BRPI0914835B1

BRPI0914835B1 - Célula hospedeira microbiana transgênica, métodos para produzir um polipeptídeo e para produzir uma proteína, construções de ácido nucléico, e, vetor de expressão.

Info

Publication number: BRPI0914835B1
Application number: BRPI0914835-3A
Authority: BR
Inventors: Michelle Maranta; Kimberly Brown
Original assignee: Novozymes A/S
Priority date: 2008-07-29
Filing date: 2009-07-29
Publication date: 2019-04-24
Also published as: DK2310497T3; CA2732122A1; US20100031399A1; EP2310497A1; BRPI0914835A2; WO2010014706A1; EP2310497B1; US8735128B2; CN102112603A

Abstract

célula hospedeira microbiana transgênica, métodos para produzir um polipeptídeo e para produzir uma proteína, construções de ácido nucleico, e, vetor de expressão. a presente invenção diz respeito a polipeptídeos isolados tendo atividade de alfa-glucuronidase e polinucleotídeos isolados que codificam os polipeptídeos. a invenção também diz respeito a construções de ácido nucleico, vetores e células hospedeiras que compreendem os polinucleotídeos bem como métodos de produzir e usar os polipeptídeos.

Description

“CÉLULA HOSPEDEIRA MICROBIANA TRANSGÊNICA, MÉTODOS PARA PRODUZIR UM POLIPEPTÍDEO E PARA PRODUZIR UMA PROTEÍNA, CONSTRUÇÕES DE ÁCIDO NUCLEICO, E, VETOR DE EXPRESSÃO.”

Referência a uma Listagem de Sequência

Este pedido contém uma Listagem de Sequência na forma legível em computador. A forma legível em computador é incorporada neste por referência.

Referência a um Depósito de Material Biológico 10 Este pedido contém uma referência a um depósito de material biológico, cujo depósito é incorporado neste por referência.

Fundamentos da Invenção

Campo da invenção

A presente invenção diz respeito a polipeptídeos isolados 15 tendo atividade de alfa-glucuronidase e polinucleotídeos isolados que codificam os polipeptídeos. A invenção também diz respeito a construções de ácido nucléico, vetores e células hospedeiras que compreendem os polinucleotídeos bem como métodos de produzir e usar os polipeptídeos.

Descrição da técnica relacionada

Os polissacarídeos da parede celular vegetal constituem 90 % da parede celular vegetal e pode ser dividida em três grupos: celulose,

Segue-se a página 2

Petição 870180057078, de 02/07/2018, pág. 19/24 hemicelulose e pectina. Celulose representa o constituinte principal dos polissacarídeos da parede celular. Hemiceluloses são o segundo constituinte mais abundante das paredes de célula vegetal. O polímero de hemicelulose principal é xilano. As estruturas de xilano encontradas nas paredes celulares das plantas podem diferir significantemente dependente de sua origem, mas estas sempre contêm uma cadeia principal de D-xilose ligada por beta-1,4. A cadeia principal de D-xilose ligada por beta-1,4 pode ser substituída por vários grupos secundários, tais como Resíduos de L-arabinosila, Dgalactosila, acetila, feruloila, p-coumaroila e glucuronila.

A biodegradação de material contendo xilano depende de duas classes de enzimas: endoxilanases e beta-xilosidases que degradam a cadeia principal de xilano. Endoxilanases (EC 3.2.1.8) clivam a cadeia principal de xilano em oligossacarídeos menores, que ainda pode ser degradado a xilose por beta-xilosidases (EC 3.2.1.37). Biodegradação de material contendo xilano também requer atividade de enzima auxiliar que remove os substituintes que não xilose, por exemplo, substituintes de ácido glucurônico, da cadeia principal de xilano. Tais atividades de enzima auxiliares inclui, por exemplo, acetilxilano esterase, arabinase, alfa-glucuronidase, ácido ferúlico esterase, e ácido p-coumárico esterase.

As alfa-glucuronidases são produzidas naturalmente por diversos microorganismos incluindo Trichoderma reesei RutC30 (Siika-aho et al., 1994, Enzyme Microb. Technol. 16: 813-819), Trichoderma viride (Ishihara et al., 1990, Bull. For. & For. Prod. Res. Inst. 359: 141-157), Aspergillus niger (Uchida et al., 1992, Bioscí. Biotech. Biochem. 56: 16081615), Thermoascus aurantiacus (Khandke et al., 1989, Arch. Biochem. Biophys. 274: 511-517) e cepa Thermoanaerobacterium sp. JW/SL-YS485 (Shao et al., 1995, Appl. Environ. Microbiol. 61: 1077-1081). O WO 1997/043423 divulga alfa-glucuronidases de Aspergillus.

Diversos relatos mostraram um efeito sinergístico entre xilanase, beta-xilosidase e alfa-glucuronidase na quebra de glucuronoarabinoxilanos (Siika-aho et al., 1994, supra}. A alfa-glucuronidase, portanto, tem aplicação na hidrólise total de hemicelulose para a produção de xilose (Uchida et al., 1992,7. Ferment. Bioeng. 74: 153-158).

A presente invenção diz respeito a polipeptídeos tendo atividade de alfa-glucuronidase e polinucleotídeos que codifica o polipeptídeos.

Sumário da Invenção

A presente invenção diz respeito a polipeptídeos isolados tendo atividade de alfa-glucuronidase selecionado do grupo que consiste de:

(a) um polipeptídeo que compreende uma sequência de aminoácido tendo pelo menos 65 % de identidade ao polipeptídeo maduro da SEQID N°: 2;

(b) um polipeptídeo codificado por um polipeptídeo que hibridiza sob condições de estringência pelo menos médias com o polipeptídeo maduro que codifica um sequência da SEQ ID N°: 1 ou seu filamento complementar de comprimento total;

(c) um polipeptídeo codificado por um polipeptídeo que compreende uma sequência de nucleotídeo tendo pelo menos 65 % de identidade ao polipeptídeo maduro que codifica um sequência da SEQ ID N°: 1 e (d) uma variante que compreende uma substituição, anulação e/ou inserção de um ou mais (diversos) aminoácidos do polipeptídeo maduro da SEQ ID N°: 2.

A presente invenção também diz respeito a polinucleotídeos isolados que codificam polipeptídeos tendo atividade de alfa-glucuronidase, selecionado do grupo que consiste de:

(a) um polinucleotídeo que codifica um polipeptídeo que compreende uma sequência de aminoácido tendo pelo menos 65 % de identidade ao polipeptídeo maduro da SEQID N°: 2;

(b) um polinucleotídeo que hibridiza sob condições de estringência pelo menos médias com o polipeptídeo maduro que codifica um sequência da SEQ ID N°: 1 ou seu filamento complementar de comprimento total;

(c) um polinucleotídeo que compreende uma sequência de nucleotídeo tendo pelo menos 65 % de identidade ao polipeptídeo maduro que codifica um sequência da SEQ ID N°: 1 e (d) um polinucleotídeo que codifica uma variante que compreende uma substituição, anulação e/ou inserção de um ou mais (diversos) aminoácidos do polipeptídeo maduro da SEQ ID N°: 2.

A presente invenção também diz respeito a construções de ácido nucléico, vetores de expressão recombinantes e células hospedeiras recombinantes que compreendem os polinucleotídeos e aos métodos de produzir os polipeptídeos tendo atividade de alfa-glucuronidase.

A presente invenção também diz respeito a métodos de inibir a expressão de um polipeptídeo tendo atividade de alfa-glucuronidase em uma célula, que compreende administrar à célula ou expressar na célula uma molécula de RNA (dsRNA) de filamento duplo, em que o dsRNA compreende uma subsequência de um polinucleotídeo da presente invenção. A presente também diz respeito a uma tal molécula de RNA inibidora de filamento duplo, em que, opcionalmente, o dsRNA é um siRNA ou uma molécula de miRNA.

A presente invenção também diz respeito a plantas que compreendem um polinucleotídeo isolado que codifica um polipeptídeo tendo atividade de alfa-glucuronidase.

A presente invenção também diz respeito a métodos de produzir um polipeptídeo tendo atividade de alfa-glucuronidase, que compreende: (a) cultivar uma planta transgênica ou uma célula vegetal que compreende um polinucleotídeo que codifica o polipeptídeo tendo atividade de alfa-glucuronidase sob condições condutivas para a produção do polipeptídeo e (b) recuperação do polipeptídeo.

A presente invenção também diz respeito a métodos de usar os 5 polipeptídeos tendo atividade de alfa-glucuronidase na degradação ou conversão de material contendo xilano ou material celulósico.

A presente invenção também diz respeito a um polinucleotídeo isolado que codifica um peptídeo sinalizador que compreende ou consiste de aminoácidos 1 a 15 da SEQ ID N°: 2; a construções de ácido nucléico, vetores de expressão e células hospedeiras recombinantes que compreendem os polinucleotídeos e a métodos de produzir uma proteína.

Breve Descrição das Figuras

As Figuras IA e 1B mostram a sequência de DNA genômica e a sequência de aminoácido deduzida de um gene de alfa-glucuronidase da

Família 67 DSM 1800 de Humicola insolens (SEQ ID N°: 1 e 2, respectivamente).

A Figura 2 mostra um mapa de restrição de pHinsGH67A. Definições

Atividade de alfa-glucuronidase: O termo “atividade de alfa20 glucuronidase” é definida aqui como uma atividade de um alfa-Dglicosiduronato glucuronoidrolase (EC 3.2.1.139) que catalisa a hidrólise de um alfa-D-glucuronosida a D-glucuronato e um álcool. Para os propósitos da presente invenção, a atividade de alfa-glucuronidase é determinada de acordo com de Vries, 1998, J. Bacteriol. 180: 243-249. Uma unidade de atividade de alfa-glucuronidase iguala a quantidade de enzima capaz de liberar 1 pmol de ácido glucurônico ou 4-O-metilglucurônico por minuto em pH 5, 40° C.

Os polipeptídeos da presente invenção têm pelo menos 20 %, preferivelmente pelo menos 40 %, mais preferivelmente pelo menos 50 %, mais preferivelmente pelo menos 60 %, mais preferivelmente pelo menos 70 %, mais preferivelmente pelo menos 80 %, ainda mais preferivelmente pelo menos 90 %, mais preferivelmente pelo menos 95 % e ainda mais preferivelmente pelo menos 100 % da atividade de alfa-glucuronidase do polipeptídeo maduro da SEQ ID N°: 2.

Glicosídeo hidrolase Familia 67: O termo “glicosídeo hidrolase Familia 67” ou “Família GH67” ou “GH67” é definido aqui como um polipeptídeo que está na Família 67 de glicosídeo hidrolase de acordo com Henrissat, 1991, A classification of glycosyl hydrolases based on amino-acid sequence similarities, Biochem. J. 280: 309-316 e Henrissat and Bairoch, 1996, Updating the sequence-based classification of glycosyl hydrolases, Biochem. J. 316: 695-696.

Atividade de degradação de xilano: Os termos “atividade de degradação de xilano” ou “atividade xilanolítica” são definidos aqui como uma atividade biológica que hidroliza o material contendo xilano. Os dois métodos básicos para medir a atividade xilanolítica incluem: (1) medir a atividade xilanolítica total e (2) medir as atividades xilanolíticas individuais (endoxilanases, beta-xilosidases, arabinofuranosidases, alfa-glucuronidases, acetil xilano esterases, ácido ferúlico esterases e alfa-glucuronil esterases). Progresso recente em ensaios de enzimas xilanolíticas foi resumido em diversas publicações, incluindo Biely and Puchard, Recent progress in the assays de xilanolytic enzymes, 2006, Journal of the Science of Food and Agriculture 86(11): 1636-1647; Spanikova and Biely, 2006, Glucuronoyl esterase - Novel carboidrato esterase produced by Schizophyllum commune, FEBS Letters 580(19): 4597-4601; Herrmann, Vrsanska, Jurickova, Hirsch, Biely e Kubicek, 1997, The beta-D-xilosidase of Trichoderma reesei is a multifunctional beta-D-xilano xiloidrolase, Biochemical Journal 321: 375381.

A atividade de degradação de xilano total pode ser medida pela determinação dos açúcares de redução formados em vários tipos de xilano, incluindo espelta de aveia, xilanos de madeira de faia e de madeira de lariço ou pela determinação fotométrica de fragmentos de xilano morto liberados de vários xilanos covalentemente mortos. O ensaio de atividade xilanolítica total mais comum é fundamentado na produção de açúcares de redução de 4-O-metil glucuronoxilano polimérico como descrito em Bailey, Biely, Poutanen, 1992, Interlaboratory testing of methods for assay of xylanase activity, Journal of Biotechnology 23(3): 257-270.

Para os propósitos da presente invenção, a atividade de degradação de xilano é determinada pela medição do aumento na hidrólise de xilano de madeira de bétula (Sigma Chemical Co., Inc., St. Louis, MO, USA) pelas enzimas de degradação de xilano sob as seguintes condições típicas: reações de 1 ml, 5 mg/ml de substrato (sólidos totais), 5 mg de proteína xilanotípica/g de substrato, 50 mM de acetato de sódio pH 5, 50° C, 24 horas, análise de açúcar usando-se ensaio e hidrazida de ácido p-hidroxibenzóico (PHBAH) como descrito por Lever, 1972, A new reaction for colorimetric determination of carboidrates, Anal. Biochem AT. 273-279.

Atividade de xilanase: O termo “atividade de xilanase” é definido aqui como a atividade de 1,4-beta-D-xilan-xiloidrolase (E.C. 3.2.1.8) que catalisa a endo-hidrólise de ligações de 1,4-beta-D-xilosídico em xilanos. Para os propósitos da presente invenção, a atividade de xilanase é determinada usando-se xilano de madeira de bétula como substrato. Uma unidade de atividade de xilanase é definida como 1,0 pmol de açúcar de redução (medido em equivalentes de glicose como descrito por Lever, 1972, A new reaction for colorimetric determination of carboidrates, Anal. Biochem AT. 273-279) produzido por minuto durante o período inicial de hidrólise a 50° C, pH 5 de 2 g de xilano de madeira de bétula por litro como substrato em 50 mM de acetato de sódio, 0,01 % de TWEEN® 20.

Atividade de Beta-xilosidase: O termo “atividade de Betaxilosidase” é definido aqui como um beta-D-xilosídeo xiloidrolase (E.C.

3.2.1.37) que catalisa a exo-hidrólise de beta (1—>4)-xilooligossacarídeos curtos, para remover resíduos de D-xilose sucessivos dos terminais não redutores. Para os propósitos da presente invenção, uma unidade de atividade de Beta-xilosidase é definida como 1,0 pmol de p-nitrofenol produzido por minuto em 40° C, pH 5 de 1 mM de p-nitrofenil-beta-D-xilosídeo como substrato em 100 mM de citrato de sódio, 0,01 % de TWEEN® 20.

Atividade celulolítica: O termo “atividade celulolítica” é definido aqui como a atividade biológica que hidrolisa um material celulósico. Os dois métodos básicos para medir atividade celulolítica inclui: (1) medir a atividade celulolítica total e (2) medir as atividades celulolíticas individuais (endoglucanases, celobioidrolases, e beta-glicosidases) como revisto em Zhang et al., Outlook for celulase improvement: Screening and selection strategies, 2006, Biotechnology Advances 24: 452-481. A atividade celulolítica total é usualmente medida usando-se substratos insolúveis, incluindo filtro de papel N° 1 Whatman, celulose microcristalina, celulose bacteriana, celulose de algas, algodão, lignocelulose pré-tratada, etc. O ensaio de atividade celulolítica total mais comum é o ensaio de filtro de papel usando-se Papel de filtro Whatman Ks 1 como o substrato. O ensaio foi estabelecido pela International Union of Pure and Applied Chemistry (IUPAC) (Ghose, 1987, Measurement of celulase activities, Pure Appl. Chem. 59: 257-68).

Para os propósitos da presente invenção, a atividade celulolítica é determinada pela medição do aumento na hidrólise de um material celulósico por enzimas celulolíticas sob as seguintes condições: 1 a 20 mg de proteína celulolítica/g de celulose em PCS por 3 a 7 dias de 50 a 65 °C em comparação com uma hidrólise de controle sem a adição de proteína celulolítica. As condições típicas são: reações de 1 ml, PCS lavado ou não lavado, 5 % de sólidos insolúveis, 50 mM de acetato de sódio pH 5, 1 mM de MnSCL, 50 a 65° C, 72 horas, análise de açúcar por Coluna AMINEX® HPX9

87Η (Bio-Rad Laboratories, Inc., Hercules, CA, USA).

Endoglucanase: O termo “endoglucanase” é definido aqui como um endo-1,4-(1,3;l,4)-beta-D-glucan 4-glucanoidrolase (E.C. 3.2.1.4), que catalisa a endoidrólise de ligações 1,4-beta-D-glicosídicas em celulose, derivados de celulose (tal como carboximetil celulose e hidroximetil celulose), liquenina, ligações beta-1,4 em beta-1,3 glucanos mistos tal como beta-D-glucanos ou xiloglucanos cerais e outros materiais vegetais contendo componentes celulósicos. A atividade de endoglucanase pode ser determinada com base em uma redução na viscosidade do substrato ou aumento nas extremidades de redução determinado por um ensaio de açúcar de redução (Zhang et al., 2006, Biotechnology Advances 24: 452-481). Para os propósitos da presente invenção, a atividade de endoglucanase é determinada usando-se hidrólise de carboximetil celulose (CMC) de acordo com o procedimento de Ghose, 1987, Pure and Appl. Chem. 59: 257-268.

Celobioidrolase: O termo “celobioidrolase” é definido aqui como uma 1,4-beta-D-glucan celobioidrolase (E.C. 3.2.1.91), que catalisa a hidrólise de ligações 1,4-beta-D-glicosídicas em celulose, celooligossacarídeos ou qualquer polímero contendo glicose ligada por beta1,4, que libera celobiose das extremidades redutoras ou não redutoras da cadeia (Teeri, 1997, Crystalline cellulose degradation: New insight into the function of cellobioidrolases, Trends in Biotechnology 15: 160-167; Teeri et al., 1998, Trichoderma reesei cellobioidrolases: why so efficient on crystalline celulose?, Biochem. Soc. Trans. 26: 173-178). Para os propósitos da presente invenção, a atividade de celobioidrolase é determinada em um derivado de dissacarídeo fluorescente 4-metilumbeliferil-P-D-lactosídeo de acordo com os procedimentos descritos por van Tilbeurgh et al., 1982, FEBS Letters 149: 152-156 e van Tilbeurgh and Claeyssens, 1985, FEBS Letters 187: 283-288.

Beta-glicosidase: O termo “beta-glicosidase” é definido aqui como a beta-D-glicosídeo glucoidrolase (E.C. 3.2.1.21), que catalisa a hidrólise de terminal resíduos de beta-D-glicose não redutores com a liberação de beta-D-glicose. Para os propósitos da presente invenção, a atividade de beta-glicosidase é determinada de acordo com o procedimento básico descrito por Venturi et al., 2002, Extracellular beta-D-glicosidase from Chaetomium thermophilum var. coprophilum: production, purification and some biochemical properties, J. Basic Microbiol. 42: 55-66, exceto que condições diferentes foram utilizadas como descrito neste. Uma unidade de atividade de beta-glicosidase é definida como 1,0 pmol de p-nitrofenol produzido por minuto em 40° C, pH 5 de 1 mM de p-nitrofenil-beta-Dglucopiranosida como substrato em 100 mM de citrato de sódio, 0,01 % de TWEEN® 20.

Atividade intensificadora celulolítica: O termo “atividade intensificadora celulolítica” é definido aqui como a atividade biológica que intensifica a hidrólise de um material celulósico por polipeptídeos tendo atividade celulolítica. Para os propósitos da presente invenção, atividade intensificadora celulolítica é determinada pela medição do aumento em açúcares de redução ou no aumento do total de celobiose e glicose da hidrólise de um material celulósico pela proteína celulolítica sob as seguintes condições: 1 a 50 mg de proteína total/g de celulose em PCS, em que a proteína total é compreendida de 50 a 99,5 % p/p de proteína celulolítica e 0,5 a 50 % p/p de proteína de atividade intensificadora celulolítica por 1 a 7 dias de 50 a 65° C em comparação com uma hidrólise de controle com carregamento de proteína total igual sem atividade intensificadora celulolítica (1 a 50 mg de proteína celulolítica/g de celulose em PCS). Em um aspecto preferido, uma mistura de CELLUCLAST® 1.5L (Novozymes A/S, Bagsvserd, Denmark) na presença de 3 % de peso total de proteína de Aspergillus oryzae beta-glicosidase (recombinantemente produzido em Aspergillus oryzae de acordo com WO 02/095014) ou 3 % de peso total de proteína de Aspergillus fumigatus beta-glicosidase (recombinantemente produzido em Aspergillus oryzae como descrito em WO 2002/095014) de carregamento de proteína de celulase é usado como a fonte da atividade celulolítica.

Os polipeptídeos tendo atividade intensificadora celulolítica têm pelo menos 20 %, preferivelmente pelo menos 40 %, mais preferivelmente pelo menos 50 %, mais preferivelmente pelo menos 60 %, mais preferivelmente pelo menos 70 %, mais preferivelmente pelo menos 80 %, ainda mais preferivelmente pelo menos 90 %, mais preferivelmente pelo menos 95 % e ainda mais preferivelmente pelo menos 100 % da atividade intensificadora celulolítica do polipeptídeo maduro de um polipeptídeo GH61.

Os polipeptídeos tendo atividade intensificadora celulolítica intensificam a hidrólise de um material celulósico catalisado por proteínas tendo atividade celulolítica pela redução da quantidade de enzima celulolítica requerida para atingir o mesmo grau de hidrólise, preferivelmente, pelo menos 1,01 vez, mais preferivelmente pelo menos 1,05 vez, mais preferivelmente pelo menos 1,10 vez, mais preferivelmente pelo menos 1,25 vez, mais preferivelmente pelo menos 1,5 vez, mais preferivelmente pelo menos 2 vezes, mais preferivelmente pelo menos 3 vezes, mais preferivelmente pelo menos 4 vezes, mais preferivelmente pelo menos 5 vezes, ainda mais preferivelmente pelo menos 10 vezes e mais preferivelmente pelo menos 20 vezes.

Material contendo xilano: O termo “material contendo xilano” é definido aqui como qualquer material que compreende um polissacarídeo de parede celular vegetal contendo uma cadeia principal de resíduos de xilose beta-(l-4)-ligados. Os xilanos de plantas terrestres são heteropolímeros que possuem uma cadeia principal de um beta-(l-4)-D-xilopiranose, que é ramificada por cadeias de carboidrato curtas. Estes compreendem ácido D12 glucurônico ou seu éter 4-O-metílico, L-arabinose e/ou vários oligossacarídeos, compostos de D-xilose, L-arabinose, D- ou L-galactose e Dglicose. Os polissacarídios tipo xilanos podem ser divididos em homoxilanos e heteroxilanos, que incluem glucuronoxilanos, (arabino)glucuronoxilanos, (glucurono)arabinoxilanos, arabinoxilanos e heteroxilanos complexos. Ver, por exemplo, Ebringerova et al., 2005, Adv. Polym. Sei. 186: 1-67.

Nos métodos da presente invenção, qualquer material contendo xilano pode ser usado. Em um aspecto preferido, o material contendo xilano é lignocelulose.

Material celulósico: O material celulósico pode ser qualquer material contendo celulose. O polissacarídeo predominante na parede celular primária de biomassa é celulose, o segundo mais abundante é hemicelulose e o terceiro é pectina. A parede celular secundária, produzido após a célula ter parado de desenvolver, também contém polissacarídeos e é fortalecido por lignina polimérica covalentemente ligada a hemicelulose. Celulose é um homopolímero de anidrocelobiose e, desta maneira, um beta-(l-4)-D-glicano linear, enquanto as hemiceluloses incluem uma variedade de compostos, tais como xilanos, xiloglicanos, arabinoxilanos e mananos em estruturas ramificadas complexas com um espectro de substituintes. Embora, em geral, polimorfos, celulose é encontrada no tecido vegetal primariamente como uma matriz cristalina insolúvel de cadeias de glicano paralelas. Hemiceluloses, usualmente, ligação de hidrogênio a celulose, bem como a outras hemiceluloses, que ajuda a estabilizar a matriz da parede celular.

Celulose é, em geral, encontrada, por exemplo, nos troncos, folhas, cascas ou espigas de plantas ou folhas, galhos e madeira de árvores. O material celulósico pode ser, mas não limitado a, material herbáceo, resíduo agrícola, resíduo florestal, resíduo sólido municipal, papel residual e polpa e resíduo de moinho de papel (ver, por exemplo, Wiselogel et al., 1995, in Handbook on Bioethanol (Charles E. Wyman, editor), pp. 105-118, Taylor &

Francis, Washington D.C.; Wyman, 1994, Bioresource Technology 50: 3-16; Lynd, 1990, Applied Biochemistry and Biotechnology 24/25: 695-719; Mosier et al., 1999, Recent Progress in Bioconversion of Lignocellulosics, in Advances in Biochemical Engineering/Biotechnology, T. Scheper, managing editor, Volume 65, pp.23-40, Springer-Verlag, New York). Aqui, é entendido que a celulose pode estar na forma de lignocelulose, um material de parede celular vegetal contendo lignina, celulose e hemicelulose em uma matriz mista. Em um aspecto preferido, o material celulósico é lignocelulose.

Em um aspecto, o material celulósico é material herbáceo. Em um outro aspecto, o material celulósico é resíduo agrícola. Em um outro aspecto, o material celulósico é resíduo florestal. Em um outro aspecto, o material celulósico é resíduo sólido municipal. Em um outro aspecto, o material celulósico é papel residual. Em um outro aspecto, o material celulósico é polpa e resíduo de moinho de papel.

Em um outro aspecto, o material celulósico é forragem de milho. Em um outro aspecto, o material celulósico é fibra de milho. Em um outro aspecto, o material celulósico é espiga de milho. Em um outro aspecto, o material celulósico é casca de laranja. Em um outro aspecto, o material celulósico é palha de arroz. Em um outro aspecto, o material celulósico é palha de trigo. Em um outro aspecto, o material celulósico é switch grass. Em um outro aspecto, o material celulósico é miscanthus. Em um outro aspecto, o material celulósico é bagaço.

Em um outro aspecto, o material celulósico é celulose microcristalina. Em um outro aspecto, o material celulósico é celulose bacteriana. Em um outro aspecto, o material celulósico é celulose de algas. Em um outro aspecto, o material celulósico é fiapo de algodão. Em um outro aspecto, o material celulósico é celulose tratada com ácido fosfórico amorfo. Em um outro aspecto, o material celulósico é papel de filtro.

O material celulósico pode ser usado como é ou pode ser submetido a um pré-tratamento, usando-se métodos convencionais conhecidos na técnica, como descrito neste. Em um aspecto preferido, o material celulósico é pré-tratado.

Forragem de milho pré-tratada: O termo “PCS” ou “Forragem de milho pré-tratada” é definido aqui como um material celulósico derivado de forragem de milho pelo tratamento com calor e ácido sulfurico diluído.

Polipeptídeo isolado; O termo “polipeptídeo isolado” como usado neste refere-se a um polipeptídeo que é isolado de uma fonte. Em um aspecto preferido, o polipeptídeo é pelo menos 1 % puro, preferivelmente pelo menos 5 % puro, mais preferivelmente pelo menos 10 % puro, mais preferivelmente pelo menos 20 % puro, mais preferivelmente pelo menos 40 % puro, mais preferivelmente pelo menos 60 % puro, ainda mais preferivelmente pelo menos 80 % puro e mais preferivelmente pelo menos 90 % puro, como determinado por SDS-PAGE.

Polipeptídeo substancialmente puro: O termo “polipeptídeo substancialmente puro” indica aqui uma preparação de polipeptídeo que contenha, na maioria, 10 %, preferivelmente na maioria 8 %, mais preferivelmente na maioria 6 %, mais preferivelmente na maioria 5 %, mais preferivelmente na maioria 4 %, mais preferivelmente na maioria 3 %, ainda mais preferivelmente na maioria 2 %, mais preferivelmente na maioria 1 % e ainda mais preferivelmente na maioria 0,5 % em peso de outro material de polipeptídeo com o qual este é natural ou recombinantemente associado. Portanto, é preferido que o polipeptídeo substancialmente puro seja pelo menos 92 % puro, preferivelmente pelo menos 94 % puro, mais preferivelmente pelo menos 95 % puro, mais preferivelmente pelo menos 96 % puro, mais preferivelmente pelo menos 97 % puro, mais preferivelmente pelo menos 98 % puro, ainda mais preferivelmente pelo menos 99 % puro, mais preferivelmente pelo menos 99,5 % puro e ainda mais preferivelmente 100 % puro em peso do material de polipeptídeo total presente na preparação.

Os polipeptídeos da presente invenção estão, preferivelmente, em uma forma substancialmente pura, isto é, que a preparação de polipeptídeo seja essencialmente livre de outro material de polipeptídeo com o qual este é natural ou recombinantemente associado. Isto pode ser realizado, por exemplo, pela preparação do polipeptídeo por métodos recombinantes bem conhecidos ou pelos métodos de purificação clássicos.

Polipeptídeo maduro: O termo “polipeptídeo maduro” é definido aqui como um polipeptídeo em sua forma final que segue a tradução e quaisquer modificações pós-tradução, tal como processamento de terminal N, truncamento de terminal C, glicosilação, fosforilação, etc. Em um aspecto, o polipeptídeo maduro são aminoácidos de 16 a 861 da SEQ ID N°: 2 com base no programa SignalP (Nielsen et al., 1997, Protein Engineering 10: 1-6) que prediz os aminoácidos de 1 a 15 da SEQ ID N°: 2 are um peptídeo sinalizador.

Polipeptídeo maduro que codifica um sequência: O termo “polipeptídeo maduro que codifica um sequência” é definido aqui como uma sequência de nucleotídeo que codifica um polipeptídeo maduro tendo atividade de alfa-glucuronidase. Em um aspecto, o polipeptídeo maduro que codifica um sequência são nucleotídeos de 46 a 2583 da SEQ ID N°: 1 com base no programa SignalP (Nielsen et al., 1997, supra) que prediz os nucleotídeos de 1 a 45 da SEQ ID N°: 1 codificam um peptídeo sinalizador.

Identidade: A relação entre as duas sequências de aminoácido ou entre as duas sequências de nucleotídeo é descrita pelo parâmetro “identidade”.

Para os propósitos da presente invenção, o grau de identidade entre as duas sequências de aminoácido é determinada usando-se o algoritmo de Needleman-Wunsch (Needleman and Wunsch, 1970, J. Mol. Biol. 48: 443453) como implementado no programa Needle do pacote EMBOSS (EMBOSS: The European Molecular Biology Open Software Suite, Rice et al., 2000, Trends in Genetics 16: 276-277), preferivelmente versão 3.0.0 ou posterior, os parâmetros opcionais usados são penalidade aberta de fenda de 10, penalidade de extensão de fenda de 0,5 e a matriz de substituição EBLOSUM62 (EMBOSS versão de BLOSUM62). a saída da “identidade mais longa” rotulada por Needle (obtida usando-se a opção -nobrief) é usado como a identidade percentual e é calculado como segue:

(Resíduos idênticos x 100)/(Comprimento do alinhamento Número total de fendas no alinhamento)

Para os propósitos da presente invenção, o grau de identidade entre duas sequências de desoxiribonucleotídeo é determinada usando-se o algoritmo de Needleman-Wunsch (Needleman and Wunsch, 1970, supra) como implementado no programa Needle do pacote EMBOSS (EMBOSS: The European Molecular Biology Open Software Suite, Rice et al., 2000, supra), preferivelmente versão 3.0.0 ou posterior, os parâmetros opcionais usados são penalidade aberta de fenda de 10, penalidade de extensão de fenda de 0,5 e a matriz de substituição EDNAFULL (EMBOSS versão de NCBI NUC4.4). a saída da “identidade mais longa” rotulada por Needle (obtida usando-se a opção -nobrief) é usado como a identidade percentual e é calculado como segue:

(Desoxirribonucleotídeos idênticos x 100)/(Comprimento do alinhamento - Número total de fendas no alinhamento)

Sequência homóloga: O termo “sequência homóloga” é definido aqui como uma proteína predita tendo um valor E (ou registro de expectativa) menor do que 0.001 em uma pesquisa tfasty (Pearson, W.R., 1999, in Bioinformatics Methods and Protocols, S. Misener and S. A. Krawetz, ed., pp. 185-219) com o Humicola insolens alfa-glucuronidase da SEQ ID N°: 2 ou o polipeptídeo maduro deste.

