação de um certo tipo de anamorfo. Stolk e Samson (1972) declararam que os membros da seção Emersonii têm anamorfos da série Paecilomyces (Talaromyces byssochlamydoides e Talaromyces leycettanus) ou Penicillium cylindrosporum (Talaromyces emersonii e Talaromyces bacillisporus) . Posteriormente, Pitt (1979) transferiu as espécies que pertencem à série Penicillium cylindrosporum para o gênero Geosmithia, com base em diversas características como a formação de conidios de poros terminais em vez de em collula (afunilamentos) , uma característica de Penicillium e Paecilomyces. Dentro do gênero Geosmithia, apenas Geosmithia argillacea é termotolerante, e Stolk et al. (1969) e Evans (1971) propuseram uma conexão com membros de Talaromyces seção Emersonii. A relação filogenética da espécie termofílica Talaromyces dentro de Talaromyces e da Trichocomaceae é desconhecida. (consultar J. Houbraken, Antonie van Leeuwenhoek, fevereiro de 2012; 101(2): 403 a 421).

Rasamsonia é um novo gênero que compreende espécies termotolerantes e termofílicas Talaromyces e Geosmithia (J. Houbraken et al., ver acima). Com base em dados fenotípicos, fisiológicos e moleculares, Houbraken et al. propuseram transferir as espécies Talaromyces emersonii, Talaromyces byssochlamydoides, Talaromyces eburneus, Geosmithia argillacea e Geosmithia cylindrospora para o novo gênero Rasamsonia.

Os fungos termofílicos preferenciais são Rasamsonia byssochlamydoides, Rasamsonia emersonii, Thermomyces lenuginosus, Talaromyces thermophilus, Thermoascus crustaceus, Thermoascus thermophilus e Thermoascus aurantiacus, sendo que Rasamsonia emersonii é o mais preferencial.

"Fungos filamentosos" incluem todas as formas filamentosas da subdivisão Eumycota e Oomycota (como definido por Hawksworth et al., Em, Ainsworth and Bisby's Dictionary of The Fungi, 8a edição, 1995, CAB International, University Press, Cambridge, UK). Os fungos filamentosos são caracterizados por uma parede micelial composta por quitina, celulose, glucano, quitosano, manano e outros polissacarideos complexos. 0 crescimento vegetative se dá por alongamento da hifa e o catabolismo de carbono é obrigatoriamente aeróbico. Cepas fúngicas filamentosas incluem, porém sem limitação, cepas de Acremonium, Agaricus, Aspergillus, Aureobasidium, Chrysosporium, Coprinus, Cryptococcus, Filibasidium, Fusarium, Geosmithia, Humicola, Magnaporthe, Mucor, Myceliophthora, Neocallimastix, Neurospora, Paecilomyces, Penicillium, Piromyces, Panerochaete, Pleurotus, Rasamsonia, Schizophyllum, Talaromyces, Thermoascus, Thermomyces, Thielavia, Tolypocladium e Trichoderma.

Diversas cepas de fungos filamentosos são prontamente acessíveis ao público em diversas coleções de cultura, como Coleção Norte-americana de Micro-organismos (ATCC), Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH (DSM), Centraalbureau Voor Schimmelcultures (CBS), e Agricultural Research Service Patent Culture Collection, Northern Regional Research Center (NRRL). Exemplos de tais cepas incluem Aspergillus niger CBS 513.88, Aspergillus oryzae ATCC 20423, IFO 4177, ATCC 1011, ATCC 9576, ATCC14488-14491, ATCC 11601, ATCC12892, P. chrysogenum CBS 455.95, Penicillium citrinum ATCC 38065, Penicillium chrysogenum P2, Talaromyces emersonii CBS 393.64, Acremonium chrysogenum ATCC 36225 ou ATCC 48272, Trichoderma reesei ATCC 26921 ou ATCC 56765 ou ATCC 26921, Aspergillus sojae ATCC11906, Chrysosporium lucknowense Cl, Garg 27K, VKM F-3500-D, ATCC44006 e derivados dos mesmos.

Uma vantagem da expressão e produção das enzimas (por exemplo, pelo menos duas, três ou quatro diferentes celulases) em um micro-organismo adequado pode ser um alto rendimento de composição enzimática que pode ser usado nos processos da presente invenção.

Nos processos da presente invenção, as composições enzimáticas são usadas. De preferência, as composições são estáveis. "Composições enzimáticas estáveis", como usado no presente documento, significa que as composições enzimáticas retêm atividade após 30 horas de tempo de reação de hidrólise, de preferência, pelo menos 10 %, 20 %, 30 %, 40 %, 50 %, 60 %, 65 %, 70 %, 75 %, 80 %, 85 %, 90 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 99 % ou 100 % de sua atividade inicial após 30 horas de tempo de reação de hidrólise. De preferência, a composição enzimática retém atividade após 40, 50, 60, 70, 80, 90 100, 150, 200, 250, 300, 350, 400, 450, 500 horas de tempo de reação de hidrólise.

A composição enzimática pode ser fermentação de um substrato adequado com um micro-organismo adequado, por exemplo, Rasamsonia emersonii ou Aspergillus niger, sendo que a composição enzimática é produzida pelo micro-organismo. O micro-organismo pode ser alterado para melhorar ou para produzir a composição. Por exemplo, o micro-organismo pode ser mutacionado por procedimentos de melhoramento de cepa clássicos ou por técnicas de DNA recombinante. Portanto, os micro-organismos mencionados no presente documento podem ser usados como tais para produzir a composição ou podem ser alterados para aumentar a produção ou para produzir uma composição alterada que pode incluir enzimas heterólogas, por exemplo, celulases, então, enzimas que não são originalmente produzidas por aquele micro-organismo. De preferência, um fungo, mais preferencialmente, um fungo filamentoso, é usado para produzir a composição. De modo vantajoso, um micro-organismo termofilico ou termotolerante é usado. Opcionalmente, um substrato é usado, o qual induz a expressão das enzimas na composição enzimática durante a produção da composição enzimática.

A composição enzimática é usada para liberar açúcares do material lignocelulósico que compreendem polissacarideos. Os principais polissacarideos são celulose (glucanos), hemiceluloses (xilanos, heteroxilanos e xiloglucanos). Além disso, um pouco de hemicelulose pode estar presente como glucomananos, por exemplo, em material lignocelulósico polissacarideos em açúcares solúveis, incluindo monômeros e multimeros, por exemplo, glicose, arabinose, galactose, frutose, manose, ramnose, ribose, ácido galacturônico, ácido glucorônico e outras hexoses e pentoses, ocorre sob a ação de diferentes enzimas que atuam em conjunto. Por produto de açúcar, refere-se ao produto de hidrólise enzimática do material lignocelulósico. 0 produto de açúcar compreende açúcares solúveis, incluindo monômeros e multimeros. De preferência, compreende glicose. Exemplos de outros açúcares são celobiose, xilose, arabinose, galactose, frutose, manose, ramnose, ribose, ácido galacturônico, ácido glucorônico e outras hexoses e pentoses. 0 produto de açúcar pode ser usado como tal ou pode ser adicionalmente processado, por exemplo, recuperado e/ou purificado.

Além disso, pectinas e outras substâncias pécticas, como arabinanos, podem compor consideravelmente a proporção da massa seca de paredes celulares tipicamente provenientes de tecidos vegetais não lenhosos (cerca de um quarto à metade da massa seca pode ser composto por pectinas).

A celulose é um polissacarideo linear composto por residues de glicose ligados por ligações β-1,4. A natureza linear das fibras de celulose, bem como a estequiometria da glicose β-ligada (em relação a a) gera estruturas mais suscetíveis à ligação de hidrogênio interfilamento do que as estruturas cx-ligadas altamente ramificadas de amido. Então, os polimeros de celulose são, em geral, menos solúveis e eram fibras mais firmemente ligadas do que as fibras encontradas no amido.

As enzimas que podem ser incluídas na composição enzimática estável usada na invenção são descritas em mais detalhes abaixo. Mono-oxigenases liticas de polissacarideo, endoglucanases (EG) e exocelobiohidrolases (CBH) catalisam a hidrólise de celulose insolúvel a produtos como celo- oligossacarideos (celobiose como um produto principal), enquanto β-glucosidases (BG) convertem os oligossacarideos, principalmente celobiose e celotriose, em glicose.

A hemicelulose é urn polimero complexo, e sua composição varia amplamente com frequência de organismo para organismo e de um tipo de tecido para outro. Em geral, um componente principal de hemicelulose é xilose β-1,4-ligada, um açúcar de cinco carbonos. No entanto, essa xilose é frequentemente ramificada em 0 a 3 e/ou 0 a 2 átomos de xilose, e pode ser substituída por ligações a arabinose, galactose, manose, ácido glucurônico, ácido galacturônico ou por esterificação a ácido acético (e esterificação de ácido ferúlico a arabinose). A hemicelulose também pode conter glucano, o qual é um termo geral para açúcares de seis carbonos β-ligados (como os glucanos e heteroglucanos β-(l,3) (1,4) mencionados anteriormente) e, adicionalmente, glucomananos (em que tanto a glicose quanto a manose estão presentes na cadeia principal linear, ligadas uma à outra por β-ligaqoes) . Xilanases, juntamente a outras enzimas acessórias, por exemplo, a-L-arabinofuranosidases, feruloila e acetilxilano esterases, glucuronidases, e β-xilosidases), catalisam a hidrólise de hemicelulose.

As substâncias pécticas incluem pectinas, arabinanos, galactanos e arabinogalactanos. As pectinas são os polissacarideos mais complexos na parede celular vegetal. As mesmas se acumulam ao redor de uma cadeia nuclear de unidades de D-ácido galacturônico α (1,4)-ligadas intercaladas até certo grau com L-ramnose. Em qualquer parede celular, há diversas unidades estruturais que são compatíveis com essa descrição, e considerou-se, de forma geral, que, em uma única molécula péctica, as cadeias nucleares de diferentes unidades estruturais são continuas uma relação às outras. Os principais tipos de unidade estrutural são: galacturonano (homogalacturonano) , o qual pode ser substituído por metanol no grupo carboxila e acetato em 0-2 e 0-3; ramnogalacturonano I (RGI), em que unidades de ácido galacturônico se alternam com unidades de ramnose que portam cadeias laterais de Austria galactano (1,4)-ligadas e arabinano (1,5)-ligadas. As cadeias laterais de arabinano podem ser fixadas diretamente à ramnose ou indiretamente através das cadeias de galactano; xilogalacturonano, com unidades de xilosila únicas em 0-3 de ácido galacturônico (intimamente associado ao RGI); e ramnogalacturonano II (RGII), uma unidade menor particularmente complexa que contém açúcares incomuns, por exemplo, apiose. Uma unidade de RGII pode conter dois residues de apiosila que, sob condições iônicas adequadas, podem formar de modo reversivel ésteres com borato.