Fragmento de polipeptídeo: O termo “fragmento de polipeptídeo” é definido aqui como um polipeptídeo tendo um ou mais (diversos) aminoácidos anulados do amino e/ou terminal carboxila do polipeptídeo maduro da SEQ ID N°: 2 ou a sequência homóloga deste; em que o fragmento tem atividade de alfa-glucuronidase. Em um aspecto preferido, um fragmento contém pelo menos 730 resíduos de aminoácido, mais preferivelmente pelo menos 770 resíduos de aminoácido e mais preferivelmente pelo menos 810 resíduos de aminoácido do polipeptídeo maduro da SEQ ID N°: 2 ou uma sequência homóloga deste.

Subsequência: O termo “subsequência” é definido aqui como uma sequência de nucleotídeo tendo um ou mais (diversos) nucleotídeos anulados da extremidade 5' e/ou 3' do polipeptídeo maduro que codifica um sequência da SEQ ID N°: 1 ou a sequência homóloga deste; em que a subsequência codifica um fragmento de polipeptídeo tendo atividade de alfaglucuronidase. Em um aspecto preferido, a subsequência contém pelo menos 2190 nucleotídeos, mais preferivelmente pelo menos 2310 nucleotídeos e mais preferivelmente pelo menos 2430 nucleotídeos do polipeptídeo maduro que codifica um sequência da SEQ ID N°: 1 ou uma sequência homóloga deste.

Variante alélica: O termo “variante alélica” indica qualquer um de dois ou mais formas alternativas de um gene que ocupa o mesmo local cromossômico. A variação alélica aumenta naturalmente através da mutação e pode resultar em polimorfismo dentro das populações. As mutações genéticas podem ser silenciosas (nenhuma mudança no polipeptídeo codificado) ou pode codificar polipeptídeos tendo sequências de aminoácido alteradas. Uma variante alélica de um polipeptídeo é um polipeptídeo codificado por uma variante alélica de um gene.

Polinucleotídeo isolado: O termo “polinucleotídeo isolado” como usado neste refere-se a um polinucleotídeo que é isolado de uma fonte.

Em um aspecto preferido, o polinucleotídeo seja pelo menos 1 % puro, preferivelmente pelo menos 5 % puro, mais preferivelmente pelo menos 10 % puro, mais preferivelmente pelo menos 20 % puro, mais preferivelmente pelo menos 40 % puro, mais preferivelmente pelo menos 60 % puro, ainda mais preferivelmente pelo menos 80 % puro e mais preferivelmente pelo menos 90 % puro, como determinado por eletroforese em agarose.

Polinucleotídeo substancialmente puro: O termo “polinucleotídeo substancialmente puro” como usado neste refere-se a uma preparação de polinucleotídeo livre de outros nucleotídeos estranhos ou indesejados e em uma forma adequada para o uso dentro dos sistemas de produção de proteína geneticamente projetados. Desta maneira, um polinucleotídeo substancialmente puro contém na maioria 10 %, preferivelmente na maioria 8 %, mais preferivelmente na maioria 6 %, mais preferivelmente na maioria 5 %, mais preferivelmente na maioria 4 %, mais preferivelmente na maioria 3 %, ainda mais preferivelmente na maioria 2 %, mais preferivelmente na maioria 1 % e ainda mais preferivelmente na maioria 0,5 % em peso de outro material de polinucleotídeo com o qual este é natural ou recombinantemente associado. Um polinucleotídeo substancialmente puro pode, entretanto, incluir regiões não traduzidas 5' e 3' de ocorrência natural, r

tal como promotores e terminadores. E preferido que o polinucleotídeo substancialmente puro seja pelo menos 90 % puro, preferivelmente pelo menos 92 % puro, mais preferivelmente pelo menos 94 % puro, mais preferivelmente pelo menos 95 % puro, mais preferivelmente pelo menos 96 % puro, mais preferivelmente pelo menos 97 % puro, ainda mais preferivelmente pelo menos 98 % puro, mais preferivelmente pelo menos 99 % puro e ainda mais preferivelmente pelo menos 99,5 % puro em peso, os polinucleotídeos da presente invenção estão, preferivelmente, em uma forma substancialmente pura, isto é, que a preparação de polinucleotídeo seja essencialmente livre de outro material de polinucleotídeo com o qual este é natural ou recombinantemente associado, os polinucleotídeos podem ser de origem genômica, cDNA, RNA, semi-sintética, sintética ou quaisquer combinações destes.

Que codifica um sequência: Quando usado neste o termo “que codifica um sequência” significa uma sequência de nucleotídeo, que especifica diretamente a sequência de aminoácido de seu produto de proteína. Cujas fronteiras codificam a sequência são, em geral, determinadas por uma estrutura de leitura aberta, que usualmente começa com o Códon de partida ATG ou códons de partida alternativos tais como GTG e TTG e extremidades com um códon de interrupção tal como TAA, TAG e TGA. A sequência codifícadora pode ser uma sequência de nucleotídeo de DNA, cDNA, sintética ou recombinante.

cDNA: O termo “cDNA” é definido aqui como uma molécula de DNA que pode ser preparada por transcrição reversa de uma molécula de mRNA, unida, madura obtida de uma célula eucariótica. cDNA precisa de sequências de íntron que podem estar presentes no DNA genômico correspondente, a transcrição de RNA primário inicial é um precursor do mRNA que é processado através de uma série de etapas antes de aparecer como mRNA unido maduro, estas etapas incluem a remoção de sequências de íntron por um processo denominado união. cDNA derivado de mRNA precisa, portanto, de quaisquer sequências de íntron.

Construção de ácido nucléico: O termo “construção de ácido nucléico” como usado neste refere-se a uma molécula de ácido nucléico, de filamento simples ou duplo, que é isolado de um gene de ocorrência natural ou que é modificado para conter segmentos de ácidos nucléicos de uma maneira que, de outra maneira, não deveria existir em estado natural ou que é sintético. O termo construção de ácido nucléico é sinônimo do termo “cassete de expressão” quando a construção de ácido nucléico contém as sequências de controle requerido para a expressão de uma sequência codifícadora da presente invenção.

Sequências de controle: O termo “sequências de controle” é definido neste incluir todos os componentes necessários para a expressão de um polinucleotídeo que codifica um polipeptídeo da presente invenção. Cada sequência de controle pode ser natural ou estranha à sequência de nucleotídeo que codifica o polipeptídeo natural ou estranho um ao outro. Tais sequências de controle incluem, mas não limitam-se a uma sequência de poliadenilação livre, sequência de propeptídeo, promotor, sequência de peptídeo sinalizador e terminador de transcrição. Em um mínimo, as sequências de controle incluem um promotor e sinais de interrupção de transcrição e de tradução. As sequências de controle podem ser fornecidas com ligantees para o propósito de introduzir locais de restrição específicos que facilita a ligação das sequências de controle com a região codificadora da sequência de nucleotídeo que codifica um polipeptídeo.

Operacionalmente ligado: O termo “operacionalmente ligado” indica aqui, uma configuração em que uma sequência de controle é colocada em uma posição apropriada com relação à sequência codificadora de uma sequência de polinucleotídeo tal que a sequência de controle direcione a expressão da sequência codificadora de um polipeptídeo.

Expressão: O termo “expressão” inclui qualquer etapa envolvida na produção de um polipeptídeo que inclui, mas não limita-se a, transcrição, modificação pós-transcrição, tradução, modificação pós-tradução e secreção.

Vetor de expressão: O termo “vetor de expressão” é definido aqui como uma molécula de DNA linear ou circular que compreende um polinucleotídeo que codifica um polipeptídeo da presente invenção e é operacionalmente ligado a nucleotídeos adicionais que fornecem sua expressão.

Célula hospedeira: o termo “célula hospedeira”, como usado neste inclui qualquer tipo de célula que é suscetível à transformação, transfecção, transdução e outros com uma construção de ácido nucléico ou vetor de expressão que compreende um polinucleotídeo da presente invenção.

Modificação: O termo “modificação” significa aqui qualquer modificação química do polipeptídeo que compreende ou consiste do polipeptídeo maduro da SEQ ID N°: 2 ou a sequência homóloga deste; bem como manipulação genética do DNA que codifica um tal polipeptídeo. A modificação pode ser uma substituição, uma anulação e/ou uma inserção de um ou mais (diversos) aminoácidos, bem como substituições de uma ou mais (diversas) cadeias secundárias de aminoácido.

Variante artificial: Quando usado neste, o termo “variante artificial” significa um polipeptídeo tendo atividade de alfa-glucuronidase produzida por um organismo que expressa uma sequência de polinucleotídeo modificada do polipeptídeo maduro que codifica um sequência da SEQ ID N°: 1 ou a sequência homóloga deste. A sequência de nucleotídeo modificada é obtida através de uma intervenção humana pela modificação da sequência de polinucleotídeo divulgada na SEQ ID N°: 1 ou a sequência homóloga deste.

Descrição Detalhada da Invenção Polipeptídeos tendo Atividade de alfa-glucuronidase Em um primeiro aspecto, a presente invenção diz respeito a polipeptídeos isolados que compreendem sequências de aminoácido tendo um grau de identidade ao polipeptídeo maduro da SEQ ID N°: 2 de preferivelmente pelo menos 65 %, mais preferivelmente pelo menos 70 %, mais preferivelmente pelo menos 75 %, mais preferivelmente pelo menos 80 %, mais preferivelmente pelo menos 85 %, ainda mais preferivelmente pelo menos 90 %, mais preferivelmente pelo menos 95 % e ainda mais preferivelmente pelo menos 96 %, pelo menos 97 %, pelo menos 98 % ou pelo menos 99 %, que têm atividade de alfa-glucuronidase (a seguir “polipeptídeos homólogos”). Em um aspecto preferido, os polipeptídeos homólogos compreendem sequências de aminoácido que diferem por dez aminoácidos, preferivelmente por cinco aminoácidos, mais preferivelmente por quatro aminoácidos, ainda mais preferivelmente por três aminoácidos, mais preferivelmente por dois aminoácidos e ainda mais preferivelmente por um aminoácido do polipeptídeo maduro da SEQ ID N°: 2.

Um polipeptídeo da presente invenção preferivelmente compreenda sequência de aminoácido da SEQ ID N°: 2 ou uma variante alélica deste ou um fragmento deste tendo atividade de alfa-glucuronidase. Em um aspecto preferido, o polipeptídeo compreenda sequência de aminoácido da SEQ ID N°: 2. Em um outro aspecto preferido, o polipeptídeo compreende o polipeptídeo maduro da SEQ ID N°: 2. Em um outro aspecto preferido, o polipeptídeo compreende aminoácidos de 16 a 861 da SEQ ID N°: 2, ou uma variante alélica deste ou um fragmento deste tendo atividade de alfa-glucuronidase. Em um outro aspecto preferido, o polipeptídeo compreende aminoácidos de 16 a 861 da SEQ ID N°: 2. Em um outro aspecto preferido, o polipeptídeo consiste da sequência de aminoácido da SEQ ID N°: 2 ou uma variante alélica deste ou um fragmento deste tendo atividade de alfa-glucuronidase. Em um outro aspecto preferido, o polipeptídeo consiste da sequência de aminoácido da SEQ ID N°: 2. Em um outro aspecto preferido, o polipeptídeo consiste do polipeptídeo maduro da SEQ ID N°: 2. Em um outro aspecto preferido, o polipeptídeo consiste de aminoácidos de 16 a 861 da SEQ ID N°: 2 ou uma variante alélica deste ou um fragmento deste tendo atividade de alfa-glucuronidase. Em um outro aspecto preferido, o polipeptídeo consiste de aminoácidos de 16 a 861 da SEQ ID N°: 2.

Em um segundo aspecto, a presente invenção diz respeito a polipeptídeos isolados tendo atividade de alfa-glucuronidase que são codificados por polinucleotídeos que, preferivelmente, hibridizam sob condições de estringência muito baixa, mais preferivelmente condições de estringência baixa, mais preferivelmente condições de estringência média, mais preferivelmente condições de estringência média-altas, ainda mais preferivelmente condições de estringência alta e mais preferivelmente condições de estringência muito altas com o polipeptídeo maduro que codifica um sequência da SEQ ID N°: 1 ou seu filamento complementar de comprimento total (J. Sambrook, E.F. Fritsch e T. Maniatis, 1989, Molecular Cloning, A Laboratory Manual, 2° edição, Cold Spring Harbor, New York).

A sequência de nucleotídeo da SEQ ID N°: 1 ou uma subsequência deste; bem como a sequência de aminoácido da SEQ ID N°: 2 ou um fragmento deste; pode ser usado para projetar sondas de ácido nucléico para identificar e clonar DNA que codifica polipeptídeos tendo atividade de alfa-glucuronidase de cepas de diferentes gêneros ou espécies de acordo com métodos bem conhecidos na técnica. Em particular, tais sondas podem ser usadas para a hibridização com o genômico ou cDNA do gênero ou espécie de interesse, seguindo os procedimentos Southern blotting padrão, a fim de identificar e isolar o gene correspondente neste. Tais sondas podem ser consideravelmente mais curtas do que a sequência total, mas deve ser de pelo menos 14, preferivelmente pelo menos 25, mais preferivelmente pelo menos 35 e mais preferivelmente pelo menos 70 nucleotídeos de comprimento. Entretanto, é preferido que a sonda de ácido nucléico seja pelo menos 100 nucleotídeos de comprimento. Por exemplo, a sonda de ácido nucléico pode ser de pelo menos 200 nucleotídeos, preferivelmente pelo menos 300 nucleotídeos, mais preferivelmente pelo menos 400 nucleotídeos ou mais preferivelmente pelo menos 500 nucleotídeos de comprimento. Sondas ainda mais longas podem ser usadas, por exemplo, sondas de ácido nucléico que são preferivelmente pelo menos 600 nucleotídeos, mais preferivelmente pelo menos 700 nucleotídeos, ainda mais preferivelmente pelo menos 800 nucleotídeos ou mais preferivelmente pelo menos 900 nucleotídeos de comprimento. Tanto sondas de DNA quanto de RNA podem ser usadas. As sondas são tipicamente rotuladas para detectar o gene correspondente (por exemplo, com P, H, S, biotina ou avidina). Tais sondas são abrangidas pela presente invenção.

Uma biblioteca de DNA ou cDNA genômico preparada a partir de tais outras cepas podem, portanto, ser avaliadas por DNA que hibridiza com as sondas descritas acima e codifica um polipeptídeo tendo atividade de alfa-glucuronidase. Genômico ou outro DNA a partir de tais outras cepas podem ser separados por agarose ou eletroforese em gel de poliacrilamida ou outras técnicas de separação, o DNA das bibliotecas ou o DNA separado pode ser transferido a e imobilizado em nitrocelulose ou outro material carregador adequado. A fim de identificar um clone ou DNA que é homólogo com SEQ ID N°: 1 ou uma subsequência destes, o material carregador é preferivelmente suado em um Southern blot.

Para os propósitos da presente invenção, hidridização indica que a sequência de nucleotídeo hibridiza a uma sonda de ácido nucléico rotulada que corresponde ao polipeptídeo maduro que codifica um sequência da SEQ ID N°: 1 ou seu filamento complementar de comprimento total ou uma subsequência deste; sob condições de estringência muito baixas a muito altas. As moléculas às quais a sonda de ácido nucléico hibridiza sob estas condições podem ser detectadas usando-se, por exemplo, Película de raio X.

Em um aspecto preferido, a sonda de ácido nucléico é o polipeptídeo maduro que codifica um sequência da SEQ ID N°: 1. Em um outro aspecto preferido, a sonda de ácido nucléico é nucleotídeos 46 to 2583 da SEQ ID N°: 1. Em um outro aspecto preferido, a sonda de ácido nucléico é uma sequência de polinucleotídeo que codifica o polipeptídeo da SEQ ID N°: 2 ou uma subsequência destes. Em um outro aspecto preferido, a sonda de ácido nucléico é SEQ ID N°: 1. Em um outro aspecto preferido, a sonda de ácido nucléico é a sequência de polinucleotídeo contida no plasmídeo pHinsGH67A que está contido em E. coli NRRL B-50155, em que a sequência de polinucleotídeo deste codifica um polipeptídeo tendo atividade de alfa-glucuronidase. Em um outro aspecto preferido, a sonda de ácido nucléico é a região codificadora de polipeptídeo maduro contido no plasmídeo pHinsGH67A que está contido em E. coli NRRL B-50155.

Para sondas longas de pelo menos 100 nucleotídeos de comprimento, condições de estringência muito baixas a muito altas são definidas como pré-hibridização e hibridização a 42° C em 5X SSPE, 0,3 % SDS, 200 pg/ml de DNA de esperma de salmão dividido e desnaturado e 25 % de formamida para estringências muito baixas e baixas, 35 % de formamida para estringências médias e média-altas ou 50 % de formamida para estringências altas e muito altas, seguindo os procedimentos Southern blotting padrão por 12 a 24 horas otimamente.

Para sondas longas de pelo menos 100 nucleotídeos de comprimento, o material carregador é finalmente lavado três vezes cada por 15 minutos usando-se 2X SSC, 0,2 % de SDS preferivelmente a 45° C (estringência muito baixa), mais preferivelmente a 50° C (estringência baixa), mais preferivelmente a 55° C (estringência média), mais preferivelmente a 60° C (estringência média-alta), ainda mais preferivelmente a 65° C (estringência alta) e mais preferivelmente a 70° C (estringência muito alta).

Para sondas curtas de cerca de 15 nucleotídeos a cerca de 70 nucleotídeos de comprimento, condições de estringência são definidas como pré-hibridização, hibridização e lavagem pós-hibridização em tomo de 5° C a cerca de 10° C abaixo da Tm calculada usando-se o cálculo de acordo com Bolton and McCarthy (1962, Proceedings of the National Academy of Sciences USA 48:1390) em 0,9 M de NaCI, 0,09 M de Tris-HCl pH 7,6, 6 mM de EDTA, 0,5 % de NP-40, IX Solução de Denhardt, 1 mM de pirofosfato de sódio, 1 mM de fosfato monobásico de sódio, 0,1 mM de ATP e 0,2 mg de RNA de levedura por ml seguindo os procedimentos Southern blotting padrão por 12 a 24 horas otimamente.

Para sondas curtas de cerca de 15 nucleotídeos a cerca de 70 nucleotídeos de comprimento, o material carregador é lavado uma vez em 6X

SCC plus 0,1 % de SDS por 15 minutos e duas vezes cada por 15 minutos usando-se 6X SSC de 5° C a 10° C abaixo da Tm calculada.

Em um terceiro aspecto, a presente invenção diz respeito a polipeptídeos isolados tendo atividade de alfa-glucuronidase codificado por polinucleotídeos que compreende ou consiste de sequências de nucleotídeo que tem um grau de identidade ao polipeptídeo maduro que codifica um sequência da SEQ ID N°: 1 de preferivelmente pelo menos 65 %, mais preferivelmente pelo menos 70 %, mais preferivelmente pelo menos 75 %, mais preferivelmente pelo menos 80 %, mais preferivelmente pelo menos 85 %, ainda mais preferivelmente pelo menos 90 %, mais preferivelmente pelo menos 95 % e ainda mais preferivelmente pelo menos 96 %, pelo menos 97 %, pelo menos 98 % ou pelo menos 99 %, que codifica um polipeptídeo tendo atividade de alfa-glucuronidase. Ver a seção polinucleotídeo neste.

Em um quarto aspecto, a presente invenção diz respeito a variantes artificiais que compreende uma substituição, anulação e/ou inserção de um ou mais (ou diversos) aminoácidos do polipeptídeo maduro da SEQ ID N°: 2, ou uma sequência homóloga deste. Preferivelmente, as mudanças de aminoácido são de uma natureza menor, isto é, substituições ou inserções de aminoácido conservativas que não afetam a dobra e/ou a atividade da proteína significantemente; anulações pequenas, tipicamente de um a cerca de 30 aminoácidos ; extensões de terminal amino ou carboxila, tal como um resíduo de metionina de terminal amino; um peptídeo ligante pequeno de até cerca de 20 a 25 resíduos ou uma extensão pequena que facilita a purificação pela mudança da carga da rede ou uma outra função, tal como um trato de polihistidina, um epítopo antigênico ou um domínio de ligação.

Os exemplos de substituições conservativas estão dentro do grupo de aminoácidos básicos (arginina, lisina e histidina), aminoácidos ácidos (ácido glutâmico e ácido aspártico), aminoácidos polares (glutamina e asparagina), aminoácidos hidrofóbicos (leucina, isoleucina e valina), aminoácidos aromáticos (fenilalanina, triptofano e tirosina) e aminoácidos pequenos (glicina, alanina, serina, treonina e metionina). As substituições de aminoácido que, em geral, não alteram a atividade específica são conhecidos na técnica e são descritos, por exemplo, por H. Neurath and R.L. Hill, 1979, In, The Proteins, Academic Press, New York. As mudanças que ocorrem mais comumente são Ala/Ser, Val/Ile, Asp/Glu, Thr/Ser, Ala/Gly, Ala/Thr, Ser/Asn, Ala/Val, Ser/Gly, Tyr/Phe, Ala/Pro, Lys/Arg, Asp/Asn, Leu/Ile, Leu/Val, Ala/Glu e Asp/Gly.

Além dos 20 aminoácidos padrão, aminoácidos não padrão (tal como 4-hidroxiprolina, 6-A-metil lisina, ácido 2-aminoisobutírico, isovalina e alfa-metil serina) pode ser substituído por resíduos de aminoácido de um polipeptídeo do tipo selvagem. Um número limitado de aminoácidos não conservativos , aminoácidos que não são codificados pelo código genético e aminoácidos não naturais pode ser substituído por resíduos de aminoácido. “Aminoácidos não naturais “ foram modificados após a síntese de proteína e/ou têm uma estrutura química em suas cadeias secundárias diferentes daqueles dos aminoácidos padrão . Aminoácidos não naturais podem ser quimicamente sintetizados e preferivelmente, são comercialmente disponíveis e incluem ácido pipecólico, ácido tiazolidino carboxílico, desidroprolina, 3- e

4-metilprolina e 3,3-dimetilprolina.

Alternativamente, as mudanças de aminoácido são de uma tal natureza que as propriedades físico-químicas do polipeptídeos são alterados. Por exemplo, as mudanças de aminoácido podem melhorar a estabilidade térmica do polipeptídeo, alterar a especificidade, mudar o pH ótimo e outros.

Os aminoácidos essenciais no polipeptídeo precursor podem ser identificados de acordo com os procedimentos conhecidos na técnica, tal como mutagênese direcionada ao local ou mutagênese de varredura de alanina (Cunningham and Wells, 1989, Science 244: 1081-1085). Na última técnica, as mutações de alanina simples são introduzidas em cada resíduo na molécula e as moléculas mutantes resultantes são testadas quanto à atividade biológica (isto é, atividade de alfa-glucuronidase) para identificar resíduos de aminoácido que são críticos para a atividade da molécula. Ver também, Hilton et al., 1996, J. Biol. Chem. 271: 4699-4708. O local ativo da enzima ou outra interação biológica também pode ser determinada pela análise física da estrutura, como determinado por tais técnicas como ressonância magnética nuclear, cristalografia, difração de elétron ou rotulação de fotoafinidade, em conjunção com a mutação de aminoácidos de local de contato putativo . Ver, por exemplo, de Vos et al., 1992, Science 255: 306-312; Smith et al., 1992, J. Mol. Biol. 224: 899-904; Wlodaver et al., 1992, FEBS Lett. 309: 59-64. As identidades de aminoácidos essenciais também podem ser inferidas a partir da análise de identidades com polipeptídeos que são relacionados com um polipeptídeo de acordo com a invenção.

As substituições, anulações e/ou inserções de aminoácido simples ou múltiplas podem ser feitas e testadas usando-se métodos conhecidos de mutagênese, recombinação e/ou embaralhamento, seguido por um procedimento de avaliação relevante, tal como aquele divulgado por Reidhaar-Olson and Sauer, 1988, Science 241: 53-57; Bowie and Sauer, 1989, Proc. Natl. Acad. Sei. USA 86: 2152-2156; WO 95/17413 ou WO 95/22625. Outros métodos que podem ser usados incluem PCR propenso ao erro, apresentação de fago (por exemplo, Lowman et al., 1991, Biochem. 30: 10832-10837; Patente U. S. N° 5,223,409; WO 92/06204) e mutagênese direcionada ao local (Derbyshire et al., 1986, Gene 46: 145; Ner et al., 1988, DNA T. 127).

Os métodos de mutagênese/embaralhamento podem ser combinados com métodos de avaliação automatizados de resposta alta à atividade detectada de polipeptídeos mutagenizados clonados expressado por células hospedeiras (Ness et al., 1999, Nature Biotechnology 17: 893-896). as moléculas de DNA mutagenizadas que codificam polipeptídeos ativos podem ser recuperados das células hospedeiras e rapidamente sequenciados usandose métodos padrão na técnica, estes métodos permitem a determinação rápida da importância de resíduos de aminoácido individuais em um polipeptídeo de interesse e pode ser aplicado a polipeptídeos de estrutura desconhecida.

O número total de substituições, anulações e/ou inserções de aminoácido do polipeptídeo maduro da SEQ ID N°: 2 é 10, preferivelmente 9, mais preferivelmente 8, mais preferivelmente 7, mais preferivelmente na maioria 6, mais preferivelmente 5, mais preferivelmente 4, ainda mais preferivelmente 3, mais preferivelmente 2 e ainda mais preferivelmente 1.

Fontes de Polipeptídeos tendo Atividade de alfa-glucuronidase

Um polipeptídeo tendo atividade de alfa-glucuronidase da presente invenção pode ser obtido a partir de microorganismos de quaisquer gêneros. Para os propósitos da presente invenção, o termo “obtido de” como usado neste em conexão com uma dada fonte deve significar que o polipeptídeo codificado por uma sequência de nucleotídeo é produzido pela fonte ou por uma cepa em que a sequência de nucleotídeo da fonte foi inserido. Em um aspecto preferido, o polipeptídeo obtido de uma dada fonte é secretada extracelularmente.

Um polipeptídeo tendo atividade de alfa-glucuronidase da presente invenção pode ser um polipeptídeo bacteriano. Por exemplo, o polipeptídeo pode ser um polipeptídeo bacteriano de gram positivo tal como um polipeptídeo de Bacillus, Streptococcus, Streptomyces, Staphylococcus, Enterococcus, Lactobacillus, Lactococcus, Clostridium, Geobacillus ou Oceanobacillus tendo atividade de alfa-glucuronidase ou um polipeptídeo bacteriano de Gram negativo tal como um polipeptídeo de E. coli, Pseudomonas, Salmonella, Campylobacter, Helicobacter, Flavobacterium, Fusobacterium, Ilyobacter, Neisseria ou Ureaplasmum tendo atividade de alfa-glucuronidase.

Em um aspecto preferido, o polipeptídeo é um polipeptídeo

Bacillus alkalophilus, Bacillus amiloliquefaciens, Bacillus brevis, Bacillus circulans, Bacillus clausii, Bacillus coagulans, Bacillus firmus, Bacillus lautus, Bacillus Icntus, Bacillus licheniformis, Bacillus mcgaterium, Bacillus pumilus, Bacillus stearothermophilus, Bacillus subtilis ou Bacillus thuringiensis tendo atividade de alfa-glucuronidase.

Em um outro aspecto preferido, o polipeptídeo é um polipeptídeo de Strcptococcus cquisimilis, Strcptococcus pyogcncs, Strcptococcus uberis ou Strcptococcus cqui subsp. Zooepidemicus tendo atividade de alfa-glucuronidase.

Em um outro aspecto preferido, o polipeptídeo é um polipeptídeo de Streptomyccs achromogencs, Streptomyces avcrmitilis, Streptomyccs coclicolor, Streptomyccs griseus ou Streptomyces lividans tendo atividade de alfa-glucuronidase.

Um polipeptídeo tendo atividade de alfa-glucuronidase da presente invenção também pode ser um polipeptídeo fungico e mais preferivelmente um polipeptídeo de levedura tal como um polipeptídeo de Candida, Kluyveromyccs, Pichia, Saccharomyces, Schizosaccharomyccs ou Yarrowium tendo atividade de alfa-glucuronidase ou mais preferivelmente um polipeptídeo fungico filamentoso tal como um polipeptídeo de Acremonium, Agaricus, Alternaria, Aspcrgillus, Aureobasidium, Botryospacria, Ccriporiopsis, Chaetomidium, Chrysosporium, Claviceps, Cochliobolus, Coprinopsis, Coptotermes, Corynascus, Cryphonectria, Cryptococcus, Diplodia, Exidia, Filibasidium, Fusarium, Gibberella, Holomastigotoides, Humicola, Irpex, Lentinula, Leptospaeria, Magnaporthe, Melanocarpus, Meripilus, Mucor, Myceliophthora, Neocallimastix, Neurospora, Paccilomyces, Pcnicillium, Phanerochaete, Piromyces, Poitrasia, Pseudoplectania, Pseudotrichonympha, Rhizomucor, Schizophyllum, Scytalidium, Talaromyces, Thermoascus, Thielavia, Tolypocladium, Trichodcrma, Trichophaea, Verticillium, Volvariella ou Xilarium tendo atividade de alfa-glucuronidase.

Em um aspecto preferido, o polipeptídeo é um polipeptídeo de

Saccharomyces carlsbergensis, Saccharomyces cerevisiae, Saccharomyces diastaticus, Saccharomyces douglasii, Saccharomyces kluyveri,

Saccharomyces norbensis ou Saccharomyces oviformis tendo atividade de alfa-glucuronidase.

Em um outro aspecto preferido, o polipeptídeo é um polipeptídeo Acremonium cellulolyticus, Aspcrgillus aculeatus, Aspergillus awamori, Aspergillus fumigatus, Aspcrgillus foetidus, Aspergillus japonicus,

Aspergillus nidulans, Aspergillus niger, Aspergillus oryzae, Chrysosporium keratinophilum, Chrysosporium lucknowense, Chrysosporium tropicum, Chrysosporium merdarium, Chrysosporium inops, Chrysosporium pannicola, Chrysosporium queenslandicum, Chrysosporium zonatum, Fusarium bactridioides, Fusarium cerealis, Fusarium crookwellense, Fusarium culmorum, Fusarium graminearum, Fusarium graminum, Fusarium heterosporum, Fusarium negundi, Fusarium oxysporum, Fusarium reticulatum, Fusarium roseum, Fusarium sambucinum, Fusarium sarcochroum, Fusarium sporotrichioides, Fusarium sulphureum, Fusarium torulosum, Fusarium trichothecioides, Fusarium venenatum, Irpex lacteus,

Mucor miehei, Myceliophthora thermophila, Neurospora crassa, Penicillium funiculosum, Penicillium purpurogenum, Phanerochaete chrysosporium, Thielavia achromatica, Thielavia albomyces, Thielavia albopilosa, Thielavia australeinsis, Thielavia fimeti, Thielavia microspora, Thielavia ovispora, Thielavia peruviana, Thielavia spededonium, Thielavia setosa, Thielavia subthermophila, Thielavia terrestris, Trichoderma harzianum, Trichoderma koningii, Trichoderma longibrachiatum, Trichoderma reesei ou Trichoderma viride tendo atividade de alfa-glucuronidase.

Em um outro aspecto preferido, o polipeptídeo é um polipeptídeo de Humicola grisea, Humicola insolens ou Humicola lanuginosum tendo atividade de alfa-glucuronidase.

Em um aspecto mais preferido, o polipeptídeo é um polipetídeo Humicola insolens tendo atividade de alfa-glucuronidase. Em um aspecto mais preferido, o polipeptídeo é a Humicola insolens DSM 1800 polypeptide tendo atividade de alfa-glucuronidase, por exemplo, o polipeptídeo que compreende o polipeptídeo maduro da SEQ ID N°: 2.

Será entendido pelas espécies mencionadas acima a invenção abrange tanto os estados perfeitos quanto imperfeitos e outros equivalentes taxonômicos, por exemplo, anamorfos, com respeito ao nome das espécies pelo qual estes são conhecidos. Aqueles habilitados na técnica reconhecerão facilmente a identidade de equivalentes apropriados.

As cepas destas espécies são facilmente acessíveis ao público em diversas coleções de cultura, tal como a American Type Culture Collection (ATCC), Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH (DSM), Centraalbureau Voor Schimmelcultures (CBS) e Agricultural Research Service Patent Culture Collection, Northern Regional Research Center (NRRL).

Além disso, tais polipeptídeos podem ser identificados e obtidos de outras fontes incluindo microorganismos isolados da natureza (por exemplo, solo, compostos, água, etc.) usando-se as sondas mencionadas acima. As técnicas para o isolamento de microorganismos de habitats naturais são bem conhecidas na técnica. O polinucleotídeo pode ser obtida avaliandose similarmente uma biblioteca genômica ou de cDNA de um tal microorganismo. Uma vez que um polinucleotídeo que codifica um polipeptídeo foi detectado com a sonda, o polinucleotídeo pode ser isolado ou clonado pela utilização de técnicas que são bem conhecidas por aqueles de habilidade comum na técnica na técnica (ver, por exemplo, Sambrook et al., 1989, supra).

Os polipeptídeos da invenção também incluem polipeptídeos fundidos ou polipeptídeos de fusão cliváveis em que um outro polipeptídeo é fundido no terminal N ou no terminal C do polipeptídeo ou fragmento deste. Um polipeptídeo fundido é produzido pela fusão de uma sequência de nucleotídeo (ou uma porção destes) que codifica um outro polipeptídeo a uma sequência de nucleotídeo (ou uma porção destes) da presente invenção. As técnicas para a produção de polipeptídeos de fusão são conhecidas na técnica e incluem ligar as sequências codificadoras que codificam os polipeptídeos de modo que estes estejam na estrutura e que a expressão do polipeptídeo fundido esteja sob o controle dos mesmos promotores e terminador.

Um polipeptídeo de fusão ainda pode compreender um local de clivagem. Na secreção da proteína de fusão, o local é clivado pela liberação do polipeptídeo tendo atividade de alfa-glucuronidase da proteína de fusão. Os exemplos de locais de clivagem incluem, mas não limitam-se a um local de Kex2 que codifica o dipeptídeo Lys-Arg (Martin et al., 2003, J. Ind. Microbiol. Biotechnol. 3: 568-576; Svetina et al., 2000, J. Biotechnol. 76: 245-251; Rasmussen-Wilson et al., 1997, Appl. Environ. Microbiol. 63: 34883493; Ward et al., 1995, Biotechnology 13: 498-503 e Contreras et al., 1991, Biotechnology 9: 378-381), um local Ile-(Glu or Asp)-Gly-Arg, que é clivado por um Fator Xa protease após o resíduo de arginina (Eaton et al., 1986, Biochem. 25: 505-512); um local Asp-Asp-Asp-Asp-Lys, que é clivado por uma enterocinase após a lisina (Collins-Racie et al., 1995, Biotechnology 13: 982-987); um local His-Tyr-Glu ou local His-Tyr-Asp, que é clivado por Genenase I (Carter et al., 1989, Proteins: Structure, Function e Genetics 6: 240-248); um local de a Leu-Val-Pro-Arg-Gly-Ser, que é clivado por trombina após o Arg (Stevens, 2003, Drug Discovery World 4: 35-48); um local Glu-Asn-Leu-Tyr-Phe-Gln-Gly, que é clivado por TEV protease após o Gin (Stevens, 2003, supra) e um local de Leu-Glu-Val-Leu-Phe-Gln-Gly-Pro, que é clivado por uma forma geneticamente projetada protease de rinovírus 3C humano após o Gin (Stevens, 2003, supra).

Polinucleotídeos

A presente invenção também diz respeito a polinucleotídeos isolados que compreendem ou consistem de sequências de nucleotídeo que codificam polipeptídeos tendo atividade de alfa-glucuronidase da presente invenção.

Em um aspecto preferido, a sequência de nucleotídeo compreende ou consiste da SEQ ID N°: 1. Em um outro aspecto mais preferido, a sequência de nucleotídeo compreende ou consiste da sequência contido no plasmídeo pHinsGH67A que está contido em E. coli NRRL B50155. Em um outro aspecto preferido, a sequência de nucleotídeo compreende ou consiste do polipeptídeo maduro que codifica um sequência da SEQ ID N°: 1. Em um outro aspecto preferido, a sequência de nucleotídeo compreende ou consiste de nucleotídeos de 46 a 2583 da SEQ ID N°: 1. Em um outro aspecto mais preferido, a sequência de nucleotídeo compreende ou consiste do polipeptídeo maduro que codifica um sequência contido no plasmídeo pHinsGH67A que está contido em E. coli NRRL B-50155. A presente invenção também abrange sequências de nucleotídeo que codificam polipeptídeos que compreendem ou consistem da sequência de aminoácido da SEQ ID N°: 2 ou o polipeptídeo maduro deste, que diferem de SEQ ID N°: 1 ou o polipeptídeo maduro que codifica em sequência deste em virtude da degeneração do código genético. A presente invenção também diz respeito a subsequências da SEQ ID N°: 1 que codificam os fragmentos da SEQ ID N°: 2 que têm atividade de alfa-glucuronidase.

A presente invenção também diz respeito a polipeptídeos mutantes que compreendem ou consistem de pelo menos uma mutação no polipeptídeo maduro que codifica um sequência da SEQ ID N°: 1, em que a sequência de nucleotídeo mutante codifica o polipeptídeo maduro da SEQ ID N°: 2.

As técnicas usadas para isolar ou clonar um polinucleotídeo que codifica um polipeptídeo são conhecidas na técnica e incluem isolamento o DNA genômico, preparação de cDNA ou uma combinação destes. A clonagem dos polinucleotídeos da presente invenção de tal DNA genômico pode ser realizada, por exemplo, usando-se a reação de cadeia de polimerase bem conhecida (PCR) ou avaliação de anticorpo das bibliotecas de expressão para detectar fragmentos de DNA clonados com características estruturais divididas. Ver, por exemplo, Innis et al., 1990, PCR: A Guide to Methods and Application, Academic Press, New York, outros procedimentos para a amplificação de ácido nucléico tal como reação de cadeia de ligase (LCR), transcrição ativada ligada (LAT) e amplificação com base na sequência de nucleotídeo (NASBA) podem ser usados, os polinucleotídeos podem ser clonados a partir de uma cepa de Humicola ou um outro organismo relacionado e, desta maneira,, por exemplo, pode ser um alélico ou uma espécie variante do polipeptídeo que codifica uma região da sequência de nucleotídeo.

A presente invenção também diz respeito a polinucleotídeos isolados que compreendem ou consistem de sequências de nucleotídeo tendo um grau de identidade ao polipeptídeo maduro que codifica um sequência da SEQ ID N°: 1 de preferivelmente pelo menos 65 %, mais preferivelmente pelo menos 70 %, mais preferivelmente pelo menos 75 %, mais preferivelmente pelo menos 80 %, mais preferivelmente pelo menos 85 %, ainda mais preferivelmente pelo menos 90 %, mais preferivelmente pelo menos 95 % e ainda mais preferivelmente pelo menos 96 %, pelo menos 97 %, pelo menos 98 % ou pelo menos 99 %, que codifica um polipeptídeo tendo atividade de alfa-glucuronidase.

A modificação de uma sequência de nucleotídeo que codifica um polipeptídeo da presente invenção pode ser necessária para a síntese de polipeptídeos substancialmente similares ao polipeptídeo. O termo “substancialmente similar” ao polipeptídeo refere-se a formas de ocorrência não naturais do polipeptídeo. Estes polipeptídeos podem diferir de alguma maneira projetada do polipeptídeo isolado de sua fonte natural, por exemplo, variantes artificiais que diferem em atividade específica, termoestabilidade, pH ótimo ou semelhante. A sequência variante pode ser construída na base da sequência de nucleotídeo apresentado como o polipeptídeo maduro que codifica um sequência da SEQ IDN°: 1, por exemplo, a subsequência deste e/ou pela introdução de substituições de nucleotídeo que não dão origem a uma outra sequência de aminoácido do polipeptídeo codificado por uma sequência de nucleotídeo, mas que corresponde ao uso de códon do organismo hospedeiro para a produção da enzima ou pela introdução de substituições de nucleotídeo que podem dar origem a uma sequência de aminoácido diferente. Para uma descrição geral de substituição de nucleotídeo, ver, por exemplo, Ford et al., 1991, Protein Expression and Purification 2: 95-107.

Estará evidente para aquele habilitado na técnica que tais substituições podem ser feitas fora das regiões críticas para a função da molécula e ainda resultar em um polipeptídeo ativo. Os resíduos de aminoácido essenciais para a atividade do polipeptídeo codificado por um polinucleotídeo isolado da invenção e portanto preferivelmente são substituído à substituição, pode ser identificado de acordo com os procedimentos conhecidos na técnica, tal como mutagênese direcionada ao local ou mutagênese de varredura de alanina (ver, por exemplo, Cunningham and Wells, 1989, supra). Na última técnica, as mutações são introduzidas em cada resíduo positivamente carregado na molécula e as moléculas mutantes resultantes são testadas quanto à atividade de alfa-glucuronidase para identificar resíduos de aminoácido que são críticos para a atividade da molécula. Os locais de interação substrato-enzima também podem ser determinados pela análise da estrutura tri-dimensional como determinado por tais técnicas como análise de ressonância magnética nuclear, cristalografia ou rotulação por fotoafinidade (ver, por exemplo, de Vos et al., 1992, supra·, Smith et al., 1992, supra·, Wlodaver et al., 1992, supra).

A presente invenção também diz respeito a polinucleotídeos isolados que codificam polipeptídeos da presente invenção, que hibridizam sob condições de estringência muito baixa, preferivelmente condições de estringência baixa, mais preferivelmente condições de estringência média, mais preferivelmente condições de estringência média-altas, ainda mais preferivelmente condições de estringência alta e mais preferivelmente condições de estringência muito altas com o polipeptídeo maduro que codifica um sequência da SEQ ID N°: 1 ou seu filamento complementar de comprimento total ou variante alélicas e subsequências destes (Sambrook et al., 1989, supra), como definido neste.

A presente invenção também diz respeito a polinucleotídeos isolados obtidos por (a) hibridização de uma população de DNA sob condições de estringência muito baixa, baixa, média, média-alta, alta ou muito alta com o polipeptídeo maduro que codifica um sequência da SEQ ID N°: 1 ou seu filamento complementar de comprimento total e (b) isolar o polinucleotídeo de hibridização, que codifica um polipeptídeo tendo atividade de alfa-glucuronidase.

Construções de ácido nucléico

A presente invenção também diz respeito a construções de ácido nucléico que compreendem um polinucleotídeo isolado da presente invenção operacionalmente ligado a uma ou mais (diversas) sequências de controle que direciona a expressão da sequência codificadora em uma célula hospedeira adequada sob condições compatíveis com as sequências de controle.

Um polinucleotídeo isolado que codifica um polipeptídeo da presente invenção pode ser manipulado em uma variedade de maneiras para fornecer a expressão do polipeptídeo. A manipulação da sequência do polinucleotídeo antes de sua inserção em um vetor pode ser desejável ou necessário dependendo do vetor de expressão. As técnicas para modificar as sequências de polinucleotídeo que utilizam métodos e DNA recombinantes são bem conhecidas na técnica.

A sequência de controle pode ser uma sequência promotora apropriada, uma sequência de nucleotídeo que é reconhecida por uma célula hospedeira para a expressão de um polinucleotídeo que codifica um polipeptídeo da presente invenção. A sequência promotora contém sequências de controle de transcrição que mediam a expressão do polipeptídeo. O promotor pode ser qualquer sequência de nucleotídeo que apresente a atividade de transcrição na célula hospedeira de escolha incluindo promotores mutantes, truncados e híbridos e podem ser obtidos a partir de genes que codifica polipeptídeos extracelulares e intracelulares homólogos ou heterólogos à célula hospedeira.

Os exemplos de promotores para direcionar a transcrição das construções de ácido nucléico da presente invenção, especialmente em uma célula hospedeira bacteriana, são os promotores obtidos do E. coli lac operon, Streptomyces coelicolor gene de agarase (dagA), Bacillus subtilis levansucrase gene (sacB), Bacillus lícheniformis gene de alfa-amilase (amyL), Bacillus stearothermophilus gene de amilase maltogênica (amyM), Bacillus amiloliquefaciens gene de alfa-amilase (amyQ), Bacillus licheniformis gene de penicilinase (penP), Bacillus subtilis xilA and xilB genes e gene de betalactamase procariótica (Villa-Kamaroff et al., 1978, Proceedings of the National Academy of Sciences USA 75: 3727-3731), bem como o promotor tac (DeBoer et al., 1983, Proceedings of the National Academy of Sciences USA 80: 21-25). Os promotores adicionais são descritos em “Useful proteins from recombinant bactéria” in Scientific American, 1980, 242: 74-94 e in Sambrook et al., 1989, supra.

Os exemplos de promotores para direcionar a transcrição das construções de ácido nucléico da presente invenção em uma célula hospedeira fúngica filamentosa são promotores obtidos dos genes para Aspergillus oryzae TAKA amilase, Rhizomucor miehei proteinase aspártica, Aspergillus niger alfa-amilase neutra, Aspergillus niger alfa-amilase estável em ácido, Aspergillus niger ou Aspergillus awamori glucoamilase (glaÃ), Rhizomucor miehei lipase, Aspergillus oryzae protease alcalina, Aspergillus oryzae triose fosfato isomerase, Aspergillus nidulans acetamidase, Fusarium venenatum amiloglicosidase (WO 00/56900), Fusarium venenatum Daria (WO 00/56900), Fusarium venenatum Quinn (WO 00/56900), Fusarium oxysporum protease semelhante à tripsina (WO 96/00787), Trichoderma reesei beta-glicosidase, Trichoderma reesei celobioidrolase I, Trichoderma reesei celobioidrolase II, Trichoderma reesei endoglucanase I, Trichoderma reesei endoglucanase II, Trichoderma reesei endoglucanase III, Trichoderma reesei endoglucanase IV, Trichoderma reesei endoglucanase V, Trichoderma reesei xilanase I, Trichoderma reesei xilanase II, Trichoderma reesei betaxilosidase, bem como o promotor NA2-tpi (um hídrido dos promotores dos genes para Aspergillus niger alfa-amilase neutra e Aspergillus oryzae triose fosfato isomerase) e promotores mutantes, truncados e híbridos destes.

Em um hospedeiro de levedura, os promotores úteis são obtidos dos genes para Saccharomyces cerevisiae enolase (ENO-1), Saccharomyces cerevisiae galactocinase (GAL1), Saccharomyces cerevisiae álcool desidrogenase/gliceraldeído-3-fosfato desidrogenase (ADH1, ADH2/GAP), Saccharomyces cerevisiae triose fosfato isomerase (TPI), Saccharomyces cerevisiae metalotioneína (CUP1) e Saccharomyces cerevisiae 3-fosfoglicerato cinase. Outros promotores úteis para células de hospedeiro de levedura são descritos por Romanos et al., 1992, Yeast 8: 423-488.

A sequência de controle também pode ser um terminador e sequência de transcrição adequado, uma sequência reconhecida por uma célula hospedeira para terminar a transcrição. A sequência terminadora é operacionalmente ligada ao terminal 3' da sequência de nucleotídeo que codifica o polipeptídeo. Qualquer terminador que é funcional na célula hospedeira de escolha pode ser usado na presente invenção.

Os terminadores preferidos para as células hospedeiras fungicas filamentosas são obtidos dos genes para Aspergillus oryzae TAKA amilase, Aspergillus niger glucoamilase, Aspergillus nidulans antranilati sintase, Aspergillus niger alfa-glicosidase e Fusarium oxysporum protease semelhante à tripsina.

Os terminadores preferidos para células de hospedeiro de levedura são obtidos dos genes para Saccharomyces cerevisiae enolase, Saccharomyces cerevisiae citocromo C (CYC1) e Saccharomyces cerevisiae gliceraldeído-3-fosfato desidrogenase. Outros terminadores úteis para células de hospedeiro de levedura são descritos por Romanos et al., 1992, supra.

A sequência de controle também pode ser uma sequência líder adequada, uma região não traduzida de um mRNA que é importante para a tradução pela célula hospedeira. A sequência líder é operacionalmente ligada ao terminal 5' da sequência de nucleotídeo que codifica o polipeptídeo. Qualquer sequência líder que é funcional na célula hospedeira de escolha podem ser usados na presente invenção.

Os líderes preferidos para células hospedeiras fungicas filamentosas são obtidos dos genes para Aspergillus oryzae TAKA amilase e Aspergillus nidulans triose fosfato isomerase.

Os líderes adequados para células de hospedeiro de levedura são obtidos dos genes para Saccharomyces cerevisiae enolase (ENO-1), Saccharomyces cerevisiae 3-fosfoglicerato cinase, Saccharomyces cerevisiae fator alfa e Saccharomyces cerevisiae álcool desidrogenase/gliceraldeído-3fosfato desidrogenase (ADH2/GAP).

A sequência de controle também pode ser uma sequência de poliadenilação, uma sequência operacionalmente ligada ao terminal 3' da sequência de nucleotídeo e, quando transcrito, é reconhecido pela célula hospedeira como um sinal para adicionar os resíduos de poliadenosina ao mRNA transcrito. Qualquer sequência de poliadenilação que é funcional na célula hospedeira de escolha pode ser usada na presente invenção.

As sequências de poliadenilação preferida para células hospedeiras fungicas filamentosas são obtidos dos genes para Aspergillus oryzae TAKA amilase, Aspergillus niger glucoamilase, Aspergillus nidulans antranilati sintase, Fusarium oxysporum protease semelhante à tripsina e

Aspergillus niger alfa-glicosidase.

As sequências de poliadenilação úteis para células de hospedeiro de levedura são descritos por Guo and Sherman, 1995, Molecular Cellular Biology 15: 5983-5990.

A sequência de controle também pode ser um peptídeo sinalizador que codifica um sequência que codifica um peptídeo sinalizador ligado ao terminal amino de um polipeptídeo e direciona o polipeptídeo codificado no caminho secretor das células. A extremidade 5' da sequência codificadora da sequência de nucleotídeo pode conter inerentemente um peptídeo sinalizador que codifica um sequência naturalmente ligada na estrutura de leitura de tradução com o segmento da sequência codificadora que codifica o polipeptídeo secretado. Altemativamente, a extremidade 5' da sequência codificadora pode conter um peptídeo sinalizador que codifica um sequência que é estranha à sequência codificadora. O peptídeo sinalizador estranho que codifica um sequência pode ser requerida onde a sequência codificadora não contém, naturalmente um peptídeo sinalizador que codifica um sequência. Altemativamente, o peptídeo sinalizador estranho que codifica um sequência pode simplesmente substituir o peptídeo sinalizador natural que codifica um sequência a fim de intensificar a secreção do polipeptídeo. Entretanto, qualquer peptídeo sinalizador que codifica um sequência que direciona o polipeptídeo expressado no caminho secretor de uma célula hospedeira de escolha, isto é, secretado em um meio de cultura, podem ser usados na presente invenção.

O peptídeo sinalizador eficaz que codifica as sequências para células hospedeiras bacterianas são o peptídeo sinalizador que codifica as sequências obtidas dos genes para Bacillus NCIB 11837 amilase maltogênica, Bacillus stearothermophilus alfa-amilase, Bacillus licheniformis subtilisina, Bacillus licheniformis beta-lactamase, Bacillus stearothermophilus proteases neutras (nprT, nprS, nprM) e Bacillus subtilis prsA. Os peptídeos sinalizadores adicionais são descritos por Simonen and Paiva, 1993, Microbiological Reviews 57: 109-137.

O peptídeo sinalizador eficaz que codifica um sequências para células hospedeiras fungicas filamentosas são o peptídeo sinalizador que codifica as sequências obtidas dos genes para Aspergillus oryzae TAKA amilase, Aspergillus niger amilase neutra, Aspergillus niger glucoamilase, Rhizomucor miehei proteinase aspártica, Humicola insolens celulase, Humicola insolens endoglucanase V e Humicola lanuginosa lipase.

Os peptídeos sinalizadores úteis para células de hospedeiro de levedura são obtidos dos genes para Saccharomyces cerevisiae fator alfa e Saccharomyces cerevisiae invertase. Outro peptídeo sinalizador útil que codifica um sequências são descritos por Romanos et al., 1992, supra.

Em um aspecto preferido, o peptídeo sinalizador compreende ou consiste de aminoácidos 1 a 15 da SEQ ID N°: 2. Em um outro aspecto preferido, o peptídeo sinalizador que codifica um sequência compreende ou consiste de nucleotídeos 1 a 45 da SEQ ID N°: 1.

A sequência de controle também pode ser um pró-peptídeo que codifica um sequência que codifica um pró-peptídeo posicionado no terminal amino de um polipeptídeo. O polipeptídeo resultante é conhecido como uma pró-enzima ou pró-polipeptídeo (ou um zimogênio em alguns casos). Um pró43 peptídeo é, em geral, inativo e pode ser convertido a um polipeptídeo ativo maduro pela clivagem catalítica ou auto-catalítica do pró-peptídeo a partir do polipeptídeo. O pró-peptídeo que codifica uma sequência pode ser obtido a partir dos genes para Bacillus subtilis protease alcalina (aprE), Bacillus subtilis protease neutra (nprT), Saccharomyces cerevisiae fator alfa, Rhizomucor miehei proteinase aspártica e Myceliophthora thermophila lacase (WO 95/33836).

Quando tanto o peptídeo sinalizador quanto a sequência de propeptídeos estão presentes no terminal amino de um polipeptídeo, a sequência de pró-peptídeo está posicionada próxima ao terminal amino de um polipeptídeo e a sequência de sinalizador de peptídeo está posicionada próxima ao terminal amino da sequência de propeptídeo.

Também pode ser desejável adicionar sequências reguladoras que permitam a regulação da expressão do polipeptídeo com relação ao desenvolvimento da célula hospedeira. Os exemplos de sistemas reguladores são aqueles que fazem com que a expressão do gene seja ligada ou desligada em resposta a um estímulo químico ou físico, incluindo a presença de um composto regulador. Os sistemas reguladores em sistemas procarióticos incluem os sistemas operadores lac, tac e trp. Na levedura, o sistema ADH2 ou Sistema GAL1 podem ser usados. Nos fungos filamentosos, o promotor TAKA alfa-amilase, Aspergillus niger promotor de glicoamilase e Aspergillus oryzae promotor de glicoamilase podem ser usados como sequências reguladoras. Outros exemplos de sequências reguladoras são aqueles que permitem a amplificação do gene. Em sistemas eucarióticos, estas sequências reguladoras incluem o gene de diidrofolato redutase que é amplificado na presença de metotrexato e os genes de metaloproteína que são amplificados com metais pesados. Nestes casos, a sequência de nucleotídeo que codifica o polipeptídeo deve ser operacionalmente ligado com a sequência reguladora.

Vetores de expressão

A presente invenção também diz respeito a vetores de expressão recombinantes que compreendem um polinucleotídeo da presente invenção, um promotor e sinais de interrupção de transcrição e de tradução. Os vários ácidos nucléicos e as sequências de controle descrito aqui pode ser unido junto para produzir um vetor de expressão recombinante que pode incluir um ou mais (diversos) locais de restrição convenientes para permitir a inserção ou a substituição da sequência de nucleotídeo que codifica o polipeptídeo em tais locais. Altemativamente, uma sequência de polinucleotídeo da presente invenção pode ser expressada pela inserção da sequência de nucleotídeo ou uma construção de ácido nucléico que compreende a sequência em um vetor apropriado para a expressão. Na criação do vetor de expressão, a sequência codificadora está localizado no vetor e modo que a sequência codificadora está operacionalmente ligada com sequências apropriadas de controle para a expressão.

O vetor de expressão recombinante pode ser qualquer vetor (por exemplo, um plasmídeo ou vírus) que pode ser convenientemente submetido a procedimentos de DNA recombinante e pode realizar a expressão da sequência de nucleotídeo. A escolha do vetor dependerá tipicamente da compatibilidade do vetor com a célula hospedeira em que o vetor deve ser introduzido. Os vetores podem ser plasmídeos lineares ou circulares fechados.

O vetor pode ser um vetor de replicação autônoma, isto é, um vetor que existe como uma entidade extracromossômica, cuja replicação é independente da replicação cromossômica, por exemplo, um plasmídeo, um elemento cromossômico, um minicromossomo, ou um cromossomo artificial. O vetor pode conter quaisquer meios para garantir a auto-replicação. Altemativamente, pode ser um que, quando introduzido na célula hospedeira, é integrado no genoma e replicado junto com os cromossomos em que este foi integrado. Além disso, um vetor simples ou plasmídeo ou dois ou mais vetores ou plasmídeos que juntos contêm o DNA total a serem introduzido no genoma da célula hospedeira ou um transposon, podem ser usados.

Os vetores da presente invenção preferivelmente contêm um ou mais (diversos) marcadores selecionáveis que permitem seleção fácil de células transfectadas, transduzidas ou semelhante. Um marcador selecionável é um gene cujo produto fornece resistência de biocida ou viral, resistência a metais pesados, oprototrofia a auxótrofos e outros.

Os exemplos marcadores selecionáveis são os genes dal de Bacillus subtilis ou Bacillus licheniformis ou marcadores que conferem resistência a antibióticos tal como resistência a ampicilina, canamicina, cloranfenicol ou tetraciclina. Os marcadores adequados para células de hospedeiro de levedura são ADE2, HIS3, LEU2, LYS2, MET3, TRP1 e URA3. Os marcadores selecionáveis para o uso em uma célula hospedeira fungica filamentosa incluem, mas não limitam-se a amdS (acetamidase), argB (omitina carbamoiltransferase), bar (fosfinotricina acetiltransferase), hph (higromicina fosfotransferase), niaD (nitrato redutase), pyrG (orotidina-5’fosfato decarboxilase), sC (sulfato adeniltransferase) e trpC (antranilati sintase), bem como equivalentes destes. Preferidos para o uso em uma célula de Aspergillus são os genes amdS e pyrG de Aspergillus nidulans ou Aspergillus oryzae e o gene bar de Streptomyces hygroscopicus.

Os vetores da presente invenção preferivelmente contêm um elemento que permite a integração do vetor no genoma da célula hospedeira ou replicação autônoma do vetor na célula independente do genoma.

Para a integração no genoma da célula hospedeira, o vetor pode contar com a sequência de polinucleotídeo que codifica o polipeptídeo ou qualquer outro elemento do vetor para a integração no genoma por recombinação homóloga ou não homóloga. Alternativamente, o vetor pode conter sequências de nucleotídeos adicionais para direcionar a integração pela recombinação homóloga no genoma da célula hospedeira em um local preciso nos cromossomos. Para aumentar a probabilidade de integração em um local preciso, os elementos de integração devem conter, preferivelmente, um número suficiente de ácidos nucléicos, tal como 100 a 10.000 pares de base, preferivelmente 400 a 10.000 pares de base e mais preferivelmente 800 a 10.000 pares de base, que tem um alto grau de identidade ao que corresponde à sequência alvo para intensificar a probabilidade de recombinação homóloga. Os elementos integracionais podem ser quaisquer sequências que são homólogas com a sequência alvo no genoma da célula hospedeira. Além disso, os elementos integracionais podem ser sequências de nucleotídeo codificadoras ou não codificadoras. Por outro lado o vetor pode ser integrado no genoma da célula hospedeira pela recombinação não homóloga.

Para a replicação autônoma, o vetor ainda pode compreender uma origem de replicação que permita que o vetor replique-se de maneira autônoma na célula hospedeira em questão. A origem de replicação pode ser qualquer replicador de plasmídeo que medie a replicação autônoma que funciona em uma célula. O termo “origem de replicação” ou “replicador de plasmídeo” é definido aqui como uma sequência de nucleotídeo que permite que um plasmídeo ou vetor repliquem-se in vivo.

Os exemplos de origens bacterianas de replicação são as origens de replicação de plasmídeo pBR322, pUC19, pACYC177 e pACYC184 permitindo a replicação em E. coli e pUBl 10, pE194, pTA1060 e pAMBl permitindo a replicação em Bacillus.

Os exemplos de origens de replicação para o uso em uma célula de hospedeiro de levedura são a origem de replicação de 2 mícron, ARS1, ARS4, a combinação de ARS1 e CEN3 e a combinação de ARS4 and CEN6.

Os exemplos de origens de replicação úteis em uma célula fungica filamentosa são AMAI e ANS1 (Gems et al., 1991, Gene 98: 61-67; Cullen e/a/., 1987, Nucleic Acids Research 15: 9163-9175; WO 00/24883). O isolamento do gene AMAI e construção e plasmídeos ou vetores que compreende o gene pode ser realizado de acordo com os métodos divulgados em WO 00/24883.

Mais do que uma cópia de um polinucleotídeo da presente invenção pode ser inserida em uma célula hospedeira para aumentar produção do produto de gene. Um aumento no número de cópia do polinucleotídeo pode ser obtido pela integração de pelo menos uma cópia adicional da sequência no genoma da célula hospedeira ou pela inclusão de um gene marcador selecionável amplificável com o polinucleotídeo onde as células contendo cópias amplificadas do gene marcador selecionável e desse modo, cópias adicionais do polinucleotídeo, podem ser selecionadas pelo cultivo das células na presença do gene selecionável apropriado.

Os procedimentos usados para ligar os elementos descritos acima para construir os vetores de expressão recombinantes da presente invenção são bem conhecidos por uma pessoa habilitada na técnica (ver, por exemplo, Sambrook et al., 1989, supra).

Células Hospedeiras

A presente invenção também diz respeito a células hospedeiras recombinantes, que compreendem um polinucleotídeo isolado da presente invenção operacionalmente ligado a uma ou mais (diversas) sequências de controle que direcionam a produção de um polipeptídeo tendo atividade de alfa-glucuronidase. Uma construção ou vetor que compreendem um polinucleotídeo da presente invenção são introduzidos em uma célula hospedeira, de modo que a construção ou vetor são mantidos como um integrante cromossômico ou como um extra-cromossomo de auto-replicação como descrito anteriormente. O termo “células hospedeiras” abrange qualquer progênie de uma célula precursora que não é idêntica à célula precursora devido às mutações que ocorrem durante a replicação. A escolha de uma célula hospedeira dependerá, até certo ponto do gene que codifica o polipeptídeo e sua fonte.

A célula hospedeira pode ser qualquer célula útil na produção recombinante de um polipeptídeo da presente invenção, por exemplo, um procariota ou um eucariota.

A célula hospedeira procariota pode ser qualquer bactéria de 5 Gram positivo ou uma bactéria de Gram negativo, bactérias de Gram positivo incluem, mas não limitam-se a, Bacillus, Streptococcus, Streptomyces, Staphylococcus, Enterococcus, Lactobacillus, Lactococcus, Clostridium, Geobacillus e Oceanobacíllus. As bactérias de Gram negativo incluem, mas não limitam-se a, E. coli, Pseudomonas, Salmonella, Campylobacter,

Helicobacter, Flavobacterium, Fusobacterium, Ilyobacter, Neisseria e Ureaplasma.