Uma composição enzimática para uso nos processos da presente invenção compreende, de preferência, pelo menos duas atividades, embora uma composição compreenda tipicamente mais de duas atividades, por exemplo, três, quatro, cinco, seis, sete, oito, novo ou até mesmo mais atividades. Tipicamente, uma composição enzimática para uso nos processos da presente invenção compreende pelo menos duas celulases. As pelo menos duas celulases podem conter as mesmas atividades ou atividades diferentes. A composição enzimática para uso nos processos da presente invenção também pode compreender pelo menos uma enzima diferente de uma celulase. De preferência, a pelo menos uma outra enzima tem uma atividade enzimática auxiliar, isto é, uma atividade adicional que, diretamente ou indiretamente, leva à degradação de lignocelulose. Exemplos de tais atividades auxiliares são mencionados no presente documento e incluem, porém, sem limitação, hemicelulases.

Então, uma composição para uso nos processos da presente invenção pode compreender atividade de mono- oxigenase litica de polissacarideo, atividade de endoglucanase e/ou atividade de celobiohidrolase e/ou atividade de β-glucosidase. Uma composição para uso na invenção pode compreender mais de uma atividade enzimática por classe de atividade. Por exemplo, uma composição para uso na invenção pode compreender duas atividades de endoglucanase, por exemplo, atividade de endo-1,3(1,4)-β glucanase e atividade de endo-β-1, 4-glucanase.

Uma composição para uso nos processos da presente invenção pode ser derivada de Rasamsonia emersonii. Na invenção, antecipa-se que um conjunto nuclear de atividades enzimáticas (degradação de lignocelulose) pode ser derivado de Rasamsonia emersonii. Rasamsonia emersonii pode fornecer um conjunto altamente eficaz de atividades, como demonstrado no presente documento para a hidrólise de material lignocelulósico. Se for necessário, o conjunto de atividades pode ser suplementado com atividades enzimáticas adicionais de outras fontes. Tais atividades adicionais podem ser derivadas de fontes clássicas e/ou produzidas por organismos geneticamente modificados.

As atividades em uma composição para uso nos processos da presente invenção podem ser termoestáveis. No presente documento, isso significa que a atividade tem uma temperatura ideal de 60 °C ou maior, 70 °C ou maior, 75 °C ou maior, 80 °C ou maior, 85 °C ou maior. Atividades em uma composição para uso nos processos da presente invenção não terão, tipicamente, a mesma temperatura ideal, porém, de preferência, serão, no entanto, termoestáveis.

Além disso, as atividades enzimáticas em uma composição para uso nos processos da presente invenção podem ser capazes de funcionar a um baixo pH. Para os propósitos desta invenção, um baixo pH indica um pH de 5,5 ou menor, 5 ou menor, 4,9 ou menor, 4,8 ou menor, 4,7 ou menor, 4,6 ou menor, 4,5 ou menor, 4,4 ou menor, 4,3 ou menor, 4,2 ou menor, 4,1 ou menor, 4,0 ou menor, 3,9 ou menor, 3,8 ou menor, 3,7 ou menor, 3,6 ou menor, 3,5 ou menor.

As atividades em uma composição para uso nos processos da presente invenção podem ser definidas por uma combinação de qualquer um dos valores de temperatura ideal e pH acima.

A composição enzimática para uso nos processos da presente invenção pode compreender, além das atividades derivadas de Rasamsonia, uma celulase (por exemplo, derivada de uma fonte diferente de Rasamsonia) e/ou uma hemicelulase (por exemplo, derivada de uma fonte diferente de Rasamsonia) e/ou uma pectinase.

Uma composição enzimática para uso nos processos da presente invenção pode compreender uma, duas, três, quatro ou mais classes de celulase, por exemplo, uma, duas, três ou quatro ou todas dentre uma mono-oxigenase litica de polissacarideo (LPMO), uma endoglucanase (EG) , uma ou duas exocelobiohidrolases (CBH) e uma β-glucosidase (BG). Uma composição para uso nos processos da presente invenção pode compreender duas ou mais de quaisquer dessas classes de celulase.

Uma composição enzimática para uso nos processos da presente invenção pode compreender um tipo de atividade de celulase e/ou atividade de hemicelulase e/ou atividade de pectinase fornecida por uma composição, como descrito no presente documento, e um segundo tipo de atividade de celulase e/ou atividade de hemicelulase e/ou atividade de pectinase fornecida por uma celulose/hemicelulase/pectinase adicional.

Como usado no presente documento, uma celulase é qualquer polipeptideo que é capaz de degradar ou modificar celulose. Um polipeptideo que é capaz de degradar celulose é aquele que é capaz de catalisar o processo de quebrar a celulose em unidades menores, parcialmente, por exemplo, em celodextrinas, ou completamente em monômeros de glicose. Uma celulase de acordo com a invenção pode resultar em uma população mista de celodextrinas e monômeros de glicose. Tal degradação ocorrerá tipicamente por meio de uma reação de hidrólise.

As mono-oxigenases liticas de polissacarideo (LPMO) são recentemente classificadas por CAZy na familia AA9 (Familia de Atividade Auxiliar 9) ou familia AA10 (Familia de Atividade Auxiliar 10). Como mencionado acima, as mono- oxigenases liticas de polissacarideo são capazes de abrir uma estrutura cristalina de glucano. As mono-oxigenases liticas de polissacarideo também podem afetar os celo- oligossacarideos. Proteinas GH61 (familia glicosideo hidrolase 61 ou, por vezes, denominada EGIV) são mono- oxigenases (liticas) de polissacarideo dependentes de oxigênio (PMOs/LPMOs) de acordo com a literatura mais recente (consultar Isaksen et al., Journal of Biological Chemistry, vol. 289, n° 5, páginas 2632 a 2642) . PMO e LPMO são usadas no presente documento de modo alternado. Frequentemente na literatura, essas proteinas são mencionadas por melhorarem a ação de celulases em substratos de lignocelulose. A GH61 foi originalmente classificada como endoglucanase com base na medição de uma atividade de endo-1,4-β-d-glucanase muito fraca em um membro da familia. 0 termo "GH61", como usado no presente documento, deve ser compreendido como uma familia de enzimas, a qual compartilha porções de sequência conservada comuns e dobramento a ser classificado na familia 61 do sistema de classificação de CAZy GH bem estabelecido (http://www.cazy.org/GH61.html). A familia de glicosideo hidrolase 61 é um membro da familia de glicosideo hidrolases EC 3.2.1. As GH61 foram recentemente reclassifiçadas atualmente como CAZy na familia AA9 (Familia de Atividade Auxiliar 9). A GH61 é usada no presente documento como sendo parte das celulases.

A CBM33 (módulo de ligação a carboidrato da familia 33) é uma mono-oxigenase litica de polissacarideo (consultar Isaksen et al, Journal of Biological Chemistry, vol. 289, n° 5, páginas 2632 a 2642), CAZy foi recentemente reclassificado como CBM33 em AA10 (Familia de Atividade Auxiliar 10).

Como usado no presente documento, uma hemicelulase é qualquer polipeptideo que é capaz de degradar ou modificar hemicelulose. Ou seja, uma hemicelulase pode ser capaz de degradar ou modificar um ou mais dentre xilano, glucuronoxilano, arabinoxilano, glucomanano e xiloglucano. Um polipeptideo que é capaz de degradar uma hemicelulose é aquele que é capaz de catalisar o processo de quebrar a hemicelulose em polissacarideos menores, parcialmente, por exemplo, em oligossacarideos, ou completamente em monômeros de açúcar, por exemplo, monômeros de açúcar hexose ou pentose. Uma hemicelulase de acordo com a invenção pode resultar em uma população mista de oligossacarídeos e monômeros de açúcar. Tal degradação ocorrerá tipicamente por meio de uma reação de hidrólise.

Como usado no presente documento, uma pectinase é qualquer polipeptideo que é capaz de degradar ou modificar pectina. Um polipeptideo que é capaz de degradar pectina é aquele que é capaz de catalisar o processo de quebrar a pectina em unidades menores, parcialmente, por exemplo, em oligossacarídeos, ou completamente em monômeros de açúcar. Uma pectinase de acordo com a invenção pode resultar em uma população mista de oligossacarídeos e monômeros de açúcar. Tal degradação ocorrerá tipicamente por meio de uma reação de hidrólise.

Consequentemente, uma composição enzimática para uso nos processos da presente invenção pode compreender qualquer celulase, por exemplo, uma mono-oxigenase litica de polissacarideo (por exemplo, GH61) , uma celobiohidrolase, uma endo-β-1,4-glucanase, uma β-glucosidase ou uma β-(1,3) (1,4)- glucanase.

Como usado no presente documento, uma celobiohidrolase (EC 3.2.1.91) é qualquer polipeptideo que é capaz de catalisar a hidrólise de ligações 1,4-β-D-glucosidicas em celulose ou celotetraose, liberando celobiose das extremidades das cadeias. Essa enzima também pode ser denominada como celulase 1, 4-β-celobiosidase, 1,4-β- celobiohidrolase, 1,4-β-D-glucano celobiohidrolase, avicelase, exo-1,4-β-D-glucanase, exocelobiohidrolase ou exoglucanase.

Conforme usado no presente documento, uma endo-β-1,4- glucanase (EC 3.2.1.4) é qualquer polipeptideo que tenha a capacidade de catalisar a endo-hidrólise de ligações 1,4-β-D- glucosidicas em celulose, liquenina ou β-D-glucanos de cereais. Tal polipeptideo também pode ter a capacidade de hidrolisar ligações 1,4 em β-D-glucanos também contendo ligações 1,3. Essa enzima também pode ser denominada celulase, avicelase, β-1,4-endoglucanoidrolase, β-1,4- glucanase, carboximetil celulase, celudextrinase, endo-1,4-β- D-glucanase, endo-1,4-β-D-glucanoidrolase, endo-1,4-β- glucanase ou endoglucanase.

Conforme usado no presente documento, uma β-glucosidase (EC 3.2.1.21) é qualquer polipeptideo que tenha a capacidade de catalisar a hidrólise de residues de β-D-glicose não redutora terminal com a liberação de β-D-glicose. Tal polipeptideo pode ter uma ampla especificidade para β-D- glucosideos e também pode hidrolisar um ou mais dentre os seguintes: um β-D-galactosideo, um α-L-arabinosideo, um β-D- xilosideo ou um β-D-fucosideo. Essa enzima também pode ser denominada amigdalase, β-D-glucosideo glucoidrolase, celobiase ou gentobiase.