A célula de hospedeiro bacteriano pode ser qualquer célula de Bacillus. As células de Bacillus úteis na prática da presente invenção incluem, mas não limitam-se a células de Bacillus alkalophilus, Bacillus amiloliquefacicns, Bacillus brevis, Bacillus circulans, Bacillus clausii, Bacillus coagulans, Bacillus firmus, Bacillus lautus, Bacillus Icntus, Bacillus lichcniformis, Bacillus mcgatcrium, Bacillus pumilus, Bacillus stearothcrmophilus, Bacillus subtilis e Bacillus thuringiensis.

Em um aspecto preferido, a célula hospedeira bacteriana é uma * 20 célula de Bacillus amiloliqucfaciens, Bacillus Icntus, Bacillus lichcniformis, Bacillus stcarothermophilus ou Bacillus subtilis. Em um aspecto mais preferido, a célula hospedeira bacteriana é uma célula de Bacillus amiloliquefacicns. Em um outro aspecto mais preferido, a célula hospedeira bacteriana é uma célula de Bacillus clausii. Em um outro aspecto mais preferido, a célula hospedeira bacteriana é uma célula de Bacillus licheniformis. Em um outro aspecto mais preferido, a célula hospedeira bacteriana é uma célula de Bacillus subtilis.

A célula hospedeira bacteriana também pode ser qualquer célula de Streptococcus. As células Streptococcus úteis na prática da presente invenção incluem, mas não limitam-se a células de Streptococcus equisimilis, Streptococcus pyogenes, Streptococcus uberis e Streptococcus equi subsp. Zooepidemicus.

Em um aspecto preferido, a célula hospedeira bacteriana é uma 5 célula de Streptococcus equisimilis. Em um outro aspecto preferido, a célula hospedeira bacteriana é uma célula de Streptococcus pyogenes. Em um outro aspecto preferido, a célula hospedeira bacteriana é uma célula de Streptococcus uberis. Em um outro aspecto preferido, a célula hospedeira bacteriana é uma célula de Streptococcus equi subsp. Zooepidemicus.

A célula hospedeira bacteriana também pode ser qualquer , célula de Streptomyces. As células de Streptomyces úteis na prática da presente invenção incluem, mas não limitam-se a células de Streptomyces achromogenes, Streptomyces avermitilis, Streptomyces coelicolor, Streptomyces griseus e Streptomyces lividans.

Em um aspecto preferido, a célula hospedeira bacteriana é uma célula de Streptomyces achromogenes. Em um outro aspecto preferido, a célula hospedeira bacteriana é uma célula de Streptomyces avermitilis. Em um outro aspecto preferido, a célula hospedeira bacteriana é uma célula de Streptomyces coelicolor. Em um outro aspecto preferido, a célula hospedeira * 20 bacteriana é uma célula de Streptomyces griseus. Em um outro aspecto preferido, a célula hospedeira bacteriana é uma célula de Streptomyces lividans.

A introdução de DNA em uma célula de Bacillus pode, por exemplo, ser realizado pela transformação de protoplasto (ver, por exemplo,

Chang and Cohen, 1979, Molecular General Genetics 168: 111-115), usandose células competentes (ver, por exemplo, Young and Spizizen, 1961, Journal of Bacteriology 81: 823-829 ou Dubnau and Davidoff-Abelson, 1971, Journal of Molecular Biology 56: 209-221), por eletroporação (ver, por exemplo, Shigekawa and Dower, 1988, Biotechniques 6: 742-751) ou por conjugação (ver, por exemplo, Koehler and Thome, 1987, Journal of Bacteriology 169: 5271-5278). A introdução de DNA em uma célula de E coli pode, por exemplo, ser realizado pela transformação de protoplasto (ver, por exemplo, Hanahan, 1983, J. Mol. Biol. 166: 557-580) ou eletroporação (ver, por exemplo, Dower et al., 1988, Nucleic Acids Res. 16: 6127-6145). A introdução de DNA em uma célula de Streptomyces pode, por exemplo, ser realizado pela transformação de protoplasto e eletroporação (ver, por exemplo, Gong et al., 2004, Folia Microbiol. (Praha) 49: 399-405), por conjugação (ver, por exemplo, Mazodier et al., 1989, J. Bacteriol. 171: 35833585) ou por transdução (ver, por exemplo, Burke et al., 2001, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 98: 6289-6294). A introdução de DNA em uma célula Pseudomonas pode, por exemplo, ser realizada por eletroporação (ver, por exemplo, Choi et al., 2006, J. Microbiol. Methods 64: 391-397) ou por conjugação (ver, por exemplo, Pinedo and Smets, 2005, Appl. Environ. Microbiol. 71: 51-57). A introdução de DNA em uma célula de Streptococcus pode, por exemplo, ser realizado por competência natural (ver, por exemplo, Perry and Kuramitsu, 1981, Infect. Immun. 32: 1295-1297), pela transformação de protoplasto (ver, por exemplo, Catt and Jollick, 1991, Microbios. 68: 189-207, por eletroporação (ver, por exemplo, Buckley et al., 1999, Appl. Environ. Microbiol. 65: 3800-3804) ou por conjugação (ver, por exemplo, Clewell, 1981, Microbiol. Rev. 45: 409-436). Entretanto, qualquer método conhecido na técnica para introduzir o DNA em uma célula hospedeira pode ser usado.

A célula hospedeira também pode ser um eucariota, tal como uma célula de mamífero, inseto, vegetal ou fungica.

Em um aspecto preferido, a célula hospedeira é uma célula fungica. “Fungos” como usado neste inclui o filo Ascomycota,

Basidiomycota, Chytridiomycota e Zygomycota (como definido por

Hawksworth et al., In, Ainsworth and Bisby’s Dictionary of The Fungi, 8° edição, 1995, CAB International, University Press, Cambridge, UK) bem como o Oomycota (como citado em Hawksworth et al., 1995, supra, página 171) e todos os fungos mitospóricos (Hawksworth et al., 1995, supra).

Em um aspecto mais preferido, a célula fungica é uma célula de levedura. “Levedura” como usado neste inclui levedura ascosporogenosa (Endomycetales), levedura basidiosporogenosa e levedura que pertence ao Fungi Imperfecti (Blastomycetes). Visto que a classificação de levedura pode mudar no futuro, para os propósitos desta invenção, levedura deve ser definido como descrito em Biology and Activitíes of Yeast (Skinner, F.A., Passmore, S.M. e Davenport, R.R., eds, Soc. App. Bacteriol. Symposium Series No. 9, 1980).

Ainda, em um aspecto mais preferido, a célula hospedeira de levedura é uma célula de Candida, Hansenula, Kluyveromyces, Pichia, Saccharomyces, Schizosaccharomyces ou Yarrowia.

Em um aspecto mais preferido, a célula hospedeira de levedura é uma célula de Saccharomyces carlsbergensis, Saccharomyces cerevisiae, Saccharomyces diastaticus, Saccharomyces douglasii, Saccharomyces kluyveri, Saccharomyces norbensis ou Saccharomyces oviformis. Em um outro aspecto mais preferido, a célula hospedeira de levedura é uma célula de Kluyveromyces lactis. Em um outro aspecto mais preferido, a célula hospedeira de levedura é uma célula de Yarrowia lipolytica.

Em um outro aspecto mais preferido, a célula hospedeira fungica é uma célula fungica filamentosa. “Fungos filamentosos” incluem todas as formas filamentosas da subdivisão Eumycota e Oomycota (como definido por Hawksworth et al., 1995, supra). Os fungos filamentosos são, em geral, caracterizados por compostos de parede de micelas de quitina, celulose, glicano, quitosano, manano e outros polissacarídeos complexos. O desenvolvimento vegetativo ocorre pelo alongamento hifal e o catabolismo de carbono é obrigatoriamente aeróbico. Em contraste, o desenvolvimento vegetativo por leveduras tal como Saccharomyces cerevisiae ocorre pela origem de um talo unicelular e o catabolismo de carbono pode ser fermentativo.

Ainda, em um aspecto mais preferido, a célula hospedeira fungioca filamentosa é uma célula de Acremonium, Aspergillus, Aureobasidium, Bjerkandera, Ceriporiopsis, Chrysosporium, Coprinus, Coriolus, Cryptococcus, Filibasidium, Fusarium, Humicola, Magnaporthe, Mucor, Myceliophthora, Neocallimastix, Neurospora, Paecilomyces, Penicillium, Phanerochaete, Phlebia, Piromyces, Pleurotus, Schizophyllum, Talaromyces, Thermoascus, Thielavia, Tolypocladium, Trametes ou Trichoderma.

Em um aspecto mais preferido, a célula hospedeira fungica filamentosa é uma célula de Aspergillus awamori, Aspergillus fumigatus, Aspergillus foetidus, Aspergillus japonicus, Aspergillus nidulans, Aspergillus niger or Aspergillus oryzae. Em um outro aspecto mais preferido, a célula hospedeira fungica filamentosa é uma célula de Fusarium bactridioides, Fusarium cerealis, Fusarium crookwellense, Fusarium culmorum, Fusarium graminearum, Fusarium graminum, Fusarium heterosporum, Fusarium negundi, Fusarium oxysporum, Fusarium reticulatum, Fusarium roseum, Fusarium sambucinum, Fusarium sarcochroum, Fusarium sporotrichioides, Fusarium sulphureum, Fusarium torulosum, Fusarium trichothecíoides ou Fusarium venenatum. Em um outro aspecto mais preferido, a célula hospedeira fungica filamentosa é uma célula de Bjerkandera adusta, Ceriporiopsis aneirina, Ceriporiopsis aneirina, Ceriporiopsis caregiea, Ceriporiopsis gilvescens, Ceriporiopsis pannocinta, Ceriporiopsis rivulosa, Ceriporiopsis subrufa, Ceriporiopsis subvermispora, Chrysosporium keratinophilum, Chrysosporium lucknowense, Chrysosporium tropicum, Chrysosporium merdarium, Chrysosporium inops, Chrysosporium pannicola, Chrysosporium queenslandicum, Chrysosporium zonatum, Coprinus cinereus,

Coriolus hirsutus, Humicola insolens, Humicola lanuginosa, Mucor miehei, Myceliophthora thermophila, Neurospora crassa, Penicillium purpurogenum, Phanerochaete chrysosporium, Phlebia radiata, Pleurotus eryngii, Thielavia terrestris, Trametes villosa, Trametes versicolor, Trichoderma harzianum, Trichoderma koningii, Trichoderma longibrachiatum, Trichoderma reesei ou Trichoderma viride.

As células fungicas podem ser transformadas por um processo que envolve a formação de protoplasto, transformação dos protoplastos e regeneração da parede celular de uma maneira conhecida per se. Os procedimentos adequados para a transformação de células hospedeiras de Aspergillus e Trichoderma são descritos em EP 238 023 and Yelton et al., 1984, Proceedings of the National Academy of Sciences USA 81: 1470-1474. Os métodos adequados para a transformação de espécies Fusarium são descritos por Malardier et al., 1989, Gene 78: 147-156 e WO 96/00787. A levedura pode ser transformada usando-se os procedimentos descritos por Becker and Guarente, In Abelson, J.N. and Simon, M.I., editors, Guide to Yeast Genetics and Molecular Biology, Methods in Enzymology, Volume 194, pp 182-187, Academic Press, Inc., New York; Ito et al., 1983, Journal of Bacteriology 153: 163 e Hinnen et al., 1978, Proceedings of the National Academy of Sciences USA 75: 1920.

Métodos de Produção

A presente invenção também diz respeito a métodos de produzir um polipeptídeo da presente invenção, que compreende: (a) cultivar uma célula, que, em sua forma do tipo selvagem produz o polipeptídeo, sob condições condutivas para a produção do polipeptídeo e (b) recuperação do polipeptídeo. Em um aspecto preferido, a célula é do gênero Myceliophthora. Em um aspecto mais preferido, a célula é Myceliophthora thermophila. Em um aspecto mais preferido, a célula é Myceliophthora thermophila CBS 117.65.

A presente invenção também diz respeito a métodos de produzir um polipeptídeo da presente invenção, que compreende: (a) cultivar uma célula hospedeira recombinante, como descrito neste, sob condições condutivas para a produção do polipeptídeo e (b) recuperação do polipeptídeo.

A presente invenção também diz respeito a métodos de produzir um polipeptídeo da presente invenção, que compreende: (a) cultivar uma célula hospedeira recombinante sob condições condutivas para a produção do polipeptídeo, em que a célula hospedeira compreende uma sequência de nucleotídeo mutante tendo pelo menos uma mutação no polipeptídeo maduro que codifica um sequência da SEQ IDN°: 1, em que a sequência de nucleotídeo mutante codifica um polipeptídeo que compreende ou consiste do polipeptídeo maduro da SEQ ID N°: 2 e (b) recuperação do polipeptídeo.

Nos métodos de produção da presente invenção, as células são cultivadas em um meio nutriente adequado para a produção do polipeptídeo usando-se métodos bem conhecidos na técnica. Por exemplo, a célula pode ser cultivada pelo cultivo no frasco de agitação e fermentação em escala pequena ou escala grande (incluindo fermentações contínuas, batelada, alimentação-batelada ou em estado sólido) em fermentadores de laboratório ou industriais realizado em um meio adequado e sob condições que permitem que o polipeptídeo seja expressado e/ou isolado. O cultivo acontece em um meio de nutriente adequado que compreende fontes de carbono ou de nitrogênio e sais inorgânicos, usando-se procedimentos conhecidos na técnica. Os meios adequados estão disponíveis a partir de fornecedores comerciais ou podem ser preparados de acordo com as composições publicadas (por exemplo, em catálogos da American Type Culture Collection). Se o polipeptídeo for secretado no meio de nutriente, o polipeptídeo pode ser recuperado diretamente a partir do meio. Se o polipeptídeo não for secretado no meio, este pode ser recuperado dos lisados celulares.

Os polipeptídeos podem ser detectados usando-se métodos conhecidos na técnica que são específicos para o polipeptídeos. Estes métodos de detecção podem incluir o uso de anticorpos específicos, formação de um produto de enzima ou desaparecimento de um substrato de enzima. Por exemplo, um ensaio de enzima podem ser usados para determinar a atividade do polipeptídeo como descrito neste.

O polipeptídeo resultante pode ser recuperado usando-se os métodos conhecidos na técnica. Por exemplo, o polipeptídeo pode ser recuperado do meio de nutriente por procedimentos convencionais que incluem, mas não limita-se a, centrifugação, filtração, extração, secagem por pulverização, evaporação ou precipitação.

Os polipeptídeos da presente invenção podem ser purificados por uma variedade de procedimentos conhecidos na técnica que inclui, mas não limita-se a, cromatografia (por exemplo, troca iônica, afinidade, hidrofóbica, cromatofocalização e exclusão de tamanho), procedimentos eletroforéticos (por exemplo, focalização isoelétrica preparativa), solubilidade diferencial (por exemplo, precipitação de sulfato de amônio), SDS-PAGE ou extração (ver, por exemplo, Protein Purification, J.-C. Janson and Lars Ryden, editors, VCH Publishers, New York, 1989) para obter os polipeptídeos substancialmente puros.

Plantas

A presente invenção também diz respeito a plantas, por exemplo, uma planta transgênica, parte vegetal ou célula vegetal, que compreende um polinucleotídeo isolado que codifica um polipeptídeo tendo atividade de acetilxilano esterase da presente invenção a fim de expressar e produzir o polipeptídeo em quantidades recuperáveis. O polipeptídeo pode ser recuperado da planta ou parte vegetal. Alternativamente, a planta ou parte vegetal contendo o polipeptídeo recombinante podem ser usadas como tais para fornecer a qualidade de um alimento ou nutrição, por exemplo, melhorando o valor nutricional, palatabilidade e propriedades reológicas ou para destruir um fator antinutritivo.

A planta transgênica pode ser dicotiledônea (uma dicot) ou monocotiledônea (uma monocot). Os exemplos de plantas monocot são gramas, tais como grama do prado (grama azul, Poa), grama de forragem tal como Festuca, Lolium, grama temperada, tal como Agrostis e cereais, por exemplo, trigo, aveias, centeio, cevada, arroz, sorgo e milho.

Os exemplos de plantas dicot são tabaco, legumes, tais como lupins, batatas, beterraba de açúcar, ervilha, feijão, soja e plantas crucíferas (famíla Brassicaceae), tal como couve flor, colza e o modelo de organismo mais intimamente relacionado Arabídopsis thaliana.

Os exemplos de partes vegetais são caule, calo, folhas, raiz, frutos, sementes e tubérculos bem como os tecidos individuais que compreendem estas partes, por exemplo, epiderme, mesófilo, parênquima, tecido vascular, meristemas. Os compartimentos vegetais específicos de célula, tais como cloroplastos, apoplastos, mitocêndria, vacúolos, peroxissomas e citoplasma, também são considerados ser uma parte vegetal. Além disso, qualquer célula vegetal, qualquer que seja o tecido de origem, é considerado ser uma parte vegetal. Da mesma maneira, as partes vegetais, tais como tecidos específicos e células isoladas para facilitar a utilização da invenção também são considerados partes vegetais, por exemplo, embriões, endospermas, aleurona e revestimentos de semente.

Também está incluído na presente invenção, a progênie de tais plantas, partes vegetais e células vegetais.

A planta trangênica ou a célula vegetal que expressa um polipeptídeo da presente invenção pode ser construída de acordo com os métodos conhecidos na técnica. Em resumo, a planta ou célula vegetal é construída pela incorporaão de uma ou mais (diversas) construções de expressão que codificam um polipeptídeo da presente invenção no genoma hospedeiro vegetal ou genoma de cloroplasto e propagação da planta modificada resultante ou célula vegetal em uma planta transgênica ou célula vegetal.

A construção de expressão é convenientemente uma construção de ácido nucléico que compreende um polinucleotídeo que codifica um polipeptídeo da presente invenção operacionalmente ligado com sequências reguladoras apropriadas para a expressão da sequência de nucleotídeo na planta ou parte vegetal de escolha. Além disso, a construção de expressão pode compreender um marcador selecionável útil para identificar células hospedeiras em que a construção de expressão foi integrada e as sequências de DNA necessárias para a introdução da construção na planta em questão (o último depende do método de introdução de DNA a ser usado).

A escolha de sequências reguladoras, tal como promotor e sequências terminadoras e, opcionalmente sequências de sinal ou trânsito, é determinada, por exemplo, na base de quando, onde e como o polipeptídeo é desejado ser expressado. Por exemplo, a expressão do gene que codifica um polipeptídeo da presente invenção pode ser constitutivo ou indutível ou pode ser específico de desenvolvimento, estágio ou tecido e o produto genético pode ser alvejado a um tecido específico ou parte vegetal, tal como sementes ou folhas. As sequências reguladoras são, por exemplo, descritas por Tague et al., 1988, Plant Physiology 86: 506.

Para a expressão constitutiva, o 35S-CaMV, o promotor de ubiquitina 1 de milho e a actina 1 de arroz 1 podem ser usados (Franck et al., 1980, Cell 21: 285-294; Christensen et al., 1992, Plant Mol. Biol. 18: 675689; Zhang et al., 1991, Plant Cell 3: 1155-1165). Os promotores específicos de órgão podem ser, por exemplo, um promotor dos tecidos de local de armazenagem tal como sementes, tubérculos de batata e frutos (Edwards and Coruzzi, 1990, Ann. Rev. Genet. 24: 275-303) ou de tecidos de local metabólico, tais como meristemas (Ito et al., 1994, Plant Mol. Biol. 24: 863878), um promotor específico de semente tal como um promotor de glutelina, prolamina, globulina ou albumina de arroz (Wu et al., 1998, Plant and Cell Physiology 39: 885-889), um promotor de Vicia faba da legumina B4 e o gene de proteína de semente desconhecido de Vicia faba (Conrad et al., 1998, Journal of Plant Physiology 152: 708-711), um promotor de uma proteína de corpo oleoso de semente (Chen et al., 1998, Plant and Cell Physiology 39: 935-941), o promotor de napA de proteína de armazenagem de Brassica napus ou qualquer oturo promotor específico de semente conhecido na técnica, por exemplo, como descrito em WO 91/14772. Além disso, o promotor pode ser um promotor específico de folha tal como um promotor rbcs de arroz ou tomate (Kyozuka et al., 1993, Plant Physiology 102: 9911000, o promotor do gene de adenina metiltransferase do vírus da cólera (Mitra and Higgins, 1994, Plant Molecular Biology 26: 85-93) ou o promotor de gene aldP de arroz (Kagaya et al., 1995, Molecular and General Genetics 248: 668-674) ou um promotor indutível por ferimento tal como um promotor pin2 de batata (Xu et al., 1993, Plant Molecular Biology 22: 573-588). Da mesma maneira, o promotor pode ser indutível por tratamentos abióticos, tais como temperatura, seca ou alterações na salinidade ou induzido por substâncias exogenamente aplicadas que ativam o promotor, por exemplo, etanol, estrogênios, hormônios vegetais, tais como etileno, ácido absícico, e ácido giberélico e metais pesados.

Um elemento intensificador de promotor também pode ser usado para atingir a expressão mais alta de um polipeptídeo da presente invenção na planta. Por exemplo, o elemento intensificador de promotor pode ser um íntron que é colocado entre o promotor e a sequência de nucleofidieo que codifica um polipeptídeo da presente invenção. Por exemplo, Xu et al., 1993, supra, divulga o uso do primeiro íntron da actina 1 do arroz para intensificar a expressão.

O gene marcador selecionável e quaisquer outras partes da construção de expressão pdoe ser escolhido daqueles disponíveis na técnica.

A construção de ácido nucléico é incorporada no genoma vegetal de acordo com técnicas convencionais conhecidas na técnica, incluindo transformação mediada por Agrobacterium, transformação mediada por vírus, microinjeção, bombardeio de partícula, transformação biolística e eletroporação (Gasser et al., 1990, Science 244: 1293; Potrykus, 1990, Bio/Technology 8: 535; Shimamoto et al., 1989, Nature 338: 274).

Presentemente, a transferência de gene mediada por Agrobacterium tumefaciens é o método de escolha para a geração de dicots transgênicas (para uma revisão, ver Hooykas and Schilperoort, 1992, Plant Molecular Biology 19: 15-38) e também pode ser usada para a transformação de monocots, embora outros métodos de transformação sejam frequentemente usados para estas plantas. Presentemente, o método de escolha para a geração de monocots transgênicas é o bombardeamento de partícula (partículas de ouro ou tungstênio microscópicas revestidas com o DNA de transformação) de calos embriônicos ou embriões em desenvolvimento (Christou, 1992, Plant Journal 2: 275-281; Shimamoto, 1994, Current Opinion Biotechnology 5: 158-162; Vasil et al., 1992, Bio/Technology 10: 667-674). Um método alternativo para a transformação de monocots é fundamentado na transformação de protoplasto como descrito por Omirulleh et al., 1993, Plant Molecular Biology 21: 415-428.

Seguindo a transformação, os transformantes tendo incorporado a construção de expressão são selecionados e regenerados em plantas totais de acordo com métodos bem conhecidos na técnica. Frequentemente, o procedimento de transformação é projetado para a eliminação seletiva de genes de seleção durante a regeneração ou nas gerações seguintes, usando-se, por exemplo, co-transformação com duas construções de T-DNA separadas ou excisão específica de local do gene de seleção ou por uma recombinase específica.

A presente invenção também diz respeito a métodos de produzir um polipeptídeo da presente invenção que compreende: (a) cultivar uma planta transgênica ou uma célula vegetal que compreende um polinucleotídeo que codifica o polipeptídeo tendo atividade de acetilxilano esterase da presente invenção sob condições condutivas para a produção do polipeptídeo e (b) recuperação do polipeptídeo.

Remoção ou redução da Atividade de alfa-glucuronidase

A presente invenção também diz respeito a métodos de produzir um mutante de uma célula precursora, que compreende interromper ou anular um polinucleotídeo ou uma porção destes, que codifica um polipeptídeo da presente invenção, que resulta na célula mutante que produz menos do polipeptídeo do que a célula precursora quando cultivada sob as mesmas condições.

A célula mutante pode ser construída pela redução ou a eliminação da expressão de uma sequência de nucleotídeo que codifica um polipeptídeo da presente invenção usando métodos bem conhecidos na técnica, por exemplo, inserções, rompimentos, substituições ou anulações. Em um aspecto preferido, a sequência de nucleotídeo é inativada. A sequência de nucleotídeo a ser modificada ou inativada pode ser, por exemplo, a região codificadora ou uma parte deste essencial para a atividade, ou um elemento regulador requerido para a expressão de uma região codificadora. Um exemplo de uma tal sequência reguladora ou de controle pode ser uma sequência promotora e uma parte funcional destes, isto é, uma parte que é suficiente para afetar a expressão de uma sequência de nucleotídeo. Outras sequências de controle para as modificações possíveis incluem, mas não são limitados a, um leitor, sequência de poliadenilação, sequência de propeptídeo, sequência de peptídeo de sinal, terminador de transcrição e ativador transcricional.

A modificação ou inativação de uma sequência de nucleotídeo pode ser realizada por submeter a célula precursora a mutagênese e selecionar para as células mutantes em que a expressão da sequência de nucleotídeo seja reduzida ou eliminada. A mutagênese, que pode ser específica ou aleatória, pode ser realizada, por exemplo, pelo uso de um agente de mutagenização químico ou físico adequado, pelo uso de um oligonucleotídeo adequado, ou por submeter a sequência de DNA a mutagênese gerada por PCR. Além disso, a mutagênese pode ser realizada pelo uso de qualquer combinação destes agentes de mutagenização.

Exemplos de um agente de mutagenização químico ou físico adequado para um presente propósito incluem irradiação ultravioleta (UV), hidroxilamina, N-metil-N'-nitro-N-nitrosoguanidina (MNNG), O-metil hidroxilamina, ácido nitroso, sulfonato de etila metano (EMS), bissulfeto de sódio, ácido fórmico e análogos de nucleotídeos.

Quando tais agentes são usados, a mutagênese é tipicamente realizada pela incubação da célula precursora a ser mutagenizada na presença do agente de mutagenização de escolha sob condições adequadas e avaliação e/ou seleção para as células mutantes não expressou nenhuma expressão genética ou reduzida.

A modificação ou inativação de uma sequência de nucleotídeo pode ser acompanhada pela introdução, substituição ou remoção de um ou mais (diversos) nucleotídeos no gene ou um elemento regulador requerido pela transcrição ou tradução destes. Por exemplo, os nucleotídeos podem ser inseridos ou removidos a fim de resultar na introdução de um códon de interrupção, a remoção do códon de partida, ou uma mudança na estrutura de leitura aberta. Tal modificação ou inativação pode ser acompanhada pela mutagênese direcionada ao local ou mutagênese gerada por PCR de acordo com os métodos conhecidos na técnica. Embora, a princípio, a modificação possa ser realizada in vivo, isto é, diretamente na expressão da célula de uma sequência de nucleotídeo a ser modificada, é preferido que a modificação seja realizada in vitro como exemplificada abaixo.

Um exemplo de uma maneira conveniente para eliminar ou reduzir a expressão de uma sequência de nucleotídeo por uma célula é baseada nas técnicas de substituição do gene, anulação do gene ou rompimento do gene. Por exemplo, no método de rompimento do gene, uma sequência de ácido nucléico que corresponde a sequência de nucleotídeo endógena é mutagenizada in vitro para produzir uma sequência de ácido nucléico defeituoso que é então transformado na célula precursora para produzir um gene defeituoso. Pela recombinação homóloga, a sequência de ácido nucléico defeituoso substitui a sequência de nucleotídeo endógena. Pode ser desejável que a sequência de nucleotídeo defeituosa também codifica um marcador que pode ser usado pela seleção dos transformantes em que uma sequência de nucleotídeo foi modificada ou destruída. Em um aspecto particularmente preferido, a sequência de nucleotídeo é rompida com um marcador selecionável tal como aqueles descritos nestes.

Altemativamente, modificação ou inativação de uma sequência de nucleotídeo pode ser realizada pelo anti-sentido estabelecido ou técnicas RNAi usando uma sequência complementar a uma sequência de nucleotídeo. Mais especificamente, expressão de uma sequência de nucleotídeo por uma célula pode ser reduzida ou eliminada pela introdução de uma sequência complementar a uma sequência de nucleotídeo do gene que pode ser transcrito na célula e é capaz de hibridizar ao mRNA produzido na célula. Sob as condições que permitem a sequência de nucleotídeo antisentido complementar para hibridizar ao mRNA, a quantidade da proteína traduzida é deste modo reduzida ou eliminada.

A presente invenção ainda diz respeito a uma célula mutante de uma célula precursora que compreende um rompimento ou anulação de uma sequência de nucleotídeo que codifica o polipeptídeo ou uma sequência controle deste, que resulta na célula mutante que produz menos do polipeptídeo ou nenhum polipeptídeo comparado a célula precursora.

As células mutantes deficientes de polipeptídeo deste modo criados são particularmente úteis como células hospedeiras para a expressão de polipeptídeos heterólogos e/ou naturais. Portanto, a presente invenção ainda diz respeito a métodos de produzir um polipeptídeo heterólogo ou natural, que compreende: (a) cultivar a célula mutante sob condições condutivas para a produção do polipeptídeo e (b) recuperação do polipeptídeo. O termo “polipeptídeos heterólogos” é definido aqui como polipeptídeos que não são naturais a célula hospedeira, uma proteína natural em que as modificações foram feitas para alterar a sequência natural, ou uma proteína natural cuja expressão é quantitativamente alterada como um resultado de uma manipulação da célula hospedeira pelas técnicas de DNA recombinantes.

Em um aspecto adicional, a presente invenção diz respeito a um método de produzir um produto de proteína essencialmente livre de atividade de alfa-glucuronidase pela fermentação de uma célula que produz ambos um polipeptídeo da presente invenção bem como o produto de proteína de interesse pela adição de uma quantidade efetiva de um agente capaz de inibir a atividade de alfa-glucuronidase ao caldo de fermentação antes, durante ou após a fermentação ser finalizada, recuperação do produto de interesse a partir do caldo de fermentação e opcionalmente submeter o produto recuperado pela purificação adicional.

Em um aspecto adicional, a presente invenção diz respeito a um método de produzir um produto de proteína essencialmente livre de atividade de alfa-glucuronidase para cultivar a célula sob condições permitindo a expressão do produto, submetendo o caldo de cultura resultante a um pH combinado e tratamento de temperatura a fim de reduzir a atividade de alfa-glucuronidase substancialmente e recuperação do produto a partir do caldo de cultura. Alternativamente, o pH combinado e tratamento de temperatura podem ser realizados em uma preparação de enzima recuperada a partir do caldo de cultura. O pH combinado e tratamento de temperatura podem ser opcionalmente usados em combinação com um tratamento com um inibidor de alfa-glucuronidase.

De acordo com este aspecto da invenção, é possível remover pelo menos 60 %, preferivelmente pelo menos 75 %, mais preferivelmente pelo menos 85 %, ainda mais preferivelmente pelo menos 95 % e mais preferivelmente pelo menos 99 % da atividade de alfa-glucuronidase. A remoção completa da atividade de alfa-glucuronidase pode ser obtida pelo uso deste método.

O pH combinado e tratamento de temperatura são preferivelmente realizados em um pH na faixa de 2-4 ou 9-11 e uma temperatura na faixa de pelo menos 60 a 70° C por um período suficiente de tempo para atingir o efeito desejado, onde tipicamente, 30 a 60 minutos é suficiente.

Os métodos usados para o cultivo e purificação do produto de interesse podem ser realizados pelos métodos conhecidos na técnica.

Os métodos da presente invenção para a produção de um produto essencialmente de alfa-glucuronidase é de interesse particular na produção de polipeptídeos eucarióticos, em particular proteínas fungicas tal como enzimas. A enzima pode ser selecionada de, por exemplo, uma enzima amilolítica, enzima lipolítica, enzima proteolítica, enzima celulolítica, oxidoredutase, ou enzima de degradação da parede celular vegetal. Exemplos de tais enzimas incluem uma aminopeptidase, amilase, amiloglucosidase, carboidrase, carboxipeptidase, catalase, celobioidrolase, celulase, chitinase, cutinase, glicosiltransferase ciclodextrina, desoxiribonuclease, endoglucanase, esterase, galactosidase, beta-galactosidase, glucoamilase, glicose oxidase, glucosidase, haloperoxidase, hemicelulase, invertase, isomerase, lacase, ligase, lipase, liase, manosidase, oxidase, enzima pectinolítica, peroxidase, fitase, fenoloxidase, polifenoloxidase, enzima proteolítica, ribonuclease, transferase, transglutaminase, ou xilanase. As células deficientes de alfaglucuronidase também podem ser usadas para expressar as proteínas heterólogas do interesse farmacêutico tal como hormônios, fatores de desenvolvimento, receptores e outros.