Conforme usado no presente documento, a β—(1,3) (1,4)- glucanase (EC 3.2.1.73) é qualquer polipeptideo que tenha a capacidade de catalisar a hidrólise de ligações 1,4-β-D- glucosidicas em β-D-glucanos contendo ligações 1,3 e 1,4. Tal polipeptideo pode agir em liquenina e β-D-glucanos de cereais, porém não em β-D-glucanos contendo apenas ligações 1,3 ou 1,4. Essa enzima também pode ser denominada liqueninase, 1,3-1,4-β-D-glucano 4-glucanoidrolase, β- glucanase, endo-β-1,3-1,4 glucanase, liquenase ou β-glucanase de ligação mista. Uma alternativa para esse tipo de enzima é EC 3.2.1.6, que é descrita como endo-1,3(4)-beta-glucanase. Esse tipo de enzima hidrolisa ligações 1,3 ou 1,4 em beta-D- glucanose quando o residue de glicose, cujo grupo redutor está envolvido na ligação a ser hidrolisada é, o próprio, substituído em C-3. Nomes alternativos incluem endo-1,3-beta- glucanase, laminarinase, 1,3-(1,3;1,4)-beta-D-glucano 3 (4) glucanoidrolase. Substratos incluem laminarina, liquenina e beta-D-glucanos de cereais.

Uma composição para o uso nos processos da presente invenção pode compreender qualquer hemicelulase, por exemplo, uma endoxilanase, uma β-xilosidase, uma a-L- arabionofuranosidase, uma cx-D-glucuronidase, uma acetil Rub 32/61 % xilano esterase, uma feruloil esterase, uma cumaroil esterase, uma α-galactosidase, uma β-galactosidase, uma β- mananase ou uma β-manosidase.

Conforme usado no presente documento, uma endoxilanase (EC 3.2.1.8) é qualquer polipeptideo que tenha a capacidade de catalisar a endo-hidrólise de ligações 1,4-β-D-xilosidicas em xilanos. Essa enzima também pode ser denominada endo-1,4- β-xilanase ou 1,4-β-D-xilano xilanoidrolase. Uma alternativa é EC 3.2.1.136, uma glucuronoarabinoxilano endoxilanase, uma enzima que tem a capacidade de hidrolisar ligações 1,4 xilosidicas em glucuronoarabinoxilanos .

Conforme usado no presente documento, uma β-xilosidase (EC 3.2.1.37) é qualquer polipeptideo que tenha a capacidade de catalisar a hidrólise de 1,4-β-D-xilanos, remover residues de D-xilose sucessivos dos terminais não redutores. Tais enzimas também podem hidrolisar xilobiose. Essa enzima também pode ser denominada xilano 1,4-β-xilosidase, 1,4-β-D-xilano xiloidrolase, exo-1,4-β-xilosidase ou xilobiase.

Conforme usado no presente documento, uma OÍ-L- arabinofuranosidase (EC 3.2.1.55) é qualquer polipeptideo que tenha a capacidade de atuar em oc-L-arabinofuranosideos, ot-L- arabinanos contendo ligações (1,2) e/ou (1,3) e/ou (1,5), arabinoxilanos e arabinogalactanos. Essa enzima também pode ser denominada oc-N-arabinofuranosidase, arabinofuranosidase ou arabinosidase.

Conforme usado no presente documento, uma a-D- glucuronidase (EC 3.2.1.139) é qualquer polipeptideo que tenha a capacidade de catalisar uma reação da seguinte forma: alfa-D-glucuronosideo + H(2)0 = um álcool + D-glucuronato. Essa enzima também pode ser denominada alfa-glucuronidase ou alfa-glucosiduronase. Essas enzimas também podem hidrolisar ácido 4-0-glucorônico metilado, que também pode estar presente como um substituinte em xilanos. Uma alternativa é EC 3.2.1.131: xilano alfa-1,2-glucuronosidase, que catalisa a hidrólise de ligações alfa-1,2-(4-0-metil)glucuronosila .

Conforme usado no presente documento, uma acetil xilano esterase (EC 3.1.1.72) é qualquer polipeptideo que tenha a capacidade de catalisar a desacetilação de xilanos e xilo- oligossacarideos. Tal polipeptideo pode catalisar a hidrólise de grupos acetila de xilano polimérico, xilose acetilada, glicose acetilada, alfa-naftil acetato ou p-nitrofenil acetato, porém, tipicamente, não de triacetilglicerol. Tal polipeptideo tipicamente não age em pectina ou manano acetilada.

Conforme usado no presente documento, uma feruloil esterase (EC 3.1.1.73) é qualquer polipeptideo que tenha a capacidade de catalisar uma reação da forma: feruloil- sacarideo + H(2)0 = ferulato + sacarideo. 0 sacarideo pode ser, por exemplo, um oligossacarideo ou um polissacarideo. Esse pode tipicamente catalisar a hidrólise do grupo 4- hidroxi-3-metoxicinamoila (feruloila) de um açúcar esterifiçado, que é geralmente arabinose em substratos "naturais". 0 acetato de p-nitrofenol e ferulato de metila são tipicamente substratos mais pobres. Essa enzima também pode ser denominada cinamoil éster hidrolase, ácido ferúlico esterase ou hidroxicinamoil esterase. Essa também pode ser denominada enzima acessória hemicelulase, visto que essa pode auxiliar as xilanases e pectinases a quebrar a pectina e hemicelulose de parede celular vegetal.

Conforme usado no presente documento, uma cumaroil esterase (EC 3.1.1.73) é qualquer polipeptideo que tenha a capacidade de catalisar uma reação da forma: cumaroil- sacarideo + H(2)0 = cumarato + sacarideo. 0 sacarideo pode ser, por exemplo, um oligossacarideo ou um polissacarideo. Essa enzima também pode ser denominada trans-4-cumaroil esterase, trans-p-cumaroil esterase, p-cumaroil esterase ou ácido p-cumárico esterase. Essa enzima também se encontra em EC 3.1.1.73, então também pode ser denominada feruloil esterase.

Conforme usado no presente documento, uma a- galactosidase (EC 3.2.1.22) é qualquer polipeptideo que tenha a capacidade de catalisar a hidrólise de residuos de a-D- galactose não redutora terminal em a-D-galactosideos, incluindo oligossacarideos de galactose, galactomananos, galactanos e arabinogalactanos. Tal polipeptideo também pode ter a capacidade de hidrolisar a-D-fucosideos. Essa enzima também pode ser denominada melibiase.

Conforme usado no presente documento, uma β- galactosidase (EC 3.2.1.23) é qualquer polipeptideo que tenha a capacidade de catalisar a hidrólise de residues de β-D- galactose não redutora terminal em β-D-galactosideos. Tal polipeptideo também pode ter a capacidade de hidrolisar ot-L- arabinosideos. Essa enzima também pode ser denominada exo-(l- >4)-β-D-galactanase ou lactase.

Conforme usado no presente documento, uma β-mananase (EC 3.2.1.78) é qualquer polipeptideo que tenha a capacidade de catalisar a hidrólise aleatória de ligações 1,4-β-D- manosidicas em mananas, galactomananas e glucomananas. Essa enzima também pode ser denominada manana endo-1,4-β- manosidase ou endo-1,4-mananase.

Conforme usado no presente documento, uma β-manosidase (EC 3.2.1.25) é qualquer polipeptideo que tenha a capacidade de catalisar a hidrólise de residues de β-D-manose não redutora terminal em β-D-manosideos. Essa enzima também pode ser denominada mananase ou manase.

Uma composição para o uso nos processos da presente invenção pode compreender qualquer pectinase, por exemplo, uma endo poligalacturonase, uma pectina metil esterase, uma endo-galactanase, uma beta galactosidase, uma pectina acetil esterase, uma endo-pectina liase, pectato liase, alfa ramnosidase, uma exo-galacturonase, uma expoligalacturonato liase, uma ramnogalacturonano hidrolase, uma ramnogalacturonano liase, uma ramnogalacturonano acetil esterase, uma ramnogalacturonano galacturonoidrolase, uma xilogalacturonase.

Conforme usado no presente documento, uma endo- poligalacturonase (EC 3.2.1.15) é qualquer polipeptideo que tenha a capacidade de catalisar a hidrólise aleatória de ligações 1, 4-ot-D-galactosidurônicas em pectato galacturonanos. Essa enzima também pode ser poligalacturonase pectina despolimerase, endopoligalacturonase, pectolase, pectina hidrolase, pectina poligalacturonase, poli-a-1,4-galacturonideo glicanoidrolase, endogalacturonase; endo-D-galacturonase ou poli(1,4-a-D- galacturonideo) glicanoidrolase.

Conforme usado no presente documento, uma pectina metil esterase (EC 3.1.1.11) é qualguer enzima que tenha a capacidade de catalisar a reação: pectina + n H2O = n metanol + pectato. A enzima também pode ser conhecida como pectinesterase, pectina desmetoxilase, pectina metoxilase, pectina metilesterase, pectase, pectinoesterase ou pectina pectilidrolase.

Conforme usado no presente documento, uma endo- galactanase (EC 3.2.1.89) é qualquer enzima com a capacidade de catalisar a endo-hidrólise de ligações 1,4-β-D- galactosidicas em arabinogalactanos. A enzima também pode ser conhecida como arabinogalactano endo-1,4-β-galactosidase, endo-1,4-β-galactanase, galactanase, arabinogalactanose ou arabinogalactano 4-β-D-galactanoidrolase.

Conforme usado no presente documento, uma pectina acetil esterase é definida, no presente documento, como qualquer enzima que tenha uma atividade de acetil esterase que catalise a desacetilação dos grupos acetila nos grupos hidroxila de residues de GalUA de pectina.

Conforme usado no presente documento, uma endo-pectina liase (EC 4.2.2.10) é qualquer enzima com a capacidade de catalisar a clivagem eliminativa de éster metilico de (1 —♦4 ) — a-D-galacturonano para obter oligossacarídeos com grupos 4- desoxi-6-0-metil-a-D-galact-4-enuronosila em suas extremidades não redutoras. A enzima também pode ser conhecida como pectina liase, pectina trans-eliminase; endo- pectina liase, transeliminase polimetilgalacturônica, pectina metiltranseliminase, pectoliase, PL, PNL ou PMGL ou (1—>4) —6— O-metil-a-D-galacturonano liase.

Conforme usado no presente documento, a pectato liase (EC 4.2.2.2) é qualquer enzima com a capacidade de catalisar a clivagem eliminativa de (1 -»4)-a-D-galacturonano para obter oligossacarideos com grupos 4-desoxi-a-D-galact-4-onuronosila em suas extremidades não redutoras. A enzima também pode ser conhecida como transeliminase poligalacturônica, ácido péctico transeliminase, poligalacturonato liase, endopectina metiltranseliminase, pectato transeliminase, endogalacturonato transeliminase, ácido péctico liase, liase péctica, ácido a-1,4-D-endopoligalacturônico liase, PGA liase, PPase-N, ácido endo-a-1,4-poligalacturônico liase, ácido poligalacturônico liase, pectina trans-eliminase, ácido poligalacturônico trans-eliminase ou (1 -»4 ) -a-D-galacturonano liase.

Conforme usado no presente documento, uma alfa ramnosidase (EC 3.2.1.40) é qualquer polipeptideo que tenha a capacidade de catalisar a hidrólise de residues de a-L- ramnose não redutora terminal em ot-L-ramnosideos ou, alternativamente, em ramnogalacturonano. Essa enzima também pode ser conhecida como α-L-ramnosidase T, α-L-ramnosidase N ou a-L-ramnosideo ramnoidrolase.

Conforme usado no presente documento, exo-galacturonase (EC 3.2.1.82) é qualquer polipeptideo com a capacidade de hidrólise de ácido péctico a partir da extremidade não redutora, liberando digalacturonato. A enzima também pode ser conhecida como exo-poli-a-galacturonosidase, exopoligalacturonosidase ou exopoligalacturanosidase.

Conforme usado no presente documento, exo-galacturonase (EC 3.2.1.67) é qualquer polipeptideo com a capacidade de catalisar: (1,4-a-D-galacturonideo)n + H2O = (1,4-a-D- galacturonideo)n-i + D-galacturonato. A enzima também pode ser conhecida como galacturano 1,4-a-galacturonidase, exopoligalacturonase, poli(galacturonato) hidrolase, exo-D- galacturonase, exo-D-galacturonanase, exopoli-D-galacturonase ou poli(1,4-a-D-galacturonideo) galacturonoidrolase.

Conforme usado no presente documento, exopoligalacturonato liase (EC 4.2.2.9) é qualquer polipeptideo com a capacidade de catalisar a clivagem eliminativa de 4-(4-desoxi-α-D-galact-4-enuronosil)-D- galacturonato a partir da extremidade redutora de pectato, isto é, pectina desesterificada. Essa enzima pode ser conhecida como pectato dissacarideo-liase, pectato exo-liase, ácido exopéctico transeliminase, exopectato liase, ácido exopoligalacturônico-trans-eliminase, PATE, exo-PATE, exo-PGL ou dissacarideo liase de extremidade redutora de (l-»4)-a-D- galacturonano.

Conforme usado no presente documento, ramnogalacturonano hidrolase é qualquer polipeptideo que tenha a capacidade de hidrolisar a ligação entre ácido galactosilurônico e ramnopiranosila, de um modo endo, em estruturas de ramnogalacturonano estritamente alternativas, que consista no dissacarideo [ácido (1,2-alfa-L-ramnoil- (1,4)-alfa-galactosilurônico] .

Conforme usado no presente documento, ramnogalacturonano liase é qualquer polipeptideo que seja qualquer polipeptideo que tenha a capacidade de clivar ligações de ct-L-Rhap-(1-»4)-ot-D-GalpA, de um modo endo, em ramnogalacturonano através de eliminação beta.

Conforme usado no presente documento, ramnogalacturonano acetil esterase é qualquer polipeptideo que catalise a desacetilação da cadeia principal de residues de ácido galacturônico e ramnose alternativos em ramnogalacturonano.

Conforme usado no presente documento, ramnogalacturonano galacturonoidrolase é qualquer polipeptideo que tenha a capacidade de hidrolisar ácido galacturônico a partir da extremidade não redutora de estruturas de ramnogalacturonano estritamente alternativas de um modo exo.

Conforme usado no presente documento, xilogalacturonase é qualquer polipeptideo que atue em xilogalacturonano através da clivagem da cadeia principal de ácido galacturônico substituído por β-xilose de um modo endo. Essa enzima também pode ser conhecida como xilogalacturonano hidrolase.

Conforme usado no presente documento, uma ct-L- arabinofuranosidase (EC 3.2.1.55) é qualquer polipeptideo que tenha a capacidade de atuar em a-L-arabinofuranosídeos, a-L- arabinanos contendo ligações (1,2) e/ou (1,3) e/ou (1,5), arabinoxilanos e arabinogalactanos. Essa enzima também pode ser denominada a-N-arabinofuranosidase, arabinofuranosidase ou arabinosidase.

Conforme usado no presente documento, endo-arabinanase (EC 3.2.1.99) é qualquer polipeptideo que tenha a capacidade de catalisar a endo-hidrólise de ligações 1,5-OÍ- arabinofuranosídicas em 1,5-arabinanos. A enzima também pode ser conhecida como endo-arabinase, arabinano endo-1,5-ot-L- arabinosidase, endo-1,5-a-L-arabinanase, endo-ot-1,5- arabanase; endo-arabanase ou 1,5-a-L-arabinano 1,5-a-L- arabinanoidrolase.

Uma composição enzimática para o uso nos processos da presente invenção tipicamente compreenderá pelo menos duas celulases e opcionalmente pelo menos uma hemicelulase e opcionalmente pelo menos uma pectinase. Uma composição para o uso nos processos da presente invenção pode compreender uma GH61, uma celobioidrolase, uma endoglucanase e/ou uma β- glucosidase. Tal composição também pode compreender uma ou mais hemicelulases e/ou uma ou mais pectinases.

Além disso, uma ou mais (por exemplo, duas, três, quatro ou todas) dentre uma amilase, uma protease, uma lipase, uma ligninase, uma hexosiltransferase, uma glucuronidase, uma expansina, uma proteína induzida por celulose ou uma proteína integradora de celulose ou proteína semelhante pode estar presente em uma composição para o uso nos processos da presente invenção (essas são denominadas atividades auxiliares acima). "Protease" inclui enzimas que hidrolisam ligações peptídicas (peptidases), bem como enzimas que hidrolisam ligações entre peptídeos e outras porções químicas, como açúcares (glicopeptidases) . Muitas proteases são distinguidas em EC 3.4 e são adequadas para o uso nos processos da presente invenção. Alguns tipos específicos de proteases incluem cisteína proteases incluindo pepsina, papaína e serina proteases incluindo quimiotripsinas, carboxipeptidases e metaloendopeptidases. "Lipase" inclui enzimas que hidrolisam lipídeos, ácidos graxos e acilglicerídeos, incluindo fosfoglicerídeos, lipoproteínas, diacilgliceróis e similares. Em plantas, os lipídeos são usados como componentes estruturais para limitar a perda de água e infecção por patógeno. Esses lipídeos incluem ceras derivadas de ácidos graxos, bem como cutina e suberina. "Ligninase" inclui enzimas que podem hidrolisar ou quebrar a estrutura de polímeros de lignina. Enzimas que podem quebrar lignina incluem lignina peroxidases, manganês peroxidases, lacases e feruloil esterases e outras enzimas descritas na técnica conhecidas por despolimerizar ou, de outro modo, quebrar polímeros de lignina. Também estão incluídas enzimas com a capacidade de hidrolisar ligações formadas entre açúcares hemicelulósicos (especialmente arabinose) e lignina. Ligninases incluem, porém sem limitação, o seguinte grupo de enzimas: lignina peroxidases (EC 1.11.1.14), manganês peroxidases (EC 1.11.1.13), lacases (EC 1.10.3.2) e feruloil esterases (EC 3.1.1.73). "Hexosiltransferase" (2.4.1-) inclui enzimas que tenham a capacidade de catalisar uma reação de transferase, porém que também podem catalisar uma reação de hidrólise, por exemplo, de celulose e/ou produtos de degradação de celulose. Um exemplo de uma hexosiltransferase que pode ser usada na invenção é uma β-glucanosiltransferase. Tal enzima pode ter a capacidade de catalisar a degradação de (1,3)(l,4)glucano e/ou celulose e/ou a produto de degradação de celulose. "Glucuronidase" inclui enzimas que catalisam a hidrólise de um glucoronosídeo, por exemplo, β-glucuronosideo para obter um álcool. Muitas glucuronidases foram distinguidas e podem ser adequadas para o uso na invenção, por exemplo, β-glucuronidase (EC 3.2.1.31), hialurono- glucuronidase (EC 3.2.1.36), glucuronosil-dissulfoglucosamina glucuronidase (3.2.1.56), glicirrizinato β-glucuronidase (3.2.1.128) ou oí-D-glucuronidase (EC 3.2.1.139).

Uma composição para o uso nos processos da presente invenção pode compreender uma expansina ou proteina semelhante a expansina, como uma swolenina (consultar Salheimo et al., Eur. J. Biochem. 269, 4202 a 4211, 2002) ou uma proteina semelhante a swolenina.

Expansinas estão implicadas no afrouxamento da estrutura da parede celular durante o crescimento celular da planta. PropÕe-se que as expansinas interrompam a ligação de hidrogênio entre a celulose e outros polissacarideos da parede celular sem ter atividade hidrolitica. Desse modo, acredita-se que essas permitam o deslizamento de fibras de celulose e o alongamento da parede celular. A swolenina, uma proteina semelhante a expansina, contém um dominio da Familia 1 de Módulo de Ligação a Carboidrato N-terminal (CBD) e um dominio semelhante a expansina C-terminal. Para os propósitos da presente invenção, uma proteina semelhante a expansina ou proteina semelhante a swolenina pode compreender um ou ambos os dominios e/ou pode interromper a estrutura das paredes celulares (como romper a estrutura da celulose), opcionalmente sem produzir quantidades detectáveis de açúcares redutores.

Uma composição para o uso nos processos da presente invenção pode ser uma proteina induzida por celulose, por exemplo, o produto de polipeptideo do gene dpi ou cip2 ou genes semelhantes (consultar Foreman et al., J. Biol. Chem. 278(34), 31988 a 31997, 2003), uma proteina de integração de celulossoma/celulose, por exemplo, o produto de polipeptideo do gene cipA ou cipC, ou uma proteina de suporte ou semelhante a suporte. Proteinas de integração de celulose e suportes são subunidades de integração multifuncional que podem organizar as subunidades celuloliticas em um complexo multienzimático. Isso é alcançado através da interação de duas classes de domínios complementares, isto é, um domínio de coesão em suporte e um domínio doquerina em cada unidade enzimática. A unidade de suporte também porta um módulo de ligação a celulose (CBM) que medeia a união do celulossoma a seu substrato. Um suporte ou proteína de integração de celulose, para os propósitos da presente invenção, pode compreender um ou ambos os domínios.

Uma composição para o uso nos processos da presente invenção pode ser composta por um membro de cada uma das classes de enzimas mencionadas acima, vários membros de uma classe de enzimas, ou qualquer combinação dessas classes de enzimas ou proteínas auxiliares (isto é, aquelas proteínas mencionadas no presente documento que não têm atividade enzimática por si só, porém, ainda assim, auxiliam na degradação lignocelulósica).