Será entendido que o termo “polipeptídeos eucarióticos” não inclui apenas polipeptídeos naturais, mas também aqueles polipeptídeos, por exemplo, enzimas, que foram modificados pelas substituições, anulações ou adições de aminoácido, ou outras tais modificações para intesificar a atividade, termoestabilidade, tolerância de pH e outros.

Em um aspecto adicional, a presente invenção diz respeito a um produto de proteína essencialmente livre atividade de alfa-glucuronidase que é produzida por um método da presente invenção.

Métodos de inibição da expressão de um polipeptídeo tendo atividade de alfa-glucuronidase

A presente invenção também diz respeito a métodos de inibir a expressão de um polipeptídeo tendo atividade de alfa-glucuronidase em uma célula, que compreende administrar à célula ou expressar na célula uma molécula de RNA (dsRNA) de filamento duplo, em que o dsRNA compreende uma subsequência de um polinucleotídeo da presente invenção. Em um aspecto preferido, o dsRNA é cerca de 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25 ou mais duplexes de nucleotídeos de comprimento.

O dsRNA é preferivelmente um RNA (siRNA) de interferência pequena ou um micro RNA (miRNA). Em um aspecto preferido, o dsRNA é RNA (siRNAs) de interferência pequena para inibição de transcrição. Em outro aspecto preferido, o dsRNA é micro RNA (miRNAs) para inibição de tradição.

A presente invenção também diz respeito a tais moléculas de

RNA (dsRNA) filamentado duplo, que compreende uma porção do polipeptídeo maduro que codifica a sequência da SEQ ID N°: 1 para inibição da expressão de um polipeptídeo em uma célula. Enquanto a presente invenção não é limitada por qualquer mecanismo particular de ação, o dsRNA pode entrar uma célula e causa a degradação de um RNA filamentada simples (ssRNA) das sequências idênticas ou similares, incluindo mRNAs endógenos. Quando uma célula é exposta ao dsRNA, mRNA a partir de um gene heterólogo é seletivamente degradado por um processo denominado interferência de RNA (RNAi).

Os dsRNAs da presente invenção podem ser usados no silenciamento do gene. Em um aspecto, a invenção fornece os métodos para degradar seletivamente o RNA usando os dsRNAis da presente invenção. O processo pode ser praticado in vitro, ex vivo ou in vivo. Em um aspecto, as moléculas de dsRNA podem ser usados para gerar uma mutação de perda de função em uma célula, um órgão ou um animal. Os métodos para fabricação e uso moléculas de dsRNA para degradar seletivamente o RNA são bem conhecidas na técnica; ver, por exemplo, Patente U.S. N°. 6.506.559; Patente U.S. N°. 6.511.824; Patente U.S. N°. 6.515.109 e Patente U.S. N°. 6.489.127.

Composições

A presente invenção também diz respeito a composições que compreende um polipeptídeo da presente invenção. Preferivelmente, as composições são enriquecidas em um tal polipeptídeo. O termo “enriquecido” indica que a atividade de alfa-glucuronidase da composição foi aumentada, por exemplo, com um fator de enriquecimento de pelo menos 1.1.

A composição pode compreender um polipeptídeo da presente invenção como o maior componente enzimático, por exemplo, uma monocomposição de componente. Alternativamente, a composição pode compreender atividades enzimáticas múltiplas, tal como uma aminopeptidase, amilase, carboidrase, carboxipeptidase, catalase, celulase, chitinase, cutinase, glicosiltransferase ciclodextrina, desoxiribonuclease, esterase, alfagalactosidase, beta-galactosidase, glucoamilase, alfa-glucosidase, betaglucosidase, haloperoxidase, invertase, lacase, lipase, manosidase, oxidase, enzima pectinolítica, peptidoglutaminase, peroxidase, fitase, polifenoloxidase, enzima proteolítica, ribonuclease, transglutaminase, ou xilanase. As enzimas adicionais podem ser produzidas, por exemplo, por um microorganismo pertencente ao gênero Aspergillus, preferivelmente Aspergillus aculeatus, Aspergillus awamori, Aspergillus fumigatus, Aspergillus foetidus, Aspergillus japonicus, Aspergillus nidulans, Aspergillus niger, ou Aspergillus oryzae',

Fusarium, preferivelmente Fusarium bactridioides, Fusarium cerealis, Fusarium crookwellense, Fusarium culmorum, Fusarium graminearum, Fusarium graminum, Fusarium heterosporum, Fusarium negundi, Fusarium oxysporum, Fusarium reticulatum, Fusarium roseum, Fusarium sambucinum, Fusarium sarcochroum, Fusarium sulphureum, Fusarium toruloseum,

Fusarium trichothecioides, ou Fusarium venenatum’, Humicola, preferivelmente Humicola insolens ou Humicola lanuginosa', ou Trichoderma, preferivelmente Trichoderma harzianum, Trichoderma koningii, Trichoderma longibrachiatum, Trichoderma reesei, ou Trichoderma viride.

As composições de polipeptídeos podem ser preparadas de acordo com os métodos conhecidos na técnica e podem ser na forma de uma composição seca ou líquida. Por exemplo, a composição de polipeptídeo pode ser na forma de um granulado ou um microgranulado. O polipeptídeo a ser incluído na composição pode ser estabelecido de acordo com os métodos conhecidos na técnica.

Os exemplos são dados abaixo dos usos preferidos das composições de polipeptídeos da invenção. A dosagem de uma composição de polipeptídeo da invenção e outras condições sob o qual uma composição é usada pode ser determinada na base dos métodos conhecidos na técnica.

Usos

A presente invenção é também direcionada aos métodos de uso dos polipeptídeos tendo atividade de alfa-glucuronidase, ou composições destes. Os polipeptídeos da presente invenção podem ser usados para a degradação ou conversão das paredes celulares vegetais ou qualquer material contendo xilano, por exemplo, lignocelulose, originando-se das paredes das células vegetais (ver, por exemplo, WO 2002/18561). Exemplos de vários usos são descritos abaixo. A dosagem dos polipeptídeos da presente invenção e outras condições sob o qual os polipeptídeos são usados podem ser determinadas na base dos métodos conhecidos na técnica.

A degradação enzimática de um material contendo xilano é facilitada pela remoção parcial ou total das ramificações secundárias. Os polipeptídeos da presente invenção são preferivelmente usados em conjunção com outras enzimas de degradação de xilano tal como xilanases, acetilxilano esterases, arabinofuranosidases, xilosidases, feruloil esterases, glucuronidases e uma combinação destes, no processo em que material contendo xilano será degradado. Por exemplo, grupos de acetila podem ser removidos por acetilxilano esterases; grupos de arabinose por alfa-arabinosidases; grupos de feruloila por feruloil esterases e grupos de ácido glucurônico por alfaglucuronidases. Os oligômeros liberados pelas xilanases, ou por uma combinação de xilanases e enzimas de hidrolização de ramificação secundária, ainda pode ser degradado pela xilose livre por beta-xilosidases.

A presente invenção também diz respeito a métodos para degradação ou converter um material celulósico ou contendo xilano, que compreende: tratar o material celulósico ou contendo xilano com uma composição enzimática na presença de um polipeptídeo tendo atividade de alfa-glucuronidase da presente invenção. Em um aspecto preferido, o método ainda compreende recuperação de um material celulósico degradado ou convertido ou contendo xilano.

A presente invenção também diz respeito a métodos para a produção de um produto de fermentação, que compreende: (a) sacarificar a um material celulósico ou contendo xilano com uma composição enzimática na presença de um polipeptídeo tendo atividade de alfa-glucuronidase da presente invenção; (b) fermentar o material celulósico sacarificado ou contendo xilano com um ou mais microorganismos fermentadores para produzir o produto de fermentação e (c) recuperar o produto de fermentação da fermentação.

A presente invenção também diz respeito a métodos de fermentação de um material celulósico ou contendo xilano, que compreende: fermentar o material celulósico ou contendo xilano com um ou mais microorganismos fermentadores, em que o material celulósico ou contendo xilano é sacarificado com uma composição enzimática na presença de um polipeptídeo tendo atividade de alfa-glucuronidase da presente invenção. Em um aspecto preferido, a fermentação do material celulósico ou contendo xilano produz um produto de fermentação. Em outro aspecto preferido, o método ainda compreende recuperar o produto de fermentação da fermentação.

Os métodos da presente invenção podem ser usados para sacarificar um material celulósico ou contendo xilano aos açúcares fermentáveis e converter os açúcares fermentáveis por muitas substâncias úteis, por exemplo, combustível, etanol potável, e/ou produtos de fermentação (por exemplo, ácidos, álcoois, cetonas, gases e outros). A produção de um produto de fermentação desejado de um material celulósico ou contendo xilano tipicamente envolve pré-tratamento, hidrólise enzimática (sacarificação) e fermentação.

O processo de um material celulósico ou contendo xilano de acordo com a presente invenção pode ser acompanhado usando processos convencionais na técnica. Além disso, os métodos da presente invenção podem ser implementados usando qualquer mecanismo do processo de biomassa convencional configurado para operar de acordo com a invenção.

A hidrólise (sacarificação) e fermentação, separado ou simultâneo, incluem, mas não são limitados a, hidrólise separada e fermentação (SHF); sacarificação simultânea e fermentação (SSF); sacarificação simultânea e co-fermentação (SSCF); hidrólise híbrida e fermentação (HHF); hidrólise separada e co-fermentação (SHCF); hidrólise híbrida e fermentação (HHCF) e conversão microbiana direta (DMC). SHF usa etapas de processo separado para hidrolizar primeiro enzimaticamente um material celulósico ou contendo xilano aos açúcares fermentáveis, por exemplo, glicose, celobiose, celotriose e açúcares de pentose e então fermentam aos açúcares fermentáveis ao etanol. Em SSF, a hidrólise enzimática de um material celulósico ou contendo xilano e a fermentação de açúcares ao etanol são combinadas em uma etapa (Philippidis, G. P., 1996, Cellulose bioconversion technology, in Handbook on Bioethanol: Production and Utilization, Wyman, C. E., ed., Taylor & Francis, Washington, DC, 179212). SSCF envolve a co-fermentação de açúcares múltiplos (Sheehan, J. e Himmel, M., 1999, Enzyme, energy and the environment: A strategic perspective on the U.S. Department of Energy’s research and development activitíes for bioethanol, Biotechnol. Prog. 15: 817-827). HHF envolve uma etapa de hidrólise separada e além disso, uma sacarificação simultânea e etapa de hidrólise, que pode ser realizado no mesmo reator. As etapas em um processo HHF podem ser realizadas em temperaturas diferentes, isto é, sacarificação enzimática de temperatura alta seguido por SSF em uma temperatura inferior que a cepa de fermentação pode ser tolerada. DMC combina todos os três processos (produção de enzima, hidrólise e fermentação) em uma ou mais etapas onde o mesmo organismo é usado para produzir uma enzima para conversão do material celulósico ou contendo xilano aos açúcares fermentáveis e para converter aos açúcares fermentáveis em um produto final (Lynd, L. R., Weimer, P. J., van Zila, W. H. e Pretorius, I. S., 2002, Microbial cellulose utilization: Fundamentais and biotechnology, Microbiol. Mol. Biol. Reviews 66: 506-577). E entendido neste que qualquer método conhecido na técnica que compreende pré-tratamento, hidrólise enzimática (sacarificação), fermentação, ou uma combinação destes pode ser usado na prática dos métodos da presente invenção.

Um mecanismo convencional pode incluir um reator agitado por batelada de alimentação, um reator agitado por batelada, um reator agitado de fluxo contínuo com ultrafiltração, e/ou um reator de coluna de fluxo de tampão contínuo (Fernanda de Castilhos Corazza, Flávio Faria de Moraes, Gisella Maria Zanin and Ivo Neitzel, 2003, Optimal control in fedbatch reactor for the cellobiose hidrolysis, Acta Scientiarum. Technology 25: 33-38; Gusakov, A. V. e Sinitsyn, A. P., 1985, Kinetics of a Cellulose hidrolysis: 1. A mathematical model for a batch reactor process, Enz. Microb. Technol. Ύ. 346-352), um reator de atrito (Ryu, S. K. e Lee, J. M., 1983, Bioconversion of waste cellulose by using a attrition bioreactor, Biotechnol. Bioeng. 25: 53-65), ou um reator com agitação intensiva induzida por um campo eletromagnético (Gusakov, A. V., Sinitsyn, A. P., Davydkin, L Y., Davydkin, V. Y., Protas, Ο. V., 1996, Enhancement of enzymatic cellulose hidrolysis using a novel type of bioreactor with intensive stirring induced by electromagnetic field, Appl. Biochem. Biotechnol. 56: 141-153). Os tipos de reatores adicionais incluem: reatores do tipo imobilizado e extrisora, de manta ascendente de leito fluidizado por hidrólise e/ou fermentação.

Pré-tratamento. Na prática dos métodos da presente invenção, qualquer processo de pré-tratamento conhecido na técnica podem ser usados para romper os componentes da parede celular vegetal do celulósico e/ou material contendo xilano (Chandra et al., 2007, Substrate pretreatment: The key to effective enzymatic hidrolysis de lignocellulosics? Adv. Biochem. Engin./Biotechnol. 108: 67-93; Galbe and Zacchi, 2007, Pretreatment of lignocellulosic materiais for efficient bioethanol production, Adv. Biochem. Engin. / Biotechnol. 108: 41-65; Hendriks and Zeeman, 2009, Pretreatments to enhance the digestibility of lignocellulosic biomass, Bioresource Technol. 100: 10-18; Mosier et al., 2005, Features of promising technologies for pretreatment of lignocellulosic biomass, Bioresource Technol. 96: 673-686; Taherzadeh and Karimi, 2008, Pretreatment of lignocellulosic wastes to improve ethanol and biogas production: A review, Int. J. of Mol. Sci. 9: 16211651; Yang and Wyman, 2008, Pretreatment: the key to unlocking low-cost cellulosic ethanol, Biofuels Bioproducts and Biorefining-Biofpr. 2: 26-40).

Um material celulósico ou contendo xilano também pode ser submetido a redução do tamanho de partícula, pré-saturação, umectação, lavagem, ou condicionamento antes do pré-tratamento usando-se métodos conhecidos na técnica.

Os pré-tratamentos convencionais incluem, mas não são limitados a, pré-tratamento de vapor (com ou sem explosão), pré-tratamento do ácido diluído, pré-tratamento de água quente, pré-tratamento alcalino, prétratamento com cal, oxidação úmida, explosão úmida, explosão de fibra de amônia, pré-tratamento com organosolv e pré-tratamento biológico. Os prétratamentos adicionais incluem percloração de amônia, ultrassom, eletroporação, microonda, CO₂ supercrítico, H₂O supercrítico, ozônio e prétratamentos de irradiação gama.

Um material celulósico ou contendo xilano pode ser prétratado antes da hidrólise e/ou fermentação. O pré-tratamento é preferivelmente realizado antes da hidrólise. Alternativamente, o prétratamento pode ser realizado simultaneamente com hidrólise de enzima para liberar açúcares fermentáveis, tal como glicose, xilose, e/ou celobiose. Em mais casos a etapa de pré-tratamento por si só resulta em alguma conversão de biomassa aos açúcares fermentáveis (ainda na ausência de enzimas).

Pré-tratamento de vapor. No pré-tratamento de vapor, um material celulósico ou contendo xilano é aquecido para romper os componentes da parede celular vegetal, incluindo lignina, hemicelulose e celulose para fabricar a celulose e outras frações, por exemplo, hemicelulose, acessíveis a enzimas. Um material celulósico ou contendo xilano é passado através de um recipiente de reação onde o vapor é injetado para aumentar a temperatura a temperatura e pressão requerida e é retida neste para o período de reação desejado. Pré-tratamento de vapor é preferivelmente feito a 140 a 230° C, mais preferivelmente 160 a 200° C e mais preferivelmente 170 a 190° C, onde a ótima faixa de temperatura depende de qualquer adição de um catalisador químico. O período de residência para o pré-tratamento de vapor é preferivelmente 1 a 15 minutos, mais preferivelmente 3 a 12 minutos e mais preferivelmente 4 a 10 minutos, onde o ótimo período de residência depende da faixa de temperatura e qualquer adição de um catalisador químico. O prétratamento de vapor permite os carregamentos dos sólidos relativamente altos, de modo que um material celulósico ou contendo xilano é geralmente apenas úmido durante o pré-tratamento. O pré-tratamento de vapor é frequentemente combinado com uma descarga explosiva do material após o pré-tratamento, que é conhecido como explosão de vapor, isto é, retirando-se rapidamente a pressão atmosférica e fluxo turbulento do material para aumentar a área de superfície acessível pela fragmentação (Duff and Murray, 1996, Bioresource Technology 855: 1-33; Galbe and Zacchi, 2002, Appl. Microbiol. Biotechnol. 59: 618-628; Pedido de Patente U.S. N°. 20020164730). Durante o prétratamento de vapor, os grupos hemicelulose de acetila são clivados e o ácido resultante autocatalisa a hidrólise de hemicelulose parcial aos monossacarídeos e oligossacarídeos. A lignina é removida apenas pela extensão limitada.

Um catalisador tal como H2SO4 ou SO2 (tipicamente 0,3 a 3 % p/p) é frequentemente adicionado antes do pré-tratamento de vapor, que diminui o período e temperatura, aumenta a recuperação e melhora a hidrólise enzimática (Ballesteros et al., 2006, Appl. Biochem. Biotechnol. 129-132: 496-508; Varga et al., 2004, Appl. Biochem. Biotechnol. 113-116: 509-523; Sassner et al., 2006, Enzyme Microb. Technol. 39: 756-762).

Pré-tratamento clínico: O termo “tratamento clínico” refere-se a qualquer pré-tratamento clínico que promove a separação e/ou liberação de celulose, hemicelulose, e/ou lignina. Exemplos dos processos de prétratamento clínico adequado incluem, por exemplo, pré-tratamento do ácido diluído, pré-tratamento com cal, oxidação úmida, explosão de congelamento/fibra de amônia (AFEX), percolação de amônia (APR) e prétratamentos de organosolve.

No pré-tratamento do ácido diluído, um material celulósico ou contendo xilano é misturado com ácido diluído, tipicamente H2SO4 e água para formar uma pasta, aquecido pelo vapor a uma temperatura desejada e após um período de residência flashed to pressão atmosférica. O prétratamento do ácido diluído pode ser realizada com um número de projetos reatores, por exemplo, reatores de tampão-fluxo, reatores contra corrente, ou reatores de leito de contração contra corrente contínuos (Duff and Murray, 1996, supra·, Schell et al., 2004, Bioresource Technol. 91: 179-188; Lee et al., 1999, Adv. Biochem. Eng. Biotechnol. 65: 93-115).

Diversos métodos de pré-tratamento sob condições alcalinas também podem ser usados. Estes alcalinos de pré-tratamentos incluem, mas não são limitados a, pré-tratamento com cal, oxidação úmida, percolação de amônia (APR) e explosão de congelamento/fibra de amônia (AFEX).

O pré-tratamento com cal é realizado com carbonato de cálcio, hidróxido de sódio, ou amônia em temperaturas baixas de 85 a 150 °C e períodos de residência de 1 hora por diversos dias (Wyman et al., 2005, Bioresource Technol. 96: 1959-1966; Mosier et al., 2005, Bioresource Technol. 96: 673-686). WO 2006/110891, WO 2006/11899, WO 2006/11900 e WO 2006/110901 divulgam os métodos de pré-tratamento usando amônia.

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A oxidação úmida é um pré-tratamento térmico realizada tipicamente a 180 a 200 °C por 5 a 15 minutos com adição de um agente oxidativo tal como peróxido de hidrogênio ou super pressão de oxigênio (Schmidt and Thomsen, 1998, Bioresource Technol. 64: 139-151; Palonen et al., 2004, Appl. Biochem. Biotechnol. 117: 1-17; Varga et al., 2004, Biotechnol. Bioeng. 88: 567-574; Martin et al., 2006, J. Chem. Technol. Biotechnol. 81: 1669-1677). O pré-tratamento é realizado em preferivelmente 1 a 40 % substância seca, mais preferivelmente 2 a 30 % substância seca e mais preferivelmente 5 a 20 % substância seca e frequentemente o pH inicial é aumentado pela adição de álcali tal como carbonato de sódio.

Uma modificação do método de pré-tratamento de oxidação úmida, conhecido como explosão úmida (combinação de oxidação úmida e explosão de vapor), pode manusear a substância seca até 30 %. Na explosão úmida, o agente de oxidação é introduzido durante o pré-tratamento após um certo período de residência. O pré-tratamento é então finalizado pela retirada da pressão atmosférica (WO 2006/032282).

A explosão de fibra de amônia (AFEX) envolve o tratamento de um material celulósico ou contendo xilano com amônia líquida ou gasosa em temperaturas moderadas tal como 90 a 100 °C e pressão alta tal como 17a

20 bar por 5 a 10 minutos, onde o conteúdo da substância seca pode ser tão alto quanto 60 % (Gollapalli et al., 2002, Appl. Biochem. Biotechnol. 98: 2335; Chundawat et al., 2007, Biotechnol. Bioeng. 96: 219-231; Alizadeh et al., 2005, Appl. Biochem. Biotechnol. 121: 1133-1141; Teymouri et al., 2005, Bioresource Technol. 96: 2014-2018). Os resultados do pré-tratamento AFEX na despolimerização da celulose e hidrólise de hemicelulose parcial. Os complexos de carboidrato de lignina são clivados.

O pré-tratamento de organosolve deslignifica um material celulósico ou contendo xilano pela extração usando etanol aquoso (40 a 60 % etanol) a 160 a 200 °C por 30 a 60 minutos (Pan et al., 2005, Biotechnol.

r 'i

Bioeng. 90: 473-481; Pan et al., 2006, Biotechnol. Bioeng. 94: 851-861; Kurabi et al., 2005, Appl. Biochem. Biotechnol. 121: 219-230). O ácido sulfúrico é usualmente adicionado como um catalisador. No pré-tratamento de organosolve, a maioria da hemicelulose é removida.

Outros exemplos de métodos de pré-tratamento adequados são descritos por Schell et al., 2003, Appl. Biochcm. and Biotechnol. Vol. 105108, p. 69-85 e Mosier et al., 2005, Biorcsource Technology 96: 673-686 e Pedido Publicado U.S. 2002/0164730.

Em um aspecto, o pré-tratamento químico é preferivelmente realizado como um tratamento ácido e mais preferivelmente como um tratamento ácido brando e/ou diluído contínuo. O ácido é tipicamente ácido sulfúrico, mas outros ácidos também podem ser usados, tal como ácido acético, ácido cítrico, ácido nítrico, ácido fosfórico, ácido tartárico, ácido succínico, cloreto de hidrogênio, ou misturas destes. O tratamento do ácido brando é conduzido na faixa de pH de preferivelmente 1-5, mais preferivelmente 1-4 e mais preferivelmente 1-3. Em um aspecto, a concentração do ácido está na faixa de preferivelmente 0,01 a 20 % em peso do ácido, mais preferivelmente 0,05 a 10 % em peso do ácido, ainda mais preferivelmente 0,1 a 5 % em peso do ácido e mais preferivelmente 0,2 a 2,0 % em peso do ácido. O ácido é contatado com um material celulósico ou contendo xilano e aquecido em uma temperatura na faixa de preferivelmente 160 a 220 °C e mais preferivelmente 165 a 195 °C, por períodos que variam de segundos a minutos a, por exemplo, 1 segundo a 60 minutos.

Em outro aspecto, o pré-tratamento é realizado como uma etapa de explosão de fibra de amônia (Etapa de pré-tratamento AFEX).

Em outro aspecto, pré-tratamento acontece em uma pasta aquosa. Em aspectos preferidos, um material celulósico ou contendo xilano está presente durante o pré-tratamento nas quantidades preferivelmente entre a 80 % em peso, mais preferivelmente entre 20 a 70 % em peso e mais preferivelmente entre 30 a 60 % em peso, tal como de cerca de 50 % em peso. O material celulósico pré-tratado ou contendo xilano pode ser lavado ou não lavado usando qualquer método conhecido na técnica, por exemplo, lavado com água.

Pré-tratamento mecânico: O termo “pré-tratamento mecânico” refere-se a vários tipos de trituração ou moagem (por exemplo, moagem seca, moagem úmida, ou moagem de esfera vibratória).

Pré-tratamento físico: O termo “pré-tratamento físico” referese a qualquer pré-tratamento que promove a separação e/ou liberação de celulose, hemicelulose, e/ou lignina de um material celulósico ou contendo xilano. Por exemplo, pré-tratamento físico pode envolver a irradiação (por exemplo, irradiação por microondas), vaporização/explosão de vapor, hidrotermólise e combinações destes.

O pré-tratamento físico pode envolver pressão alta e/ou temperatura alta (explosão de vapor). Em um aspecto, pressão alta significa pressão na faixa de preferivelmente cerca de 300 a cerca de 600 psi, mais preferivelmente cerca de 350 a cerca de 550 psi e mais preferivelmente cerca de 400 a cerca de 500 psi, tal como de cerca de 450 psi. Em outro aspecto, temperatura alta significa temperaturas na faixa de cerca de 100 a cerca de

300 °C, preferivelmente cerca de 140 a cerca de 235 °C. Em um aspecto preferido, o pré-tratamento mecânico é realizado em um processo de batelada, sistema hidrolizador de pistola de vapor que usa pressão alta e temperatura alta como definido acima, por exemplo, um hidrolizador Sunds disponível de Sunds Defibrator AB, Sweden.

Pré-tratamento clínico e físico combinado: Um material celulósico ou contendo xilano pode ser pré-tratado tanto fisicamente quanto quimicamente. Por exemplo, a etapa de pré-tratamento pode envolver diluído ou o tratamento do ácido brando e temperatura alta e/ou tratamento de pressão. Os pré-tratamentos clínicos e físicos podem ser realizados sequencialmente ou simultaneamente, como desejado. Um pré-tratamento mecânico também pode ser incluído.

Consequentemente, em um aspecto preferido, um material celulósico ou contendo xilano é submetido ao pré-tratamento físico, químico ou mecânico, ou qualquer combinação destes, para promover a separação e/ou liberação de celulose, hemicelulose, e/ou lignina.

Pré-tratamento biológico: O termo “pré-tratamento biológico” refere-se a qualquer pré-tratamento biológico que promove a separação e/ou liberação de celulose, hemicelulose, e/ou lignina de um material celulósico ou contendo xilano. As técnicas de pré-tratamento biológico podem envolver a aplicação de microorganismos de solubilização de lignina (ver, por exemplo, Hsu, T.-A., 1996, Pretreatment of biomass, in Handbook on Bioethanol: Production and Utilization, Wyman, C. E., ed., Taylor & Francis, Washington, DC, 179-212; Ghosh and Singh, 1993, Physicochemical and biological treatments for enzymatic/microbial conversion do celullosic biomass, Adv. Appl. Microbiol. 39: 295-333; McMillan, J. D., 1994, Pretreating lignocellulosic biomass: a review, in Enzymatic Conversion of Biomass for Fuels Production, Himmel, Μ. E., Baker, J. O. e Overend, R. P., eds., ACS Symposium Series 566, American Chemical Society, Washington,

DC, chapter 15; Gong, C. S., Cao, N. J., Du, J. e Tsáo, G. T., 1999, Ethanol production from renewable resources, in Advances in Biochemical Engineering/Biotechnology, Scheper, T., ed., Springer-Verlag Berlin Heidelberg, Germany, 65: 207-241; Olsson and Hahn-Hagerdal, 1996, Fermentation of lignocellulosic hydrolysates for production of ethanol, Enz.

Microb. Tech. 18: 312-331 e Vallander and Eriksson, 1990, Production of ethanol from lignocellulosic materiais: State of the art, Adv. Biochem. Eng./Biotechnol. 42: 63-95).

Sacarifícação. Na etapa de hidrólise, também conhecido como sacarificação, o material celulósico pré-tratado ou contendo xilano é hidrolizado para quebrar celulose e hemicelulose aos açúcares fermentáveis, tal como glicose, celobiose, xilose, xilulose, arabinose, manose, galactose, e/ou oligossacarídeos solúveis. A hidrólise é realizada enzimaticamente por uma composição de enzima na presença de um polipeptídeo tendo atividade de alfa-glucuronidase da presente invenção. As enzimas das composições também podem ser adicionalmente adicionadas.

A hidrólise enzimática é preferivelmente realizada em um ambiente aquoso sob as condições que já podem ser determinadas por uma pessoa habilitada na técnica. Em um aspecto preferido, hidrólise é realizada sob condições para a atividade de uma enzima, isto é, ótimo para uma enzima. A hidrólise pode ser realizada como uma batelada de alimentação ou processo contínuo onde um material celulósico pré-tratado ou contendo xilano (substrato) é alimentado gradualmente, por exemplo, uma solução de hidrólise contendo enzima.

A sacarificação é geralmente realizada nos reatores e fermentadores de tanque agitados sob pH controlado, temperatura e condições de mistura. O período do processo adequado, temperatura e condições de pH já podem ser determinados por uma pessoa habilitada na técnica. Por exemplo, a sacarificação pode durar até 200 horas, mas é tipicamente realizada por preferivelmente cerca de 12 a cerca de 96 horas, mais preferivelmente cerca de 16 a cerca de 72 horas e mais preferivelmente cerca de 24 a cerca de 48 horas. A temperatura está na faixa de preferivelmente cerca de 25° C a cerca de 70° C, mais preferivelmente cerca de 30° C a cerca de 65° C e mais preferivelmente cerca de 40° C to 60° C, em particular cerca de 50° C. O pH está na faixa de preferivelmente cerca de 3 a cerca de 8, mais preferivelmente cerca de 3,5 a cerca de 7 e mais preferivelmente cerca de 4 a cerca de 6, em particular cerca de pH 5. O conteúdos dos sólidos secos está na faixa de preferivelmente cerca de 5 a cerca de 50 % em peso, mais preferivelmente cerca de 10 a cerca de 40 % em peso e mais preferivelmente cerca de 20 a cerca de 30 % em peso.

Uma composição de enzima preferivelmente compreende as enzimas tendo atividade celulósica e/ou atividade de degradação de xilano. Em um aspecto, uma composição de enzima compreende uma ou mais enzimas de degradação de xilano. Em outro aspecto, uma composição de enzima compreende uma ou mais enzima celulolíticas. Em outro aspecto, uma composição de enzima compreende uma ou mais enzimas de degradação de xilano e uma ou mais enzimas celulolíticas.

Uma ou mais enzimas de degradação de xilano são preferivelmente selecionadas do grupo que consiste de uma xilanase, um acetixilan esterase, um feruloil esterase, uma arabinofuranosidase, uma xilosidase e uma glucuronidase. Uma ou mais enzimas celulolíticas são preferivelmente selecionadas do grupo que consiste de uma endoglucanase, uma celobioidrolase e uma beta-glucosidase.

Em outro aspecto preferido, uma composição de enzima ainda compreende um polipeptídeo tendo atividade de intensificação celulolítica (ver, por exemplo, WO 2005/074647, WO 2005/074656 e WO 2007/089290). Em outro aspecto, uma composição de enzima ainda pode compreender uma ou mais atividades de enzima adicionais para melhorar a degradação do material contendo celulose. As enzimas adicionais preferidas são hemicelulases (por exemplo, alfa-D-glucuronidases, alfa-Larabinofuranosidases, endo-mananases, beta-manosidases, alfagalactosidases, endo-alfa-L-arabinanases, beta-galactosidases), carboidratoesterases (por exemplo, acetil-xilan esterases, acetil-manan esterases, ácido ferúlico esterases, esterases de ácido coumárico, glucuronoil esterases), pectinases, proteases, enzimas ligninolíticas (por exemplo, lacases, manganês peroxidases, lignina peroxidases, enzimas que produzem Η₂Ο₂, oxidoredutases), expansinas, swolleninas, ou misturas destes. Nos métodos da presente invenção, as enzimas adicionais podem ser adicionadas antes ou durante a fermentação, por exemplo, durante a sacarificação ou durante ou após a propagação dos microorganismos de fermentação.

Um ou mais componentes de uma composição de enzima pode ser proteínas de tipo selvagem, proteínas recombinantes, ou uma combinação de proteínas de tipo selvagem e proteínas recombinantes. Por exemplo, um ou mais componentes podem ser proteínas naturais de uma célula, que é usada como uma célula hospedeira para expressar recombinantemente um ou mais (diversos) outros componentes de uma composição de enzima. Um ou mais componentes de uma composição de enzima podem ser produzidas as monocomponentes, que são então combinados para formar uma composição de enzima. Uma composição de enzima pode ser uma combinação das preparações de proteína de monocomponente e multicomponente.

As enzimas usadas nos métodos da presente invenção podem ser em quaisquer formas adequadas para o uso nos processos descritos neste, tal como, por exemplo, um caldo de fermentação bruta com ou sem as células removidas, as preparações de enzimas purificadas ou semi-purificadas, ou uma célula hospedeira como uma fonte das enzimas. Uma composição de enzima pode ser um pó seco ou granulado, um granulado não pó, um líquido, um líquido estabelecido, ou uma enzima protegida estabelecida. As preparações de enzima líquida podem, por exemplo, ser estabelecidas pela adição dos estabilizadores tal como um açúcar, um álcool de açúcar ou outro poliol, e/ou ácido Iático ou outro ácido orgânico de acordo com processos estabelecidos.

As ótimas quantidades das enzimas e polipeptídeos tendo atividade de alfa-glucuronidase dependem de diversos fatores incluindo, mas não limitado a, a mistura de componente das enzimas celulolíticas, o material celulósico ou contendo xilano, a concentração do material celulósico ou contendo xilano, os pré-tratamentos do material celulósico ou contendo xilano, temperatura, tempo, pH e inclusão do organismo de fermentação (por exemplo, levedura para a sacarificação simultânea e fermentação).

Em um aspecto preferido, uma quantidade efetiva da enzima celulolítica(s) e/ou enzimas de degradação de xilano a um material celulósico ou contendo xilano é cerca de 0,5 a cerca de 50 mg, preferivelmente a cerca de 0,5 a cerca de 40 mg, mais preferivelmente a cerca de 0,5 a cerca de 25 mg, mais preferivelmente a cerca de 0,75 a cerca de 20 mg, mais preferivelmente a cerca de 0,75 a cerca de 15 mg, ainda mais preferivelmente a cerca de 0,5 a cerca de 10 mg e mais preferivelmente a cerca de 2,5 a cerca de 10 mg por g de um material celulósico ou contendo xilano.

Em outro aspecto preferido, uma quantidade efetiva dos peptídeos tendo atividade de alfa-glucuronidase a um material celulósico ou contendo xilano é cerca de 0,01 a cerca de 50,0 mg, preferivelmente cerca de 0,01 a cerca de 40 mg, mais preferivelmente cerca de 0,01 a cerca de 30 mg, mais preferivelmente cerca de 0,01 a cerca de 20 mg, mais preferivelmente cerca de 0,01 a cerca de 10 mg, mais preferivelmente cerca de 0,01 a cerca de 5 mg, mais preferivelmente a cerca de 0,025 a cerca de 1,5 mg, mais preferivelmente a cerca de 0,05 a cerca de 1,25 mg, mais preferivelmente a cerca de 0,075 a cerca de 1,25 mg, mais preferivelmente a cerca de 0,1 a cerca de 1,25 mg, ainda mais preferivelmente a cerca de 0,15 a cerca de 1,25 mg e mais preferivelmente a cerca de 0,25 a cerca de 1,0 mg por g de um material celulósico ou contendo xilano.

Em outro aspecto preferido, uma quantidade efetiva dos peptídeos tendo atividade de alfa-glucuronidase as enzimas celulolíticas e/ou enzimas de degradação de xilano é cerca de 0,005 a cerca de 1,0 g, preferivelmente a cerca de 0,01 a cerca de 1,0 g, mais preferivelmente a cerca de 0,15 a cerca de 0,75 g, mais preferivelmente a cerca de 0,15 a cerca de 0,5 g, mais preferivelmente a cerca de 0,1 a cerca de 0,5 g, ainda mais preferivelmente a cerca de 0,1 a cerca de 0,5 g e mais preferivelmente a cerca de 0,05 a cerca de 0,2 g por g das enzimas celulolíticas.

As enzimas podem ser derivadas ou obtidas de qualquer origem adequada, incluindo, bactéria, fungos, levedura, plantas ou origem de mamífero. O termo “obtido” significa neste que uma enzima pode ser isolada a partir de um organismo que naturalmente produz a enzima como uma enzima natural. O termo “obtido” também significa neste que uma enzima pode ser produzida recombinantemente em um organismo hospedeiro que utiliza os métodos descritos neste, em que a enzimas recombinantemente produzida é natural ou estranha ao organismo hospedeiro ou tem uma sequência de aminoácido modificado, por exemplo, tendo um ou mais aminoácidos que são anulados, inseridos e/ou substituídos, isto é, uma enzima recombinantemente produzida isto é um mutante e/ou um fragmento de uma sequência de aminoácido natural ou uma enzima produzida pelos processos de misturação do ácido nucléico conhecido na técnica. Abrangido dentro do significado de uma enzima natural são variantes naturais e dentro do significado de uma enzima estranha são variantes obtidas recombinantemente, tal como pela mutagênese ou misturação direcionada ao local.

Um polipeptídeo tendo atividade de enzima celulolítica ou atividade de degradação de xilano pode ser um polipeptídeo bacteriano. Por exemplo, o polipeptídeo pode ser um polipeptídeo bacteriano gram positivo tal como a Bacillus, Streptococcus, Streptomyces, Staphylococcus, Enterococcus, Lactobacillus, Lactococcus, Clostridium, Geobacillus, ou Oceanobacillus polipeptide tendo atividade de enzima celulolítica ou atividade de degradação de xilano, ou um polipeptídeo bacteriano gram negativo tal como um polipeptídeo E. coli, Pseudomonas, Salmonella, Campylobacter, Helicobacter, Flavobacterium, Fusobacterium, Ilyobacter, Neisseria, ou Ureaplasmum tendo atividade de enzima celulolítica ou atividade de degradação de xilano.

Em um aspecto preferido, o polipeptídeo é um polipeptídeo

Bacillus alkalophilus, Bacillus amiloliquefaciens, Bacillus brevis, Bacillus circulans, Bacillus clausii, Bacillus coagulans, Bacillus firmus, Bacillus lautus, Bacillus lentus, Bacillus licheniformis, Bacillus megaterium, Bacillus pumilus, Bacillus stearothermophilus, Bacillus subtilis, ou Bacillus thuringiensis tendo atividade de enzima celulolítica ou atividade de degradação de xilano.

Em outro aspecto preferido, o polipeptídeo é um polipeptídeo Streptococcus equisimilis, Streptococcus pyogenes, Streptococcus uberis, ou Streptococcus equi subsp. Zooepidemicus tendo atividade de enzima celulolítica ou atividade de degradação de xilano.

Em outro aspecto preferido, o polipeptídeo é um polipeptídeo Streptomyces achromogenes, Streptomyces avermitilis, Streptomyces coelicolor, Streptomyces gr is eus, ou Streptomyces lividans tendo atividade de enzima celulolítica ou atividade de degradação de xilano.

O polipeptídeo tendo atividade de enzima celulolítica ou atividade de degradação de xilano também pode ser um polipeptídeo fungico e mais preferivelmente um polipeptídeo de levedura tal como um polipeptídeo Condida, Kluyveromyces, Pichia, Saccharomyces, Schizosaccharomyces, ou Yarrowíum tendo atividade de enzima celulolítica ou atividade de degradação de xilano; ou mais preferivelmente um polipeptídeo fungico filamentoso tal como um polipeptídeo Acremonium, Agaricus, Alternaria, Aspergillus, Aureobasidium, Botryospaeria, Ceriporiopsis, Chaetomidium,

Chrysosporium, Claviceps, Cochliobolus, Coprinopsis, Coptotermes, Corynascus, Cryphonectria, Cryptococcus, Diplodia, Exidia, Filibasidium, Fusarium, Gibberella, Holomastigotoides, Humicola, Irpex, Lentinula, Leptospaeria, Magnaporthe, Melanocarpus, Meripilus, Mucor, Myceliophthora, Neocallimastix, Neurospora, Paecilomyces, Penicillium, Phanerochaete, Piromyces, Poitrasia, Pseudoplectania,

Pseudotrichonympha, Rhizomucor, Schizophyllum, Scytalidium, Talaromyces,

Thermoascus, Thielavia, Tolypocladium, Trichoderma, Trichophaea,

Verticillium, Volvariella, ou Xilaríum tendo atividade de enzima celulolítica ou atividade de degradação de xilano.

Em um aspecto preferido, o polipeptídeo é um polipeptídeo Saccharomyces carlsbergensis, Saccharomyces cerevisiae, Saccharomyces diastaticus, Saccharomyces douglasii, Saccharomyces kluyveri, Saccharomyces norbensis, ou Saccharomyces oviformis tendo atividade de enzima celulolítica ou atividade de degradação de xilano.

Em outro aspecto preferido, o polipeptídeo é um polipeptídeo Acremonium cellulolyticus, Aspergillus aculeatus, Aspergillus awamori,

Aspergillus fumigatus, Aspergillus foetidus, Aspergillus japonicus, Aspergillus nidulans, Aspergillus niger, Aspergillus oryzae, Chrysosporium keratinophilum, Chrysosporium lucknowense, Chrysosporium tropicum, Chrysosporium merdarium, Chrysosporium inops, Chrysosporium pannicola, Chrysosporium queenslandicum, Chrysosporium zonatum, Fusarium bactridioides, Fusarium cerealis, Fusarium crookwellense, Fusarium culmorum, Fusarium graminearum, Fusarium graminum, Fusarium heterosporum, Fusarium negundi, Fusarium oxysporum, Fusarium reticulatum, Fusarium roseum, Fusarium sambucinum, Fusarium sarcochroum, Fusarium sporotrichioides, Fusarium sulphureum, Fusarium torulosum, Fusarium trichothecioides, Fusarium venenatum, Humicola grisea, Humicola insolens, Humicola lanuginosa, Irpex lacteus, Mucor miehei, Myceliophthora thermophila, Neurospora crassa, Penicillium funiculosum, Penicillium purpurogenum, Phanerochaete chrysosporium, Thielavia achromatica, Thielavia albomyces, Thielavia albopilosa, Thielavia australeinsis, Thielavia fimeti, Thielavia microspora, Thielavia ovispora, Thielavia peruvíana, Thielavia spededonium, Thielavia setosa, Thielavia subthermophila, Thielavia terrestris, Trichoderma harzianum, Trichoderma koningii, Trichoderma longibrachiatum, Trichoderma reesei, Trichoderma viride, ou Trichophaea saccatum tendo atividade de enzima celulolítica ou atividade de degradação de xilano.

Os mutantes projetados por proteína ou quimicamente modificados de polipeptídeos tendo atividade de enzima celulolítica ou atividade de degradação de xilano também podem ser usadas.

Um ou mais componentes de uma composição de enzima pode ser um componente recombinante, isto é, produzido pela clonagem de uma sequência de DNA que codifica o componente simples e célula subsequente transformadas com a sequência de DNA e expressada em um hospedeiro (ver, por exemplo, WO 91/17243 e WO 91/17244). O hospedeiro é preferivelmente um hospedeiro heterólogo (enzima é estranho ao hospedeiro), mas o hospedeiro pode sob certas condições também ser um hospedeiro homólogo (enzima é natural ao hospedeiro). As proteínas celulolíticas de monocomponentes também podem ser preparadas pela purificação de uma tal proteína a partir do caldo de fermentação.

Exemplos das preparações da proteína celulolítica comercial adequadas para o uso na presente invenção incluem, por exemplo, CELLIC™ Ctec (Novozymes A/S), CELLUCLAST™ (Novozymes A/S) e NOVOZYM™ 188 (Novozymes A/S). Outras preparações comercialmente disponíveis que compreende celulase que podem ser usadas incluem CELLUZYME™, CEREFLO™ e ULTRAFLO™ (Novozymes A/S), LAMINEX™ e SPEZYME™ CP (Genencor Int.), ROHAMENT™ 7069 W (Rohm GmbH) e FIBREZYME® LDI, FIBREZYME® LBR, ou VISCOSTAR® 150L (Dyadic International, Inc.). As enzimas de celulase são adicionadas em quantidades efetivas de cerca de 0,001 a cerca de 5,0 % em peso dos sólidos, mais preferivelmente de cerca de 0,025 a cerca de 4,0 % em peso dos sólidos e mais preferivelmente de cerca de 0,005 a cerca de 2,0 % em peso dos sólidos.

Exemplos das endoglucanases bacterianas que podem ser usadas nos métodos da presente invenção, incluem, mas não são limitados a, um Acidothermus cellulolyticus endoglucanase (WO 91/05039; WO 93/15186; Patente U.S. N°. 5,275,944; WO 96/02551; Patente U.S. N°. 5.536.655, WO 00/70031, WO 05/093050); Thermobifida fusca endoglucanase III (WO 05/093050) e Thermobifida fusca endoglucanase V (WO 05/093050).

Exemplos de endoglucanases fungicas que podem ser usadas nos métodos da presente invenção, incluem, mas não são limitados a, a Trichoderma reesei endoglucanase I (Penttila et al., 1986, Gene 45: 253-263; GENBANK™ N°. de acessão Ml5665); Trichoderma reesei endoglucanase II (Saloheimo, et al., 1988, Gene 63:11-22; GENBANK™ N°. de acessão Ml9373); Trichoderma reesei endoglucanase III (Okada et al., 1988, Appl. Environ. Microbiol. 64: 555-563; GENBANK™ N°. de acessão AB003694); Trichoderma reesei endoglucanase IV (Saloheimo et al., 1997, Eur. J. Biochem. 249: 584-591; GENBANK™ N°. de acessão Y11113) e Trichoderma reesei endoglucanase V (Saloheimo et al., 1994, Molecular Microbiology 13: 219-228; GENBANK™ N°. de acessão Z33381); Aspergillus aculeatus endoglucanase (Ooi et al., 1990, Nucleic Acids Research 18: 5884); Aspergillus kawachíi endoglucanase (Sakamoto et al., 1995, Current Genetics 27: 435-439); Erwinia carotovara endoglucanase (Saarilahti et al., 1990, Gene 90: 9-14); Fusarium oxysporum endoglucanase (GENBANK™ N°. de acessão L29381); Humicola grisea var. thermoidea endoglucanase (GENBANK™ N°. de acessão AB003107); Melanocarpus albomyces endoglucanase (GENBANK™ N°. de acessão MAL515703); Neurospora crassa endoglucanase (GENBANK™ N°. de acessão XM_324477); Humicola insolens endoglucanase V; Myceliophthora thermophila CBS 117.65 endoglucanase; basidiomycete CBS 495.95 endoglucanase; basidiomycete CBS 494.95 endoglucanase; Thielavia terrestris NRRL 8126 CEL6B endoglucanase; Thielavia terrestris NRRL 8126 CEL6C endoglucanase); Thielavia terrestris NRRL 8126 CEL7C endoglucanase; Thielavia terrestris NRRL 8126 CEL7E endoglucanase; Thielavia terrestris NRRL 8126 CEL7F endoglucanase; Cladorrhinum foecundissimum ATCC 62373 CEL7A endoglucanase e Trichoderma reesei strain No. VTT-D-80133 endoglucanase (GENBANK™ N°. de acessão

M15665).

Exemplos de celobioidrolases úteis nos métodos da presente invenção incluem, mas não são limitados a, Trichoderma reesei celobioidrolase I; Trichoderma reesei celobioidrolase II; Humicola insolens celobioidrolase I, Myceliophthora thermophila celobioidrolase II, Thielavia terrestris celobioidrolase II (CEL6A), Chaetomium thermophilum celobioidrolase I e Chaetomium thermophilum celobioidrolase II.

Exemplos de beta-glucosidases úteis nos métodos da presente invenção incluem, mas não são limitados a, Aspergillus oryzae betaglucosidase; Aspergillus fumigatus beta-glucosidase; Penicillium brasilianum

IBT 20888 beta-glucosidase; Aspergillus niger beta-glucosidase e Aspergillus aculeatus beta-glucosidase.

O polipeptídeo Aspergillus oryzae tendo atividade betaglucosidase pode ser obtido de acordo com WO 2002/095014. O polipeptídeo Aspergillus fumigatus tendo atividade beta-glucosidase pode ser obtido de acordo com WO 2005/047499. O polipeptídeo Penicillium brasilianum tendo atividade beta-glucosidase pode ser obtido de acordo com WO 2007/019442. O polipeptídeo Aspergillus niger tendo atividade beta-glucosidase pode ser obtido de acordo com Dan et al., 2000, J. Biol. Chem. 275: 4973-4980. O polipeptídeo Aspergillus aculeatus tendo atividade beta-glucosidase pode ser obtido de acordo com Kawaguchi et al., 1996, Gene 173: 287-288.

A beta-glucosidase pode ser uma proteína de fusão. Em um aspecto, o beta-glucosidase é uma proteína de fusão BG Aspergillus oryzae da variante de beta-glucosidase ou a proteína de fusão Aspergillus oryzae de beta-glucosidase obtido de acordo com WO 2008/057637.

Outras endoglucanases, celobioidrolases, e beta-glucosidases são divulgadas em numerosas Famílias de Glicosil Hidrolase usando a classificação de acordo com Henrissat B., 1991, A classification of glycosyl hydrolases based on amino-acid sequence similarities, Biochem. J. 280: 309316 e Henrissat B. e Bairoch A., 1996, Updating the sequence-based classification of glycosyl hydrolases, Biochem. J. 316: 695-696.

Outras enzimas celulolíticas que podem ser usadas na presente invenção são descritas em EP 495.257, EP 531.315, EP 531.372, WO 89/09259, WO 94/07998, WO 95/24471, WO 96/11262, WO 96/29397, WO 96/034108, WO 97/14804, WO 98/08940, WO 98/012307, WO 98/13465, WO 98/015619, WO 98/015633, WO 98/028411, WO 99/06574, WO 99/10481, WO 99/025846, WO 99/025847, WO 99/031255, WO 2000/009707, WO 2002/050245, WO 2002/0076792, WO 2002/101078, WO 2003/027306, WO 2003/052054, WO 2003/052055, WO 2003/052056, WO 2003/052057, WO 2003/052118, WO 2004/016760, WO 2004/043980, WO 2004/048592, WO 2005/001065, WO 2005/028636, WO 2005/093050, WO 2005/093073, WO 2006/074005, WO 2006/117432, WO 2007/071818, WO 2007/071820, WO 2008/008070, WO 2008/008793, Patente U.S. N°. 4,435,307, Patente U.S. N°. 5.457.046, Patente U.S. N°. 5.648.263, Patente U.S. N°. 5.686.593, Patente U.S. N°. 5.691.178, Patente U.S. N°. 5.763.254 Patente U.S. N°. 5.776.757.

Nos métodos da presente invenção, qualquer polipeptídeo tendo atividade de intensificação celulolítica podem ser usados.

Em um primeiro aspecto, o polipeptídeo tendo atividade de intensificação celulolítica compreende os seguintes motivos:

[ILMV]-P-X(4,5)-G-X-Y-[ILMV]-X-R-X-[EQ]-X(4)-[HNQ] e [FW]-[TF]-K-[AIV], em que X é qualquer aminoácido, X(4,5) é qualquer aminoácido a 4 ou 5 posições contínuas e X(4) é qualquer aminoácido a 4 posições contínuas.

O polipeptídeo que compreende os motivos notados acima ainda pode compreender:

H-X(l ,2)-G-P-X(3)-[YW]-[AILMV], [EQ]-X-Y-X(2)-C-X-[EHQN]-[FILV]-X-[ILV], ou

H-X(1,2)-G-P-X(3)-[YW]-[AILMV] e [EQ]-X-Y-X(2)-C-X[EHQN]-[FILV]-X-[ILV], em que X é qualquer aminoácido, X(l,2) é qualquer aminoácido a 1 posição ou 2 posições contínuas, X(3) é qualquer aminoácido a 3 posições contínuas e X(2) é qualquer aminoácido a 2 posições contínuas. Nos motivos acima, a abreviação de aminoácido de letra simples IUPAC aceitado é utilizado.

Em um aspecto preferido, o polipeptídeo tendo atividade de intensificação celulolítica ainda compreende H-X(1,2)-G-P-X(3)-[YW]15 [AILMV]. Em outro aspecto preferido, o polipeptídeo isolado tendo atividade de intensificação celulolítica ainda compreende [EQ]-X-Y-X(2)-C-X[EHQN]-[FILV]-X-[ILV]. Em outro aspecto preferido, o polipeptídeo tendo atividade de intensificação celulolítica ainda compreende H-X(l,2)-G-P-X(3)[YW]-[AILMV] e [EQ]-X-Y-X(2)-C-X-[EHQN]-[FILV]-X-[ILV].

Em um segundo aspecto, o polipeptídeo tendo atividade de intensificação celulolítica compreende o seguinte motivo:

[ILMV]-P-x(4,5)-G-x-Y-[ILMV]-x-R-x-[EQ]-x(3)-A-[HNQ], em que x é qualquer aminoácido, x(4,5) é qualquer aminoácido a 4 ou 5 posições contínuas e x(3) é qualquer aminoácido a 3 posições contínuas. No motivo acima, a abreviação de aminoácido de letra simples IUPAC aceitado é utilizado.

Os exemplos de polipeptídeos tendo atividade de intensificação celulolítica útil nos métodos da presente invenção incluem, mas não são limitados a, polipeptídeos tendo atividade de intensificação celulolítica de Thielavia terrestris (WO 2005/074647); polipeptídeos tendo atividade de intensificação celulolítica de Thermoascus aurantiacus (WO 2005/074656) e polipeptídeos tendo atividade de intensificação celulolítica de Trichoderma reesei (WO 2007/089290).

Exemplos de preparações de enzima de degradação de xilano comercial adequado para o uso na presente invenção incluem, por exemplo, SHEARZYME™ (Novozymes A/S), CELLIC™ Htec (Novozymes A/S), VISCOZYME® (Novozymes A/S), ULTRAFLO® (Novozymes A/S), PULPZYME® HC (Novozymes A/S), MULTIFECT® Xilanase (Genencor),

ECOPULP® TX-200A (AB Enzimas), HSP 6000 Xilanase (DSM), DEPOL™ 333P (Biocatalysts Limit, Wales, UK), DEPOL™ 740L. (Biocatalysts Limit, Wales, UK) e DEPOL™ 762P (Biocatalysts Limit, Wales, UK).

Os exemplos de xilanases úteis nos métodos da presente invenção incluem, mas não são limitados a, Aspergillus aculeatus xilanase (GeneSeqP:AAR63790; WO 94/21785), Aspergillus fumígatus xilanases (WO 2006/078256) e Thielavia terrestris NRRL 8126 xilanases (WO 2009/079210).

Exemplos de beta-xilosidases úteis nos métodos da presente invenção incluem, mas não são limitados a, Trichoderma reesei betaxilosidase (UniProtKB/TrEMBL número de acessão Q92458), Talaromyces emersonii (SwissProt número de acessão Q8X212) e Neurospora crassa (SwissProt número de acessão Q7SOW4).

Exemplos de acetilxilano esterases úteis nos métodos da presente invenção incluem, mas não são limitados a, Hypocrea jecorina acetilxilano esterase (WO 2005/001036), Neurospora crassa acetilxilano esterase (UniProt número de acessão q7s259), Thielavia terrestris NRRL 8126 acetilxilano esterase (WO 2009/042846), Chaetomium globosum acetilxilano esterase (Uniprot número de acessão Q2GWX4), Chaetomium gracile acetilxilano esterase (GeneSeqP número de acessão AAB82124), Phaeosphaeria nodorum acetilxilano esterase (Uniprot número de acessão Q0UHJ1) e Humicola insolens DSM 1800 acetilxilano esterase (WO 2009/073709).

Exemplos de ácido ferúlico esterases úteis nos métodos da presente invenção incluem, mas não são limitados a, Humicola insolens DSM 1800 feruloil esterase (WO 2009/076122), Neurospora crassa feruloil esterase (UniProt número de acessão Q9HGR3) e Neosartorya fischeri feruloil esterase (UniProt Número de acessão A1D9T4).

Exemplos de arabinofuranosidases úteis nos métodos da presente invenção incluem, mas não são limitados a, Humicola insolens DSM 1800 arabinofúranosidase (WO 2009/073383) e Aspergillus niger arabinofúranosidase (GeneSeqP número de acessão AAR94170).

Exemplos de alfa-glucuronidases úteis nos métodos da presente invenção incluem, mas não são limitados a, Aspergillus clavatus alfa-glucuronidase (UniProt número de acessão alce 12), Trichoderma reesei alfa-glucuronidase (Uniprot número de acessão Q99024), Talaromyces emersonii alfa-glucuronidase (UniProt número de acessão Q8X211), Aspergillus niger alfa-glucuronidase (Uniprot número de acessão Q96WX9), Aspergillus terreus alfa-glucuronidase (SwissProt número de acessão Q0CJP9) e Aspergillus fumigatus alfa-glucuronidase (SwissProt número de acessão Q4WW45).

As enzimas e proteínas usadas nos métodos da presente invenção podem ser produzidas pela fermentação das cepas microbianas notadas acima em um meio nutriente contendo carbono adequado e fontes de nitrogênio e sais inorgânicos, usando procedimentos conhecido na técnica (ver, por exemplo, Bennett, J.W. and LaSure, L. (eds.), More Gene Manipulations in Fungi, Academic Press, CA, 1991). Os meios adequados são disponíveis de fornecedores comerciais ou pode ser preparada de acordo com composições publicadas (por exemplo, em catálogos de American Type Culture Collection). As faixas de temperaturas e outras condições adequadas para o desenvolvimento e produção de enzima são conhecidos na técnica (ver, por exemplo, Bailey, J.E. e Ollis, D.F., Biochemical Engineering Fundamentais, McGraw-Hill Book Company, NY, 1986).

A fermentação pode ser qualquer método de cultivo de uma célula resultando na expressão ou isolamento de uma enzima. Fermentação pode ser portanto, entendida como que compreende cultivo de frasco por agitação, ou fermentação em escala ampla ou menor (incluindo batelada por alimentação, batelada contínua, ou fermentações em estado sólido) nos fermentadores industriais ou de laboratórios realizada em um meio adequado e sob condições permitem uma enzima ser expressada ou isolada. As enzimas resultantes produzidas pelos métodos descritos acima pode ser recuperadas a partir do meio de fermentação e purificadas pelos procedimentos convencionais.

Fermentação. Os açúcares fermentáveis obtidos a partir de um material celulósico hidrolizado e pré-tratado ou contendo xilano pode ser fermentado por uma ou mais microorganismos fermentadores capazes de fermentar os açúcares diretamente ou indiretamente em um produto de fermentação desejado. “Fermentação” ou “processo de fermentação” refere-se a qualquer processo de fermentação ou qualquer processo que compreende uma etapa de fermentação. Processo de fermentações também inclui os processos de fermentação usados na indústria de álcool consumível (por exemplo, cerveja e vinho), indústria de laticínios (por exemplo, produtos de laticínicos fermentados), indústria de couro e indústria de tabaco. As condições de fermentação dependem do produto de fermentação desejado e organismo de fermentação e já pode ser facilmente determinado por uma pessoa habilitada na técnica.

Na etapa de fermentação, açúcares liberados de um material celulósico ou contendo xilano como um resultado do pré-tratamento e etapas de hidrólise enzimática, são fermentados a um produto, por exemplo, etanol, por um organismo de fermentação, tal como levedura. Hidrólise (sacarificação) e fermentação podem ser separadas ou simultâneas, como descritas neste.

Qualquer material celulósico hidrolisado adequado ou contendo xilano podem ser usados na etapa de fermentação na prática da presente invenção. O material é geralmente selecionado com base no produto de fermentação desejado, isto é, a substância a ser obtida a partir da fermentação e o processo utilizado, como é bem conhecido na técnica.

O termo “meio de fermentação” é entendido neste referir a um meio antes dos microorganismos de fermentação são adicionados, tal como, um meio resultante a partir de um processo de sacarificação, bem como um meio usado na sacarificação simultânea e processo de fermentação (SSF).

O “microorganismo de fermentação” refere-se a qualquer microorganismo, incluindo organismos fungicos e bacterianos, adequados para o uso no processo de fermentação desejado para produzir um produto de fermentação. O organismo de fermentação podem ser organismos de fermentação C₆ e/ou C5, ou uma combinação destes. Organismos de fermentação tanto C<, quanto C₅ são bem conhecidas na técnica. Os microorganismos fermentadores adequados são capazes de fermentar, isto é, converter açúcares, tal como glicose, xilose, xilulose, arabinose, maltose, manose, galactose, ou oligossacarídeos, diretamente ou indiretamente no produto de fermentação desejado.

Exemplos de organismos de fermentação bacterianos e fungicos produzindo etanol são descritos por Lin et al., 2006, Appl. Microbiol. Biotechnol. 69: 627-642.

Exemplos de microorganismos fermentadores que podem fermentar açúcares C6 incluem organismos fungicos e bacterianos, tal como levedura, a levedura preferida inclui as cepas de Saccharomyces spp., preferivelmente Saccharomyces cerevisiae.

Exemplos de organismos de fermentação que podem fermentar açúcares C5 incluem organismos fungicos e bacterianos, tal como levedura. A levedura de fermentação C5 incluem as cepas de Pichia, preferivelmente Pichia stipitis, tal como Pichia stipitis CBS 5773; cepas de Candida, preferivelmente Candida boidinii, Candida brassicae, Candida shcatae, Candida diddensii, Candida pscudotropicalis, ou Candida utilis.

Outros organismos de fermentação incluem cepas de Zymomonas, tal como Zymomonas mobilis', Hansenula, tal como Hansenula anômala’, Kluyveromyces, tal como K fragilis’, Schizosaccharomyces, tal como S. pombe e E. coli, especialmente cepas de E. coli que foram geneticamente modificados para melhorar a produção de etanol.

Em um aspecto preferido, a levedura é Saccharomyces spp. em um aspecto mais preferido, a levedura é Saccharomyces cerevisiae. Em outro aspecto mais preferido, a levedura é Saccharomyces distaticus. Em outro aspecto mais preferido, a levedura é Saccharomyces uvarum. Em outro aspecto preferido, a levedura é a Kluyveromyces. Em outro aspecto mais preferido, a levedura é Kluyveromyces marxianus. Em outro aspecto mais preferido, a levedura é Kluyveromyces fragilis. Em outro aspecto preferido, a levedura é Candida. Em outro aspecto mais preferido, a levedura é Candida boidinii. Em outro aspecto mais preferido, a levedura é Candida brassicae. Em outro aspecto mais preferido, a levedura é Candida diddensii. Em outro aspecto mais preferido, a levedura é Candida pseudotropicalis. Em outro aspecto mais preferido, a levedura é Candida utilis. Em outro aspecto preferido, a levedura é Clavispora. Em outro aspecto mais preferido, a levedura é Clavispora lusitaniae. Em outro aspecto mais preferido, a levedura é Clavispora opuntiae. Em outro aspecto preferido, a levedura é Pachysolen. Em outro aspecto mais preferido, a levedura é Pachysolen tannophilus. Em outro aspecto preferido, a levedura é Pichia. Em outro aspecto mais preferido, a levedura é Pichia stipitis. Em outro aspecto preferido, a levedura é Bretannomyces. Em outro aspecto mais preferido, a levedura é Bretannomyces clausenii (Philippidis, G. P., 1996, Cellulose bioconversion technology, in Handbook on Bioethanol: Production and Utilization, Wyman, C. E., ed., Taylor & Francis, Washington, DC, 179-212).