Uma composição para o uso nos processos da presente invenção pode ser composta por enzimas de (1) fornecedores comerciais; (2) enzimas que expressam genes clonados; (3) caldo (como aquelas que resultam do cultivo de uma cepa microbiana em meios, em que as cepas secretam proteínas e enzimas nos meios; (4) lisatos celulares de cepas cultivadas como em (3); e/ou (5) enzimas que expressam material vegetal. Diferentes enzimas em uma composição da invenção podem ser obtidas de diferentes fontes.

As enzimas podem ser produzidas de maneira exógena em micro-organismos, leveduras, fungos, bactérias ou plantas, depois isoladas e adicionadas, por exemplo, ao material lignocelulósico. Alternativamente, a enzima pode ser produzida em uma fermentação que usa material lignocelulósico (pré-tratado) (como palha de milho ou palha de trigo) para fornecer nutrição a um organismo que produz uma enzima (ou enzimas). Dessa maneira, plantas que produzem as enzimas podem, as próprias, servir como um material lignocelulósico e ser adicionadas no material lignocelulósico.

Nos usos e métodos descritos no presente documento, os fornecidos concomitantemente (isto é, como composição por si só) ou de modo separado ou sequencial.

Em uma modalidade, as composições enzimáticas para o uso nos processos da presente invenção podem ser um caldo de fermentação integral, conforme descrito abaixo. 0 caldo de fermentação integral pode compreender qualquer um dos polipeptideos mencionados acima ou qualquer combinação desses. Preferencialmente, a composição enzimática é um caldo de fermentação integral em que as células estão mortas. O caldo de fermentação integral compreende um primeiro componente de ácido orgânico que compreende pelo menos ácido orgânico com 1 a 5 carbonos e/ou um sal desses, e um segundo componente de ácido orgânico que compreende pelo menos um ácido orgânico com 6 ou mais carbonos e/ou um sal desses. Em uma modalidade, o primeiro componente de ácido orgânico é ácido acético, ácido fórmico, ácido propiônico, um sal desses ou qualquer combinação desses, e o segundo componente de ácido orgânico é ácido benzoico, ácido cicloexanocarboxilico, ácido 4-metilvalérico, ácido fenilacético, um sal desses ou qualquer combinação desses.

O termo "caldo de fermentação integral", conforme usado no presente documento, se refere a uma preparação produzida através de fermentação celular que é submetida a minima ou nenhuma recuperação e/ou purificação. Por exemplo, caldos de fermentação integrais são produzidos quando culturas microbianas são produzidas até a saturação, incubadas em condições limitantes de carbono para permitir a sintese de proteina (por exemplo, a expressão de enzimas por células hospedeiras) e a secreção em meio de cultura celular. Tipicamente, o caldo de fermentação integral é não fracionado e compreende meio de cultura celular usado, enzimas extracelulares e micróbios, de preferência células inviáveis.

Se for necessário, o caldo de fermentação integral pode ser fracionado, e o um ou mais dentre os teores fracionados podem ser usados. Por exemplo, as células mortas e/ou detritos celulares podem ser removidos de um caldo de fermentação integral para fornecer uma composição que esteja livre desses componentes.

O caldo de fermentação integral pode compreender adicionalmente um conservante e/ou agente antimicrobiano. Tais conservantes e/ou agentes são conhecidos na técnica.

O caldo de fermentação integral conforme descrito no presente documento é tipicamente um liquido, porém pode conter componentes insolúveis, como células mortas, detritos celulares, componentes de meios de cultura e/ou enzima (ou enzimas) insolúvel. Em algumas modalidades, os componentes insolúveis podem ser removidos para fornecer um caldo de fermentação integral clarificado.

Conforme descrito acima, uma composição enzimática está presente na etapa (d) e na etapa (f) dos processos da presente invenção. Essas composições enzimáticas podem ser iguais ou podem ser diferentes. Além disso, conforme descrito acima, enzimas adicionais são adicionadas durante a etapa (d) e/ou a etapa (f) dos processos de acordo com a presente invenção. As enzimas adicionadas podem ser enzimas que já estão presentes na etapa (d) e na etapa (f) . Alternativamente, essas podem ser enzimas diferentes. Ademais, as enzimas adicionais adicionadas durante a etapa (d) podem diferir ou podem ser iguais às enzimas adicionais adicionadas durante a etapa (f) dos processos de acordo com a presente invenção.

Material lignocelulósico, conforme usado no presente documento, inclui qualquer material lignocelulósico e/ou hemicelulósico. Um material lignocelulósico adequado para o uso nos processos da presente invenção inclui biomassa, por exemplo, biomassa virgem e/ou biomassa não virgem como biomassa agricola, produtos orgânicos comerciais, detritos de demolição e construção, residues sólidos urbanos, papel usado Rusina e resíduos de jardim. Formas comuns de biomassa incluem árvores, arbustos e gramas, trigo, palha de trigo, bagaço de cana-de-açúcar, painço amarelo, miscanthus, cana-energia, milho, palha de milho, cascas de milho, espigas de milho, caules de canola, caules de soja, sorgo doce, grãos de milho incluindo fibra de grãos, produtos e subprodutos de moagem de grãos como milho, trigo e cevada (incluindo moagem a úmido e moagem a seco) frequentemente denominados "farelo ou fibra", bem como resíduos sólidos urbanos, papel usado e resíduos de jardim. A biomassa também pode ser, porém sem limitação, material herbáceo, resíduos agrícolas, resíduos florestais, resíduos sólidos urbanos, papel usado, e resíduos de moagem de papel e polpa. "Biomassa agrícola" inclui ramos, arbustos, canas, milho e cascas de milho, culturas energéticas, florestas, frutos, flores, grãos, gramas, culturas herbáceas, folhas, cascas, espinhos, troncos, raízes, mudas, culturas lenhosas de curta duração, arbustos, painço amarelo, árvores, vegetais, cascas de frutas, videiras, polpa de beterraba sacarina, farelo de milho, cascas de aveia e madeiras macias e duras (não incluindo madeiras com materiais nocivos) . Além disso, a biomassa agrícola inclui materiais de resíduos orgânicos gerados de processos agrícolas incluindo atividades florestais e lavoura, especificamente incluindo resíduos de madeira florestal. A biomassa agrícola pode ser qualquer uma dentre as supracitadas por si sós ou em qualquer combinação ou mistura dessas.

A celulose é um composto orgânico com a fórmula (CeHioOsín, um polissacarideo que consiste em uma cadeia linear de várias centenas a mais de dez milhares de unidades de D-glicose β(1—4)-ligadas. Uma molécula de glucano é um polissacarideo de monômeros de D-glicose ligados por ligações glicosídicas. No presente documento, glucano e celulose são usados de modo intercambiável para um polissacarideo de monômeros de D-glicose ligados por ligações glicosídicas. Os métodos para a análise quantitativa de composições de polissacarideo ou glucano são bem conhecidas e descritas na técnica e estão, por exemplo, resumidas em Carvalho de Souza et al.r Carbohydrate Polymers 95 (2013) 657 a 663. Em geral, 50 a 70 % do glucano é celulose cristalina, o restante é celulose amorfa.

Conforme descrito acima, o material lignocelulósico pode opcionalmente ser pré-tratado. Métodos de pré-tratamento são conhecidos na técnica e incluem, porém, sem limitação, por calor, mecânico, modificação quimica, modificação biológica e qualquer combinação desses. O pré-tratamento é tipicamente realizado a fim de melhorar a acessibilidade do material lignocelulósico à hidrólise enzimática e/ou hidrolisar a hemicelulose e/ou solubilizar a hemicelulose e/ou celulose e/ou lignina, no material lignocelulósico. Em uma modalidade, o pré-tratamento compreende tratar o material lignocelulósico com explosão de vapor, tratamento com água quente ou tratamento com ácido diluido ou base diluida.

Conforme descrito acima, o material lignocelulósico pode opcionalmente ser lavado. A lavagem opcional etapa pode ser usada para remover compostos solúveis em água que podem agir como inibidores para a etapa de hidrólise e/ou fermentação. A etapa de lavagem pode ser conduzida de uma maneira conhecida pelo versado.

A composição enzimática usada no processo da invenção pode hidrolisar de modo extremamente eficaz o material lignocelulósico, por exemplo, palha de milho ou palha de trigo, que pode, então, ser adicionalmente convertido em um produto, como etanol, biogás, butanol, ácido lático, um plástico, um ácido orgânico, um solvente, um suplemento de alimento animal, um produto farmacêutico, uma vitamina, um aminoácido, uma enzima ou uma matéria-prima quimica. Adicionalmente, produtos intermediários de um processo após a hidrólise, por exemplo, ácido lático como intermediário na produção de biogás, podem ser usados como blocos de construção para outros materiais. A presente invenção é exemplificada com a produção de etanol, porém isso é feito como exemplificação apenas, e não como limitação, os outros produtos mencionados podem ser produzidos igualmente bem.

O processo de acordo com a invenção compreende duas etapas de hidrólise enzimática, etapa (d) e etapa (f). Na etapa (d) , a hidrólise é principalmente realizada com a finalidade de liquefação do material lignocelulósico, ao passo que na etapa (f), a hidrólise é principalmente realizada com a finalidade de liberar açúcar do material lignocelulósico. Dependendo do material lignocelulósico e do método de pré-tratamento, diferentes condições de reação, por exemplo, temperatura, dosagem enzimática, tempo de reação de hidrólise e concentração de matéria seca, podem ser adaptadas pelo versado a fim de alcançar um propósito desejado de a hidrólise. Algumas indicações são fornecidas abaixo.

Em uma modalidade, a hidrólise enzimática na etapa (d) e/ou na etapa (f) dos processos de acordo com a presente invenção é conduzida a uma temperatura de 45 °C ou mais, 50 °C ou mais, 55 °C ou mais, 60 °C ou mais, 65 °C ou mais, ou 70 °C ou mais. A temperatura alta durante a hidrólise tem muitas vantagens, que incluem trabalhar na temperatura ideal da composição enzimática, a redução de risco de contaminação (bacteriana), viscosidade reduzida, é necessária uma quantidade menor de água de resfriamento, uso de água de resfriamento com uma temperatura mais alta, reuso das enzimas e mais. A temperatura usada na hidrólise enzimática na etapa (d) e/ou na etapa (f) pode ser diferente ou pode ser igual.