A bactéria que pode eficientemente fermentar hexose e pentose ao etanol incluem, por exemplo, Zymomonas mobilis e Clostridium thermocellum (Philippidis, 1996, supra).

Em um aspecto preferido, a bactéria é um Zymomonas. Em um aspecto mais preferido, a bactéria é Zymomonas mobilis. Em outro aspecto preferido, a bactéria é um Clostridium. Em outro aspecto mais preferido, a bactéria é Clostridium thermocellum.

A levedura comercialmente disponível adequada para a produção de etanol inclui, por exemplo, levedura ETANOL RED™ (disponível de Fermentis/Lesaffre, USA), FALI™ (disponível de Fleischmann’s Yeast, USA), SUPERSTART™ e levedura fresca THERMOSACC™ (disponível de Etanol Technology, WI, USA), BIOFERM™ AFT e XR (disponível de NABC - North American Bioproducts Corporation, GA, USA), GERT STRAND™ (disponível de Gert Strand AB, Sweden) e FERMIOL™ (disponível de DSM Specialties).

Em um aspecto preferido, o microorganismo de fermentação foi geneticamente modificado para fornecer a capacidade de fermentar açúcares de pentose, tal como xilose utilizando, arabinose utilizando e xilose e arabinose co-utilizando microorganismos.

A clonagem dos genes heterólogos em vários microorganismos fermentadores tem levado a construção dos organismos capazes de converter hexoses e pentoses ao etanol (co-fermentação) (Chen and Ho, 1993, Cloning and improving the expression of Pichia stipitis xylose reductase gene in

Saccharomyces cerevisiae, Appl. Biochem. Biotechnol. 39-40: 135-147; Ho et al., 1998, Genetically engineered Saccharomyces yeast enable of effectively cofermenting glucose and xylose, Appl. Environ. Mícrobiol. 64: 1852-1859; Kotter and Ciriacy, 1993, Xylose fermentation by Saccharomyces cerevisiae, Appl. Microbiol. Biotechnol. 38: 776-783; Walfridsson et al., 1995, Xylosemetabolizing Saccharomyces cerevisiae strains overexpressing the TKL1 and TAL1 genes encoding the pentose fosfato pathway enzyme transketolase and transaldolase, Appl. Environ. Microbiol. 61: 4184-4190; Kuyper et al., 2004, Minimal metabolic engineering de Saccharomyces cerevisiae for efficient anaerobic xylose fermentation: a proof of principie, FEMS Yeast Research 4: 655-664; Beall et al., 1991, Parametric studies of Ethanol production from xylose and other sugars by recombinant Escheríchia coli, Biotech. Bioeng. 38: 296-303; Ingram et al., 1998, Metabolic engineering de bactéria for a production of ethanol, Biotechnol. Bioeng. 58: 204-214; Zhang et al., 1995, Metabolic engineering of a pentose metabolism pathway in ethanologenic Zymomonas mobilis, Science 267: 240-243; Deanda et al., 1996, Development of an arabinose-fermenting Zymomonas mobilis strain by metabolic pathway engineering, Appl. Environ. Microbiol. 62: 4465-4470; WO 2003/062430, xylose isomerase).

Em um aspecto preferido, o microorganismo de fermentação geneticamente modificado é Saccharomyces cerevisiae. Em outro aspecto preferido, o microorganismo de fermentação geneticamente modificado é Zymomonas mobilis. Em outro aspecto preferido, o microorganismo de fermentação geneticamente modificado é Escherichia coli. Em outro aspecto preferido, o microorganismo de fermentação geneticamente modificado é Klebsiella oxytoca. Em outro aspecto preferido, o microorganismo de fermentação geneticamente modificado é Kluyveromyces sp.

E bem conhecido na técnica que os organismos descritos acima também podem ser usados para produzir outras substâncias, como descritos neste.

O microorganismo de fermentação é tipicamente adicionado ao hidrolisado ou lignocelulose degradada e a fermentação é realizada por cerca de 8 a cerca de 96 horas, tal como cerca de 24 a cerca de 60 horas. A temperatura é tipicamente entre cerca de 26° C a cerca de 60° C, em particular cerca de 32° C ou 50 °C e a cerca de pH 3 a cerca de pH 8, tal como de cerca de pH 4-5, 6, ou 7.

Em um aspecto preferido, a levedura e/ou outro microorganismo é aplicado ao material celulósico degradado ou contendo xilano e a fermentação é realizada por cerca de 12 a cerca de 96 horas, tal como tipicamente 24 a 60 horas. Em um aspecto preferido, a temperatura está preferivelmente entre cerca de 20 °C a cerca de 60 °C, mais preferivelmente cerca de 25 °C a cerca de 50 °C e mais preferivelmente cerca de 32 °C a cerca de 50 °C, em particular cerca de 32 °C ou 50 °C e o pH está geralmente de cerca de pH 3 a cerca de pH 7, preferivelmente de cerca de pH 4-7. Entretanto, alguns organismos de fermentação, por exemplo, bactéria, tem ótima temperatura de fermentação mais alta. A levedura e outro microorganismo é preferivelmente aplicado em quantidades de aproximadamente 10⁵ a 10¹², preferivelmente de aproximadamente 10⁷ a 10¹⁰, especialmente aproximadamente 2 x 10⁸ contagem de célula viável por ml do caldo de fermentação. Ainda a orientação com relação ao uso de levedura pela fermentação pode ser observada em, por exemplo, “The Alcohol Textbook” (Editors K. Jacques, T.P. Lyons and D.R. Kelsall, Nottingham University Press, United Kingdom 1999), que é incorporado neste por referência.

Para a produção de etanol, seguindo a fermentação a pasta fermentada é destilada ao extrato de etanol. O etanol obtido de acordo com os métodos da invenção podem ser usados como, por exemplo, combustível etanol, etanol potável, isto é, álcool neutro potável, ou etanol industrial.

Um estimulador de fermentação pode ser usado em combinação com qualquer um dos processos descritos neste ainda para melhor o processo de fermentação e em particular, o desempenho do microorganismo de fermentação, tal como, intensificação da taxa e produção de etanol. Um “estimulador de fermentação” refere-se aos estimuladores para o desenvolvimento dos microorganismos fermentadores, em particular, levedura. Os estimuladores de fermentação preferidos para o desenvolvimento incluem vitaminas e minerais. Exemplos de vitaminas incluem multivitaminas, biotina, pantotenato, ácido nicotínico, meso-inositol, tiamina, piridoxina, ácido para-aminobenzóico, ácido fólico, riboflavina e vitaminas A, B, C, D e E. Ver, por exemplo, Alfenore et al., Improving ethanol production and viability of Saccharomyces cerevisiae by a vitamin feeding strategy during fed-batch process, Springer-Verlag (2002), que é incorporado neste por referência. Exemplos de minerais incluem minerais e sais minerais que podem fornecer os nutrientes que compreende P, K, Mg, S, Ca, Fe, Zn, Mn e Cu.

Produtos de fermentação: Um produto de fermentação pode ser qualquer substância derivada a partir da fermentação. O produto de fermentação pode ser, sem limitação, um álcool (por exemplo, arabinitol, butanol, etanol, glicerol, metanol, 1,3-propanodiol, sorbitol e xilitol); um ácido orgânico (por exemplo, ácido acético, ácido acetônico, ácido adípico, ácido ascórbico, ácido cítrico, ácido 2,5-diceto-D-glucônico, ácido fórmico, ácido fumárico, ácido glucárico, ácido glucônico, ácido glucurônico, ácido glutárico, ácido 3-hidroxipropiônico, ácido itacônico, ácido lático, ácido málico, ácido malônico, ácido oxálico, ácido propiônico, ácido succínico e ácido xilônico); uma cetona (por exemplo, acetona); um aminoácido (por exemplo, ácido aspártico, ácido glutâmico, glicina, lisina, serina e treonina) e um gás (por exemplo, metano, hidrogênio (H₂), dióxido de carbono (CO₂) e monóxido de carbono (CO)). O produto de fermentação também pode ser proteína como um produto de valor alto.

100

Em um aspecto preferido, o produto de fermentação é um álcool. Será entendido que o termo “álcool” abrange uma substância que contém uma ou mais porções de hidroxila. Em um aspecto mais preferido, o álcool é arabinitol. Em outro aspecto mais preferido, o álcool é butanol. Em outro aspecto mais preferido, o álcool é etanol. Em outro aspecto mais preferido, o álcool é glicerol. Em outro aspecto mais preferido, o álcool é metanol. Em outro aspecto mais preferido, o álcool é 1,3-propanodiol. Em outro aspecto mais preferido, o álcool é sorbitol. Em outro aspecto mais preferido, o álcool é xilitol. Ver, por exemplo, Gong, C. S., Cao, N. J., Du, J. e Tsao, G. T., 1999, Ethanol production from renewable resources, in Advances in Biochemical Engineering/Biotechnology, Scheper, T., ed., Springer-Verlag Berlin Heidelberg, Germany, 65: 207-241; Silveira, Μ. M. e Jonas, R., 2002, The biotechnological production of sorbitol, Appl. Microbiol. Bíotechnol. 59: 400-408; Nigam, P. e Singh, D., 1995, Processes for fermentative production of xilitol - a sugar substitute, Process Biochemistry 30 (2): 117-124; Ezeji, T. C., Qureshi, N. and Blaschek, Η. P., 2003, Production of acetone, buthanol and ethanol by Clostridium beijerinckii BA101 and in situ recovery by gas stripping, World Journal of Microbiology andBiotechnology 19 (6): 595-603.

Em outro aspecto preferido, o produto de fermentação é um ácido orgânico. Em outro aspecto mais preferido, o ácido orgânico é ácido acético. Em outro aspecto mais preferido, o ácido orgânico é ácido acetônico. Em outro aspecto mais preferido, o ácido orgânico é ácido adípico. Em outro aspecto mais preferido, o ácido orgânico é ácido ascórbico. Em outro aspecto mais preferido, o ácido orgânico é ácido cítrico. Em outro aspecto mais preferido, o ácido orgânico é ácido 2,5-diceto-D-glucônico. Em outro aspecto mais preferido, o ácido orgânico é ácido fórmico. Em outro aspecto mais preferido, o ácido orgânico é ácido fumárico. Em outro aspecto mais preferido, o ácido orgânico é ácido glucárico. Em outro aspecto mais

101 preferido, o ácido orgânico é ácido glucônico. Em outro aspecto mais preferido, o ácido orgânico é ácido glucurônico. Em outro aspecto mais preferido, o ácido orgânico é ácido glutárico. Em outro aspecto preferido, o ácido orgânico é ácido 3-hidroxipropiônico. Em outro aspecto mais preferido, o ácido orgânico é ácido itacônico. Em outro aspecto mais preferido, o ácido orgânico é ácido lático. Em outro aspecto mais preferido, o ácido orgânico é ácido málico. Em outro aspecto mais preferido, o ácido orgânico é ácido malônico. Em outro aspecto mais preferido, o ácido orgânico é ácido oxálico. Em outro aspecto mais preferido, o ácido orgânico é ácido propiônico. Em outro aspecto mais preferido, o ácido orgânico é ácido succínico. Em outro aspecto mais preferido, o ácido orgânico é ácido xilônico. Ver, por exemplo, Chen, R. e Lee, Y. Y., 1997, Membrane-mediated extractive fermentation for lactic acid production from cellulosic biomass, Appl. Biochem. Biotechnol. 63-65: 435-448.

Em outro aspecto preferido, o produto de fermentação é uma cetona. Será entendido que o termo “cetona” abrange uma substância que contém uma ou mais porções de cetona. Em outro aspecto mais preferido, a cetona é acetona. Ver, por exemplo, Qureshi and Blaschek, 2003, supra.

Em outro aspecto preferido, o produto de fermentação é um aminoácido. Em outro aspecto mais preferido, o ácido orgânico é ácido aspártico. Em outro aspecto mais preferido, o aminoácido é ácido glutâmico. Em outro aspecto mais preferido, o aminoácido é glicina. Em outro aspecto mais preferido, o aminoácido é lisina. Em outro aspecto mais preferido, o aminoácido é serina. Em outro aspecto mais preferido, o aminoácido é treonina. Ver, por exemplo, Richard, A. e Margaritis, A., 2004, Empirical modeling de batch fermentation kinetics for poli(glutamic acid) production and other microbial biopolimers, Biotechnology and Bioengineering 87 (4): 501-515.

Em outro aspecto preferido, o produto de fermentação é um

102 gás. Em outro aspecto mais preferido, o gás é metano. Em outro aspecto mais preferido, o gás é H₂. Em outro aspecto mais preferido, o gás é CO₂. Em outro aspecto mais preferido, o gás é CO. Ver, por exemplo, Kataoka, N., A. Miya e K. Kiriyama, 1997, Studies on hydrogen production by continuous culture system of hydrogen-producing anaerobic bactéria, Water Science and Technology 36 (6-7): 41-47 e Gunaseelan V.N. in Biomass and Bioenergy, Vol. 13 (1-2), pp. 83-114, 1997, Anaerobic digestion of biomass for methane production: A review.

Recuperação. Os produtos das fermentações podem ser opcionalmente recuperados a partir do meio de fermentação usando qualquer método conhecido na técnica incluindo, mas não limitado a, cromatografia, procedimentos eletroforéticos, solubilidade diferencial, destilação, ou extração. Por exemplo, o álcool é separado a partir de um material celulósico fermentado ou contendo xilano e purificado pelos métodos convencionais de destilação. O etanol com uma pureza de até cerca de 96 % em volume pode ser obtido, que podem ser usados como, por exemplo, combustível etanol, etanol potável, isto é, álcool neutro potável, ou etanol industrial.

Outros usos

Os polipeptídeos da presente invenção também podem ser usados com atividade limitada de outras enzimas xilanolíticas para degradar os xilanos para a produção dos oligossacarídeos. Os oligossacarídeos podem ser usados como agentes de volume, oligossacarídeos semelhantes a arabinoxilano liberados a partir do material de parede celular cereal, ou de mais ou menos arabinoxilanos purificados de cereais.

Os polipeptídeos da presente invenção também podem ser usados em combinação com outras enzimas xilanolíticas para degradar os xilanos a xilose e outros monossacarídeos (Patente U.S. N°. 5,658,765). A xilose liberada pode ser convertida a outros compostos.

Os polipeptídeos da presente invenção podem ser usados

103 juntos com outras enzimas semelhantes a glucanases para melhorar a extração do material vegetal rico em óleo, semelhante ao óleo de milho do embriões de milho.

Os polipeptídeos da presente invenção também podem ser usados no cozimento para melhorar o desenvolvimento, elasticidade, e/ou estabilidade da pasta e/ou o volume, estrutura de migalha e/ou propriedades anti-envelhecimento do produto cozido (ver Patente U.S. N°. 5.693.518). Os polipeptídeos também podem ser usados para a preparação da pasta ou produtos cozidos preparados a partir de qualquer tipo de farinha (por exemplo, com base em trigo, centeio, cevada, aveia ou milho). Os produtos cozidos produzidos com um polipeptídeo da presente invenção incluem pão, pão francês, baguetes e outros. Para os propósitos de cozimento um polipeptídeo da presente invenção pode ser usado como apenas ou maior atividade enzimática, ou podem ser usados em combinação com outras enzimas tal como uma xilanase, uma lipase, uma amilase, uma oxidase (por exemplo, glicose oxidase, peroxidase), uma lacase e/ou uma protease.

Os polipeptídeos da presente invenção também podem ser usados para a modificação da alimentação animal e pode exercer seu efeito in vitro (para modificação dos componentes de alimentação) ou in vivo para melhorar a digestibilidade de alimentação e aumentar a eficiência de sua utilização (Patente U.S. N°. 6.245.546). Os polipeptídeos podem ser adicionados pelas composições de alimentação animal contendo quantidades altas de arabinoxilanos e glucuronoxilans, por exemplo, alimentação contendo cereais tais como cevada, trigo, centeio, aveia ou milho. Quando adicionado ao alimento o polipeptídeo melhorará a quebra in vivo do material da parede celular vegetal parcialmente devido a uma redução da viscosidade intestinal (Bedford et al., 1993, Proceedings of the lst Symposium on Enzyme in Animal Nutrition, pp. 73-77), portanto a utilização melhorada dos nutrientes vegetais pelo animal é atingido. Por meio deste a taxa de desenvolvimento

104 e/ou razão de conversão de alimentação (isto é, o peso do alimento ingerido relativo ao ganho de peso) do animal é melhorado.

Os polipeptídeos da presente invenção também podem ser usados na indústria de polpa e papel, inter alia, nos processos de alvejamento para intensificar o brilho das polpas alvejadas considerando a quantidade de cloro nos estágios de alvejamento é reduzido e para aumentar a liberdade das polpas no processo do papel reciclado (Eriksson, 1990, Wood Science and Technology 24: 79-101; Paice et al., 1988, Biotechnol. and Bioeng. 32: 235239 e Pommier et al., 1989, Tappi Journal 187-191). O tratamento da polpa lignocelulósica pode ser realizado, por exemplo, como descrito em Patente U.S. N°. 5.658.765, WO 93/08275, WO 91/02839 e WO 92/03608.

Os polipeptídeos da presente invenção também podem ser usados na preparação de cerveja, em particular para melhorar a filtrabilidade do mosto contendo, por exemplo, cevada e/ou malte de sorgo (WO 2002/24926). Os polipeptídeos podem ser usados na mesma maneira como pentosanases convencionalmente usado pela preparação, por exemplo, como descrito por Viêtor et al., 1993, J. Inst. Brew. 99: 243-248 e EP 227159. Além disso, os polipeptídeos podem ser usados para o tratamento do grão de cervejeiro gasto, isto é, resíduos da produção de mosto de cerveja contendo cevado ou cevada maltada ou outros cereais, a fim de melhorar a utilização dos resíduos, por exemplo, alimentação animal.

Os polipeptídeos da presente invenção podem ser usados para a separação dos componentes dos materiais de células vegetais, em particular de componentes cereais tal como componentes de trigo. De interesse particular é a separação de trigo no glúten e amido, isto é, componentes de interesse comercial considerável. O processo de separação pode ser realizado pelo uso dos métodos conhecidos na técnica, tal como o denominado processo de massa (ou processo de moagem úmida) realizada como um hidroclone ou um processo decantador. No processo de massa, o material de partida é uma

105 dispersão bombeada diluída do material vegetal tal como trigo a ser submetido a separação. Em um processo de separação do trigo é dispersão é feita normalmente a partir da farinha de trigo e água.

Os polipeptídeos da invenção também podem ser usados na preparação de sucos de fruta e vegetais a fim de aumentar a produção.

Os polipeptídeos da presente invenção também podem ser usados como um componente de um sistema de contagem enzimática para produtos têxteis.

Os polipeptídeos da presente invenção também podem ser usados nas aplicações de detergentes de lavanderia em combinação com outras funcionalidades da enzima.

Peptídeo de sinal

A presente invenção também diz respeito a um polinucleotídeo isolado que codifica um peptídeo sinalizador que compreende ou consiste de aminoácidos 1 a 15 da SEQ ID N°: 2.

Em um aspecto preferido, o polinucleotídeo isolado que codifica um peptídeo sinalizador compreende ou consiste de nucleotídeos 1 a 45 daSEQIDN⁰: 1.

A presente invenção também diz respeito a construções de ácido nucléico que compreende um gene que codifica uma proteína, em que o gene é operacionalmente ligado ao polinucleotídeo isolado que codifica o peptídeo de sinal, em que o gene é estranho ao polinucleotídeo que codifica the peptídeo de sinal.

A presente invenção também diz respeito a vetores de expressão recombinantes e células hospedeiras recombinantes que compreendem tais construções de ácido nucléico.

A presente invenção também diz respeito a métodos de produzir uma proteína, que compreende: (a) cultivar uma célula hospedeira recombinante que compreende um gene que codifica a proteína

106 operacionalmente ligada a um tal polinucleotídeo que codifica um peptídeo sinalizador, em que o gene é estranho ao polinucleotídeo sob condições condutivas para a produção da proteína e (b) recuperação da proteína e (b) recuperação da proteína.

A proteína pode ser natural ou heteróloga a uma célula hospedeira. O termo “proteína” não é significa neste referir-se a um comprimento específico do produto codificado e, portanto, abrange peptídeos, oligopeptídeos e proteínas. O termo “proteína” também abrange dois ou mais polipeptídeos combinados para formar o produto codificado. As proteínas também incluem polipeptídeos híbridos que compreendem uma combinação das sequências de polipeptídeo completo ou parcial obtido de pelo menos duas proteínas diferentes em que uma ou mais (diversos) pode ser heterólgos ou naturais à célula hospedeira. As proteínas ainda incluem as variações projetadas e alélicas de ocorrência natural das proteínas mencionadas acima e proteínas híbridas.

Preferivelmente, a proteínas é um hormônio ou variante destes, enzima, receptor ou porção destes, anticorpo ou porção destes, ou repórter. Em um aspecto mais preferido, a proteína é uma oxidoredutase, transferase, hidrolase, liase, isomerase, ou ligase. Ainda em um aspecto mais preferido, a proteína é uma aminopeptidase, amilase, carboidrase, carboxipeptidase, catalase, celulase, chitinase, cutinase, glicosiltransferase ciclodextrina, desoxiribonuclease, esterase, alfa-galactosidase, beta-galactosidase, glucoamilase, alfa-glucosidase, beta-glucosidase, invertase, lacase, outra lipase, manosidase, mutanase, oxidase, enzima pectinolítica, peroxidase, fitase, polifenoloxidase, enzima proteolítica, ribonuclease, transglutaminase ou xilanase.

O gene pode ser obtido a partir de qualquer procariótica, eucariótica ou outra fonte.

A presente invenção ainda é descrita pelos seguintes exemplos

107 que não devem ser construídos como limitantes do escopo da invenção.

Exemplos

Materiais

As químicas usadas como tampões e substratos foram produtos comerciais de pelo menos o grau reagente.

Cepas

Humicola insolens DSM 1800 foi usado como a fonte do gene glycosidase da Família 67 que codifica um polipeptídeo tendo atividade de alfa-glucuronidase.

Meio

As placas PDA foram compostas por litro de 39 g de ágar de dextrose de batata.

O meio YP foi composto por litro de 10 g do extrato de levedura e 20 g de Bacto peptona.

Ensaio da atividade de alfa-glucuronidase

A solução de ensaio para determinação da atividade de alfaglucuronidase é composta de 0,16 ml de substrato (2 mg de ácido aldotriourônico-ácido aldobiurônico [80:20] em 0,05 M de acetato de sódio de tampão de pH 5,0) e 0,04 ml de solução de enzima (volume total, 0,2 ml). O ensaio é iniciado pela adição de uma amostra de enzima. Após 30 minutos de incubação a 40° C, a reação é interrompida pela fusão de uma amostra por 4 minutos. O precipitado é removido pela centrifugação (10,000 χ g), após o tensoativo ser transferido a um novo tubo. Ao tubo é adicionado 0,6 ml de reagente de cobre preparado como descrito por Milner and Avigad, 1967, Carbohydrate Research 4: 359-351 e então a amostra é fundida por 10 minutos e esfriada em gelo. Subsequentemente, 0,4 ml de reagente de arsenomolibdato preparado como descrito por Nelson, 1944, J. Biol. Chem. 153: 375-380, é adicionado. A amostra é gentilmente misturada, 0,8 ml de H₂O é adicionado e a absorbância a 600 nm é medida contra a água. Um

108 controle é preparado pela fusão de uma mistura de ensaio completo em tempo zero, antes da incubação a 40° C. Um controle de substrato é feito pela adição de água em vez da solução de enzima. Uma curva padrão é preparada pelo uso de D-ácido glucurônico.

Exemplo 1: Extração de DNA genômico Humicola insolens

DSM 1800

Humicola insolens DSM 1800 foi desenvolvido em placas PDA a 45 °C para confluência. Três 4 mm² quadrados foram cortados a partir das placas PDA e inoculados em 25 ml de meio YP contendo 2 % de glicose em um frasco de agitação com defletores de 125 ml a 41° C e 200 rpm por 2 dias. As micélias foram coletadas por filtração usando MIRACLOTH® (Calbiochem, La Jolla, CA, USA), lavadas duas vezes com água desionizada e congeladas sob nitrogênio líquido. As micélias congeladas foram trituradas, por mortar e pilão, a um pó fino e DNA total foi isolado usando um kit DNAEASY® Plant Maxi (QIAGEN Inc., Valencia, CA, USA).

Exemplo 2: Isolamento de um fragmento parcial de um gene glycosidase alfa-glucuronidase da Família 67 de Humicola insolens DSM 1800

Usando o programa iniciador de oligonucleotídeo híbrido degenerado consenso (CODEHOP; Rose et al., 1998, Nucleic Acids Research 26: 1628-1635), os iniciadores degenerados foram projetados as regiões da homologia com alfa-glucuronidases conhecidos. Os iniciadores degenerados utilizados para gerar um fragmento do gene Humicola insolens GH67A alfaglucuronidase são mostrados abaixo.

Iniciador HinsAglucsense3:

5'-AAGTACGGCCCCATCGAYTTYCARGT-3' (SEQ ID N°: 3)

Tradução de proteína para o iniciador degenerado HinsAglucsense3:

KYGPIDFQV

109

Iniciador HinsAglucAnti2:

5'- TGGAACCACAGCATCAGGTYRTCNGGNGT -3' (SEQ ID N°: 4)

Tradução de proteína para o iniciador degenerado Hins Agluc Anti2:

TPDXLMLWF

Para obter o fragmento de DNA inicial do gene Humicola insolens GH67A alfa-glucuronidases, o PCR gradiente foi realizado em 6 temperaturas de recozimento diferentes que variam de 50 °C a 70,5 °C. As reações de amplificação (25 μΐ) foram compostas de 80 ng de DNA genômico Humicola insolens DSM 1800 como modelo, 0,4 mM cada um de dATP, dTTP, dGTP e dCTP, 50 pmol cada um do iniciador HinsAglucsense3 e iniciador HinsAglucAnti2, tampão IX ADVANTAGE® GC-Melt LA (Clontech Laboratories, Inc., Mountain View, CA, USA) e 1,25 unidades de ADVANTAGE® GC Genomic Polimerase Mix (Clontech Laboratories, Inc., Mountain View, CA, USA). As amplificações foram realizadas usando um EPPENDORF® MASTERCYCLER® 5333 (Eppendorf Scientific, Inc., Westbury, NY, USA) programado pela pré-desnaturação a 95° C por 1 minuto; 30 ciclos cada um em uma temperatura de desnaturação de 95° C por 30 segundos; temperaturas de recozimento 60 °C +/- 10 °C por 30 segundos (6 opções gradiente) e alongamento a 72° C por 1 minuto e alongamento final a 72° C por 6 minutos.

Os produtos de reação foram isolados por 1,0 % de eletroforese em gel de agarose em tampão TBE (10,8 g de Tris base, 5,5 g de ácido bórico e 4 ml de 0,5 M de EDTA pH 8,0 por litro). Um grupo de produto PCR de aproximadamente 700 bp a partir de uma temperatura de recozimento 51,4 °C foi taxado a partir do gel, purificado usando um kit de extração em gel QIAQUICK® (QIAGEN Inc., Valencia, CA, USA) de acordo com as instruções do fabricante e sequenciados. O sequenciamento de DNA do fragmento PCR foi realizado com um sequenciador de DNA

110 automático um modelo Perkin-Elmer Applied Biosystems 377 XL (PerkinElmer/Applied Biosystems, Inc., Foster City, CA, USA) usando química terminadora de pigmento (Giesecke et al., 1992, Journal ofVirology Methods 38: 47-60) e estratégia de marcha de iniciador. Uma sequência parcial foi obtida, que contém a homologia a outras alfa-glucuronidases conhecidas.

Exemplo 3: Isolamento de um gene Humicola insolens GH67A alfa-glucuronidase de comprimento total

Um gene alfa-glucuronidase de comprimento total foi isolado de Humicola insolens DSM 1800 usando um kit GENOMEWALKER™ Universal (Clontech Laboratories, Inc., Mountain View, CA, USA) de acordo com as instruções do fabricante. Brevemente, o DNA genômico total de Humicola insolens DSM 1800 foi digerido separadamente com quatro enzimas de restrição diferentes (Dra I, Eco RV, Pvu II e Stu I) que deixam as extremidades abruptas. Cada batelada do DNA genômico digerido foi então ligado separadamente ao adaptador GENOMEWALKER™ (Clontech Laboratories, Inc., Mountain View, CA, USA) para criar quatro bibliotecas. Estas quatro bibliotecas foram então utilizadas como modelos nas reações de PCR usando-se seis iniciadores específicos de gene mostrados abaixo, dois para uma amplificação de PCR primário e secundário uma porção a montante da aproximação do fragmento a extremidade final de 5’ do gene (zona 1 Terminal N), dois para uma amplificação de PCR primário e secundário a jusante através da extremidade final de 5’ que codifica o terminal N do gene alfa-glucuronidase (zona 2 Terminal N) e dois para o PCR primário e secundário amplificando-se a jusante do fragmento através da extremidade final 3 ’ que codifica o terminal C do gene alfa-glucuronidase. Os iniciadores seguintes foram projetados com base na seqüência do gene alfa-glucuronidase da Família 67 parcial de Humicola insolens descritas no Exemplo 2.

Terminal N:

Zona 1:

111

Iniciador HinsAGGSP15’R (primário):

5'-TTGAAGCGGCTGCCGTTGAGGATGTC-3' (SEQ ID N°: 5)

Iniciador HinsAGGSP25’R (secundário): 5'-AGTTCCTTCCACATGGGCGCGAGGTAG-3' (SEQ ID N°: 6)

Zona 2:

Iniciador HinsAGGWset2ntermRGSPl (primário): 5'-ATAGCCACGCTCGACGCTGCCGTGAAT-3' (SEQ ID N°: 7)

Iniciador HinsAGGW2ntermGSP2R (secundário):

5'-ACTGGTTCACCCAGCGGATGGGAGCAT-3' (SEQ ID N°: 8)

Terminal C:

Iniciador HinsAGGSP13’F (primário):

5'-TCCAGACGCTGACCGACATCCTGTTGG-3' (SEQ ID N°: 9)

Iniciador HinsAGGSP23’F (secundário):

5'-CCCGAGGTCGCCGAGCTGTATGAACAC-3' (SEQ ID N°: 10)

As amplificações primárias foram compostas de 1 μΐ (aproximadamente 6 ng) de cada biblioteca como modelo, 0,4 mM cada um de dATP, dTTP, dGTP e dCTP, 10 pmol do adaptor Iniciador 1 (Clontech Laboratories, Inc., Mountain View, CA, USA), 50 pmol do iniciador HinsAGGSP15’R ou HinsAGGWset2ntermRGSPl ou HinsAGGSP13’F, tampão IX ADVANTAGE® GC-Melt LA e 1,25 unidades de ADVANTAGE® GC Genomic Polimerase Mix em um volume final de 25 μΐ.

As amplificações foram realizadas usando um EPPENDORF® MASTERCYCLER® 5333 programado pela pré-desnaturação a 95° C por 1 minuto; 7 ciclos cada um em uma temperatura de desnaturação de 95° C por 25 segundos; recozimento e alongamento a 72° C por 5 minutos; 32 ciclos cada um em uma temperatura de desnaturação de 95 °C por 25 segundos;

recozimento e alongamento a 67° C por 5 minutos e alongamento final a 67 °C por 7 minutos.