Em uma modalidade, a quantidade de composição enzimática adicionada (no presente documento também denominada dosagem enzimática ou carga enzimática) é baixa. Em uma modalidade, a quantidade de enzimas é de 6 mg de proteina / g de peso de matéria seca ou menor, 5 mg de proteina / g de matéria seca ou menor, 4 mg de proteina / g de matéria seca ou menor, 3 mg de proteina / g de matéria seca ou menor, 2 mg de proteina / g de matéria seca ou menor, ou 1 mg de proteina / g de matéria seca ou menor (expressa como proteina em mg de proteina / g de matéria seca). Em uma modalidade, a quantidade de enzimas é 0,5 mg de enzimas / g de peso de matéria seca ou menor, 0,4 mg de composição enzimática / g de peso de matéria seca ou menor, 0,3 mg de enzimas / g de peso de matéria seca ou menor, 0,25 mg de enzimas / g de peso de matéria seca ou menor, 0,20 mg de enzimas / g de peso de matéria seca ou menor, 0,18 mg de enzimas / g de peso de matéria seca ou menor, 0,15 mg de enzimas / g de peso de matéria seca ou menor ou 0, 10 mg de enzimas / g de peso de matéria seca ou menor (expressa como o total de enzimas celulase em mg de enzimas / g de matéria seca). Uma baixa dosagem enzimática é possivel, devido à atividade e estabilidade das enzimas. A quantidade de composição enzimática adicionada na hidrólise enzimática na etapa (d) e/ou na etapa (f) pode ser diferente ou pode ser igual.

Em uma modalidade, o tempo de hidrólise total é de 6 horas ou mais, 10 horas ou mais, 20 horas ou mais, 40 horas ou mais, 50 horas ou mais, 60 horas ou mais, 70 horas ou mais, 80 horas ou mais, 90 horas ou mais, 100 horas ou mais, 120 horas ou mais, 130 h ou mais.

Em uma modalidade, o tempo de hidrólise total é 5 a 150 horas, 30 a 140 horas, 40 a 120 horas, 45 a 110 horas, 50 a 100 horas, 55 a 95 horas, 60 a 90 horas, 65 a 85 horas ou 70 a 80 horas. Devido à estabilidade da composição enzimática, tempos de reação de hidrólise mais longos são possiveis com rendimentos de açúcar mais altos correspondentes. "Tempo de hidrólise total", conforme usado no presente documento, significa o tempo de reação da etapa (d) e da etapa (f) .

Em uma modalidade, o tempo de hidrólise enzimática na etapa (d) dos processos de acordo com a presente invenção é de 3 a 30 horas.

Em uma modalidade, o tempo de hidrólise enzimática na etapa (f) dos processos de acordo com a presente invenção é de 3 a 120 horas.

O pH durante a hidrólise pode ser escolhido pelo versado. Em uma modalidade, o pH durante a hidrólise pode ser 3,0 a 6,4. As enzimas estáveis da invenção podem ter uma ampla faixa de pH de até 2 unidades de pH, até 3 unidades de pH, até 5 unidades de pH. 0 pH ideal pode se encontrar dentro dos limites de pH 2,0 a 8,0, 2,5 a 7,5, 3,0 a 7,0, 3,5 a 6,5, 4,0 a 5,0, 4,0 a 4,5 ou é de cerca de 4,2. O pH usado na hidrólise enzimática na etapa (d) e/ou na etapa (f) pode ser diferente ou pode ser igual. 0 pH ideal da composição enzimática usada na hidrólise enzimática na etapa (d) e/ou na etapa (f) pode ser diferente ou pode ser igual.

Em uma modalidade, a etapa de hidrólise é conduzida até que 70 % ou mais, 80 % ou mais, 85 % ou mais, 90 % ou mais, 92 % ou mais, 95 % ou mais do açúcar disponível no material lignocelulósico ser liberado.

De modo significativo, um processo da invenção pode ser realizado com o uso de altos niveis de matéria seca (do material lignocelulósico) em uma reação de hidrólise. Em uma modalidade, o teor de matéria seca no final da hidrólise da etapa (f) é 5 % em peso ou maior, 6 % em peso ou maior, 7 % em peso ou maior, 8 % em peso ou maior, 9 % em peso ou maior, 10 % em peso ou maior, 11 % em peso ou maior, 12 % em peso ou maior, 13 % em peso ou maior, 14 % em peso ou maior, 15 % em peso ou maior, 16 % em peso ou maior, 17 % em peso ou maior, 18 % em peso ou maior, 19 % em peso ou maior, 20 % em peso ou maior, 21 % em peso ou maior, 22 % em peso ou maior, 23 % em peso ou maior, 24 % em peso ou maior, 25 % em peso ou maior, 26 % em peso ou maior, 27 % em peso ou maior, 28 % em peso ou maior, 29 % em peso ou maior, 30 % em peso ou maior, 31 % em peso ou maior, 32 % em peso ou maior, 33 % em peso ou maior, 34 % em peso ou maior, 35 % em peso ou maior, 36 % em peso ou maior, 37 % em peso ou maior, 38 % em peso ou maior, 39 % em peso ou maior ou 40 % em peso ou maior.

Em uma modalidade, a fermentação na etapa (h) dos processos de acordo com a presente invenção é realizada no segundo recipiente. Por conseguinte, a fermentação pode ser realizada simultaneamente com a sacarificação em um recipiente (um processo denominado SSF) . Alternativamente, a fermentação na etapa (h) também pode ser realizada em um terceiro recipiente. Preferencialmente, a fermentação é realizada após a hidrólise, e condições ideais tanto para a hidrólise quanto para a fermentação podem ser selecionadas, o que pode ser diferente para a hidrólise e para a fermentação. Em um aspecto adicional, a invenção inclui, desse modo, na etapa de fermentação, processos em que um micro-organismo é usado para a fermentação de uma fonte de carbono que compreende açúcar (ou açúcares), por exemplo, glicose, L- arabinose e/ou xilose. A fonte de carbono pode incluir qualquer carboidrato oligo- ou polimero que compreende unidades de L-arabinose, xilose ou glicose, como por exemplo, lignocelulose, xilanos, celulose, amido, arabinano e similares. Para a liberação de unidades de xilose ou glicose de tais carboidratos, carboidrases apropriadas (como xilanases, glucanases, amilases e similares) podem ser adicionadas ao meio de fermentação ou podem ser produzidas pela célula hospedeira modificada. No último caso, a célula hospedeira modificada pode ser geneticamente modificada para produzir e excretar tais carboidrases. Uma vantagem adicional do uso de fontes oligo- ou poliméricas de glicose é que isso permite manter uma concentração (mais) baixa de glicose livre durante a fermentação, por exemplo, o uso de quantidades de limite de taxa das carboidrases. Isso, por sua vez, evitará a repressão do sistema necessária para o metabolismo e transporte de açúcares diferentes de glicose como xilose. Em um processo preferencial, a célula hospedeira modificada fermenta tanto a L-arabinose (opcionalmente xilose) quanto a glicose, de preferência simultaneamente, em tal caso, de preferência, é usada uma célula hospedeira modificada que é insensível à repressão de glicose para evitar o crescimento diáuxico. Além de uma fonte de L-arabinose, opcionalmente xilose (e glicose) como fonte de carbono, o meio de fermentação adicionalmente compreenderá o ingrediente apropriado necessário para o crescimento da célula hospedeira modificada. As composições de meios de fermentação para o crescimento de micro-organismos como leveduras ou fungos filamentosos são bem conhecidas na técnica. 0 tempo de fermentação pode ser mais curto do que na fermentação convencional nas mesmas condições, em que parte da hidrólise enzimática ainda tem que fazer parte da fermentação. Em uma modalidade, o tempo de fermentação é 100 horas ou menos, 90 horas ou menos, 80 horas ou menos, 70 horas ou menos, ou 60 horas ou menos, para uma composição de açúcar de 50 g/1 de glicose e outros açúcares correspondentes do material lignocelulósico (por exemplo, 50 g/1 de xilose, 35 g/1 de L-arabinose e 10 g/1 de galactose) . Para composições de açúcar mais diluidas, o tempo de fermentação pode ser reduzido de modo correspondente. 0 processo de fermentação pode ser um processo de fermentação aeróbico ou anaeróbico. Um processo de fermentação anaeróbico está definido, no presente documento, como o processo de fermentação executado na ausência de oxigênio ou em que substancialmente nenhum oxigênio é consumido, de preferência menos do que 5, 2,5 ou 1 mmol/l/h, mais preferencialmente 0 mmol/l/h é consumido (isto é, o consumo de oxigênio é não detectável), e em que moléculas orgânicas servem tanto como doadoras de elétrons quanto como receptoras de elétrons. Na ausência de oxigênio, o NADH produzido na glicólise e na formação de biomassa não pode ser oxidado através de fosforilação oxidativa. Para resolver esse problema, muitos micro-organismos usam piruvato ou um de seus derivados como um aceitador de hidrogênio e elétron, regenerando, assim, NAD+. Desse modo, em um processo de fermentação anaeróbica preferencial, o piruvato é usado como um (aceitador de hidrogênio e) elétron e é reduzido a produtos de fermentação como etanol, ácido lático, ácido 3- hidroxi-propiônico, ácido acrilico, ácido acético, ácido succinico, ácido citrico, ácido málico, ácido fumárico, um aminoácido, 1,3-propano-diol, etileno, glicerol, butanol, um antibiótico β-lactama e uma cefalosporina. Em uma modalidade preferencial, o processo de fermentação é anaeróbico. Um processo anaeróbico é vantajoso, visto que é mais barato do que os processos aeróbicos: é necessário menos equipamento especial. Além disso, espera-se que os processos anaeróbicos obtenham um rendimento de produto mais alto do que os processos aeróbicos. Em condições aeróbicas, geralmente o rendimento de biomassa é mais alto do que em condições anaeróbicas. Como consequência, geralmente em condições aeróbicas, o rendimento de produto esperado é mais baixo do que em condições anaeróbicas.

Em uma outra modalidade, o processo de fermentação se dá em condições limitantes de oxigênio. Com mais preferência, o processo de fermentação é aeróbico e em condições limitantes de oxigênio. Um processo de fermentação limitante de oxigênio é um processo em que o consumo de oxigênio é limitado pela transferência de oxigênio do gás para o liquido. 0 grau de limitação de oxigênio é determinado pela quantidade e composição do fluxo do gás de entrada, bem como as reais propriedades de transferência de massa/mistura do equipamento de fermentação usado. Preferencialmente, em um processo em condições limitantes de oxigênio, a taxa de consumo de oxigênio é de pelo menos 5,5, mais preferencialmente pelo menos 6 e ainda mais preferencialmente pelo menos 7 mmol/l/h.

O processo de fermentação é, de preferência, executado a uma temperatura que é ideal para a célula modificada. Desse modo, para a maior parte das leveduras ou células fúngicas, o processo de fermentação é realizado a uma temperatura que é menor do que 42 °C, de preferência menor do que 38 °C. Para células hospedeiras de fungos filamentosos ou leveduras, o processo de fermentação é, de preferência, realizado a uma temperatura que é menor do que 35, 33, 30 ou 28 °C, e a uma temperatura que é maior do que 20, 22, ou 25 °C.

Em uma modalidade da invenção, na etapa (h) , a fermentação é conduzida com um micro-organismo que tem a capacidade de fermentar pelo menos um açúcar C5. Em uma modalidade, o processo é um processo para a produção de etanol, em que o processo compreende a etapa de fermentar um meio contendo açúcar (ou açúcares) com um micro-organismo que tem a capacidade de fermentar pelo menos um açúcar C5. O micro-organismo pode ser um organismo procariótico ou eucariótico. O micro-organismo usado no processo pode ser um micro-organismo geneticamente modificado. Exemplos de organismos adequados são leveduras, por exemplo, Saccharomyces, por exemplo, Saccharomyces cerevisiae, Hansenula, Issatchenkia, por exemplo, Issatchenkia orientalis, Pichia, por exemplo, Pichia stipitis, ou bactérias, por exemplo, Lactobacillus, por exemplo, Lactobacillus lactis, Geobacillus, Zymomonas, por exemplo, Zymomonas mobilis, Clostridium, por exemplo, Clostridium phytofermentans. Em uma modalidade o micro-organismo que tem a capacidade de fermentar pelo menos um açúcar C5 é uma levedura. Em uma modalidade, a levedura pertence ao gênero Saccharomyces, de preferência da espécie Saccharomyces cerevisiae. A levedura, por exemplo, Saccharomyces cerevisiae, usada na etapa (h) dos processos de acordo com a presente invenção, tem a capacidade de converter açúcares de hexose (C6) e açúcares de pentose (C5) . A levedura, por exemplo, Saccharomyces cerevisiae, usada na etapa (h) dos processos de acordo com a presente invenção, pode fermentar de maneira anaeróbica pelo menos um açúcar C6 e pelo menos um açúcar C5. Por exemplo, a levedura tem a capacidade de usar L-arabinose e xilose além de glicose de maneira anaeróbica. Em uma modalidade, a levedura tem a capacidade de converter L-arabinose em L-ribulose e/ou 5-fosfato de xilulose e/ou em um produto de fermentação desejado, por exemplo, em etanol. Organismos, por exemplo, cepas de Saccharomyces cerevisiae, com a capacidade de produzir etanol de L-arabinose, podem ser produzidos modificando-se uma levedura hospedeira introduzindo os genes araA (L-arabinose isomerase), araB (L- ribuloglioxalato) e araD (L-ribulose-5-P4-epimerase) de uma fonte adequada. Tais genes podem ser introduzidos em uma célula hospedeira a fim de que tenha a capacidade de usar arabinose. Tal abordagem é fornecida e descrita no documento W02003/095627. Os genes araA, araB e araD de Lactobacillus plantarum podem ser usados e são revelados no documento W02008/041840. O gene araA de Bacillus subtilis e os genes araB e araD de Escherichia coli podem ser usados e são revelados no documento EP1499708. Em uma outra modalidade, os genes araA, araB e araD podem ser derivados de pelo menos um dentre os gêneros Clavibacter, Arthrobacter e/ou Gramella, em particular um dentre Clavibacter michiganensis, Arthrobacter aurescens, e/ou Gramella forsetii, conforme revelado no documento WO 2009011591. Em uma modalidade, a levedura também pode compreender uma ou mais cópias do gene de xilose isomerase e/ou uma ou mais cópias do gene de xilose redutase e/ou xilitol desidrogenase.

A levedura pode compreender uma ou mais modificações genéticas para permitir que a levedura fermente xilose. Exemplos de modificações genéticas são a introdução de um ou mais dentre o gene xilA, gene XIL1 e o gene XIL2 e/ou o gene XKS1; deleção do gene aldose redutase (GRE3); superexpressão dos genes PPP TALI, TKL1, RPE1 e RKI1 para permitir o melhoramento do fluxo através da via de pentose fosfato na célula. Exemplos de levedura geneticamente modificada são descritos no documento EP1468093 e/ou WO2006/009434 .

Um exemplo de uma levedura comercial adequada é RN1016, que é a cepa de Saccharomyces cerevisiae de fermentação de xilose e glicose disponível junto à DSM, Holanda.

Em uma modalidade, o processo de fermentação para a produção de etanol é anaeróbico. Anaeróbico já foi definido anteriormente no presente documento. Em uma outra modalidade preferencial, o processo de fermentação para a produção de etanol é aeróbico. Em uma outra modalidade preferencial, o processo de fermentação para a produção de etanol se dá em condições limitantes de oxigênio, mais preferencialmente aeróbicas e em condições limitantes de oxigênio. Condições limitantes de oxigênio já foram definidas anteriormente no presente documento.

A produtividade de etanol volumétrica é, de preferência, pelo menos 0,5, 1,0, 1,5, 2,0, 2,5, 3,0, 5,0 ou 10,0 g de etanol por litro por hora. O rendimento de etanol em L-arabinose e opcionalmente xilose e/ou glicose no processo, de preferência, é de pelo menos 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 60, 70, 80, 90, 95 ou 98 %. O rendimento de etanol é definido no presente documento como uma porcentagem do rendimento máximo teórico, que, para glicose e L-arabinose, e opcionalmente xilose, é 0,51 g de etanol por g de glicose ou xilose.

Em um aspecto, o processo de fermentação que leva à produção de etanol tem várias vantagens em comparação com os processos de fermentações de etanol conhecidos: processos anaeróbicos são possiveis; condições limitantes de oxigênio são possiveis; taxas de produção de etanol e rendimentos de etanol mais altos podem ser obtidos; a cepa usada pode ter a capacidade de usar L-arabinose e opcionalmente xilose.

Alternativamente aos processos de fermentação descritos acima, pelo menos duas células distintas podem ser usadas, isso significa que esse processo é um processo de cofermentação. Todas as modalidades preferenciais dos processos de fermentação, conforme descrito acima, também são modalidades preferenciais desse processo de cofermentação: a identidade do produto de fermentação, identidade da fonte de L-arabinose e da fonte de xilose, condições de fermentação (condições aeróbicas ou anaeróbicas, condições limitantes de oxigênio, temperatura em que o processo está sendo realizado, produtividade de etanol, rendimento de etanol) .

O processo de fermentação pode ser realizado sem qualquer necessidade de ajustar o pH durante o processo. Ou seja, o processo é tal que pode ser realizado sem a adição de qualquer ácido (ou ácidos) ou base (ou bases) . No entanto, isso exclui uma etapa de pré-tratamento, em que o ácido pode ser adicionado. 0 ponto é que a composição enzimática usada nos processos da invenção tem a capacidade de atuar em pH baixo e, portanto, não há necessidade de ajustar o pH do ácido de uma matéria-prima pré-tratada ácida a fim de que a hidrólise possa acontecer. Consequentemente, os processos da invenção podem ser processos de residuo zero com o uso apenas de produtos orgânicos sem necessidade de entrada quimica inorgânica. 0 tempo de reação geral (ou o tempo de reação da etapa de hidrólise e da etapa de fermentação juntas) pode ser reduzido. Em uma modalidade, o tempo de reação geral é de 300 horas ou menos, 200 horas ou menos, 150 horas ou menos, 140 horas ou menos, 130 ou menos, 120 horas ou menos, 110 horas ou menos, 100 horas ou menos, 90 horas ou menos, 80 horas ou menos, 75 horas ou menos, ou cerca de 72 horas em 90 % de rendimento de glicose. De modo correspondente, tempos de reação gerais menores podem ser alcançados em menor rendimento de glicose.

Os produtos de fermentação que podem ser produzidos pelos processos da invenção incluem aminoácidos, vitaminas, produtos farmacêuticos, suplementos de alimento animal, produtos quimicos especializados, matérias-primas quimicas, plásticos, solventes, combustíveis, ou outros polímeros orgânicos, ácido lático e etanol, incluindo etanol combustível (sendo que o termo "etanol" é entendido como incluindo álcool etílico ou misturas de álcool etílico e água) .

Os produtos adicionados de valor especifico que podem ser produzidos pelos processos da invenção incluem, porém sem limitação, biocombustiveis (incluindo biogás, etanol e butanol); ácido lático; ácido 3-hidroxi-propiônico; ácido acrílico; ácido acético; 1,3-propano-diol; etileno; glicerol; um plástico; um produto químico especializado; um ácido orgânico, incluindo ácido cítrico, ácido succinico e ácido maleico; um solvente; um suplemento de alimento animal; um produto farmacêutico como um antibiótico de β-lactama ou uma cefalosporina; uma vitamina; um aminoácido, como lisina, metionina, triptofano treonina e ácido aspártico; uma enzima, como uma protease, uma celulase, uma amilase, uma glucanase, uma lactase, uma lipase, uma liase, uma oxidorredutase, uma transferase ou uma xilanase; uma matéria-prima quimica; ou um suplemento de alimento animal.

Os processos de acordo com a invenção opcionalmente compreendem recuperação de produto de fermentação. Um produto de fermentação pode ser separado do caldo de fermentação de uma maneira conhecida pelo versado. Para cada produto de fermentação, o versado, desse modo, será capaz de selecionar uma técnica de separação apropriada. Por exemplo, o etanol pode ser separado de um caldo de fermentação de levedura através de destilação, por exemplo, destilação a vapor/destilação a vácuo de modo convencional.

Os efeitos benéficos da presente invenção são constatados em vários materiais lignocelulósicos e, portanto, acredita-se que estejam presentes na hidrólise de todos os tipos de materiais lignocelulósicos. Esses efeitos benéficos da presente invenção são constatados em várias composições enzimáticas e, portanto, acredita-se que estejam presentes em todos os tipos de composições enzimáticas de hidrólise.

EXEMPLOS Exemplo 1

O efeito na liquefação da ordem da adição de material lignocelulósico e composição enzimática ao recipiente de hidrólise

Para mostrar o efeito da ordem da adição do material lignocelulósico e da composição enzimática ao recipiente de hidrólise no processo de liquefação, os experimentos a seguir foram conduzidos.

Em dois recipientes agitados A e B, a hidrólise foi realizada com material lignocelulósico pré-tratado (37 % (p/p) de matéria seca de palha de cana) e uma composição enzimática (100 mg de eWB-CE enriquecida em BG/g de DM) a uma temperatura de 62 °C e pH 4,5 por 8,4 horas.

Uma composição contendo celulase TEC-210 foi produzida conforme descrito no documento WO 2011/000949. 0 caldo integral da composição contendo celulase TEC-210 (eWB-CE) compreendia 44 mg de proteina/g de caldo integral.