As amplificações secundárias foram compostas de 1 μΐ de cada

112 produto PCR primário como modelo, 0,4 mM cada um de dATP, dTTP, dGTP e dCTP, 10 pmol do adaptor Iniciador 2 (Clontech Laboratories, Inc., Mountain View, CA, USA), 50 pmol do iniciador HinsAGGSP25’R ou HinsAGGW2ntermGSP2R ou HinsAGGSP23’F, tampão IX ADVANTAGE® GC-Melt LA e 1,25 unidades de ADVANTAGE® GC Genomic Polimerase Mix em um volume final de 25 μΐ. As amplificações foram realizadas usando um EPPENDORF® MASTERCYCLER® 5333 programado pela pré-desnaturação a 95° C por 1 minuto; 5 ciclos cada um em uma temperatura de desnaturação de 95° C por 25 segundos; recozimento e alongamento a 72° C por 5 minutos; 20 ciclos cada um em uma temperatura de desnaturação de 95 °C por 25 segundos; recozimento e alongamento a 67° C por 5 minutos e alongamento final a 67 °C por 7 minutos.

Os produtos de reação foram isolados por 1,0 % de eletroforese em gel de agarose em tampão TBE. A partir da extremidade final 5’ a amplificação de PCR do Terminal N zona 1, 3 faixas de produtos foram analisados: a 500-800 bp faixas de produtos sujos a partir da biblioteca Eco RV, uma faixa de produto 800 bp da biblioteca Pvu II e uma faixa de produto 500 bp da biblioteca Stu I. As 3 faixas de produtos foram taxadas a partir do gel, purificado usando um kit de extração em gel QIAQUICK®, clonado no vetor pCR®2.1-TOPO® (Invitrogen, Carlsbad, CA, USA) usando um kit TOPO® TA CLONING (Invitrogen, Carlsbad, CA, USA) e seqüenciado como descrito no Exemplo 2. A partir da extremidade final de 5’ a amplificação de PCR do Terminal N zona 2 PCR, 3 faixas de produtos foram analisadas: uma faixa de produtos 750 bp da biblioteca Eco RV, uma faixa de produto par 400 bp da biblioteca Pvu II e uma faixa de produto 2,2 kb da biblioteca Stu I. As 3 faixas de produtos taxadas a partir do gel, purificado usando um kit de extração em gel QIAQUICK®, clonado no vetor pCR®2.1TOPO® usando um kit TOPO® TA CLONING e seqüenciados como acima. A partir da extremidade final 3’ a amplificação PCR do Terminal C, 2 faixas

113 de produto foram analisadas: um grupo de produto de 400 bp de Biblioteca Pvu II e uma faixa de produto 2,2 kb da biblioteca Stu I. As 2 faixas de produtos foram taxadas a partir do gel, purificado usando um kit de extração em gel QIAQUICK®, clonado no vetor pCR®2.1-TOPO® usando um kit

TOPO® TA CLONING e seqüenciados como acima.

Exemplo 4: Construção de pHinsGH67A O sequenciamento de DNA foi realizado com um sequenciador de DNA automático um modelo Perkin-Elmer Applied Biosystems 377 XL usando química terminadora de pigmento (Giesecke et al., 1992, supra) e estratégia de marcha de iniciador.

Os dados de sequência de nucleotídeo foram examinados pela qualidade e todas as sequências foram comparadas a cada outra com assistência de software PHRED/PHRAP (University of Washington, Seattle, WA, USA). Os resultados da sequência de fragmento de PCR foram comparados e alinhados com a sequência do gene alfa-glucuronidase da Família 67 parcial de Humicola insolens descritas no Exemplo 2.

Um modelo de gene para uma seqüência Humicola insolens alfa-glucuronidase foi construído com base na similaridade da proteína codifica pelos homólogos conhecidos de alfa-glucuronidases. Dois iniciadores de oligonucleotídeo sintéticos mostrados abaixo foram projetados para amplificar o PCR do gene Humicola insolens DSM 1800 alfa-glucuronidase a partir do DNA preparado no Exemplo 1.

HinsAGBDInfNCOl:

5'-ACACAACTGGCCATGAAGAGCCTCCTGCTGCTCGCGGCCATT-3’ (SEQIDN⁰: 11)

HinsAGBDInfPacl:

5'-CAGTCACCTCTAGTTATCAATCCACAATCCCCTTTCCATGCG-3' (SEQIDN⁰: 12)

As letras em negrito representam a sequência codificadora. A

114 sequência remanescente é homóloga aos locais de inserção de pBM120a (WO 2006/078256) pela clonagem eventual no plasmídeo para a expressão do gene Humicola insolens DSM 1800 alfa-glucuronidase em Aspergillus niger MBinl20.

Cinquenta picomols de cada um dos iniciadores acima foram usados em uma reação de PCR composta de 80 ng do DNA genômico Humicola insolens, IX Expand High Fidelity^plus Reaction Buffer® (Roche Diagnostics, Mannheim, Germany), 0,4 mM cada um de dATP, dTTP, dGTP e dCTP e 5 unidades de Expand High Fidelity^plus Enzyme Blend® em um volume final de 50 μΐ. A amplificação foi realizado usando um EPPENDORF® MASTERCYCLER® 5333 programado por 1 ciclo a 95° C por 1 minuto; 30 ciclos cada um a 95° C por 30 segundos, 62° C por 30 segundos e 72° C por 2 minutos 30 segundos e a alongamento final a 72 °C por 7 minutos. O bloco de calor então para um ciclo de saturação a 4° C.

Os produtos de reação foram isolados por 1,0 % de eletroforese em gel de agarose em tampão TBE onde aproximadamente 2,7 kb de faixa de produto foi taxado a partir do gel e purificado usando um kit de extração em gel QIAQUICK®.

O fragmento em gel 2,7 kb purificado foi clonado no vetor pCR®2.1-TOPO® usando um kit TOPO® TA CLONING, para gerar pHinsGH67A (Figura 2). O Humicola insolens GH67A inserido em pHinsGH67A foi confirmado pelo sequenciamento de DNA. E. coli pHinsGH67A foi depositado com o Agricultural Research Service Patent Culture Collection, Northern Regional Research Center, 1815 University Street, Peoria, IL, USA, on July 24, 2008 as E. coli NRRL B-50155.

Exemplo 5: Caracterização da seqüência genômica Humicola insolens que codifica um gene GH67A alfa-glucuronidase

A sequência de nucleotídeo (SEQ ID N°: 1) e sequência de aminoácido deduzida (SEQ ID N°: 2) da seqüência genômica Humicola

115 insolens que codifica um GH67A alfa-glucuronidase são mostrados na Figuras IA e 1B. O fragmento genômico codifica um polipeptídeo dos 861 aminoácidos. O teor % G+C do comprimento total que codifica a sequência e o maduro que codifica a sequência são ambos 64,8 %. Usando o programa de software SignalP (Nielsen et al., 1997, Protein Engineering 10: 1-6), um peptídeo sinalizador de 15 resíduos foi predito. A proteína madura predita contém 846 aminoácidos com uma massa molecular de 95,6 kDa.

Um alinhamento global em forma de pares comparativos das sequências de aminoácidos foi determinado usando o algoritmo NeedlemanWunsch (Needleman and Wunsch, 1970, supra} como implementado no Programa Needle de EMBOSS com penalidade de abertura de fenda de 10, penalidade de extensão de fenda de 0,5 e a matriz EBLOSUM62. O alinhamento mostrou que a sequência de aminoácido deduzida do polipeptídeo maduro do gene Humicola insolens Família 67 alfaglucuronidase formou 63 % de identidade da sequência de aminoácido deduzida de um Aspergillus clavatus alfa-glucuronidase (UniProt número de acessão alce 12).

Depósito do material biológico

O seguinte material biológico foi depositado sob os termos de Budapest Treaty with the Agricultural Research Service Patent Culture Collection (NRRL), Northern Regional Research Center, 1815 University Street, Peoria, Illinois, 61604, USA e dão o seguinte número de acessão:

Data do depósito do Número de acessão do depósito E. coli pHinsGH67A NRRL B-50155 24 de Julho de 2008.

A cepa foi depositada sob condições que garantem que o acesso a cultura será disponível durante a pendência deste Pedido de Patente a um determinado pelas leis de Patente estrangeira a ser intitulada neste. O depósito representa uma cultura substancialmente pura da cepa depositada. O depósito é disponível como requerido pelas leis de Patente estrangeira nos

116 países em que as contrapartes do Pedido de objetivo, ou sua progênie são depositadas. Entretanto, deve ser entendido que a disponibilidade de um depósito não constitui uma licença para praticar a invenção de objetivo em detrimento dos direitos de Patente garantidos por ação governamental.

A presente invenção ainda é descrita pelos seguintes parágrafos numerados:

[1] Um peptídeo isolado tendo atividade de alfa-glucuronidase, selecionado do grupo que consiste de: (a) um polipeptídeo que compreende uma sequência de aminoácido tendo pelo menos 65 % de identidade ao polipeptídeo maduro da SEQ ID N°: 2; (b) um polipeptídeo codificado por um polipeptídeo que hibridiza sob condições de estringência pelo menos médias com o polipeptídeo maduro que codifica a sequência da SEQ ID N°: 1 ou seu filamento complementar de comprimento total; (c) um polipeptídeo codificado por um polipeptídeo que compreende uma sequência de nucleotídeo tendo pelo menos 65 % de identidade ao polipeptídeo maduro que codifica a sequência da SEQ ID N°: 1 e (d) uma variante que compreende uma substituição, anulação e/ou inserção de um ou mais (diversos) aminoácidos do polipeptídeo maduro da SEQ ID N°: 2.

[2] O polipeptídeo do parágrafo 1, que compreende uma sequência de aminoácido tendo pelo menos 65 % de identidade ao polipeptídeo maduro da SEQ ID N°: 2.

[3] O polipeptídeo do parágrafo 2, que compreende uma sequência de aminoácido tendo pelo menos 70 % de identidade ao polipeptídeo maduro da SEQ ID N°: 2.

[4] O polipeptídeo do parágrafo 3, que compreende uma sequência de aminoácido tendo pelo menos 75 % de identidade ao polipeptídeo maduro da SEQ ID N°: 2.

[5] O polipeptídeo do parágrafo 4, que compreende uma sequência de aminoácido tendo pelo menos 80 % de identidade ao

117 polipeptídeo maduro da SEQ ID N°: 2.

[6] O polipeptídeo do parágrafo 5, que compreende uma sequência de aminoácido tendo pelo menos 85 % de identidade ao polipeptídeo maduro da SEQ ID N°: 2.

[7] O polipeptídeo do parágrafo 6, que compreende uma sequência de aminoácido tendo pelo menos 90 % de identidade ao polipeptídeo maduro da SEQ ID N°: 2.

[8] O polipeptídeo do parágrafo 7, que compreende uma sequência de aminoácido tendo pelo menos 95 % de identidade ao polipeptídeo maduro da SEQ ID N°: 2.

[9] O polipeptídeo do parágrafo 8, que compreende uma sequência de aminoácido tendo pelo menos 97 % de identidade ao polipeptídeo maduro da SEQ ID N°: 2.

[10] O polipeptídeo do parágrafo 1, que compreende ou consiste da sequência de aminoácido da SEQ ID N°: 2 ou um fragmento deste tendo atividade de alfa-glucuronidase.

[11] O polipeptídeo do parágrafo 10, que compreende ou consiste da sequência de aminoácido da SEQ ID N°: 2.

[12] O polipeptídeo do parágrafo 10, que compreende ou 20 consiste do polipeptídeo maduro da SEQ ID N°: 2.

[13] O polipeptídeo do parágrafo 1, que é codificado por um polipeptídeo que hibridiza sob condições de estringência pelo menos médias com o polipeptídeo maduro que codifica a sequência da SEQ ID N°: 1 ou seu filamento complementar de comprimento total.

[14] O polipeptídeo do parágrafo 13, que é codificado por um polipeptídeo que hibridiza sob pelo menos condições de estringência médiaalta com o polipeptídeo maduro que codifica a sequência da SEQ ID N°: 1 ou seu filamento complementar de comprimento total.

[15] O polipeptídeo do parágrafo 14, que é codificado por um

118 polipeptídeo que hibridiza sob pelo menos condições de estringência alta com o polipeptídeo maduro que codifica a sequência da SEQ ID N°: 1 ou seu filamento complementar de comprimento total.

[16] O polipeptídeo do parágrafo 15, que é codificado por um polipeptídeo que hibridiza sob pelo menos condições de estringência muito alta com o polipeptídeo maduro que codifica a sequência da SEQ ID N°: 1 ou seu filamento complementar de comprimento total.

[17] O polipeptídeo do parágrafo 1, que é codificado por um polipeptídeo que compreende uma sequência de nucleotídeo tendo pelo menos 65 % de identidade ao polipeptídeo maduro que codifica a sequência da SEQIDN°: 1.

[18] O polipeptídeo do parágrafo 17, que é codificado por um polipeptídeo que compreende uma sequência de nucleotídeo tendo pelo menos 70 % de identidade ao polipeptídeo maduro que codifica a sequência daSEQIDN⁰: 1.

[19] O polipeptídeo do parágrafo 18, que é codificado por um polipeptídeo que compreende uma sequência de nucleotídeo tendo pelo menos 75 % de identidade ao polipeptídeo maduro que codifica a sequência da SEQ IDN°: 1.

[20] O polipeptídeo do parágrafo 19, que é codificado por um polipeptídeo que compreende uma sequência de nucleotídeo tendo pelo menos 80 % de identidade ao polipeptídeo maduro que codifica a sequência daSEQIDN⁰: 1.

[21] O polipeptídeo do parágrafo 20, que é codificado por um polipeptídeo que compreende uma sequência de nucleotídeo tendo pelo menos 85 % de identidade ao polipeptídeo maduro que codifica a sequência daSEQIDN⁰: 1.

[22] O polipeptídeo do parágrafo 21, que é codificado por um polipeptídeo que compreende uma sequência de nucleotídeo tendo pelo

119 menos 90 % de identidade ao polipeptídeo maduro que codifica a sequência daSEQIDN⁰: 1.

[23] O polipeptídeo do parágrafo 22, que é codificado por um polipeptídeo que compreende uma sequência de nucleotídeo tendo pelo menos 95 % de identidade ao polipeptídeo maduro que codifica a sequência daSEQIDN⁰: 1.

[24] O polipeptídeo do parágrafo 23, que é codificado por um polipeptídeo que compreende uma sequência de nucleotídeo tendo pelo menos 97 % de identidade ao polipeptídeo maduro que codifica a sequência daSEQIDN⁰: 1.

[25] O polipeptídeo do parágrafo 1, que é codificado por um polipeptídeo que compreende ou consiste de uma sequência de nucleotídeo da SEQ ID N°: 1; ou uma subsequência destes que codifica um fragmento tendo atividade de alfa-glucuronidase.

[26] O polipeptídeo do parágrafo 25, que é codificado por um polipeptídeo que compreende ou consiste de uma sequência de nucleotídeo da SEQIDN°: 1.

[27] O polipeptídeo do parágrafo 25, que é codificado por um polipeptídeo que compreende ou consiste do polipeptídeo maduro que codifica a sequência da SEQ ID N°: 1.

[28] O polipeptídeo do parágrafo 1, em que o polipeptídeo é uma variante que compreende uma substituição, anulação e/ou inserção de um ou mais (diversos) aminoácidos do polipeptídeo maduro da SEQ ID N°: 2.

[29] O polipeptídeo do parágrafo 1, que é codificado pelo polinucleotídeo contido no plasmídeo pHinsGH67A que está contido em E. coli NRRL B-50155.

[30] O polipeptídeo de qualquer um dos parágrafos 1-29, em que o polipeptídeo maduro são aminoácidos 16 a 861 da SEQ ID N°: 2.

[31] O polipeptídeo de qualquer um dos parágrafos 1-30, em

120 que o polipeptídeo maduro que codifica a sequência são nucleotídeos 46 a 2583 da SEQIDN°: 1.

[32] Um polinucleotídeo isolado que compreende uma sequência de nucleotídeo que codifica o polipeptídeo de qualquer um dos parágrafos 1-31.

[33] O polinucleotídeo isolado do parágrafo 32, que compreende pelo menos uma mutação no polipeptídeo maduro que codifica a sequência da SEQ ID N°: 1, em que a sequência de nucleotídeo mutante codifica o polipeptídeo maduro da SEQ ID N°: 2.

[34] Uma construção de ácido nucléico que compreende o polinucleotídeo do parágrafo 32 ou 33 operacionalmente ligados a uma ou mais (diversos) sequências de controle que direcionam a produção do polipeptídeo em um hospedeiro de expressão.

[35] Um vetor de expressão recombinante que compreende a construção de ácido nucléico do parágrafo 34.

[36] Uma célula hospedeira recombinante que compreende o polinucleotídeo do parágrafo 32 ou 33 operacionalmente ligados a uma ou mais (diversos) sequências de controle que direcionam a produção de um polipeptídeo tendo atividade de alfa-glucuronidase.

[37] Um método de produzir o polipeptídeo de qualquer um dos parágrafos 1-31, que compreende: (a) cultivar uma célula, que, em sua forma do tipo selvagem produz o polipeptídeo, sob condições condutivas para a produção do polipeptídeo e (b) recuperação do polipeptídeo.

[38] Um método de produzir o polipeptídeo de qualquer um dos parágrafos 1-31, que compreende: (a) cultivar uma célula hospedeira que compreende uma construção de ácido nucléico que compreende uma sequência de nucleotídeo que codifica o polipeptídeo sob condições condutivas para a produção do polipeptídeo e (b) recuperação do polipeptídeo.

121 [39] Um método de produzir um mutante de uma célula precursora, que compreende interromper ou anular um polinucleotídeo que codifica o polipeptídeo ou uma porção destes, de qualquer um dos parágrafos 1-31, que resulta no mutante que produz menos do polipeptídeo do que a célula precursora.

[40] Uma célula mutante produzida pelos métodos do parágrafo 39.

[41] A célula mutante do parágrafo 40, ainda compreende um gene que codifica uma proteína heteróloga ou natural.

[42] Um método de produzir uma proteína, que compreende: (a) cultivar a célula mutante do parágrafo 41 sob condições condutivas para a produção da proteína e (b) recuperação da proteína.

[43] O polinucleotídeo isolado do parágrafo 32 ou 33, obtido pela (a) hibridização de uma população de DNA sob condições de estringência pelo menos médias com o polipeptídeo maduro que codifica a sequência da SEQ ID N°: 1 ou seu filamento complementar de comprimento total e (b) isolamento do polinucleotídeo de hibridização, que codifica um polipeptídeo tendo atividade de alfa-glucuronidase.

[44] O polinucleotídeo isolado do parágrafo 43, obtido pela (a) hibridização de uma população de DNA sob pelo menos condições de estringência média-alta com o polipeptídeo maduro que codifica a sequência da SEQ ID N°: 1 ou seu filamento complementar de comprimento total e (b) isolamento do polinucleotídeo de hibridização, que codifica um polipeptídeo tendo atividade de alfa-glucuronidase.

[45] O polinucleotídeo isolado do parágrafo 44, obtido pela (a) hibridização de uma população de DNA sob pelo menos condições de estringência alta com o polipeptídeo maduro que codifica a sequência da SEQ ID N°: 1 ou seu filamento complementar de comprimento total e (b) isolamento do polinucleotídeo de hibridização, que codifica um polipeptídeo

122 tendo atividade de alfa-glucuronidase.

[46] O polinucleotídeo isolado do parágrafo 45, obtido pela (a) hibridização de uma população de DNA sob pelo menos condições de estringência muito alta com o polipeptídeo maduro que codifica a sequência da SEQ ID N°: 1 ou seu filamento complementar de comprimento total e (b) isolamento do polinucleotídeo de hibridização, que codifica um polipeptídeo tendo atividade de alfa-glucuronidase.

[47] O polinucleotídeo isolado de qualquer um dos parágrafos 43-46, em que o polipeptídeo maduro que codifica a sequência são nucleotídeos 46 a 2583 da SEQ ID N°: 1.

[48] Um método de produzir um polinucleotídeo que compreende uma sequência de nucleotídeo mutante que codifica um polipeptídeo tendo atividade de alfa-glucuronidase, que compreende: (a) introduzindo pelo menos uma mutação no polipeptídeo maduro que codifica a sequência da SEQ ID N°: 1, em que a sequência de nucleotídeo mutante codifica um polipeptídeo que compreende ou consiste do polipeptídeo maduro da SEQ ID N°: 2 e (b) recuperação do polinucleotídeo que compreende a sequência de nucleotídeo mutante.

[49] Um polinucleotídeo mutante produzido pelos métodos do parágrafo 48.

[50] Um método de produzir um polipeptídeo, que compreende: (a) cultivar uma célula que compreende o polinucleotídeo mutante do parágrafo 49 que codifica o polipeptídeo sob condições condutivas para a produção do polipeptídeo e (b) recuperação do polipeptídeo.

[51] Um método de produzir o polipeptídeo de qualquer um dos parágrafos 1-31, que compreende: (a) cultivar uma planta transgênica ou uma célula vegetal que compreende um polinucleotídeo que codifica o polipeptídeo sob condições condutivas para a produção do polipeptídeo e (b)

123 recuperação do polipeptídeo.

[52] Uma planta transgênica, parte vegetal ou célula vegetal transformadas com um polinucleotídeo que codifica o polipeptídeo de qualquer um dos parágrafos 1-31.

[53] Uma molécula de RNA inibidora de filamento duplo que compreende uma subsequência do polinucleotídeo do parágrafo 32 ou 33, em que, opcionalmente, o dsRNA é um siRNA ou uma molécula de miRNA.

[54] A molécula de RNA inibidora filamentada dupla (dsRNA) do parágrafo 53, que é cerca de 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25 ou mais duplexes de nucleotídeos de comprimento.

[55] Um método de inibir a expressão de um polipeptídeo tendo atividade de alfa-glucuronidase em uma célula, que compreende administrar à célula ou expressar na célula uma molécula de RNA (dsRNA) de filamento duplo, em que o dsRNA compreende uma subsequência do polinucleotídeo do parágrafo 33 ou 34.

[56] O método do parágrafo 55, em que o dsRNA é cerca de 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25 ou mais duplexes de nucleotídeos de comprimento.

[57] Um polinucleotídeo isolado que codifica um peptídeo sinalizador que compreende ou consiste de aminoácidos 1 a 15 da SEQ ID N°: 2.

[58] Uma construção de ácido nucléico que compreende um gene que codifica a proteína operacionalmente ligada ao polinucleotídeo do parágrafo 57, em que o gene é estranho ao polinucleotídeo.

[59] Um vetor de expressão recombinante que compreende a construção de ácido nucléico do parágrafo 58.

[60] Uma célula hospedeira recombinante que compreende a construção de ácido nucléico do parágrafo 58.

[61] Um método de produzir uma proteína, que compreende:

124 (a) cultivar uma célula hospedeira recombinante que compreende um gene que codifica a proteína operacionalmente ligada ao polinucleotídeo do parágrafo 57, em que o gene é estranho ao polinucleotídeo sob condições condutivas para a produção da proteína e (b) recuperação da proteína.

[62] Uma composição que compreende o polipeptídeo de qualquer um dos parágrafos 1-31.

[63] Um método para degradar ou converter um material celulósico ou contendo xilano, que compreende: tratar o material celulósico ou contendo xilano com uma composição enzimática na presença do polipeptídeo tendo atividade de alfa-glucuronidase de qualquer um dos parágrafos 1-31.

[64] O método do parágrafo 63, em que o material celulósico ou contendo xilano é pré-tratado.

[65] O método do parágrafo 63 ou 64, em que uma composição de enzima compreende uma ou mais enzima celulolíticas, uma ou mais enzimas de degradação de xilano, ou uma combinação de um ou mais enzimas de degradação de xilano e uma ou mais enzimas celulolíticas.

[66] O método do parágrafo 65, em que uma ou mais enzimas celulolíticas são selecionadas do grupo que consiste de uma endoglucanase, uma celobioidrolase e uma beta-glucosidase.

[67] O método do parágrafo 65 ou 66, em que uma composição de enzima ainda compreende um polipeptídeo GH61 tendo atividade de intensificação celulolítica.

[68] O método do parágrafo 65, em que uma ou mais enzimas de degradação de xilano são selecionadas do grupo que consiste de uma xilanase, um acetixilan esterase, um feruloil esterase, uma arabinofuranosidase, uma xilosidase e uma glucuronidase.

[69] O método de qualquer um dos parágrafos 63-68, em que uma composição de enzima ainda compreende uma ou mais enzimas

125 selecionadas do grupo que consiste de uma hemicelulase, uma esterase, uma protease, uma lacase e uma peroxidase.

[70] O método de qualquer um dos parágrafos 63-69, ainda compreende recuperar o material celulósico degradado ou contendo xilano.

[71] O método do parágrafo 70, em que um material celulósico degradado ou contendo xilano é um açúcar.

[72] O método do parágrafo 71, em que o açúcar é selecionado do grupo que consiste de glicose, xilose, manose, galactose e arabinose.

[73] Um método para produzir um produto de fermentação, que compreende: (a) sacarificar a um material celulósico ou contendo xilano com uma composição enzimática na presença do polipeptídeo tendo atividade de alfa-glucuronidase de qualquer um dos parágrafos 1-31; (b) fermentar o material celulósico sacarificado ou contendo xilano com um ou mais microorganismos fermentadores para produzir o produto de fermentação e (c) recuperar o produto de fermentação da fermentação.

[74] O método do parágrafo 73, em que o material celulósico ou contendo xilano é pré-tratado.

[75] O método do parágrafo 73 ou 74, em que uma composição de enzima compreende uma ou mais enzima celulolíticas, uma ou mais enzimas de degradação de xilano, ou uma combinação de um ou mais enzimas de degradação de xilano e uma ou mais enzimas celulolíticas.

[76] O método do parágrafo 75, em que uma ou mais enzimas celulolíticas são selecionadas do grupo que consiste de uma endoglucanase, uma celobioidrolase e uma beta-glucosidase.

[77] O método do parágrafo 75 ou 76, em que uma composição de enzima ainda compreende um polipeptídeo GH61 tendo atividade de intensificação celulolítica.

[78] O método do parágrafo 75, em que uma ou mais enzimas de degradação de xilano são selecionadas do grupo que consiste de uma

126 xilanase, um acetixilan esterase, um feruloil esterase, uma arabinofuranosidase, uma xilosidase e uma glucuronidase.

[79] O método de qualquer um dos parágrafos 73-78, em que uma composição de enzima ainda compreende uma ou mais enzimas selecionadas do grupo que consiste de uma hemicelulase, uma esterase, uma protease, uma lacase e uma peroxidase.

[80] O método de qualquer um dos parágrafos 73-79, em que as etapas (a) e (b) são realizadas simultaneamente em uma sacarificação simultânea e fermentação.

[81] O método de qualquer um dos parágrafos 73-80, em que o produto de fermentação é um álcool, um ácido orgânico, uma cetona, um aminoácido ou um gás.

[82] Um método de fermentar a um material celulósico ou contendo xilano, que compreende: fermentar o material celulósico ou contendo xilano com um ou mais microorganismos fermentadores, em que o material celulósico ou contendo xilano é sacarificado com uma composição enzimática na presença do polipeptídeo tendo atividade de alfa-glucuronidase de qualquer um dos parágrafos 1-31.

[83] O método do parágrafo 82, em que a fermentação do material celulósico ou contendo xilano produz um produto de fermentação.

[84] O método do parágrafo 83, ainda compreende recuperar o produto de fermentação da fermentação.

[85] O método de qualquer um dos parágrafos 82-84, em que o material celulósico ou contendo xilano é pré-tratado.

[86] O método de qualquer um dos parágrafos 82-85, em que uma composição de enzima compreende uma ou mais enzima celulolíticas, uma ou mais enzimas de degradação de xilano, ou uma combinação de um ou mais enzimas de degradação de xilano e uma ou mais enzimas celulolíticas.

[87] O método do parágrafo 86, em que uma ou mais enzimas

127 celulolíticas são selecionadas do grupo que consiste de uma endoglucanase, uma celobioidrolase e uma beta-glucosidase.

[88] O método do parágrafo 86 ou 87, em que uma composição de enzima ainda compreende um polipeptídeo GH61 tendo atividade de intensificação celulolítica.

[89] O método do parágrafo 86, em que uma ou mais enzimas de degradação de xilano são selecionadas do grupo que consiste de uma xilanase, um acetixilan esterase, um feruloil esterase, uma arabinofuranosidase, uma xilosidase e uma glucuronidase.

[90] O método de qualquer um dos parágrafos 82-89, em que uma composição de enzima ainda compreende uma ou mais enzimas selecionadas do grupo que consiste de uma hemicelulase, uma esterase, uma protease, uma lacase e uma peroxidase.

[91] O método de qualquer um dos parágrafos 82-90, em que o produto de fermentação é um álcool, um ácido orgânico, uma cetona, um aminoácido ou um gás.

A invenção descrita e reivindicada neste não será limitada no escopo pelos aspectos específicos neste divulgado, visto que estes aspectos são pretendidos como ilustrações dos diversos aspectos da invenção. Quaisquer aspectos equivalentes são pretendidos estar dentro do escopo desta invenção. De fato, várias modificações da invenção em adição aquelas mostradas e descritas neste tomarão evidentes aquela pessoa habilitada na técnica a partir da descrição precedente. Tais modificações também são pretendidas divergir dentro do escopo das reivindicações anexas. No caso de conflito, a presente divulgação incluindo as definições controlará.

Claims

REIVINDICAÇÕES

1. Célula hospedeira microbiana transgênica, caracterizada pelo fato de ser transformada com uma construção de ácido nucleico que compreende um polinucleotídeo que codifica um polipeptídeo tendo atividade

5 de alfa-glucuronidase, em que o polinucleotídeo consiste na SEQ ID NO: 1, ou nos nucleotídeos 46 a 2583 da SEQ ID NO: 1 operacionalmente ligado a uma ou mais sequências controle, em que o polinucleotídeo é heterólogo à célula hospedeira microbiana ou o polinucleotídeo é heterólogo a dita uma ou mais sequências controle.

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2. Célula hospedeira microbiana transgênica de acordo com a reivindicação 1, caracterizada pelo fato de que a SEQ ID NO: 1 codifica a SEQ ID NO: 2, ou os nucleotídeos 46 a 2583 de SEQ ID NO: 1 codificam os aminoácidos 16 a 861 da SEQ ID NO: 2.
3. Método para produzir um polipeptídeo tendo atividade de

15 alfa-glucuronidase, caracterizado pelo fato de que compreende: (a) cultivar a célula hospedeira microbiana transgênica como definida na reivindicação 1 ou 2, para a produção do polipeptídeo; e (b) recuperar o polipeptídeo.
4. Construção de ácido nucléico, caracterizada pelo fato de que compreende um gene que codifica uma proteína operacionalmente ligada a

20 um polinucleotídeo codificando um peptídeo sinal que consiste dos nucleotídeos 1 a 45 da SEQ ID NO: 1, que codifica o peptídeo sinal de aminoácidos 1 a 15 da SEQ ID NO: 2, em que o gene é heterólogo à sequência nucleotídica que codifica o peptídeo sinal.
5. Método para produzir uma proteína, caracterizado pelo fato

25 de que compreende:

(a) cultivar uma célula hospedeira microbiana transgênica para a produção da proteína, em que a célula hospedeira microbiana transgênica é transformada com uma construção de ácido nucléico como definida na reivindicação 4; e (b) recuperar a proteína.

Petição 870190008902, de 28/01/2019, pág. 16/17
6. Construção de ácido nucléico, caracterizada pelo fato de que compreende um polinucleotídeo que codifica um polipeptídeo tendo atividade de alfa-glucuronidase consistindo na SEQ ID NO: 1 ou nucleotídeos 46 a 2583 de SEQ ID NO: 1 operacionalmente ligada a um ou mais sequências

5 controle heterólogos para a produção do polipeptídeo em uma célula hospedeira microbiana transgênica.
7. Vetor de expressão, caracterizado pelo fato de que compreende um pobnucleotídeo que codifica um polipeptídeo tendo atividade de alfa-glucuronidase consistindo na SEQ ID NO: 1 ou os nucleotídeos 46 a
10 2583 da SEQ ID NO: 1, operacionalmente bgada a uma ou mais sequências controle heterólogas para a produção do pobpeptídeo em uma célula hospedeira microbiana transgênica.