O recipiente A foi preenchido com 349 g de ácido citrico 50 mM e, depois, o material lignocelulósico pré- tratado (denominado biomassa na Tabela 1) foi adicionado. Em seguida, a composição enzimática foi adicionada ao material lignocelulósico no recipiente. Após isso, a composição enzimática e o material lignocelulósico foram adicionados ao recipiente em um modo de batelada, conforme descrito na Tabela 1 (em t=0, 1,8 g de composição enzimática foi adicionada a 31 g de material lignocelulósico pré-tratado presente no recipiente).

O recipiente B foi preenchido com 349 g de ácido citrico 50 mM e coma quantidade total (24,2 g) da composição enzimática e, depois, o material lignocelulósico pré-tratado foi adicionado em um modo de batelada, conforme descrito na Tabela 1 (em t=0, 31 g de material lignocelulósico pré- tratado foram adicionados à composição enzimática total presente no recipiente).

A viscosidade da mistura de hidrólise foi acompanhada durante a hidrólise e foi determinada com um reômetro Brookfield DV III em 1 rpm e a uma temperatura de 62 °C.

As porções finais foram adicionadas em 8,4 horas após o inicio da hidrólise enzimática. Nesse ponto no tempo, o recipiente A e o recipiente B continham um total de 430 g de material lignocelulósico pré-tratado e 24,2 g de composição enzimática, o que corresponde a 0,056 g de composição enzimática por g de material lignocelulósico pré-tratado. O teor de matéria seca após 8,4 horas foi de 20 % (p/p).

Os resultados das medições de viscosidade são mostrados na Tabela 2. Os resultados mostram que, no recipiente B, em que o material lignocelulósico é adicionado ao recipiente que já compreende composição enzimática, a viscosidade é menor do que quando a composição enzimática é adicionada ao material lignocelulósico presente no recipiente. Em outras palavras, quando todas as enzimas já estão presentes no recipiente de hidrólise no inicio da fase de alimentação de biomassa da hidrólise enzimática, a viscosidade é menor do que quando as enzimas são adicionadas à biomassa. A viscosidade menor reduz as necessidades de entrada de potência para a mistura, que são especialmente significativas em grande escala, e facilita a amostragem reproduzível devido à homogeneidade aumentada do material lignocelulósico liquefeito durante a fase de alimentação. Ter a composição enzimática presente no recipiente no inicio da hidrólise enzimática, como no recipiente B, também simplifica o processamento, visto que apenas um fluxo tem que ser adicionado ao recipiente (no recipiente B, apenas o material lignocelulósico tem que ser adicionado, ao passo que, no recipiente A, o material lignocelulósico e a composição enzimática precisam ser adicionados). Essa simplificação reduz os riscos nas falhas de processo.

Exemplo 2

O efeito na liquefação da adição por batelada alimentada e da adição por batelada do material lignocelulósico ao recipiente de hidrólise que compreende a composição enzimática

Para demonstrar que a adição por batelada alimentada de material lignocelulósico (denominada biomassa na Tabela 3) a um recipiente contendo a composição enzimática tem vantagens em relação à adição por batelada de material lignocelulósico a um recipiente contendo composição enzimática, o experimento a seguir foi realizado.

Oito recipientes semelhantes contendo as quantidades do ácido citrico (50 mM, pH 4,5) e da composição enzimática, conforme é fornecido na Tabela 3, foram aquecidos a 62 °C. O material lignocelulósico pré-tratado (37 % (p/p) de matéria seca de palha de cana) foi adicionado por batelada a recipientes 1 a 7 nas quantidades fornecidas na Tabela 3, de modo que diferentes teores de matéria seca foram obtidos no inicio de a hidrólise enzimática.

A viscosidade foi medida com o uso de um reômetro Brookfield DV III a uma temperatura de 62 °C após o material lignocelulósico e a composição enzimática serem misturados. A viscosidade medida é representativa para a viscosidade no inicio da hidrólise enzimática de material lignocelulósico em diferentes teores de matéria seca.

O material lignocelulósico foi adicionado em um modo de batelada ao recipiente 8. A quantidade do tampão de ácido citrico (2169 g) e da composição enzimática (101 g) indicada na Tabela 3 estava presente no inicio da hidrólise enzimática. Em seguida, o material lignocelulósico foi adicionado em porções (batelada alimentada) alcançando os niveis de biomassa fornecidos na Tabela 3. O tempo entre cada adição foi de 1 hora. Por conseguinte, primeiramente, 176 g de biomassa foram adicionados ao recipiente para fornecer uma quantidade total de biomassa de 176 g, após uma hora, 594 g de biomassa foram adicionados ao recipiente para obter uma quantidade total de biomassa de 770 g, após mais uma hora, 392 g biomassa foram adicionados ao recipiente para obter uma quantidade total de biomassa de 1162 g, etc. No final da adição por batelada alimentada de material lignocelulósico, 20 % (p/p) de matéria seca com uma dosagem enzimática de 0,1 g de enzima por g de biomassa DM foram obtidos. A viscosidade foi medida com o uso de um reômetro Brookfield DV III a uma temperatura de 62 °C após o material lignocelulósico e a composição enzimática serem misturados.

A Tabela 3 demonstra claramente que a adição por batelada alimentada de material lignocelulósico a um recipiente que compreende composição enzimática leva a uma viscosidade menor do que quando o material lignocelulósico é adicionado por batelada a um recipiente que compreende a composição enzimática. Esse é o caso para teores de matéria seca acima e abaixo de 10 % (p/p)• Tabela 1: Adição de material lignocelulósico e composição enzimática durante a liquefação nos recipientes A e B. Tabela 2: Medição de viscosidade. Tabela 3: Teor dos recipientes 1 a 8, em que a hidrólise enzimática foi realizada em diferentes niveis de matéria seca.

Claims (13)

1. Processo para a preparação de um produto de açúcar a partir de material lignocelulósico caracterizado por compreender as seguintes etapas: a) opcionalmente, pré-tratamento do material lignocelulósico; b) opcionalmente, lavagem do material lignocelulósico opcionalmente pré-tratado; c) adição por batelada alimentada do material lignocelulósico opcionalmente lavado e/ou opcionalmente pré-tratado a um primeiro recipiente que compreende uma composição enzimática que compreende pelo menos duas celulases, em que no início da alimentação, o referido primeiro recipiente já compreende a referida composição enzimática e o material lignocelulósico é adicionado a ele; em que a composição enzimática é derivada de um fungo, opcionalmente um micro-organismo do gênero Rasamsonia, ou a composição enzimática compreende uma enzima fúngica, opcionalmente uma enzima Rasamsonia; d) hidrólise enzimática do material lignocelulósico opcionalmente lavado e/ou opcionalmente pré-tratado no primeiro recipiente com o uso da composição enzimática que compreende pelo menos duas celulases para liquefazer o material lignocelulósico; em que a viscosidade do material lignocelulósico no primeiro recipiente durante (d) é controlada por ajustar a taxa de adição do material lignocelulósico opcionalmente lavado e/ou opcionalmente pré-tratado, e a viscosidade do material lignocelulósico no primeiro recipiente durante a etapa (d) é mantida abaixo de 1000 cP; e) adição do material lignocelulósico liquefeito a um segundo recipiente; f) hidrólise enzimática do material lignocelulósico liquefeito no segundo recipiente com o uso de uma composição enzimática que compreende pelo menos duas celulases para obter um produto de açúcar; e g) opcionalmente, recuperação do produto de açúcar em que o oxigênio é adicionado ao primeiro e/ou ao segundo recipiente.

2. Processo para a preparação de um produto de fermentação a partir de material lignocelulósico caracterizado por compreender as seguintes etapas: a) opcionalmente, pré-tratamento do material lignocelulósico; b) opcionalmente, lavagem do material lignocelulósico opcionalmente pré-tratado; c) adição por batelada alimentada do material lignocelulósico opcionalmente lavado e/ou opcionalmente pré-tratado a um primeiro recipiente que compreende uma composição enzimática que compreende pelo menos duas celulases, em que no início da alimentação, o referido primeiro recipiente já compreende a referida composição enzimática e o material lignocelulósico é adicionado a ele; em que a composição enzimática é derivada de um fungo, opcionalmente um micro-organismo do gênero Rasamsonia, ou a composição enzimática compreende uma enzima fúngica, opcionalmente uma enzima Rasamsonia; d) hidrólise enzimática do material lignocelulósico opcionalmente lavado e/ou opcionalmente pré-tratado no primeiro recipiente com o uso da composição enzimática que compreende pelo menos duas celulases para liquefazer o material lignocelulósico; em que a viscosidade do material lignocelulósico no primeiro recipiente durante (d) é controlada por ajustar a taxa de adição do material lignocelulósico opcionalmente lavado e/ou opcionalmente pré-tratado, e a viscosidade do material lignocelulósico no primeiro recipiente durante a etapa (d) é mantida abaixo de 1000 cP; e) adição do material lignocelulósico liquefeito a um segundo recipiente; f) hidrólise enzimática do material lignocelulósico liquefeito no segundo recipiente com o uso de uma composição enzimática que compreende pelo menos duas celulases para obter um material lignocelulósico hidrolisado; g) opcionalmente, recuperação do material lignocelulósico hidrolisado; h) fermentação do material lignocelulósico hidrolisado para produzir um produto de fermentação; e i) opcionalmente, recuperação do produto de fermentação em que o oxigênio é adicionado ao primeiro e/ou ao segundo recipiente.

3. Processo, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que enzimas adicionais são adicionadas durante a etapa (d) e/ou a etapa (f).

4. Processo, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que uma composição aquosa, opcionalmente, uma composição enzimática aquosa que compreende pelo menos duas celulases, é adicionada ao primeiro recipiente.

5. Processo, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que o oxigênio é adicionado ao espaço livre do recipiente.

6. Processo, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que o primeiro recipiente e/ou o segundo recipiente tem um volume de pelo menos 1 m3.

7. Processo, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que o tempo de hidrólise enzimática na etapa (d) é de 3 a 24 horas.

8. Processo, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que o tempo de hidrólise enzimática na etapa (f) é de 3 a 120 horas.

9. Processo, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que a hidrólise enzimática na etapa (d) e/ou na etapa (f) é conduzida a uma temperatura de 45 °C ou mais, opcionalmente 50 °C ou mais e, opcionalmente a uma temperatura de 55 °C ou mais.

10. Processo, de acordo com a reivindicação 2, caracterizado pelo fato de que a fermentação na etapa (h) é realizada no segundo recipiente.

11. Processo, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que o teor de matéria seca ao final da hidrólise da etapa (f) é de 5 % em peso ou maior.

12. Processo, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que a composição enzimática é um caldo de fermentação integral.

13. Processo, de acordo com a reivindicação 2, caracterizado pelo fato de que a fermentação na etapa (h) é conduzida com um micro-organismo que é capaz de fermentar pelo menos um açúcar C5.